PT1676586E - Métodos para separar variantes do rotavírus e vacina de rotavírus vivo atenuado - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"MÉTODOS PARA SEPARAR VARIANTES DO ROTAVÍRUS E VACINA DE ROTAVÍRUS VIVO ATENUADO"

Esta invenção refere-se a novas formulações de vacina, métodos para as preparar e sua utilização em terapia. Em particular, a presente invenção refere-se a novas formulações de vacinas de rotavirus. A diarreia infecciosa aguda é uma causa principal de doença e morte em muitas áreas do mundo. Nos paises em desenvolvimento, o impacto da doença diarreica é desconcertante. Para a Ásia, África e América Latina, foi estimado que existam entre 3-4 biliões de casos de diarreia em cada ano e, desses casos, cerca de 5-10 milhões resultam em morte (Walsh, J.A. et al.: N. Engl. J. Med., 301: 967-974 (1979)).

Os rotavirus têm sido reconhecidos como uma das causas mais importantes da diarreia grave em bebés e crianças jovens (Estes, M.K. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Terceira Edição, editado por Fields et al., Raven Publishers, Filadélfia, 1996). Estima-se que a doença por rotavirus seja responsável por mais de um milhão de mortes anualmente. A doença induzida por rotavirus afecta, mais normalmente, crianças entre os 6 e os 24 meses de idade e o pico de prevalência da doença ocorre, geralmente, durante os meses mais frescos em climas temperados e ao longo do ano em áreas tropicais. Os rotavirus são, tipicamente, transmitidos de pessoa para pessoa pela via fecal-oral com um periodo de incubação de cerca de 1 a cerca de 1 3 dias. Ao contrário da infecção na faixa etária dos 6 meses aos 24 meses, os recém nascidos são, geralmente, assimtomáticos ou têm apenas uma doença moderada. Em contraste com a doença grave normalmente encontrada em crianças jovens, a maioria dos adultos estão protegidos como resultado de infecção prévia por rotavírus, por esse motivo, a maioria das infecções em adultos são moderadas ou assimptomáticas (Offit, P.A. et al. Comp. Ther. 8 (8) : 21-26, 1982) .

Os rotavírus são geralmente esféricos e os seus nomes derivam da estrutura distintiva da sua cápside interna e externa ou em dupla camada. Tipicamente, a estrutura da cápside de um rotavírus em dupla camada envolve uma camada ou núcleo proteico interno gue contém o genoma. 0 genoma de um rotavírus é constituído por 11 segmentos de ARN de cadeia dupla que codifica, pelo menos, 11 proteínas virais distintas. Duas dessas proteínas virais, designadas por VP4 e VP7, estão organizadas no exterior da estrutura em dupla camada da cápside. A cápside interna do rotavírus apresenta uma proteína, que é a proteína do rotavírus designada por VP6. A importância relativa destas três proteínas rotavirais específicas em induzir a resposta imunitária que se segue a uma infecção por rotavírus, não é ainda evidente. Contudo, a proteína VP6 determina o grupo e o subgrupo do antigénio e as proteínas VP4 e VP7 são determinantes da especificidade do serotipo. A proteína VP7 é uma glicoproteína com 38000 PM (34000 PM quando não glicosilada) que é o produto de tradução do segmento genómico 7, 8 ou 9, dependendo da estirpe. Esta proteína estimula a formação do anticorpo de neutralização principal, após a infecção por rotavírus. A proteína VP4 é uma proteína não glicosilada com, aproximadamente, 88000 PM que é o produto de 2 tradução do segmento genómico 4. Esta proteína estimula também o anticorpo de neutralização após a infecção por rotavírus.

Uma vez que as proteínas VP4 e VP7 são as proteínas virais contra as quais são dirigidos os anticorpos de neutralização, acredita-se que sejam as principais candidatas para o desenvolvimento de vacinas de rotavírus, proporcionando protecção contra doença por rotavírus. A infecção natural por rotavírus durante a infância é conhecida por promover imunidade protectora.

Uma vacina de rotavírus vivo atenuado é, assim, altamente desejável. De um modo preferido, deverá ser uma vacina oral, uma vez que esta é a via natural de infecção do vírus.

Os primeiros desenvolvimentos na vacina para prevenir infecções por rotavírus começaram nos anos 70 após a descoberta do vírus. Inicialmente, foram estudadas estirpes atenuadas de animais e humanos e apresentavam resultados mistos ou desapontantes. Mais recentemente, foram centrados esforços em reassociações humano-animal que tiveram mais sucesso.

Uma estirpe de rotavírus conhecida como 89-12 foi descrita por Ward; ver Patente US Número 5474773 e Bernstein, D. L. et al.r Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998. A estirpe 89-12 foi isolada de um espécime recolhido de fezes de uma criança de 14 meses com doença provocada por rotavírus natural em 1988. De acordo com a Patente US Número 5474773 o rotavírus humano HRV 89-12 foi, depois, adaptado para cultura por 2 passagens em células primárias de Rim de Macaco Verde Africano (AGMK) e 4 passagens em células MA-104, como descrito por Ward em J. Clin. Microbiol. 3 19, 748-753, 1984. Foi, depois, purificado 3 vezes, em placas, em células MA-104 (até à passagem 9) e crescido após 2 passagens adicionais nestas células. Foi efectuada uma passagem adicional (passagem 12) para depósito na ATCC sob o número de acesso ATCC VR 2272. A estirpe depositada é conhecida como 89-12C2. A publicação de 1998 em Vaccine por Bernstein et al., é referida abaixo como a publicação Vaccine (1998). A publicação descreve a segurança e imunogenicidade de um candidato a vacina de rotavírus humano vivo administrado oralmente. Esta vacina foi obtida da estirpe 89-12, atenuada por passagem, sem purificação em placa, 26 vezes em células primárias de AGMK e, depois, mais 7 vezes numa linha celular de AGMK estabelecida (33 passagens no total).

Daqui para a frente, o material mencionado anteriormente, que foi passado 26 vezes em série, será referido como P26 e o material que foi passado 33 vezes em série, será referido como P33. Em geral, o rotavírus derivado por passagens de 89-12 n vezes irá ser referido como Pn.

Nos exemplos que se seguem, o material P33 foi passado mais 5 vezes por células Vero. Este é referido como P38.

Os isolados P26 e P33 descritos na publicação Vaccine (1998), não foram depositados numa colecção de culturas, nem foram analisados para estabelecer a sua caracterização genética.

Verificou-se agora que a população P26, descrita na literatura, compreende uma mistura de variantes. Isto foi 4 determinado pela caracterização genética como aqui descrito abaixo (ver exemplos) . A P26 não é, por isso, uma população consistente de confiança para passagens posteriores, em particular para produção de lotes de vacinas. De um modo semelhante, a P33 compreende uma mistura de variantes e não tem uma consistência de confiança para a produção de lotes de vacinas.

Verificou-se que o material P26 é uma mistura de, pelo menos, três variantes do gene VP4. A P33 e P38 são, de um modo semelhante, uma mistura de duas variantes. Estas variantes parecem ser antigenicamente diferentes, em termos de epitopos de neutralização da estirpe 89-12C2 depositada no ATCC, quando se avaliam os títulos de anticorpo de neutralização do soro de crianças vacinadas com P33 contra estas variantes. Isto é ilustrado na Figura 3.

Além disso, verificou-se que quando o material P33 é administrado a crianças, duas variantes identificadas são replicadas e excretadas. Das 100 crianças vacinadas, apenas 2 apresentaram sinais de gastroenterite devido a infecção por rotavírus, enquanto 20% de um grupo placebo foram infectadas. Estas verificações sugerem que as variantes identificadas estão associadas com a protecção da doença por rotavírus. A presente invenção proporciona um método de separar variantes de rotavírus e uma vacina de rotavírus vivo atenuado melhorada, derivada de uma estirpe de rotavírus humano (homogénea) clonada.

