PT1703914E - Estirpes de vacinas de apicomplexos da família dos sarcocystidae - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"ESTIRPES DE VACINAS DE APICOMPLEXOS DA FAMÍLIA DOS SARCOCYSTIDAE" A invenção presente diz respeito a estirpes mutantes atenuadas de apicomplexos da família dos

Sarcocystidae, tais como Toxoplasma e Neospora, bem como à sua utilização em vacinas. 0 phylum dos Apicomplexos (ramo Apicomplexa), agrupa um grande número de parasitas maioritariamente intracelulares. Estes parasitas são responsáveis por doenças tais como a toxoplasmose, a malária, a laneosporose, a 'coccidiose e a criptosporidiose. Eles possuem em comum um processo especifico de invasão das células hospedeiras, em diversos passos, levando à formação de um vacúolo parasitóforo no qual o parasita,se desenvolve (MENARD et ai., Cell Microbiol. 3: 63-73, 2001; SOLDATX et al., Int. J. Parasitol. 31: 1293-1302, 2001). O Toxoplasma gondii é um parasita protozoário intracelular obrigatório, responsável pela toxoplasmose humana e animal. Ele pertence à família dos Sarcocystidae que agrupa igualmente outros patogéneos importantes do homem e do animal, tais como os Neospora ou os Sarcocystis (LEVINE, The Protozoan Phylum Apicomplexa. Vol. 1, CRC Press, Boca Raton, FL, página 203, 1988; TENTER et al.,

Int. J. Parasitol. 32(5): 595-616, 2002). O seu ciclo de vida apresenta dois aspectos distintos: um ciclo assexuado 2 num hospedeiro intermediário, tal como o homem, o murganho, os ovinos e os suinos, levando à produção de taquizóitos e em seguida de quistos contendo bradizóitos; e um ciclo sexuado no gato, levando á produção de oocistos (contendo esporozóitos) eliminados nas fezes. A toxoplasmose animal representa um problema económico importante no domínio da produção animal. Ela atinge todos os animais domésticos. A transmissão a estes animais faz-se pela ingestão de oocistos, formas resistentes emitidas para o ambiente por gatos infectados por um toxoplasma patogénico. Nos ovinos, nos caprinos e nas porcas infectadas durante a gestação, ela provoca abortos. Na união Europeia cujo parque ovino é estimado em 100 milhões de cabeças, perde-se em cada ano 1 milhão de borregos devido a abortos toxoplásmicos.

Por outro lado, o consumo de carne (sobretudo de borrego e de porco) infectada pela presença de bradizóitos é a principal fonte de infecções em seres humanos. Quando contraída durante a. gravidez, a toxoplasmose é a segunda causa principal de malformações . congénitas. Para além disto, durante os últimos vinte anos, este parasita tem-se manifestado como um parasita oportunista, que está na origem de encefalites em pacientes com sida. O desenvolvimento e a preparação de vacinas que confiram uma protecção contra as parasitoses por Apicomplexa tem sido objecto de inúmeras investigações. São utilizadas duas estratégias principais: 1) a identificação 3 de antigénios parasitários capazes de proporcionar uma resposta imunitária protectora, e a incorporação destes antigénios nas composições de vacinas; 2) a selecção de estirpes atenuadas dos parasitas. Por exemplo, no caso da toxoplasmose, foi proposto utilizarem-se diversas estirpes atenuadas de Toxoplasma gondil (Patente US 5.045,313; Patente US 4.473.549; Pedido de patente US 2002/0164.754; Pedido de patente GB 2.204.323), para conferir aos mamíferos uma imunidade contra os toxoplasmas.

Hoje em dia, apenas está comercializada uma vacina anti-toxoplasmose baseada numa estirpe atenuada. Trata-se da vacina TOXOVAX®, à base de taquizóitos vivos da estirpe S48 de Toxoplasma gondíi. A natureza da mutação responsável pela atenuação desta estirpe permanece desconhecida.

Os passos chave da infecção pelos Apicomplexos, e em especial pelo Toxoplasma gondiif são a ligação do parasita às células hospedeiras, seguida pela invasão destas células. O aparelho invasor dos Apicomplexos implica a exocitose sequencial de dois .tipos de organelos de segregação: os micronemas e as roptrias.

Em estudos recentes foi detectado o papel central dos micronemas no reconhecimento das células hospedeiras, e na adesão a elas. As proteínas dos micronemas, designadas sob a designação genérica de "MIC" contêm módulos homólogos dos domínios de adesão de proteínas dos eucariotas superiores (TOMLEY e SOLDATI, Trends Parasitol. 17: 81-88,· 4 2001).

Conhece-se hoje em dia cerca de doze proteínas MIC no Toxoplasma gondii (SOLDATI et al., Int. J. Parasitol. 31 : 1293-1302,2001). Algumas delas são proteínas transmembranares, por exemplo a MIC2 do Toxoplasma gondii, denominada TRAP no Plasmodium (MATUSCHEWSKI et al., EMBO J. 21: 1597-1606, 2002); as outras são proteínas solúveis que alvejam os micronemas e são redistribuídas à superfície do parasita no decurso da invasão, em associação com as proteínas transmembranares.

Recentemente foram caracterizadas duas proteínas solúveis MICl e MIC3, capazes de se ligar à superfície das células hospedeiras, no T. gondii (ACHBAROU et al., Mol. Biochem. Parasitol., 47,223-233, 1991; FOURMAUX et al., Mol. Biochem. Parasitol. 83: 201-210, 1996 ; GARCIA-REGUET et al., Cell. Microbiol. 2: 353-364, 2002). A proteína MICl contém um domínio duplicado em tandem possuindo uma homologia longínqua com o domínio do tipo ΤΞΡ-1 de TRAP, e apresenta uma especificidade de ligação à lactose (LOURENCO et al., Glycobiol. 11: 541-547, 2001). A proteína MIC3 é um dímero com massa molecular aparente de 90 kDa, formada por duas sub-unidades com 38 kDa ligadas por pontes de dissulfureto. A MIC3 contém cinco domínios do tipo1 EGF dos quais dois se cavalgam, e um domínio do tipo ' domínio de ligação à quitína, rico em 5 pontes de dissulfureto, e que parece ser necessário para a ligação à superfície da célula hospedeira (GARCIA-REGUET et al., 2000, citado acima; CEREDE et al., EMBO <J. 21: 2526-2536, 2002).

As MIC1 e MIC3 associam-se a outras proteínas MIC para formar dois complexos independentes, os MICl/4/6 e MIC3/8. As proteínas transmembranares MIC6 e MIC8 desempenham o papel de transportadores para alvejar respectivamente as proteínas MIC1/4 e MIC3 aos micronemas. A proteína MIC1 é indispensável para que o complexo MICl/4/6 possa sair dos compartimentos precoces da via de secreção (REISS et al., J. Cell Biol. 152: 563-578, 2001).

Foi recentemente demonstrado que a proteína MIC3 de Toxoplasma gondii constitui um antigénio principal de vacinas,, suscitando uma resposta imunitária humoral precoce e muito forte (Pedido de PCT WO 01/64.243).

Com o objectivo de estudar o papel desempenhado pelas M1C1 e MIC3 na capacidade de invasão e na virulência do Toxoplasma gondii, os Inventores construíram estirpes mutantes de Γ. gondii, nas quais uma e outra, das adesinas MIC1 e MIC3, foram inactivadas.

Eles constataram que a inactivação de MIC1 diminui em cerca de 50 % a capacidade de invasão dos fibroblastos in vitro, enquanto que a da MIC3 não modifica essa capacidade de invasão; a inactivação em simultâneo das duas proteínas não modifica significativamente a capacidade 6 de invasão, em relação à inactivação apenas da MIC1. A virulência in vivo não resulta senão muito pouco afectada pela inactivação isolada de MIC1 e de MIC3; no entanto, ela é fortemente diminuída pela inactivação simultânea das duas proteínas.

Os Inventores constataram por outro lado que apesar da ausência dos antigénios principais que são MICl e MIC3, uma estirpe que é um mutante duplo de Toxoplasma çfondii na qual aquelas duas proteínas são inactivadas, permite que se obtenha uma protecção como vacina eficaz em relação à toxoplasmose.