Consequentemente, de acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção proporciona uma população de rotavírus 5 atenuado (isolado), caracterizada por compreender uma única variante ou substancialmente uma única variante, sendo a referida variante definida pela sequência de nucleótidos codificando, pelo menos, uma das principais proteínas virais, designadas como VP4 e VP7.

De um modo preferido, a população de rotavírus de acordo com a invenção é uma variante clonada.

Por uma população compreendendo uma única variante ou substancialmente uma única variante, entende-se uma população de rotavírus que não contém mais de 10% e, de um modo preferido, menos do que 5% e, de um modo muito preferido, menos do que 1% de uma variante ou variantes diferentes. As populações de vírus podem ser purificadas até à homogeneidade ou homogeneidade substancial por passagem em tipos de células adequados ou efectuando uma série de um ou mais passos de clonagem.

Uma vantagem da invenção é que uma população compreendendo uma única variante é mais adequada para a formulação de um lote consistente de vacinas. As variantes em particular, definidas por sequências nucleotídicas que codificam a principal proteína virai, podem também estar associadas com eficácia melhorada na prevenção da infecção por rotavírus.

Num aspecto preferido, a única variante ou substancialmente única na população de rotavírus da invenção é uma variante na qual o gene VP4 compreende uma sequência nucleotídica compreendendo, pelo menos, um dos seguintes: uma base adenina (A) na posição 788, uma base adenina (A) na posição 802 e uma base timina (T) na posição 501 a partir do codão iniciador. 6

Num outro aspecto, a única variante ou substancialmente única na população da invenção é uma variante na qual o gene VP7 compreende uma sequência nucleotídica compreendendo, pelo menos, um dos seguintes: uma timina (T) na posição 605, uma adenina (A) na posição 897 ou uma guanina (G) na posição 897 a partir do codão iniciador. De um modo preferido, na posição 897 existe uma adenina (A).

Num aspecto preferido, a única variante na população de acordo com a invenção tem uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma timina (T) na posição 501 a partir do codão iniciador na sequência do gene VP4.

Noutro aspecto preferido, a única variante na população de acordo com a invenção tem uma timina (T) na posição 605 e uma adenina/guanina (A/G) na posição 897 a partir do codão iniciador na sequência de VP7. De um modo muito preferido, na sequência de VP7 existe uma adenina (A) na posição 897.

Num aspecto particularmente preferido, a única variante na população de acordo com a invenção, tem uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma timina (T) na posição 501 a partir do codão iniciador na sequência do gene VP4 e uma timina (T) na posição 605 e uma adenina/guanina (A/G) na posição 897 a partir do codão iniciador na sequência do VP7. De um modo muito preferido, na sequência do VP7 existe uma adenina (A) na posição 897. sequência sequência sequência

Noutro aspecto, a única variante compreende uma nucleotídica codificando uma proteína VP4, em que a nucleotídica é como mostrado na Figura 1 e/ou uma 7 nucleotídica codificando uma proteína VP7, em que a sequência nucleotídica é como mostrado na Figura 2. A presente invenção proporciona também um método de produção de uma população de rotavírus compreendendo substancialmente uma única variante, compreendendo o método: passar uma preparação de rotavírus num tipo celular adequado; seleccionar opcionalmente a cultura homogénea utilizando os passos tanto de: a) diluição limite; ou b) isolamento individual em placa; e verificação da presença de substancialmente uma única variante, efectuando uma determinação da sequência de uma região apropriada da sequência do gene VP4 e/ou VP7. A determinação da sequência pode ser, adequadamente, efectuada através de uma técnica de hibridação quantitativa ou semi-quantitativa, tal como hibridação Slot blot ou hibridação em placa.

De um modo preferido, a variante seleccionada é uma variante que é replicada e excretada quando a preparação de rotavírus de partida é administrada a um indivíduo humano, em particular uma criança. A população de vírus clonado que resulta do método de acordo com a invenção, pode ser amplificada por posterior passagem numa linha celular adequada.

Os tipos celulares adequados para passagem da população de rotavírus, no método anterior, incluem células de rim de macaco verde Africano (AGMK) que podem ser linhas celulares estabelecidas ou células AGMK primárias. As linhas celulares AGMK adequadas incluem, por exemplo, Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ECACC 85011422) e CV-1 (ATCC CCL-70). Também adequadas são as linhas celulares MA-104 (macaco rhesus) e MRC-5 (humanas-ATCC CCL-171). As células Vero são particularmente preferidas para objectivos de amplificação. A passagem por células Vero proporciona um rendimento elevado em vírus.

As técnicas para verificar se existe uma única variante numa população de vírus resultante do método e para determinar a natureza dessa única variante envolvem processos de sequenciação ou hibridação convencionais, conhecidos na técnica e que são aqui descritos abaixo.

Num aspecto preferido, o método da invenção é efectuado utilizando um rotavírus apropriado, particularmente, rotavírus com as características da estirpe 89-12 ou de um seu derivado de passagem.

Uma população de variante única particularmente preferida é a P43, que é obtida da P33 (um rotavírus humano isolado passado 33 vezes em cultura em tipos celulares apropriados) por uma série de passos de clonagem de diluição final, seguidos por passagem do material clonado em células Vero, para amplificação. 9

Uma população P43 foi depositada na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) , Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Reino Unido a 13 de Agosto de 1999 com o número de depósito 99081301, sob os termos do Tratado de Budapeste.

Embora esta disponibilidade pública indicada seja o método mais simples de se obter o rotavirus humano P43, não é totalmente impossível ou improvável que rotavirus semelhantes e, de um modo substancial, funcionalmente idênticos possam ser produzidos por estes ou outros métodos, tendo em conta os ensinamentos desta invenção. Tais rotavirus, de um modo substancial funcionalmente idênticos, são considerados como sendo biologicamente equivalentes ao rotavirus humano P43 desta invenção e, por isso, estão dentro do âmbito geral da presente invenção. Será, então, entendido que a invenção engloba as populações de rotavirus, com as caracteristicas da variante P43, como aqui descrito.

Será também entendido que a invenção engloba materiais derivados do P43 ECACC 99081301 depositado, submetendo-o a um processamento posterior, tal como propagando-o por passagem posterior, clonagem ou outros processos utilizando o virus vivo ou por modificação do P43, de qualquer modo, incluindo através de técnicas de engenharia genética ou técnicas de reassociação. Tais passos e técnicas são bem conhecidos na técnica.

Os materiais derivados do P43 depositado, que estão abrangidos pela invenção, incluem proteína e material genético. De particular interesse são os rotavirus reassociados que compreendem, pelo menos, um antigénio ou, pelo menos, um 10 segmento do P43, por exemplo reassociados que compreendem uma estirpe virulenta de rotavírus, na qual um, ou parte de um dos 11 segmentos do genoma foi substituído pelo segmento de genoma do P43 ou uma sua parte. Especif icamente, uma reassociação de rotavírus, na qual o segmento ou segmento parcial, codificando a NSP4 é um segmento ou segmento parcial de P43, pode ter propriedades úteis. Os rotavírus reassociados e técnicas para os preparar são bem conhecidas (Foster, R.H. e Wagstaff, A.J. Tetravalent Rotavírus Vaccine, a review. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9(2), 155-178, 1998).

Os materiais de particular interesse são descendentes do P43 e derivados imunologicamente activos do P43. Derivados imunologicamente activos, significa materiais obtidos de ou com o vírus P43, particularmente, antigénios do vírus que são capazes de induzir uma resposta imunitária que é reactiva contra o Rotavírus quando injectados num animal hospedeiro.