Eles tomaram então a iniciativa de estudar as característícas infecciosas e protectoras da estirpe referida em relação ao animal, em especial em relação a murinos e a ovinos.

Eles conseguiram desta forma por em evidência que a vacinação com esta estirpe protege os animais contra a formação de quistos cerebrais durante uma re-infecção por uma estirpe selvagem patogénica de Toxoplasma gondíi; o que diminui consideravelmente o âmbito de uma infecçâo por essa estirpe selvagem patogénica, o risco de passagem transplacentar no caso de fêmeas em gestação, e a possibilidade de transmissão pelo consumo de carne dos animais vacinados, e portanto a termo permite fazer baixar a prevalência de geral da infecçâo. A invenção'presente tem portanto como objecto uma 7 estirpe mutante de um Apicomplexo da família dos Sarcocystidae, que inclua uma mutação que inactiva a adesina MXC1 e uma mutação que inactiva a adesina MIC3.

De acordo com um modo de concretização preferido da invenção presente, o Sarcocystidae referido é seleccionado de entré os Toxoplasma e os Neospora.

De acordo com uma particularidade preferida deste modo de concretização, a estirpe mutante referida é uma estirpe de Toxoplasma, nomeadamente de Toxoplasma gondii.

Neste documento, utilizam-se os seguintes entendimentos: - "mutação que inactive a adesina MIC1" é toda a mutação de que resulte na ausência da expressão de MIC1, ou na expressão de uma proteína MIC1 não funcional, o que significa incapaz de formar um complexo com as proteínas MI.C4 e MIC6, ou incapaz de se ligar à lactose. - "mutação que inactive a adesina MIC3" é toda a mutação de. que resulte na ausência da expressão de MIC1, ou na expressão de uma proteína MICl não funcional, o que significa que tenha perdido a sua função de ligação à superfície de uma célula hospedeira. São exemplos de mutações de que resulta uma 8 ausência da expressão de MICl ou de MIC3, nomeadamente a deleçâo da totalidade do gene. correspondente, ou da sua região codíficante, ou' da sua região promotora. São exemplos de mutações de que resulta a expressão de uma proteína MIC3 não funcional, nomeadamente as mutações que afectam a região do gene mic3 que codifica para o domínio do tipo:"domínio de ligação da proteína MIC3 à quitina", a saber os aminoácidos 84-144 da proteína referida. Pode nomeadamente tratar-se de mutações que afectam pelo menos o triptofano na posição 126 ou a fenilalanina na posição 128 da proteína MIC3.

Estas mutações podem ser efectuadas de uma maneira clássica por inserção, deleção, ou substituição de uma ou.mais bases, ao nível da sequência visada. A título- de exemplos não limitativos de técnicas de mutagénese e de transformação que são utilizáveis nos toxoplasmas, citar-se-ão nomeadamente aquelas que forma descritas nas publicações seguintes: KIM et al., (Science 262: 911-914, 1993); DONALD e ROOS, (Mol. Biochem. Parasitol. 63: 243-253, 1994); SOLDATI et al.r (Mol. Biochem. Parasitol. 74: 87-97, 1995); DONALD e ROOS, (Mol. Biochem. Parasitol. 91: 295-305, 1998). A invenção presente tem igualmente como objecto a utilização de uma estirpe mutante de Apicomplexos, e nomeadamente de toxoplasma, de acordo com a invenção, para a obtenção de uma vacina destinada a conferir uma imunidade protectora contra uma psrasitose por Apicomplexos, em 9 especial contra 1 toxoplasmose. A invenção presente tem também como objecto uma vacina caracterizada por incluir a titulo de principio activo uma estirpe mutante de Apicomplexos e nomeadamente de toxoplasma, de acordo com a invenção, tal como se definiu acima. A invenção presente será mais bem entendida recorrendo ao complemento de descrição que se seguirá, que se refere a exemplos de construção de mutantes de Toxoplasma gondii nos quais MIC1 e/ou MIC3 estão inactivados, e à utilização em vacinas de um mutante duplo no qual MIC1 e MIC3 estão inactivadas.

Deve no entanto entender-se claramente que estes exemplos são apresentados unicamente a: titulo de ilustração do objecto da invenção, da qual não constituem de modo algum uma limitação.

EXEMPLO 1 : INACTIVAÇÃO DE MIC1 E/OU DE MIC3 NO T. GONDII.

Plasmideos utilizados:

Os plasmideos pmic3K0-l e pmic3KO-2 foram utilizados respectivamente. para construir o mutante simples mic3K0 a partir da estirpe RHhxgprt- e o mutante duplo micl-3K0 a partir da estirpe miclKO. Os plasmideos pM3MIC3ty e pM2MIClmyc + pM3MIC3 foram utilizados - 10 respectivainente para restaurar a expressão de ' MIC3 no mutante mic3KO (estirpe mic3KO+MIC3) , e para restaurar a expressão de MICl e a de MIC3 no mutante duplo micl-3KQ (estirpe micl-3KO+MICl-3)

Plasmideo pmic3KO-l

Amplificou-se a região 3'UTR do gene Mic3 (2136 pb) por PCR a partir do plasmideo pBlueMIC3 (CEREDE et al., 2002, citado acima), que resulta da inserção de um fragmento de ADN genómico de 2247 pb (GenBank AJ 132530) de T. gondii no local Notl do plasmideo pBluescript II® SK (-) ·

Para a amplificação, utilizaram-se os iniciadores ML 9: 5T -GTGTAAGCTTCAGCGAGTCTCTGAGAG-3 ' (SEQ ID. NO: 1) e ML 10 : 5 ' -GGGGTACCGAGCTCATGAGCAGAAGCTGCCAG-3 ' (SEQ ID NO: 2) . A zona amplificada foi clonada entre os locais de restrição HindIII e Kpnl do plasmideo pminiHXGPRT (DONALD e ROOS, 1998, citado acima). Obteve-se um fragmento de ADN de 1977 pb da' região 5'UTR de Mic3 por digestão Xbal/Nhel de um fragmento EcoRI de 3,5 kb da sequência génomica em 5' de Mic3, e clonou-se no local Xbal de pminiHXGPRT. 0 plasmideo resultante, que contém o marcador de selecção HXGPRT (hipoxantina-xantina-guanina fosfo-ribosil transferase), enquadrado pelas regiões que flanqueiam em 3' e em 51 o ORF de mic3, foi denominado pmic3KO-l.

Plasmideo pmic3KO-2 11

As regiões 3'UTR e 5'UTR de mic3, obtidas como se descreveu acima neste documento, . foram inseridas no plasmídeo pTUB/CAT (KIM et al. , 1993, citado acima) , de um lado e do outro da sequência codificando para o marcador de selecção cloranfenicol acetil transferase (CAT), nos mesmos locais de restrição que os que se descreveram para o plasmídeo pmniHXGPRT. . 0 plasmídeo resultante, contendo o marcador de selecção CAT, enquadrado pelas regiões que flanqueiam em 3' e em 5' o ORF de mic3, foi denominado pmic3KO-2.

Plasmídeo pM3MIC3ty

Este plasmídeo foi construído a partir do plasmídeo pT8GFPPfmyoAtail (HETMANN et al., Mol- Biol. Cell 11: 1385-1400, 2000), ao qual foi adicionado um epítopo TY (BASTIN et al., Mol. .Biochem. Parasitol. 77(2): 235-239, 1996) entre os locais Nsil e Pacl. Este plasmídeo contém o promotor da tubulina entre os locais Kpnl e EcoRI, e o gene que codifica para a GFP rodeado pelos locais EcoRI e Nsil. A região do promotor de Mlc3 (562 pb) ' foi amplificada por.PCR a partir do plasmídeo pBlueMIC3 com os iniciadores ML23: 5'-CTGAATTCAGATCTTACCAGTGTTGGACAAGG-3' (SEQ ID NO: 3) e ML24; 5T-GGGGTACCCCTTGCTAGGTAACCACTCGTGC-3' (SEQ ID NO: 4), e inserida em. vez do promotor da tubulina nos locais Kpnl e EcoRI. 0 iniciador ML24 permite introduzir um local de 12 restrição BglII a montante do local EcoRI e clonar em seguida o gene Mic3 em vez do gene que codifica para a GFP nos locais BglII e Nsil. A sequência que codifica para MIC3 foi amplificada por PCR a partir do plasmideo pBlueMIC3 com os iniciadores ML1'1: 5 ' -GCACAATTGAGATCTAAAATGCGAGGCGGGACGTCC-3’ (SEQ ID NO: 5) e ML15: 5'~ TGCTATGCATTCCTAGGCTGCTTAATTTTCTCACACGTCAC-3' (SEQ ID NO: 6) introduzindo respectivamente os locais de restrição BglII é Nsil.