Na adaptação do rotavírus a uma linha celular apropriada, por exemplo, células Vero, pode ser necessário tratar o vírus de modo a remover qualquer potencial contaminante, tal como quaisquer agentes adventícios que possam estar presentes e que poderão, de outro modo, causar contaminação. No caso de vírus adventícios sensíveis ao éter, tal pode ser efectuado através de tratamento com éter como aqui descrito abaixo. A presente invenção refere-se também à inclusão de tal tratamento com éter como um passo opcional no processo global, para se obter um rotavírus vivo atenuado ou vacina formulada com este.

Também dentro do âmbito da invenção estão misturas de P43 com outras variantes de rotavírus, por exemplo, outras variantes clonadas, ou com outros vírus, em particular, outros vírus 11 atenuados. Tais misturas são úteis nas vacinas da invenção que são aqui descritas abaixo. A presente invenção proporciona também uma vacina de rotavirus vivo atenuado que compreende uma população de variante substancialmente única misturada com um adjuvante ou um veiculo farmacêutico adequado.

De um modo preferido, a vacina de rotavirus de acordo com a invenção é uma vacina de rotavirus monovalente contendo uma estirpe de rotavirus única. A presente invenção é particularmente vantajosa ao proporcionar uma vacina de rotavirus vivo na qual o rotavirus vivo atenuado é um rotavirus humano e não causa intussuscepção.

Os veículos farmacêuticos adequados para utilização na vacina de acordo com a invenção incluem aqueles conhecidos na técnica, como sendo adequados para administração oral, especialmente, em crianças. Tais veículos incluem, e não estão limitados a, hidratos de carbono, poliálcoois, aminoácidos, hidróxido de alumínio, hidróxido de maqnésio, hidroxiapatite, talco, óxido de titânio, hidróxido de ferro, estearato de magnésio, carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, celulose microcristalina, gelatina, peptona vegetal, xantano, carragenano, goma-arábica, β-ciclodextrina. A invenção proporciona também um processo para preparar uma vacina de rotavirus, por exemplo, por liofilização do vírus na presença de estabilizadores adequados ou mistura do vírus, de acordo com a invenção, com um adjuvante ou veículo farmacêutico adequado. 12

Pode também ser vantajoso formular o vírus da invenção em veículos baseados em lípidos, tais como virossomas ou lipossomas, em emulsões óleo em água ou com partículas de transporte. Alternativamente ou em adição, podem ser incluídos na formulação imunoestimulantes, tais como aqueles conhecidos na técnica para vacinas orais. Tais imunoestimulantes incluem, toxinas bacterianas, particularmente, a toxina da cólera (CT) na forma de holotoxina (molécula inteira) ou apenas a cadeia B (CTB) e a enterotoxina instável ao calor de E. coli (LT) . As LT mutadas (mLT) que, com menor probabilidade se converterão na sua forma activa do que a LT nativa, são descritas nos documentos WO 96/06627, WO 93/13202 e US 5182109.

Outros imunoestimulantes que podem, vantajosamente, ser incluídos são os derivados da saponina, tais como QS21 e lípido A monofosforilo, em particular o lípido A monofosforilo 3-des-O-acilado (3D-MPL). As saponinas purificadas como adjuvantes orais são descritas no documento WO 98/56415. As saponinas e o monofosforil-lipido A podem ser empregues separadamente ou em combinação (e. g: documento WO 94/00153) e podem ser formulados em sistemas de adjuvante em conjunto com outros agentes. 0 3D-MPL é um adjuvante bem conhecido, produzido por Ribi Immunochem, Montana e a sua preparação é descrita no documento GB 2122204.

Uma discussão geral sobre veículos e adjuvantes para imunização oral pode ser encontrada em Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, editado por Powell e Newman, Plenum Press, Nova Iorque, 1995. A invenção proporciona também um método para vacinar indivíduos humanos, especialmente crianças, administrando a um 13 indivíduo com essa necessidade, uma quantidade eficaz de uma composição de vacina de acordo com a invenção. De um modo preferido, a vacina viva atenuada é administrada por administração oral.

Num aspecto preferido, a composição de vacina da invenção é formulada com um antácido para minimizar a inactivação da vacina pelo ácido no estômago. Os componentes antácidos adequados, incluem antácidos inorgânicos, por exemplo, hidróxido de alumínio A1(0H)3 e hidróxido de magnésio Mg(OH)2. Os antácidos disponíveis comercialmente, que são adequados para utilização na invenção, incluem Mylanta (marca registada) que contém hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio. Estes são insolúveis em água e são administrados em suspensão. 0 hidróxido de alumínio é um componente particularmente preferido de uma composição de vacina de acordo com a invenção, na medida em que pode proporcionar não só um efeito de antácido mas também um efeito de adjuvante.

Também adequados para utilização como antácidos na vacina da invenção, são os antácidos orgânicos, tal como sais carboxilato de ácidos orgânicos. Um antácido preferido na composição de vacina da invenção contém um sal carboxilato de ácido orgânico, de um modo preferido, um sal de ácido cítrico, tal como citrato de sódio ou citrato de potássio.

Um antácido particularmente preferido que pode ser utilizado na composição de vacina da presente invenção é o sal inorgânico insolúvel, carbonato de cálcio (CaC03) . 0 carbonato de cálcio é capaz de se associar com o rotavírus e a actividade do 14 rotavírus é mantida durante a associação com o carbonato de cálcio.

Para prevenir a sedimentação do carbonato de cálcio durante o passo de preenchimento, os agentes viscosos estão, de um modo preferido, presentes na formulação.

Os possíveis agentes viscosos que podem ser utilizados, incluem excipientes pseudoplásticos. Uma solução pseudoplástica é definida como uma solução com uma viscosidade superior em repouso em comparação com a sua viscosidade sob agitação. Os excipientes deste tipo são polímeros naturais, tais como goma-arábica, goma de adraganto, ágar-ágar, alginatos, pectinas ou polímeros semi-sintéticos, por exemplo: carboximetilcelulose (Tyloses C®), metilcelulose (Methocels A®, Viscontrans MC®, Tylose MH® e MB®) , hidroxipropilcelulose (Klucels®) e hidroxipropilmetilcelulose (Methocels E® e K®, Viscontrans MPHC®) . No geral, esses excipientes pseudoplásticos são utilizados em conjunto com agentes tixotrópicos. Os agentes viscosos alternativos que podem ser utilizados são excipientes pseudoplásticos com uma capacidade de fluidez baixa. Esses polímeros, a uma concentração suficiente, dão origem uma organização estrutural fluida, resultando numa solução de elevada viscosidade, com baixa capacidade de fluidez, quando em repouso. Tem de ser fornecida uma certa quantidade da energia ao sistema para permitir a fluência e transferência. São necessárias energias externas (agitação) para destruir temporariamente a organização estrutural fluida, de modo a se obter uma solução fluida. Exemplos de tais polímeros são Carbopols® e goma de xantano. 15

Os excipientes tixotrópicos tornam-se numa estrutura de gel quando em repouso, enquanto sob agitação formam uma solução fluida. Exemplos de excipientes tixotrópicos são: Veegum® (Silicato de magnésio-alúminio) e Avicel RC® (cerca de 89% de celulose microcristalina e 11% de Carboximetilcelulose de Na). A composição de vacina da presente invenção compreende, de um modo preferido, um agente de viscosidade selecionado de goma de xantano ou amido.

Assim, a composição de vacina da presente invenção é, de um modo preferido, formulada com uma combinação de carbonato de cálcio e goma de xantano.

Outros componentes de uma composição utilizada na invenção incluem, adequadamente, açúcares, por exemplo, lactose e/ou sacarose. A composição de vacina de acordo com a invenção pode conter componentes adicionais incluindo, por exemplo, aromatizantes (particularmente para uma vacina oral) e agentes bacterioestáticos. São consideradas diferentes apresentações da composição de vacina de acordo com a invenção.

Numa forma de realização preferida, a vacina é administrada como uma formulação liquida. De um modo preferido, a formulação liquida é reconstituída antes da administração a partir de, pelo menos, dois dos seguintes componentes: i) componente do vírus 16 ii) componente líquido.

Nesta forma de realização, o componente do vírus e o componente líquido estão, normalmente, presentes em recipientes separados que podem ser, convenientemente, compartimentos separados de um único reservatório ou reservatórios separados que podem estar unidos de tal modo que a composição de vacina final seja reconstituída sem a expor ao ar.

Antes da reconstituição, o vírus pode estar numa forma seca ou numa forma líquida. De um modo preferido, o componente do vírus está liofilizado. 0 vírus liofilizado é mais estável do que o vírus numa solução aquosa. 0 vírus liofilizado pode ser adequadamente reconstituído utilizando uma composição de antácido líquida para produzir uma formulação de vacina liquida. Alternativamente o vírus liofilizado pode ser reconstituído com água ou solução aquosa, em que, neste caso, a composição de vírus liofilizado contém, de um modo preferido, um componente antácido.

De um modo preferido, a formulação de vacina compreende um componente de vírus formulado com carbonato de cálcio e goma de xantano num compartimento ou reservatório e este é reconstituído com água ou solução aquosa presente no segundo compartimento ou reservatório.

Noutra forma de realização preferida, a composição de vacina é uma formulação sólida, de um modo preferido, um bolo liofilizado que é adequado para dissolução imediata quando colocado na boca. As formulações liofilizadas podem ser convenientemente proporcionadas na forma de comprimidos numa embalagem farmacêutica em blister. 17

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma vacina de rotavirus na forma de um comprimido de dissolução rápida para administração oral.

Noutro aspecto, a invenção proporciona uma composição compreendendo uma estirpe de rotavirus vivo atenuado, em particular, uma estirpe de rotavirus humano, em que a composição é um sólido liofilizado capaz de dissolução imediata quando colocado na boca.

De um modo preferido, o comprimido de dissolução rápida de acordo com a invenção dissolve-se na boca do indivíduo com uma rapidez suficiente para prevenir deglutição do comprimido não dissolvido. Esta abordagem é particularmente vantajosa para vacinas de rotavirus pediátricas.

De um modo preferido, o vírus é um rotavirus humano vivo atenuado que é formulado com um antácido inorgânico, tal como carbonato de cálcio e um agente de viscosidade, tal como goma de xantano.

Um outro aspecto da presente invenção é proporcionar uma formulação liofilizada, em que o componente do vírus é qualquer estirpe de rotavirus que é formulada com carbonato de cálcio e goma de xantano. As vacinas da invenção podem ser formuladas e administradas por técnicas conhecidas, utilizando uma quantidade adequada do vírus vivo para proporcionar uma protecção eficaz contra infecção por rotavirus sem efeitos secundários significativos em vacinas típicas. Uma quantidade adequada de vírus vivo irá estar, normalmente, entre 104 e 107 ffu por dose. Uma dose típica da vacina pode compreender 105-106 ffu por dose e 18 pode ser administrada em várias doses durante um período de tempo, por exemplo, em duas doses administradas com um intervalo de dois meses. Os benefícios podem, contudo, ser obtidos tendo mais de 2 doses, por exemplo, um regime de 3 ou 4 doses, em particular, em países em desenvolvimento. 0 intervalo entre doses pode ser superior ou inferior a dois meses de intervalo. Uma quantidade óptima do vírus vivo para uma dose única ou para um regime de dose múltipla e um momento óptimo para as doses, podem ser apurados por estudos convencionais que envolvem a observação de títulos de anticorpos e outras respostas em indivíduos. A vacina da invenção também pode compreender outros vírus vivos adequados para protecção contra outras doenças, por exemplo, poliovírus. Alternativamente, podem ser administradas outras vacinas de vírus vivos adequadas para administração oral, numa dose separada, mas em simultâneo com a composição de vacina de rotavírus segundo a invenção.

Legenda da Figura para a Figura 3

Os soros de doze crianças, com 4 a 6 meses de idade, vacinadas com o material P33, como descrito na publicação Vaccine (1998), foram testados para a neutralização do P33, P38, P43 e 89-12C2. A gama de títulos de neutralização de todos os soros testados é semelhante para P33, P38 e P43. A análise estatística não mostra nenhuma diferença significativa nos títulos de neutralização totais, contra os três vírus. Isto sugere que os 19 epitopos de neutralização conformacional e não-conformacional de P33, P38 e P43 sejam igualmente bem reconhecidos pelos soros anti-P33 de crianças vacinadas com P33. Esta observação sugere, indirectamente, que os epitopos de neutralização revelados neste ensaio in vitro não foram alterados entre P33, P38 e P43. A gama de títulos de neutralização de P89-12C2, contudo, difere significativamente de P33, P38 e P43. Esta observação sugere que os epitopos de neutralização conformacional e não conformacional de P33, P38 e P43 não são igualmente bem reconhecidos pelos soros anti-P33 de crianças vacinadas com P33. Esta observação sugere, indirectamente, que os epitopos de neutralização revelados neste ensaio in vitro foram alterados entre 89-12 C2 e P33, P38 e P43.

Os seguintes exemplos ilustam a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Demonstração de que a estirpe S9-12 na passagem 26 (P26) é uma mistura de variantes

Sequenciação dos genes VP4 e VP7 de lotes de passagens diferentes

Foi efectuada a sequênciação dos genes VP4 e VP7 da passagem P26 (células AGMK primárias), passagem P33 (linha celular AGMK estabelecida (em oposição às primárias)), passagem P41 e passagem P43. A extração de ARN total foi transcrita inversamente e amplificada por PCR num tubo/num passo. 20

Os iniciadores Rota 5bis e Rota 29bis amplificaram o gene VP4 inteiro e os iniciadores Rota 1 e Rota 2bis amplificaram o gene VP7 inteiro. 0 material de PCR foi sequenciado utilizando diferentes iniciadores (ver Tabela 1). A sequência da passagem P26 diferiu da sequência da passagem P33 em 3 bases (nas posições 501, 788 e 802 pb a partir do codão iniciador) em VP4 e em três bases em VP7 (108, 605 e 897 pb a partir do codão iniciador).

Os varrimentos da sequência da passagem P26 do VP4 e VP7 mostram, em posições mutadas, a presença da sequência da passagem P33 como um fundo. Assim, pode ser observado que a passagem P26 é uma mistura de, pelo menos, 2 variantes.