Plasmídeos pM2MIClmyc e pM3MIC3 O plasmideo pM2MIClmyc (REISS et al., J. Cell Biol. 152: 563-578, 2001) exprime a proteína MIC1, etiquetada com o epítopo myc na sua extremidade terminal C, sob o controlo das sequências de flanqueio em 5' e em 31 do gene Mic2. O plasmideo pM3MIC3 foi construído por clonagem de um fragmento Pvul/SacI de 2072 pb do vector pBlueMIC3, contendo o. gene Mic3. e as suas regiões flanqueantes em 5' e em 3', entre os locais Saci e PacI do ve.ctor pT/230-TUB5/BLE (SOLDATI èt al.r Mol. Biochem. Parasitol. 74: 87-97, 1995) contendo um cartucho de expressão que expressa o marcador de selecção com fleomicína.

Construção das estirpes mutantes mic3KO e micl-3KO, e das estirpes mutantes complementadas mic3KO+MIC3, e mxcl-3KO+MICl-3 13 A haploidia do genoma dos Apicomplexos na sua fase proliferativa permite invalidar' o gene Mic3, numa única . recombinação homóloga.

Todos os T. gondii utilizados foram produzidos em fibroblastos humanos (HFF) cultivados em meio' mínimo da Dulbecco (DMEM) suplementado com 1Q % de soro fetal de vitelo (FCS) , glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina e 50 g/mL de estreptomicina. Eles foram recolhidos aquando da lise das células hospedeiras.

Estirpe mic3KQ A estirpe de T. gondii utilizada para a mutagénese foi a estirpe RHhxgprf (DONALD e ROOS, 1998, citado acima) , deficiente no que toca ao gene de hipoxantina-xantina-guanina fosfo-ribosil transferase (HXGPRT), e por essa razão sensível ao ácido micofenólico.

Adicionam-se 80-100 μg de plasmídeo pmic3K0-l purificado e depois linearizado por Kpnl a 107 taquizôitos RHhxgprt” suspensos em meio de electroporação CYTOMIX {VAN DEN HOFF et al.r Nucleic Acids Res. 20: 2902, 1992), ê leva-se a cabo a electroporação num recipiente com uma abertura de 4 mm, com um volume de 800 μ1, num aparelho BTX Electrocell Manipulator {Parâmetros: 2 kV, R=48 ohm).

Depois da electroporação, depositam-se os taquizôitos sobre uma monocamada de células HFF em cultura. Para a selecção dos mutantes, no dia seguinte ao da 14 electroporação, suplementa-se o meio de cultura com o agente de selecção (25 μρ/ηΐ, de ácido micofenólico e 50 μg/mL de xantina), e levam-se· â cabo neste meio três passagens em cultura.

Cinco dias depois da última passagem, clonam-se os parasitas por diluição limite num poço de uma placa com 96 poços, de células HFF, na presença de agente de selecção, e amplificam-se os clones retidos.

Estirpe micl-3KO A estirpe de T. gancHi utilizada para a mutagénese é a estirpe miclKO (REISS et al., J. Cell Biol. 152: 563-578, 2001) que deriva da estirpe RHhxgprt" descrita acima neste documento por deleção do gene Micl que é substituído pelo gene que codifica para a HXGPRT na estirpe miclKO.

Adicionam-se 80-100 μρ de plasmídeo pmic3KO-l purificado e depois linearizado por Kpnl a 107 taquizóitos miclKO para uma electroporação nas condições descritas acima.

Os mutantes foram seleccionados e 'clonados tal como acima, na presença de cloranfenicol 20 μΜ a título de agente de selecção.

Os mutantes nos quais MIC3 foi inactivado são designados mic3KO, e aqueles em que MIC1 e MIC3 foram 15 inactivados são designados micl-3K0.

Estirpe mic3KO+MIC3 A expressão de MIC3 foi restaurada por co-transfecção dos parasitas mic3K0 com 100 μg do vector pM3MIC3ty, e 10 μg do plasmideo pTUB/CAT. A selecção foi efectuada na .presença de cloranfenicol 20 μΜ tal como se descreveu acima. A estirpe mic3KO complementada com MIC3 é denominada mic3KO+MlC3.

Estirpe micl-3KO+MICl-3 A expressão de MIC1 e de MIC3 foi restaurada por co-transfeçção dos parasitas micl-3KO com 100 μg do vector pM2MIClmyc, e 10 pg do plasmideo pM3MIC3.

Seleccionaram-se' Os mutantes e clonaram-se tal como se descreveu acima, na presença de 10 . μg/mL de fleomicina a titulo de agente de selecção. A estirpe micl-3K0 complementada com MICl e com MIC3 é denominada micl-3KO+MICl-3.

Analisaram-se as proteínas totais dos mutantes mic3KO, micl-3KO, mic3KO+MIC3, e micl-3KO+MICl-3 por electrofotese SDS-PAGE e por transferência de Western. 16

Depois de se extraírem as proteínas totais por ebulição das células em tampão SDS (na presença ou não de DTT 0,1 M) e de se separarem sobre géis de poliacrilamida a 10%, as proteínas são transferidas sobre membrana de nitrocelulose. As transferências de Western foram, marcadas tal como descrito por GARCIA-REGCJET ét al. (1998, citado acima) com a ajuda de anticorpos monoclonais anti-MIC3 (T42F3 a 1:400) e anti-MICl (T101F7) e foram detectados por IgG de cabra antí-murino conjugados com fosfatase alcalina (a 1:1000). Os Resultados são apresentados na Figura 1..

Legenda da,Figura 1:

1 = estirpe selvagem de Toxoplasma gondii RH

2 = mutante mic3KO 3 = mutante mic3KO+MIC3 4 = mutante miclKO (REISS et ai.:, 2001). 5= mutante miclKO+MICl (REISS et al., 2001)

6 = mutante micl-3KO 7 = mutante micl-3KO+MICl-3

Os Resultados mostram que a expressão de MIC3 não é detectável na mic3KO (2) e na micl-3R0 . (6), mas está restaurada na mic3KO+MIC3 (3) e na micl-3KO+MICl-3 (7) . A expressão de MICl não é detectável na miclKO (4) e na micl-3KO (6) mas está. restaurada na miclKO+MICl (5) e na micl-3KO+MIC1-3 (7).

Estes resultados foram confirmados por imunofluorescência. Cultivam-se taquizóitos sobre uma 17 monocamada de células HFF de um dia para o outro, lavam-se com PBS, e fixam-se pelo formaldeído â 4 % durante 20 minutos. Ao fim de 3 lavagens, as células HFF infectadas foram permeabilizadas com 0,1 % de Triton X-100, em PBS durante 10 minutos,· cessou-se a reacção adicionando soro fetal bovino (FBS) a 10 % à mistura durante 30 minutos, e em seguida incubam-se as células com o anticorpo primário (mAb anti-MICl T101F7, mAb anti-MIC3 T42F3) diluído' em FBS a 2 % durante' 40 minutos, lavam-se e em .seguida incubam-se com um anticorpo secundário (cabra anti-murino acoplado ao FITC, e vermelho do Texas cabra anti-coelho) . As observações foram realizadas num microscópio .Leica. DMRA2 equipado para a epifluorescência, e as imagens foram obtidas com uma câmara Prínceton cooISNAP CCD.