Os varrimentos da sequência da passagem P33 parecem homogéneos em VP4 e heterogéneos para VP7 (ver Tabela 2). A passagem P38 (derivada da passagem 33) foi passada 5 vezes em células Vero e apresentava o mesmo conjunto de sequências VP4 e VP7 que a passagem P33 (linha celular AGMK). Assim, não ocorreu nenhuma modificação importante nas populações entre P33 e P38. 21 TABELA 1: Oligonucleótidos utilizados para o RT-PCR e sequenciação nome sequência posição VP7 Rota 1 GGC TTT AAA AGA GAG AAT TTC CGT CTG G -49 a -22 Rota lbis GGT TAG CTC CTT TTA ATG TAT GGT A -16 a 10 Rota 2bis GGT CAC ATC GAA CAA TTC TAA TCT AAG 1014-988 Rota 7 CAA GTA CTC AAA TCA ATG ATG G 266-287 Rota 12 TGT TGA TTT TTC TGT CGA TCC AC 372-394 Rota 46 GGT TGC TGA GAA TGA GAA ATT AGC TAT 651-682 AGT GG Rota 18 CCA CTA TAG CTA ATT TCT CAT TCT CAG 682-651 CAA CC VP4 Rota 5 TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A 2-23 Rota 6 ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC 878-859 Rota 5bis TGG CTT CAC TCA TTT ATA GAC A 2-23 Rota 6bis ATT TCA GAC CAT TTA TAA CCT AG 878-856 Rota 25 GGA GTA GTA TAT GAA AGT ACA AAT AAT AG 268-296 Rota 26 CTA TTA TTT GTA CTT TCA TAT ACT ACT CC 296-268 Rota TCG ATA CAG TAT AAG AGA GCA CAA G 721-745 2 7bis Rota 28 TTC ATT AAC TTG TGC TCT CTT ATA CTG 753-727 Rota 31 GTA TAT GTA GAC TAT TGG GAT G 1048-1070 Rota 32 CAT CCC AAT AGT CTA CAT ATA C 1070-1048 Rota 45 TGT AAC TCC GGC AAA ATG CAA CG 1205-1227 Rota 53 CGT TGC ATT TTG CCG GAG TTA CA 1227-1205 Rota 54 GTA AGA CAA GAT TTA GAG CGC CA 1465-1487 Rota 55 TGG CGC TCT AAA TCT TGT CTT AC 1487-1465 Rota 40 CTT GAT GCT GAT GAA GCA GCA TCT G 1703-1727 Rota 39 CAG ATG CTG CTT CAT CAG CAT CAA G 1727-1703 Rota 33 CGA TCA TAT CGA ATA TTA AAG GAT G 2008-2032 Rota 34 CAT CCT TTA ATA TTC GAT ATG ATC G 2032-2008 Rota AGC GTT CAC ACA ATT TAC ATT GTA G 2335-2311 29bis 22 TABELA 2: oligonucleótidos utilizados em hibridação nome sequência posição VP7 Rota 41 Rota 42 AGT ATT TTA TAC TAT AGT AGA TTA TAT TAA TC AGT ATT TTA TAC TAT GGT AGA TTA TAT TAA TC 882-913 882-913 VP4 Rota 15 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TCC TTT C 807-783 Rota 16 ATC CCT ATT ATA CTG CAT TTC TTT C 807-783 Rota 35 ATC CCC ATT ATA CTG CAT TTC TTT C 807-783 Rota 36 ATC CCT ATT ATA CTG CAT TCC TTT C 807-783

As bases mostradas a negrito na Tabela 2 são os locais de variação da sequência especifica em VP4 e VP7. TABELA 3: variaçao da sequência dos genes VP4 e VP7 3.1

VP4 VP7 501 pb 16 7 aa 78 8 pb 263 aa 802 pb 268 aa 108 pb 36 aa 605 pb 2 02 cLcL 89 7 pb 299 aa P26 (AGMK) A G/A G/A A C/T A P33 (AGMK)) T A A G/A T/C A/G P38 (VERO) T A A A/G T G/A P43 (VERO) T A A A T A 23 N.B. Num segundo clone dos 3 clones que foram desenvolvidos ao nível do lote de produção, o nucleótido de VP7 na posição a 897 pb é G em vez de A como no clone P43 selecionado. Isto resulta numa metionina no lugar de uma isoleucina na sequência de aminoácidos. As variantes correspondentes ao clone P43 selecionado e ao clone no qual existe uma G em VP7 a 897 pb a partir do codão iniciador, foram excretadas nas fezes de crianças que tinham sido vacinadas com o material P33.

Na Tabela 3.1, onde existem duas bases alternativas numa posição em particular, a primeira das duas representa a base que aparece numa população maior e a segunda é a base que aparece numa população menor. As populações de variantes maior e menor são julgadas pela força do sinal na sequenciação. 3.2 VP4 VP7 501 pb 16 7 aa 788 pb 263 aa 802 pb 268 aa 10 8 pb 36 aa 605 pb 2 02 clcL 897 pb 299 aa P26 (AGMK) Leu Gly/Glu Gly/Arg Arg Thr/Met Ile P33 (AGMK)) Phe Glu Arg Arg/Arg Met/Thr Ile/Met P38 (VERO) Phe Glu Arg Arg/Arg Met Met/Ile P43 (VERO) Phe Glu Arg Arg Met Ile A Tabela 3.2 mostra as modificações em aminoácidos que resultam das diferenças de nucleótidos entre as variantes. TABELA 4 VP4 (posições 788-802) VP7 (posição 897) G-G A-A A-G G-A A G Sondas Rota 15 Rota 16 Rota 35 Rota 36 Rota 41 Rota 42 Passagens P26 - + + + nd nd P33 - + - - ++ + P38 - + - - + ++ P43 - + - - +

Hibridização Slot blot A modificação em populações entre as passagens P26 a P33 em células AGMK foi também confirmada por hibridação slot blot. Os fragmentos dos genes VP4 e VP7 gerados por RT/PCR foram hibridados com sondas de oligonucleótidos especificas para cada variante (ver Tabela 3.1 e 3.2). Em contraste com P26 que hibridou com Rota 16, Rota 35 e Rota 36 e não com Rota 15, o fragmento de PCR de VP4 do material P33, nas posições 788 e 802, só hibridou com Rota 16 e não com Rota 15, Rota 35 ou Rota 36. Estes resultados estabeleceram a presença de, pelo menos, 3 variantes em P26 (ver a Tabela 4).

Para o fragmento de PCR do VP7 do material P33, a posição 897 hibridou com Rota 41 e Rota 42. Estes resultados estabeleceram a presença de, pelo menos, duas variantes no material P33. 25

Exemplo 2: Isolamento e caraterização do clone P43

Para isolar os componentes P33 como uma população de vírus homogénea, foram efectuadas três diluições de ponto terminal de P33/AGMK em células Vero e o vírus resultante foi utilizado para infectar células Vero.

Os poços positivos foram selecionados utilizando dois critérios: crescimento demonstrado pelo maior número de foci detectados nos poços e os poços positivos mais isolados nas placas, como é realizado normalmente. Depois de 3 passagens de diluição terminal em placas de microtitulação de 96 poços, foram amplificadas sucessivamente, 10 poços positivos em células Vero e avaliados no seu rendimento.

Com base no rendimento, foram desenvolvidos três clones para o nível de passagem do lote de produção. Verificou-se que o imunorreconhecimento por anticorpos policlonais é semelhante tanto entre os três clones como entre os clones e P33. A homogeneidade dos clones foi avaliada por hibridação slot blot. A seleção final de um clone único foi baseada no rendimento e sequência. O clone selecionado foi amplificado por passagens sucessivas em células Vero para gerar uma semente Mestre, uma semente de Trabalho e, finalmente, lotes de produção. O clone selecionado foi caracterizado geneticamente a diferentes níveis de passagem por sequênciação do VP4 e VP7 (identidade) e por hibridação slot blot específica do VP4 e VP7 (homogeneidade) dos materiais amplificados por PCR. A sequência 26 dos genes VP4 e VP7 do material P43 são dados nas Figuras 1 e 2, respectivamente, e são idênticas ao P41. A homogeneidade do clone selecionado foi avaliada através de uma hibridação selectiva utilizando sondas de oligonucleótidos discriminando modificações nos nucleótidos nas regiões do VP4 e/ou VP7 de cada variante identificada durante a sequênciação do P26/AGMK primário (ver Tabela 4). 0 fragmento de VP4 hibridou com Rota 16 e não com Rota 15, Rota 35 ou Rota 36. 0 fragmento de VP7 hibridou com Rota 41 e não com Rota 42.

Estes resultados confirmaram que P43 é uma população homogénea.

Exemplo 3: Remoção do vírus potencialmente adventício

Foi adicionado éter a P33 (crescimento em AGMK) , para uma concentração final de 20% durante 1 hora. O éter foi, depois, removido com N2 borbulhado durante 35 min. Não foi observado impacto no título da semente de P33.