Os resultados mostram que nenhuma proteína MIC3 é detectável nos taquizóitos mic3KO, enquanto numa estirpe selvagem a expressão de MIC3 é observada nos micronemas das estirpes complementadas (mic3KO+MIC3, micl-3KO+MICl-3). A complementação de MIC1 a míclKO+MICl e a micl-3KO+MICl-3 conduz a uma determinada acumulação de MIC1 no vacúolo parasitóforo e no espaço perinuclear.

EXEMPLO 2 : EFEITOS DA INACTIVAÇÃO DE MICl E/OU DE MIC3 SOBRE AS PROPRIEDADES INFECCIOSAS DE T. GONDII

Mantiveram-se os mutantes de Toxoplasma gondii descritos no exemplo 1 acima com passagens regulares sobre células HFF cultivadas em meio DMEM suplementado com 10 % de soro fetal bovino (FCS), com glutamina 2 mM, com 50 U/mL 18 de penicilina e com 50 pg/mL de estreptomicina.

Capacidade de invasão

Adicionam-se 2xl05 taquizóitos purificados de miclKO, miclKO+MICl, mic3K0 e micl-3KO a células HFF cultivadas sobre lamelas em vidro. As células foram fixadas durante 12 h e depois coradas utilizando uma mistura de azul de metileno com eosina (estojo RAL 555), e montadas sob lamelas, de modo permanente (PERTEX, Microm, França). Contou-se o número de vacúolos parasitários, representando a capacidade de invasão do parasita, em 10 campos seleccionados de forma aleatória em cada lamela, e apresentaram-se os dados obtidos sob a forma da média de vacúolos por campo que provinham de 4 lamelas, na base de 5 repetições independentes.

Levou-se a cabo o controlo nas mesmas condições utilizando a estirpe RHhxgprt", cuja capacidade de invasão é comparável à da estirpe selvagem RH de Toxoplasma gondii.

Apresentam-se os Resultados na Figura 2(*** = invasão significativamente inferior, p < 0,001).

Os resultados mostram que a capacidade de invasão dos parasitas miclKO é diminuída de cerca de 50 % em relação à da estirpe de controlo RHhxgprf".

Em contrapartida, a capacidade de invasão dos parasitas mic3K0 e dos parasitas da estirpe de controlo é 19 comparável (Figura 2A) . A capacidade de invasão dos parasitas micl-3K0 não difere significativamente da dos mutantes miclKO (Figura 2A}, indicando que MIC1 e MIC3 não possuem uma função aditiva na invasão dos fibroblastos por Toxoplasma gondii·. Ά complementação de miclKO com MIC1 restaura a capacidade de invasão a um nível comparável com o observado na estirpe de controlo (Figura 2B).

Virulência

Em geral os murganhos morrem 9 dias depois de uma infecção por via intraperitoneal com 20 taquizóitos da estirpe selvagem RH de Toxoplasma gondii. 0 estudo da virulência dos mutantes miclKO, mic3K0, micl-3KO, miclKO+MICl, mic3KO+MIC3 e micl-3KO+MICl-3 foi levado a cabo sobre um lote de 10 murganhos machos OFl por injecção intraperitoneal de 20 taquizóitos/murganho, da estirpe micl-3KO, e monitorizando-se os murganhos infectados. à da

Levaram-se a cabo controlos nas mesmas condições, sobre um lote de 9 murganhos machos OFl, utilizando a estirpe RHhxgprt-, cuja virulência é comparável estirpe selvagem RH de Toxoplasma gondii.

Representam-se os Resultados na Figura 3. 20

Legenda das. Figuras 3A, 3B e 3C: ♦ = estirpe miclKO (A);, estirpe mic3KO (B); estirpe micl-3KO (C) £1. = estirpe miclKO+MICl (A) ; estirpe mic3KO+MIC3; estirpe micl-3KO+MICl-3 (C); Δ = estirpe RHhxgprt” (A, B e C)

Todos os murganhos infectados pela estirpe RHhxgprt” estão mortos 9 dias depois . da . infecção. Os murganhos infectados com miclKO ou com mic3KO apresentam um ligeiro atraso da mortalidade (morte dos murganhos entre 9 e 22 dias após a infecção), que não se observa no caso dos murganhos infectados com os mutantes complementados miclRO+MICl e mic3KO+MIC3. Só um dos murganhos infectados com mic3KO continuava vivo passados 4 4 dias da infecção, e este animal desenvolveu uma resposta ' a anticorpos específica contra T. gondii (resultados não apresentados) .. Estes Resultados indicam que a inactivação isolada dos genes Mi cl ou Mic3 não leva senão a uma ligeira diminuição da virulência em relação a murganhos.

Em . contrapartida, no caso dos murganhos infectados com a estirpe. micl-3KO, observa-se uma. sobrevivência quase total (90 % de sobrevivência passados 40 dias da infecção). A complementação de micl-3KO com MIC1 e com MIC3 (estirpe micl-3KO+MICl-3) restaura por completo a virulência dos parasitas.

Também se infectaram os murganhos com quantidades - 21 - diversas do mutante duplo micl-3K0, e a dose letal (DLioo) de micl-3KO foi comparada com a da estirpe de controlo RHhxgprt". Enquanto a DLioo a 9- dias para a estirpe de controlo.é inferior a 20 taguizóitos,.a da estirpe micl-3KO é da ordem de 2xl03 taquizóitos.

EXEMPLO 3: IMPLICAÇÃO DA FUNÇÃO DE ADESÃO DE MIC3 NA VIRULÊNCIA DE TOXOPLASMA GONDII

Determinação de resíduos implicados na função de adesão de MIC3

Havia sido demonstrado (CEREDE et al., 2002, citado acima) que o domínio do tipo dos domínios de ligação à quitina, de. MIC3, era essencial para a ligação à superfície da célula hospedeira. ,

Introduziram-se diversas mutações neste domínio, para se determinar quais os resíduos essenciais para a-funcionalidade de MIC3.

As mutações que se levaram a cabo foram as seguintes: substituição de um dos resíduos de cisteína nas posições 102 (mutante' C102G) , 107 (mutante C107G)t 108 (mutante C108G), por um resíduo de glicina; substituição do resíduo de prolina na 22 posição 103 por um resíduo de alanina (mutante P 103A); substituição de um dos resíduos de serina nas posições 109 (mutante S109A) e 130 (mutante S130A) por um resíduo de, alanina; substituição de um dos resíduos de tirosina nas posições 96 (mutante Y96A), 135 (mutante Y135A)·, . e 141 (mutante Ύ141Α) , por um resíduo de alanina; - substituição de Um dos resíduos de . fenilalanina nas posições 97 (mutante F97A), ' 121 (mutante F121A), e 128 (mutante F128A) , por um resíduo de alanina; - substituição do resíduo de . triptofano na posição 126 por' um resíduo de alanina (mutante W126A). .

As posições das . mutações estão indicadas por referência à sequência polipeptídica do precursor de MIC3 (Genbank CAB56644).

As mutações foram efectuadas por mutagénese dirigida por PCR (Quiçkchange RO, Stratagène), da sequência codificando para a· forma, madura de MIC3, contida no plasmídeo pOC2 (CEREDE et al., 2002, citado acima). 23

Os plasmideos obtidos são respectivamente denominados pC102 (mutante C102G), pC107 (mutante CÍ07G), pC108 (mutante C108G),.. pPlQ3 (mutante P103A), pS109 (mutante S109A), pS130 (mutante Ξ130Α), pY96 (mutante Y96A), pF97 (mutante F97A), pF121 (mutante F121A), pW126 (mutante W126A), pFl28 (mutante F128A), pY135 (mutante Y135A), e pYl41 (mutante Y141A).

Os plasmideos foram purificados utilizando o estojo Qiagen kit® (Qiagen),. e a presença das mutações esperadas foi verificada por sequenciação.