Exemplo 4: Formulação de uma vacina viva atenuada

Os lotes de produção descritos acima sao formulados para administração oral a crianças pelo seguinte método. 27 1. Vírus liofilizado São utilizadas técnicas convencionais para preparar doses de vírus. 0 lote virai purificado congelado é descongelado e diluído com a composição de meio apropriada, neste caso Meio eagle modificado por Dulbecco, até uma concentração virai padrão desejada, neste caso 106'2 ffu/mL. 0 vírus diluído é, então, diluído posteriormente com o estabilizador de liofilização (sacarose a 4%, dextrano a 8%, sorbitol a 6%, aminoácido a 4%) até ao título virai alvo, neste caso, 105'6 ffu/dose. Alíquotas de 0,5 mL da composição de vírus estabilizada são transferidas, assepticamente, para frascos de 3 mL. Cada frasco é, então, fechado parcialmente com uma rolha de borracha, a amostra é seca por congelação sob vácuo, o frasco é, então, totalmente fechado e é encapsulado com uma cápsula de alumínio para manter a rolha no lugar.

Para utilização, o vírus é reconstituído utilizando um dos seguintes reconstituintes antácidos: (a) Reconstituinte de citrato O citrato de sódio é dissolvido em água, esterilizado por filtração e assepticamente transferido para recipientes de reconstituição em quantidades de 1,5 mL a uma concentração de 544 mg de Na3Citrato. 2H20 por dose de 1,5 mL. Os recipientes de reconstituição podem ser, por exemplo, frascos de 3 mL, frascos de 4 mL, seringas de 2 mL ou cápsulas de plástico suave, comprimíveis, para administração oral. Como uma alternativa à manutenção de componentes estéreis em condições estéreis, o recipiente final pode ser autoclavado. 28 (b) Reconstituinte de A1(0H)3

Uma suspensão de hidróxido de alumínio asséptica (Mylanta -marca registada) é diluida assepticamente em água estéril, transferida assepticamente para recipientes de reconstituição (por exemplo, seringas de 2 mL ou cápsulas de plástico suave comprimíveis) em quantidades de 2 mL contendo cada um 48 mg de AI(OH)3. Uma alternativa à utilização de componentes estéreis sob condições estéreis é irradiar a suspensão de hidróxido de alumínio (de um modo preferido, numa fase diluída) , com radiação γ. São incluídos ingredientes convencionais para impedir a deposição da suspensão. Tais ingredientes convencionais incluem, por exemplo, estearato de magnésio, carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, celulose microcristalina e polímeros de silicone. Podem também ser incluídos agentes bacteriostáticos, por exemplo, butilparabeno, propilparabeno ou outros agentes bacteriostáticos convencionais utilizados na comida e aromatizantes. 29 neste caso aminoácido a 4%) até ao título virai alvo, 105'6 ffu/dose. São transferidas assepticamente alíquotas de 0,5 mL da composição de vírus estabilizada para frascos de 3 mL. A liofilização e o encerramento dos frascos são, então, efectuados como descrito na parte 1. 3. Vírus liofilizado com A1(0H)3 para apresentação em blister São utilizadas técnicas convencionais para preparar doses de vírus. O lote virai purificado congelado é descongelado e diluído com a composição de meio apropriada, neste caso, Meio eagle modificado por Dulbecco, até uma concentração virai padrão desejada, neste caso, 106'2 ffu/mL. A suspensão de hidróxido de alumínio é adicionada para se atingir uma quantidade final de 48 mg/dose e a composição de vírus é diluída com o estabilizante de liofilização que pode ser sacarose, dextrano ou aminoácidos a 4%, gelatina, peptona vegetal ou xantano até ao título virai alvo de 105'6 ffu/dose. É empregue uma operação de enchimento asséptica para transferir doses de 0,5 mL ou, de um modo preferido, menos para as cavidades blister. A composição é liofilizada e as cavidades blister são seladas por selagem térmica.

Opcionalmente, são incluídos ingredientes convencionais para impedir a deposição da suspensão de hidróxido de alumínio. Tais ingredientes convencionais incluem, por exemplo, estearato de magnésio, carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, celulose microcristalina e polímeros de silicone. Podem também ser incluídos aromatizantes. 30

Exemplo 5: Titulação virai de rotavirus para várias formulações 5.1: Comparação entre formulações baseadas em lactose e sacarose:

Lote n° Composição da formulação Título virai antes da liofilização Título virai depois da liofilização e 1 semana a 37 °C 98G06/01 Lactose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2% 105'22 104'b' 98G06/03 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2% 105'28 104'92 0 rotavirus P43 foi formulado com sacarose ou com lactose, como apresentado na tabela acima. A titulação virai antes da liofilização é o titulo virai no liquido formulado concluído (contendo sacarose, dextrano, sorbitol e aminoácidos) e sem o passo de liofilização.

Os bons resultados são aqueles nos quais é alcançada uma diminuição <0,5 log no passo de liofilização e uma redução <0,5 log durante "1 semana a 37 °C" (teste de estabilidade acelerada). A precisão da titulação virai está entre + ou -0,2 log. 31

Os resultados indicam que pode ser utilizada sacarose em vez da lactose. 5.2: Efeito de arginina e substituição de sorbitol por maltitol:

Lote n° Composição da formulação Título virai no tempo = zero após liofilização Título virai depois da liofilização e 1 semana a 37 °C 98L16/01 Lactose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2% 104,a 104'8 98L16/02 Lactose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol:3%; Aminoácidos: 2% Arginina: 3% co O \—1 104'9 98L16/04 Lactose: 2%; Dextrano: 4%; Maltitol: 3%; Aminoácidos: 2% Arginina: 3% O \—1 10b

Os resultados demonstraram que a adição de arginina (que é conhecida por melhorar a estabilidade do vírus durante a liofilização e também por proporcionar um meio básico de modo a compensar a acidez de estômago) mantém o título virai. 0 sorbitol tende a reduzir a temperatura de transição vítrea do bolo de liofilização a um nível muito elevado. Isto 32 pode ser superado utilizando maltitol em vez de sorbitol, como demonstrado acima e o titulo virai continua a ser mantido. 5.3: Várias composições de formulação

Esta experiência demonstra que sao possíveis várias formulações.

Lote n° Composição da formulação Titulo virai antes da liofilização Titulo virai depois da liofilização e 1 semana a 37 °C 99C11/01 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2% 105'24 o LO O \—1 99C11/02 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Maltilol:3%; Aminoácidos: 2% IO5'09 104'92 99C11/04 Dextrano: 4% Maltitol: 3%; Aminoácidos: 2% 104'89 TO5'06 33

Lote n° Composição da formulação Titulo virai no tempo = zero após liofilização Titulo virai depois da liofilização e 1 semana a 37 °C 99C17/01 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2% IO5'40 105'41 99C17/02 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol: 1,5%; Aminoácidos: 2% Í05'30 104'93 99C17/03 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Aminoácidos: 2% 105'31 105'24 99C17/04 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Maltilol: 3%; Aminoácidos: 2% 104'42 104'45 99C17/05 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Maltilol: 1,5%; Aminoácidos: 2% 104'39 o o \—1 99C17/06 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol 3% 105'44 r-~ O \—1 99C17/07 Sacarose: 2%; Dextrano: 4%; Sorbitol: 1,5% 105'11 oo O \—1 34 5.4: Associação entre o Rotavirus e antácido A1(0H)3:

Rotavirus AI(OH)3 h2o Tempo de contacto à temperatura ambiente Centrifugação Titulo virai do sobrenadante em ffu/mL Titulo virai do precipitado em ffu/mL 105'6 ffu/mL 48 mg em 0,240 mL 0, 76 mL 30 min 8000 rpm, 10 min IO3'66 IO"'6 ffu/mL 0,48 mg em 0,240 mL 0, 76 mL 30 min 8000 rpm, 10 min 104'41 IO8'8 ffu/mL 1 mL 30 min 8000 rpm, 10 min IO3'68 Rotavirus em Bolo Liofilizado 12 mg em 0, 120 mL 1,38 mL 30 min 8000 rpm, 10 min Abaixo do limite de detecção IO4-’ 0 AI(OH)3 é utilizado como antácido. Isto demonstra que o Rotavirus está associado com o sal inorgânico insolúvel (A1(0H)3) uma vez que é centrifugado em conjunto com o A1(0H)3 (diminuição da actividade virai no sobrenadante). 35 5.5: Dissolução do antácido A1(0H)3 por Citrato de Sódio antes da titulação virai

Amostras Dissolução Condições Títulos virais virais ffu/mL 99B10/06 1,5 mL de 24 h à 1—l 1—l -O O 1—1 formulação Citrato de Na3 temperatura líquida antes ambiente da liofilização; 105'43 99B10/06 1,5 mL de 24 h à IÕ4731 liofilizada; Citrato de Na3 temperatura 105'43 ambiente

Quando o Rotavírus está associado com o AI(OH)3, é possível liofilizar tudo (incluindo o AI(OH)3). Depois da liofilização, é possível recuperar o Rotavírus por dissolução do A1(0H)3 em Citrato de Sódio. Este passo não danifica o Rotavírus e mantém a a sua atividade após este passo de dissolução. 5.6: Infectividade do Rotavírus depois da libertação da associação de AI (OH) 3-Rotavírus: 0 mecanismo de libertação do vírus (pela dissolução do veículo) pode, muito bem, ocorrer in vivo. De facto, abaixo de pH 6, o hidróxido de alumínio torna-se completamente solúvel e, assim, o Rotavírus será libertado no estômago. 36 AI (OH) 3 + 3H+----> Al+++ (solúvel em água) + 3 H20

No estômago, os iões Al+++ não são absorvidos (J.J. Powell, R. Jugdaohsingh e R.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153).

No intestino, devido ao aumento de pH, as formas insolúveis do alumínio são precipitadas (AI(OH)3 ou A1P04) e eliminadas pela via natural.

Desconhece-se se o AI(OH)3 (ou A1P04) recém formado precipitado será capaz de se reassociar com o Rotavírus livre. Isto levanta a questão da infectividade da própria associação AI(OH)3-Rotavírus. É também possível a libertação do Rotavírus, da associação AI(OH)3-Rotavírus, através de outros mecanismos. A lisina, por exemplo, interfere com a adsorção virai no A1(0H)3.

Outros aniões como borato, sulfato, carbonato e fosfato são conhecidos como sendo especificamente adsorvidos no hidróxido de alumínio, assim, teoricamente, deverá ser possível deslocar (por competição pelo local de adsorção) o Rotavírus da associação AI(OH)3-Rotavírus. 37 DRVCO 03Α46 + 12 mg de Al(OH)3 em 0,120 mL + 65 mg de Lisina 1,380 mL de H20 + 30 min à T. Ambiente +

Centrifugação 8000 rpm 10 min

Culot Sobrenadante + dissolução em Citrato abaixo da detecção 3,8

Assim, o Rotavírus pode ser libertado da associação Rotavirus-Al(OH)3 e o Rotavírus libertado permanece activo.

Esta libertação pode ser efectuada por dissolução do Al(OH)3 (pelo HC1 no estômago ou por Na3 Citrato in vitro) ou por deslocação do Rotavírus por um aminoácido básico (lisina). 38 5.7: Infectividade da associação AI (OH) 3-Rotavírus

Uma dose única de Rotavírus liofilizado foi reconstituída com água e dividida em duas partes. A primeira parte, considerada como a referência, recebeu um volume adicional de água. A segunda parte recebeu 24 mg de A1(0H)3 suspenso em 0,240 mL de água (Titulações virais pré-clínicas). DRVC003A4 6 + 1,5 mL H20 0,750 mL + 0,240 mL de H20 1 hora 0,750 mL +

24 mg de AI (OH)3 em 0,240 mL 1 hora 6,22 5,55

Quando o AL(OH)3 está presente, o Rotavírus está activo e o valor da titulação virai é superior comparado com a amostra de referência.

Esta experiência foi repetida sem dividir a dose liofilizada e acrescentando 12 mg de Al(OH)3 ou 24 mg de Al(OH)3. 39

Aqui, a amostra de referência foi aquela reconstituída com um tampão de Citrato-Bicarbonato. Assim, o título virai é, novamente, superior na presença de A1(0H)3.

DRVCO 03A46 + 1,5 mL de tampão WL DRVCO 03A46 + 12 mg de AI(OH)3 em 0,120 mL + 1,380 mL de H20 DRVCO 03A46 + 24 mg de AI(OH)3 em 0,240 mL + 1,260 mL de H20 5,34 6,24 6,05 5,32 5,95 6,26

Como no exemplo acima, o Rotavírus associa-se com as partículas de Al(OH)3, uma vez que o vírus pode ser removido por centrifugação. O DRVC003A46 é um Rotavirus formulado liofilizado (Sacarose: 2%; Dextrano: 4%, Sorbitol: 3%; Aminoácidos: 2%). 40 DRVCO 03Α46 + 12 mg de AI(OH)3 em 0,120 mL + 1,380 mL de H20 + DRVC003A46 + 24 mg de AI(OH)3 em 0,240 mL + 1,260 mL de H20 +

Centrifugação 8000 rpm 10 min

Centrifugação 8000 rpm 10 min

+

1,5 mL de SDSAA 5,92 <1,44 6,11 <1,44

Culot Sobrenadante +

1,5 mL de SDSAA 5,78 <1,44 5,96 <1,44 SDSAA = Sacarose a 2%, Dextrano a 4%, Aminoácido a 2%.

De acordo com a titulação virai efectuada no sobrenadante, a quantidade de Al(OH)3 necessária para adsorver o Rotavírus parece ser baixa (começando com uma dose liofilizada de 5,7 log) aumentando a titulação virai): 41 AI (OH) 3 Tempo de adsorção Titulo no sobrenadante 12 mg 1 hora TA 2,7 24 mg 1 hora TA 3,4 48 mg 1 hora TA 3,4 72 mg 1 hora TA 2,0 96 mg 1 hora TA Abaixo da detecção 12 mg Durante a noite 2,7 2 4 mg Durante a noite Abaixo da detecção 48 mg Durante a noite 2,5 12 mg Imediato Abaixo da detecção 2 4 mg Imediato 2,0 48 mg Imediato Abaixo da detecção 0 tempo necessário para adsorver o Rotavírus no A1(0H)3 parece ser curto:

Uma dose de Rotavírus liofilizado foi reconstituída na presença de 24 mg de A1(0H)3 e centrifugada após 0, 15, 60 min e 24 horas. Os "culot" foram ressuspensos em SDSAA antes da titulação virai:

Tempo Culot Sobrenadante 0 min 5, 26 3,17 15 min 5, 34 <1,44 60 min 5, 96 <1,44 24 horas 6, 13 <1,44 42 5.8: Utilizando CaCC>3 como antácido

Para evitar o alumínio na vacina, o antácido A1(0H)3 foi substituído por outro sal inorgânico insolúvel: CaCC>3 (carbonato de cálcio) .

Os fenómenos observados com CaC03 são paralelos aos descritos para A1(0H)3: - Associação do Rotavírus com o sal inorgânico; - Manutenção da actividade do Rotavírus quando associado com o sal inorgânico; - Possibilidade de libertação do Rotavírus da associação por dissolução da base inorgânica por um ácido;

Possibilidade de co-liofilização do antácido e do Rotavírus.