As proteínas MIC3 mutantes .foram expressas por transfecção de células BHK-21 (Rim de Hamster Bebé, ATCC CCL-10) cultivadas em meio BHK>21 (Gibco-BRL) suplementado qom soro fetal de bovino (FCS) a 5 %, 2 mM em triptose, com 100 U/mL de penicilina e com 100 μρ/ιτιΐ de estreptomicina.

Para cada plasmídeo, transfectarara-se 3xl05 células BHK-21 previamente cultivadas sobre lamelas em vidro durante 24 . h em placas de 24 poços, com o plasmídeo purificado, utilizando Lipofectamina®, de acordo com as condições preconizadas. pelo fabricante (Gibco-BRL). Cultivaram-se as células durante mais 24 h antes da análise.

Estudaram-se as propriedades- de ligação das proteínas MIC3 mutantes analisando a sua localização, nas células BHK-21 transfectadas. Fixaram-se as células BHK-21 transfectadas com formaldeído' a 3 % em PBS durante 15 24 minutos, e depois lavaram-se e permeabilizaram-se com Triton X-100 a 0,1 % em PBS durante 10 minutos. Lavaram-se em seguida as lamelas sobre as quais se encontravam as células com PBS contendo 0,5 % de SAB, e incubaram-se durante 1 h no mesmo tampão que continha um anticorpo anti-MIC3 (T82C10, a 1:200) ou anti-V5 (a 1:500), e depois durante 1 h com um IgG de cabra conjugado Com TRITC (Sigma, a 1:400), com diversas lavagem com PBS entre cada incubação. Lavaram-se, em seguida as lamelas e montaram-se sobre lâminas de .· microscópio. Levou-se a cabo a visualização por intermédio de um microscópio de fluorescência.

Definiram-se quatro categorias de mutantes de acordo com a sua localização.

Na primeira categoria (mutantes C102G, C107G, C108G, Y141A, F121A), a proteína está retida no sistema secretor; na segunda categoria (Y135A, Y96A, F97A, S109A, P103A) a proteína está normalmente segregada e liga-se à superfície das células transfectadas, tal como o faz a proteína MIC3 madura do tipo selvagem; . na terceira categoria, (W126A, Y128A) a proteína é segregada normalmente mas não se liga à superfície das células transfectadas; na quarta categoria (S130A), a proteína é normalmente segregada e liga-se a uma rede de material celular deposto pelas células à superfície das placas de vidro.

Estes resultados mostram que todas as mutações 25 que afectam um resíduo de cisteina levam a um defeito importante na secreção; as proteínas MIC3 mutantes correspondentes acumulam-se sob a forma de vesículas grandes- perinucleares,· indicando que essas proteínas são mal replicadas, ou foram' assembladas de modo incompleto. Este resultado é coerente com o papel das cisteínas na dobragem do domínio.

No que toca às outras substituições, as duas mutações F121A e Y141A afectam igualmente a saída das proteínas. Os outros mutantes (Y135A, Y96A, F9.7A, S109A, P103A, W126A, F128A,. S130A) são todos eles expressos sob a forma de dímeros e são segregados. Dois dentre eles (W126A, Y128A) não se ligam às células BHK-21 transfectadas.. Atento o facto de haverem perdido.· esta propriedade de ligação, estes dois mutantes são segregados abundantemente para o sobrenadante. No caso do mutante S130A, a marcação com os anticorpos anti-MIC3 não se associa à membrana plasmática da célula,transfectada, como no caso da proteína MIC3 de tipo selvagem, mas sim com o espaço intercelular, como se a proteína R-MIC3 S130A estivesse ligada ao material celular deposto sobre as placas.

Estes resultados mostram que os dois resíduos aromáticos W126 e Y128 estão implicados na interacção com o receptor da superfície da célula hospedeira, e que o resíduo S 130 poderá· igualmente contribuir para as propriedades de ligação de MIC3 por participar na especificidade da interacção. 26

Implicação dos resíduos W126 θ Y128 na virulência de T. gondii

Para estudar o papel da função de adesão de MIC3 na virulência de T. cfondiif levaram-se a cabo experiências de complementação da estirpe dupla mutante micl-3K0 com os mutantes W126A e F128A.

Os plasmídeos p'M3MIC3Wl2 6A, pM3MIC3F128A, e pM3MIC3Y135A, foram construídos a· partir do plasmideo pM3MIC3. Estes plasmídeos contêm o gene. de selecção de fleomicina, e expressam respectivamente'os mutantes W126A, F128A, e Y135A. A presença das mutações esperadas foi verificada por sequenciação. A estirpe micl-3K0 foi transfectada com os plasmídeos pM3MIC3W126A (estirpe micl-3KO+MIC3W126A) ou pM3MIC3Fl28A (estirpe micl-3KO+MIC3F128A). A título de controlos positivos de ligação utilizaram-se a estirpe micl-3KO+MIC3 e a estirpe micl-3K0 transfectada com o plasmideo pM3MIC3Y135A (micl-3K0+MIC3Y135A). A expressão das proteínas MIC3 nas diferentes estirpes foi analisada por transferência de Western, e as suas propriedades de ligação forma analisadas por transferência de células. Levou-se a cabo a transferência de células com uma cópia da folha de nitrocelulose utilizada para a transferência de Western, incubada com uma suspensão de células Mode-K (VIDAL et al., J. Immunol. Methods 166: 63-73, 1993) cultivadas em meio RPMI (Bio 27

Whittaker) suplementado com 5 % de soro fetal de vitelo (FCS), com Hepes 25 mM, com glutamina 2 mM, com 100 U/rnL de penicilina e com 100 μς/ιτιΕ de estreptomicina.

Os Resultados estão apresentados nas Figuras 4A (transferência de Western) e 4B (transferência de células).

Legende das Figuras 4A e 4B:

1 = estirpe selvagem de. Toxoplasma gondií RH 2 = estirpe micl-3KO+MIC3 ' 3 = estirpe micl“3KO+MIC3W126A. 4 = estirpe micl“3KO+MIC3F12SA'

5 = estirpe micl-3KO+MIC3Y135A

Os Resultados da transferência de Western mostram a expressão de proteínas MIC3 em todas as estirpes. Toas estas proteínas migram à dimensão que é. de esperar para um dímero, em condições redutoras. No entanto, as proteínas W126A e Y135A migraram mais depressa do que as outras, o que sugere terem sofrido uma alteração conformacional.

Os resultados da transferência de células mostram que, tal como era de esperar, as células se ligam fortemente à MIÇ3 nativa (1), à MIC3myc (2), e à MIC3 Y135A (5). Em contrapartida, as células são incapazes de se ligar à MIC3 W126A (3) e à MIC3 F128A (4) . Por outro lado, a modificação da conformação de MIC3 Y135A não afecta as suas propriedades de ligação. 28

As estirpes micl-3KO+MIC3W126A, micl- 3KO+MIC3F128A, e a titulo de controlo, micl-3KO+MIC3Yl35A, foram utilizadas para analisar a implicação da função de adesão de MIC3 na virulência em relação ao murganho.

Análise da virulência das estirpes

Levou-se a cabo o teste de virulência tal como se descreveu no' exemplo 2: 20 taquizóitos de cada parasita foram injectados por via iritraperitoneal em murganhos machos OF 1 (lote de 11 a 20 murganhos) cuja sobrevivência foi monitorizada durante 40 dias. Os resultados estão apresentados na Figura 5.

Legenda da Figura 5:

♦ = estirpe micl-3KON Δ. = estirpe miclKO Δ = estirpe micl-3KO+MIC3o 0 = estirpe micl-3K0+MIC3Y135A + = estirpe micl-3KO+MIC3Fl28A x = estirpe micl-3KO+MIC3W126A

Tal como se esperava, os murganhos infectados com micl-3KO+MIC3 comportam-se do mesmo modo como os murganhos infectados com miclKO, e morrem de acordo com uma cinética semelhante em 9 a 26 dias. A sobrevivência dos murganhos infectados pela estirpe micl-3KO+MIC3Y135A é superior (o que se pode dever a que a proteína MIC3 Y135A nos vacúolos parasitóforos esteja parcial e estereoquimicamente impedida 29 de actuar).

Por outro lado observa-se, ' 40 dias após a infecçâo, uma sobrevivência de respeçtivamente 83,3 % e 95 % dos' murganhos infectados com a estirpe micl-3KO+MIC3W126A e dos infectados com a micl-3KO+MIC3F128A. .Estes resultados mostram que a função de ligação de MIC3 às células hospedeiras ê essencial para a virulência do parasita.

EXEMPLO 4: VACINAÇÃO DO MURGANHO COM O MUTANTE

MIC1-3KO

Protocolo experimental

Trataram-se como se segue lotes de murganhos machos OFl com.9,5 semanas de idade: 21 murganhos (lote 1) receberam o mutante micl-3KO ; ' - 21' murganhos (lote 2) receberam o mutante micl-3KO e foram depois infectados de novo passado cerca de 1 mês com a estirpe de Toxoplasma gondii quistogénica76 K; - 10 murganhos (lote 3) foram infectados com a estirpe de Toxoplasma gondii quistogénica 76 K' na mesma altura em que esta. foi utilizada para infectar o lote 2. 30

No dia 0, os murganhos dos lotes 1 e 2 receberam 20 taquizóitos do mutante micl-3K0 por via intraperitoneal.

No dia 14, controlou-se a infecção nos murganhos pesquisando-se a presença de IgG anti-TQXopla$ma gondii, recorrendo a um extracto total de toxoplasma (estirpe RH) .

No dia 37, alimentaram-ge forçadamente os murganhos efectivamente imunizados (presença de IgG anti-toxoplasmas) do lote 2 (8 murganhos), e os do lote 3 (8 murganhos) com 70 quistos da estirpe de Toxoplasma gondii 76K.

No dia 61, sacrificaram-se os murganhos dos três lotes. Procurou-se a presença de IgG anti-MIC3, devido à infecção com Toxoplasma gondii 7 6K, (uma vez que- a estirpe da vacina mícl-3K0 não expressa esta proteína) e levou-se. a cabo uma contagem dos quistos cerebrais nos cérebros entretanto homogeneizados destes murganhos (contagem sobre Uma célula de Malassez; o limite de detecção é' de 3,0 quistos por cérebro).

Alimentaram-se 8 murganhos machos OF 1 não antes testados, com 15 semanas de idade, com 1/3 do cérebro de cada um dos 8 murganhos do lote 2 (controlo da ausência de parasitas cerebrais).

Um murganho de. controlo recebeu 60 quistos da estirpe de Toxoplasma gondii 76K, provenientes de um murganho do lote 3 (controlo positivo). 31

No dia 82, pesquisou-se a presença 'dê IgG anti-MIC3 nos murganhos submetidos a alimentação forçada no dia 61.

No dia 103, sacrificaram-se os murganhos e levou-se a cabo uma contagem dos quistos cerebrais.

Resultados

No dia 14

Dos 42 murganhos dos lotes 1 e 2, 8 morreram por volta do dia 10, na fase aguda da infecção (o que reflecte a sensibilidade elevada dos murganhos à virulência residual dò mutante MIC1-3KO).-"O. controlo da infecção através da detecção dos IgG dirigidos contra os antigénios dos parasitas mostra que 16 murganhos eram negativos.e portanto não tinham sido infectados. Os lotes 1 e 2 ficaram portanto respectivamente reduzidos a' 10 e a 8 murganhos.

No dia 61

Pesquisa de IgG anti-MIC3 Não se detectou nenhum IgG antí-MIC3 no soro dos murganhos do lote 1 (controlo negativo), enquanto que a presença de IgG anti-MIC3 foi detectada no soro dòs murganhos do lote 3 (controlo positivo). Detectou-se a γ · . presença de IgG anti-MIC3 no soro dos murganhos do lote 2, com excepção de um murganho que apenas apresentava uma 32 resposta muito fraca.

Contagem de quistos cerebrais

No exame ao microscópio, os cérebros dos murganhos do lote 1 não contêm quistos cerebrais {controlo negativo), enquanto que os cérebros dos murganhos do lote 3 contêm entre 2.250 e 7.250 quistos/cérebro, ou seja, em média, 4037 quistos/cérebro (controlo positivo). Nos murganhos do lote 2, 7 murganhos não contêm . quistos cerebrais e um murganho contém 30 quistos cerebrais (ou seja um quisto apenas observado' em 16 contagens de 10 μΐι numa célula de Malassez).

No dia 82

Os murganhos neófitos a que se forneeeram por alimentação forçada os cérebros dos murganhos do lote 2 apresentam IgG anti-MIC3. Q murganho de controlo à qual haviam sido administrados 60 quistos da estirpe de Toxoplasma gondii 76K provenientes de um murganho do lote 3 apresenta igualmente IgG anti-MIC3.

No dia 103

Os murganhos neófitos a que se forneceram por alimentação forçada os cérebros dos murganhos do lote 2 apresentam respectivamente 500, 375, 1000, 250, 165, 125, 310 e 375 quistos cerebrais. A titulo de comparação, o murganho de controlo que recebeu 60 quistos da estirpe de Toxoplasma gondii 76K provenientes de um murganho do lote 3 33 - apresenta 2250 quistos cerebrais.

Conclusão

Os.murganhos imunizados pelo mutante micl-3K0 não formam praticamente quistos cerebrais quando se pratica uma nova infecção com a estirpe de Toxoplasma gondii 76K (protecção de 99,9%).

Pelo contrário, diversos cérebros dos murganhos infectados de novo são infecciosos por via· oral, e portanto a: imunização pela. a estirpe da vacina, itlíc1-3K0, não é completamente esterilizante no caso de uma nova infecção.

EXEMPLO 5: VACINAÇÃO DE OVELHAS PELO MUTANTE

MIC1-3KO

Animais 0 estatuto de imunidade em relação à toxoplasmose foi determinado em mais de setenta ovelhas da raça pré-alpes do sul. Só se mantiveram em experimentação trinta e seis ovelhas devido à sua seronegatividade em relação à toxoplasmose.

Mantêm-se as ovelhas durante toda a experiência num ovil estanque nas instalações do INRA de Nouzílly (Indre-et-Loire) para limitar tanto quanto possível os riscos de contaminação natural. Só o pessoal de tratamento do gado e os experimentadores,. equipados com vestimentas 34 que pertencem ao ovil, é que podem penetrar no interior das edificações, para se evitar a contaminação do meio, e só se ausentam da zona estanque depois de se haverem submetido a um chuveiro.

Os utensílios utilizados e o material biológico não saem senão depois de terem passado por um banho desinfectante, e o efluente é incinerado.

Depois da vacinação, as ovelhas são colocadas em gestação pelo método natural depois de se terem sincronizado os cios por intermédio de esponjas impregnadas com hormonas, que se colocaram nas vaginas das ovelhas.

Estirpes de T. gondxl:

Estirpe EH A produção de extracto total, de parasitas (ET) é feita a partir da estirpe virulenta RH (do tipo I). Esta estirpe é mantida por passagens sucessivas em murganhos 0F1 fêmeas por injecção intraperitoneal de 106 taquizóitos. Três dias mais tarde, sacrificam-se os murganhos e recuperam-se os taquizóitos por lavagem da cavidade intraperitoneal com 5 mL do meio RPMI. Uma numeração dos taquizóitos é levada a cabo sobre uma célula de Malassez, voltam a injectar-se 106 taquizóitos por via intraperitoneal a murganhos sãos para se manter a estirpe.

Para a preparação do extracto total de parasita, 35 os taquizóitos da estirpe RH são lavados, sonicados a 60 watt/s, três vezes ao longo de 10 minutos, e centrifugados a 2000 g durante 30 minutos a 4°C. Concentra-se o sobrenadante e distribui-se em alíquotas. Determina-se a concentração utilizando um estojo de doseamento (Micro BGA) que utiliza como padrão a BSA (Bovine Serum Albumin). Conservam-se as alíquotas a -20°C.

Estirpe da vacina Micl-K30

Obteve-se a estirpe Micl-3KO tal como no Exemplo 1 acima. Mantém-se a estirpe por passagens sucessivas sobre uma linhagem de ' fibroblastos de prepúcio humano (HFF) cultivados em meio IMDM ao- qual se adiciona soro.fetal de vitelo a 10 %, que se torna 50 mM em glutamato, 50 mM em penicilina e 50 mM em estreptomicina .·

Estirpe de teste PRU A infecção das ovelhas a meio da gestação é levada a cabo com 400 oocistos da estirpe PRU do tipo II (estirpe Prugniaud) produzidos a partir de fezes purificadas de gatos infectados.

Protocolo experimental

Vacinação Dívidem-se as trinta e seis ovelhas seronegativas em três lotes de doze ovelhas: 36 - lote testemunho - lote que recebe 105 taquizóitos Micl-3KO, denominado "lote a dose fraca" (KOFA) - lote que recebe 2x106 taquizóitos Micl-3KQ, denominado "lote a dose forte" (KOFO) A vacinação destas ovelhas foi levada a cabo por via subcutânea.

Registos de temperatura

Depois da imunização, mediu-se diariamente a temperatura rectal dos animais todas as manhãs, até que elá voltasse- a estabilizar-se a valores fisiológicos. .A temperatura fisiológica na ovelha é de 38,5°C. Para levar em conta a actividade dosanimais e o estresse engendrado pelas manipulações, considera-se que existe hipertermia a partir de uma temperatura de 40,0oC..

Estudo da resposta humoral A resposta imunitária humoral foi estudada avaliando por ELISA a cinética de aparecimento dos IgG especificamente anti-T. gondii no soro.

Obtenção dos soros

Obtêm-se amostras de soro antes da imunização 37 (dia 0) e em seguida nos dias 24, 39, 98, e 134 após a vacinação.

Retira-se o sangue ao nivel da veia jugular e mantém-se o sangue obtido (sem anticoagulante) de um dia para o outro a +4°C para permitir que se forme o coágulo. Recupera-se o soro centrifugando as amostras a 1.500 rpm durante 5 minutos a +20°C. Recupera-se o sobrenadante e distribui-se em aliquotas que constituem amostras de 3 mL que se conservam a -20°C

Teste ELISA

Utiliza-se.o extracto total da estirpe RH de T. gondíi, obtido tal como se descreveu'acima neste documento, para sensibilizar os poços com fundo chato dè. placas de microtitulação (Nunc) . Deposita-se em cada poço 100 μύ de extracto (com uma concentração de 10 μg/InL em tampão carbonato 50 mM e a pH = 9,6) . Passada uma noite a +4°C, são efectuadas três lavagens com tampão PBS adicionado de 0,05 % de Tween-20 (PBS-T) , recorrendo a uma máquina de lavar automática (MultiWash Advantage).

Os locais não específicos são saturados por incubação das placas durante 1 h 37°C atmosfera húmida) com PBS contendo 4 % de BSA.

Depositam-se 100 μΐ de cada amostra de soro diluído em PBS-T (diluições a 1/50 e a 1/100), e incuba-se durante lha 37°C. 3.8

Depois de duas séries de três lavagens, deposita-se 100 μΐ, de anti-IgG de carneiro acoplado a fosfatase alcalina (PAL; Sigma)., diluída a 1/5000 em PBS-T, e incuba-se durante hora e meia a 37°C. Levam-se a cabo mais duas séries de três lavagens e revela-se utilizando' 100 pL de paranitrofenilfosfato (PNPP) a 1 mg/mL em DEA-HCl.

Faz-se a leitura ao fim de 10 a 20 minutos, de incubação, num leitor de . placas (contador Wallac 1420 Multilabel) ao comprimento de onda λ = 405 nm.

Determinou-se o limiar de positividade em função dos valores da absorvância (DO) das ovelhas do lote testemunho: fixou-se a um valor de DO de 0,35 para uma diluição de soro a 1/100.

Infecção

As . ovelhas foram colocadas em reprodução dois meses depois de terem sido vacinadas. A meio da gestação, levou-se a cabo a infecção. .das ovelhas em gestação por alimentação forçada de 400 oocistos da estirpe PRU. Diirante os dias que se seguiram à infecção, mediu-se quõtidianamente a temperatura rectal, até se observar que ela voltara aos valores fisiológicos, e avaliou-se a resposta imunitária humoral e celular tal como se descreveu acima.

Por último, registaram-se os abortos .febris e infecciosos quando as ovelhas pariram. 39

RESULTADOS

Registos de temperaturas após a imunização

As médias das temperaturas após a imunização das ovelhas dos diversos lotes estão representadas na Figura 6.

As temperaturas do lote testemunho permanecem nos valores fisiológicos. ' Em contrapartida, observa-se um pico térmico no dia 3 para os dois lotes vacinados (40,5°C) ; a hipertermia do lote FO é mais precoce (40,1°C no dia 2) do que a do lote FA (39,5°C no dia 2). Observa-se um regresso das temperaturas a valores fisiológicos 4 dias depois da imunização.

Estudo da resposta humoral após a imunização

Representam-se. na Figura 7 as médias dos resultados dos testes ELISA nos dias 0, 24, 39, 98, e 134, para os soros dos diversos lotes de ovelhas,, diluídos a 1/100 .

As ovelhas do lote testemunho nao desenvolveram qualquer resposta humoral.

As ovelhas do lote FO ' e as do lote FA desenvolveram uma reacção IgG anti-toxoplásmica a partir do dia 24. Observa-se uma manutenção desta reacção até ao fim da experiência (dia 134). . 40

Rendimento da gestação

Depois das relações com o macho, só trinta das trinta e seis ovelhas entraram em gestação. Observaram-se em cada lote duas ovelhas que não entraram em gestação.

Estudo dos registos de temperatura após a infecção

Na -Figura 8 representam-se as medias das temperaturas após a infecção para as ovelhas dos diferentes lotes.. . .

Após a infecção, observou-se uma hipertermia no para todas as ove,lhas. Nõ lote testemunho, o. pico febril durou cinco dias, entre o dia 5 e o dia 9, com uma temperatura máxima de 41,5°C no dia 6. Para os dois lotes vacinados, o pico febril durou três dias entre' o dia 4 e o dia 6, com um máximo de temperatura, de 41-, 2°C no dia 5.

No momento do pico febril observado para o- lote testemunho (dia 6) , as temperaturas das ovelhas dos lotes KO FA e KO FO já haviam baixado (para entre 40,0 e 40,5°C) enquanto que o pico observado nas ovelhas do lote testemunho se mantém até ao dia 7, e depois diminui progressivamente até ao dia 9, em que a temperatura média observada é de 40,5°C (para KO FA e para KO FO do dia 7 ao dia 9: 39,0°C). 41 0 pico febril das ovelhas vacinadas é mais precoce, menos prolongado e com um máximo febril menos pronunciado do que os do lote testemunho.

Registo dos abortos e dos partos À nascença, identificam-se e . pesam-se os cordeiros mortos e os viáveis.

Existem dois tipos de aborto:. - os . abortos febris devidos ao aumento de temperatura após a infecção com os ooc.i.stos; - . os abortos toxoplásmicos infecciosos devidos ao desenvolvimento do parasita no feto.

Abortos febris

Estes abortos sucedem na sequência do pico térmico verificado após a infecção...

Resumem-se os Resultados na Tabela I adiante.

. Tabela I

Lote Testemunho KO FA KO FO Abortos febris 6/10 0/10 0/10 42

Seis. das ovelhas do lote testemunho abortaram nos quinze dias após a infecção. Em contrapartida, não se observou nenhum aborto febril nas ovelhas vacinadas.

Abortos devidos à infecção com toxoplasma

Estes abortos sucedem durante a gestação, e devem-se à passagem transplacentar do parasita e ao seu desenvolvimento no feto. Observam-se em geral. no final da gestação.

Resumem-se os resultados obtidos na Tabela II adiante.

Tabela II

Lote Testemunho KO FA KO FO Abortos infecciosos 4/10 1/10 . 3/9

Para a interpretação destes resultados, excluiu-se uma ovelha do lote KO FO: com. efeito, no caso desta ovelha, o parto foi difícil: um dos dois cordeiros era viável. Mas ignorado pela mãe, não sobreviveu: não foi portanto incluído nos resultados.

No lote testemunho, nenhuma das quatro ovelhas que não tinham sofrido aborto febril consegui levar a sua gestação ao termo e dar à luz um cordeiro viável.

Para o lote de dose fraca (KO FA), apenas uma das 43 dez ovelhas abortou.

Para o lote de dose forte (KO FO) , três das nove ovelhas sofreram abortos. A percentagem de protecção global conferida pela vacinação foi avaliada em função do número total de abortos (febris + infecciosos) ) . Quando a ovelha pariu dois cordeiros dos. quais um estava vivo, não se considerou o aborto rios resultados uma vez que são encaráveis diversas hipóteses para explicar aborto, para além da infecção: falta de espaço durante a gestação ou falta de interesse e de cuidados pelo cordeiro logo após o seu nascimento; contabilizaram-se portanto estas ovelhas como protegidas pela vacinação.

Resumem-se os Resultados na Tabela II adiante.

Tabela III ' Lote Testemunho Dose ' Dose fraca forte Número de abortos o 1 3 Número total de 10 10 9 ovelhas . Percentagem de 0 % . 90 % 67 % protecção A percentagem de protecção no lote KO FA é de 90 % contra 67 % para o- lote KQ FO. Para o lote testemunho, a 44 protecção é nula.

Cordeiros viáveis

Sete cordeiros eram viáveis à nascença a partir, de nove ovelhas em gestação, no lote de dose forte, contra nove cordeiros viáveis para dez ovelhas em gestação no lote de dose fraca. Estes cordeiros estavam de boa saúde e não tinham malformações. Os pesos escalonavam-se entre 2.200 e 5.-200. g e correspondiam aos pesos normais dos .cordeiros a termo (duração de gestação de cinco meses)'. EXEMPLO 6: COMPARAÇÃO DA ESTIRPE MIC1-3KO COM A ESTIRPE S48 (TOXOVAX®)

Comparação dos perfis imunoelectroforéticos dos táquizóitos micl-3KO a dos táquizóitos S48.

Analisaram-se as proteínas totais dos táquizóitos das estirpes micl-3K0 e S48 por electroforese SDS-PAGE em. condições não redutoras e por transferência de Western, tal como se descreveu no exemplo 1 acima. As transferências de Western foram reveladas recorrendo a anticorpos monoclonais anti-MIC3 (T82C10), ou. anti-MICl (T101F7), de um soro de murganho infectado por via oral com a estirpe 76K.de, T. gondii, ou de um soro de murganho néscio. Apresentam-se os resultados na Figura 9.

Legenda da Figura 9: (A) lisado de táquizóitos S48; (B) lisado de táquizóitos micl-3KO. Pista 1: soro 45 anti-76 K; pista 2: soro de murganho néscio; pista 3: anti-MIC1; pista 4: anti-MIC3.

Estes resultados mostram que as estirpes micl-3K0 e S48 têm perfis electroforéticos muito diferentes, e nomeadamente que, ao contrário da estirpe micl-3KO, a estirpe S48 exprime as duas proteínas MIC1 e MIC3.

Comparação conferida pelas vacinas com estirpes micl-3KO e S48 A protecção conferida por uma e outra destas estirpes como vacinas foi avaliada utilizando o protocolo do exemplo 5 acima.

Para esse efeito dividiu-se em três lotes um rebanho de ovelhas seronegativas: - um lote testemunho com 12 ovelhas. - ·. um lote (Toxo. KO 1-3) de 13 ovelhas, imunizado com 105 taquizóitos da estirpe micl-3KO. . - um lote (Toxo S48) de 12 ovelhas, imunizado com 105 taquizóitos da estirpe Ξ4 8

Depois da inoculação das vacinas, levaram-se a cabo as seguintes medições em todos os lotes: 46 - registo das temperaturas após a imunização

monitorização da resposta humoral pela técnica ELISA

infecção das fêmeas em gestação com 400 oocistos da estirpe PRU registo das temperaturas após a infecção - monitorização dos abortos e dos partos Temperaturas após a imunização

Representam-se na Figura- 10. as. médias das temperaturas após a imunização das ovelhas dos. diferentes lotes.

Resposta humoral após a imunização

Registam-se as médias dos resultados dos testes ELISA nos dias 20, 24, e 39, para os soros dos diferentes lotes de ovelhas diluídos a 1/100,.na Figura 11.

Rendimento da gestação

Depois de serem levadas ao macho, 11 ovelhas testemunho (das 12 de que se partiu}, 12 ovelhas ToxoKO (das 13 de que se partiu) , e 12 ovelhas ToxoS48 (das 12 de que se. partiu) estavam em gestação. 47

Temperaturas após a infecção.

Na Figura 12 representam-se as médias das temperaturas das ovelhas dos diversos lotes após a infecção

Monitorização dos abortos e dos partos

Abortos febris (1 semana após o pico térmico da prova de infecção)

Resumem-se os resultados na Tabela IV adiante.

Tabela IV

Lote Testemunho ToxoKO S48 Abortos febris. 10/11 0/12 0/12 .Abortos .infecciosos (durante as 2 últimas semanas de gestação

Resumem-se os resultados na Tabela. V adiante.

Tabela V

Lote Testemunho J ToxoKO S48 Abortos infecciosos 1/11 4/12 4/12

Protecção global:

Resumem-se os resultados na.Tabela VI adiante. 48

Tabela VI

Lote Testemunho ToxoKO S48 Número de abortos 11 4 4 Número total de ovelhas 10 12 12 em gestação Percentagem de protecção 0 % 66,6 % 66,6 % Δ percentagem de protecção é de 66,6 % para ambos os lotes ToxoKO e ToxoS48. Para o lote testemunho a protecção é nula.

As duas estirpes MIC1-3K0 e S48 conferem portanto um nível de protecção semelhante. 49

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110 INSITUTO NACIONAL DA INVESTIGAÇÃO AGRONÓMICA CENTRO NACIONAL DA INVESTIGAÇÃO CIENTÍFICA UNIVERSIDADE FRANÇOIS RABELAIS DUBREMETZ, Jean-François BOUT, Daniel LEBRUN, Maryse SOÊTE, Martine CEREDE, Odile

DOS

<120>ESTIRPES DE APICOMPLEXOS DA' FAMÍLIA SARCOCYSTIDAE PARA VACINAS <130> MJPbv539/120 <150> FR04 00260 <151> 2004-01-13 <160> 6 <170> Patente na versão 3.1

<210> 1 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 50 <223> Iniciador para PCR: ML9 <400> 1 gtgtaagctt cagcgagtct ctgagag 27 <210> 2

<211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador para PCR: ML10 <400> 2 ggggtaccga gctcatgagc agaagctgcc ag 32

<210> 3 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador para PCR: ML23 <400> 3 ctgaattcag atcttaccag tgttggacaa gg 32 <210> 4 <211> 31 51

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador para PCR: ML24 <400> 4 ggggtacccc ttgctaggta accactcgtg c 31

<210> 5 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0 <223> Iniciador para PCR: ML11 <400> 5 gcacaattga gatctaaaat gcgaggcggg acgtcc 36

<210> 6 <211> 41 <212 > ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador para PCR: ML15 <400> 6 tgctatgcat tcctaggctg cttaattttc tcacacgtca c 41

Lisboa, 15 de Julho de 2008

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Estirpe mutante de um Apicomplexo da família dos Sarcocystidae caracterizada por incluir uma mutação que inactiva a adesina MIC1 e uma mutação que inactiva a adesina MIC3.

2) Estirpe mutante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se tratar de uma estirpe de toxoplasma.

3) Estirpe mutante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por se tratar de uma estirpe de Toxoplasma gondil.

4) Utilização de uma estirpe mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, para a obtenção de uma vacina.

5) Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por a vacina referida ser uma vacina contra a toxoplasmose.

6) Vacina contendo uma estirpe mutante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3. Lisboa, 15 de Julho de 2008