Associação do Rotavírus com CaC03

Num ensaio inicial, o Rotavírus liofilizado (título virai de 5,7), foi reconstituído com uma suspensão de CaC03 em água (50 mg em 1,5 mL); e depois centrifugado e o título virai do sobrenadante comparado com o culot. 43 DRVCO 03Α46 + 50 mg de CaC03 em 1,5 mL de H20 +

Centrifugação 8000 rpm 10 min DRVCO 03A46 + 50 mg de CaC03 em 1,5 mL de H20 +

Centrifugação 8000 rpm 10 min

Culot Sobrenadante + nt

1,5 mL de SDSA A

Culot Sobrenadante + nt 1,5 mL de Citrato de Na 5, 83 4,46 5, 88 4,33

Isto indica que mais de 90% do Rotavirus está associado com o CaC03.

Também, efectuar a originais . guando o vírus estava associado, foi possível titulação e recuperar as guantidades virais

Também, os títulos virais sao, ligeiramente, superiores aos obtidos sem CaC03. 44

DRVCO 03A46 + 1,5 mL de tampão W.L 5,35 DRVC003A46 + 1,5 mL de H20 +

Centrifugação 8000 rpm 10 min "Culot" Sobrenadante 4,99 5,03

Quantidade de CaC03 e associação com o Rotavírus 0 Rotavírus liofilizado foi reconstituído com uma suspensão de CaCC>3 em água (1,5 mL) : 10 mg 5 0 mg 100 mg e, depois, centrifugado, e o título virai do sobrenadante comparado com o do culot.

CaC03 Extempo + Centri. 1 Hora + Centri. Culots Sobrenadante Culots Sobrenadante 100 mg 4,57 3,01 4, 79 3,09 50 mg 4, 17 4, 15 4,22 3,86 10 mg 3,17 4, 77 3,87 4, 87 45

Assim, obviamente, mais CaC03 e mais vírus são associados e menos é encontrado no sobrenadante. Contudo, a dose total não é completamente recuperada (esperado um total de 5,3, pelo menos, ou até mesmo 5,8, como obtido anteriormente - ver acima).

Protecção do Rotavírus pelo CaC03 durante a titulação antácida de Baby Rossett-Rice

Utilizando 10 doses de Rotavírus (DRVC003A46) liofilizado e 50 mg de CaCCR, foram efectuados dois tipos de titulações baby Rossettr-Rice:

Numa titulação de Rossett-Rice clássica, o antácido é misturado com o Rotavírus e é vertido HC1 neste meio.

Na baby Rossett-Rice "invertida", a situação é o oposto: é vertido antácido no conjunto de HC1 (como ocorre in vivo).

Titulação baby Rossett-Rice clássica Rota Liofili. Tampão Título Virai Título Virai armazenado a: Teórico Determinado O O 60 mg de CaC03 5, 3 4,6 1 oo o o O 60 mg de CaC03 5, 3 4,6 d^ o O 24 mg de AI(OH)3 5,4 <2, 9 1 00 o o O 24 mg de AI(OH)3 5,4 <2, 9 46

Titulação baby Rossett-Rice inversa Rota Liofili. Tampão Título Virai Título Virai armazenado a: Teórico Determinado 0 O 60 mg de CaCC>3 5, 3 4,6 1 03 O 0 O 60 mg de CaC03 5, 3 4,6 o O 24 mg de AI(0H)3 5,4 <2, 9 1 03 O O O 24 mg de AI(0H)3 5,4 <2, 9

Assim, nesta experiência in vitro, o carbonato de cálcio é capaz de proteger cerca de 20 % do Rotavirus da presença de HC1, enquanto o hidróxido de alumínio não é capaz. 5.9: Liofilização do Rotavirus na presença do antácido CaC03:

Lote n° Composição Título virai no tempo = zero após liofilização Título virai após liofilização e 1 semana a 37 °C 99K08/01 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 5 0 mg 10b'28 IO5'10 99K08/02 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 6 0 mg 105'16 105'15 47 (continuação)

Lote n° Composição Titulo virai no tempo = zero após liofilização Titulo virai após liofilização e 1 semana a 37 °C 00C24/01 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 6 0 mg Xantano: 0,3% IO5'07 104'69 00C24/03 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 6 0 mg Xantano: 0,3% IO5'07 104'85 00E09/25 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 6 0 mg Xantano: 0,25% Í05'°3 104'91 00E09/30 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 6 0 mg Xantano: 0,30% IO5'01 104'87 00F26/06 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 6 0 mg Amido: 2% o m O \—1 o o \—1 48

Isto é o "todo em um" - liofilização do Rotavírus e antácido (CaC03) em associação no mesmo frasco. Para evitar a sedimentação de CaC03 durante o passo de enchimento, são necessários agentes viscosos. Exemplos de tais agentes de viscosidade incluem Goma de xantano e Amido. A actividade do Rotavírus é mantida mesmo na presença de Goma de xantano e Amido. 5.10 Comprimidos liofilizados para desintegração rápida guando colocados na boca:

As seguintes formulações demonstram o conceito "lyoc". Isto é, a dissolução rápida do bolo liofilizado na boca.

Lote n ° Composição da formulação Título virai antes da liofilização Título virai após liofilização e 1 semana a 37 °C 99B10/06 Sacarose a 4% Glutamato de sódio a 3,7% 48 mg de AI(OH)3 m O i—1 104'53 99C11/12 Maltilol a 3% 4 8 mg de AI(OH) Hidroxipropilmetil-celulose: 1% 104'16 49

Lote n° Composição da formulação Titulo virai no tempo = zero após da liofilização Titulo virai após liofilização e 1 semana a 37 °C 00C24/05 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 60 mg Xantano: 0,3% Í05'02 104'54 00C24/06 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% CaC03: 60 mg Xantano: 0,3% 104'86 104'56 00F26/11 Sacarose: 1% Dextrano: 2% Sorbitol: 1,5% Aminoácidos: 1% CaC03: 60 mg Amido: 2% o O \—1 o O \—1

No "conceito lyoc" o Xantano e o Amido podem ser utilizados (mantendo das propriedades de dissolução rápidas do bolo liofilizado). 50

Exemplo 6: Utilização de Carbonato de Cálcio como antácido para a composição de vacina de Rotavirus

Quando é utilizada uma suspensão de CaC03 em água como o antácido para o Rotavirus, existe o problema de sedimentação rápida das partículas de carbonato de cálcio quando colocadas em água, uma vez que o valor de densidade do pó é de, aproximadamente, 2,6 e o tamanho médio de partícula é de 30 pm.

Esta sedimentação pode ser retardada por: 1 aumento da densidade do meio circundante 2 aumento da viscosidade do meio circundante 3 redução do tamanho das partículas 4 manter as partículas afastadas umas das outras 6.1: Aumento da densidade do meio circundante:

Quando a suspensão de CaC03-Agua (quando colocada na seringa) é colocada no bolo liofilizado (contendo sacarose a 2%, dextrano a 4%; sorbitol a 3%; aminoácidos a 2%) a densidade do meio circundante é aumentada, mas a velocidade de sedimentação do CaC03 não é muito diferente da suspensão de CaC03-Água. 51 6.2 Aumento da viscosidade do meio circundante:

Excipientes pseudoplásticos

Uma solução pseudoplástica é definida como uma solução com uma viscosidade superior em repouso em comparação com a sua viscosidade sob agitação.

Excipientes convencionais deste tipo são: polímeros naturais, por exemplo: goma arábica goma de adraganto ágar-ágar alginatos pectinas polímeros semi-sintéticos, por exemplo: carboximetilcelulose (Tyloses C®) metilcelulose (Methocels A®, Viscotrans MC®, Tylose MH® e MB®) hidroxipropilcelulose (Klucels®) 52 hidroxipropilmetilcelulose (Methocels E® e K®, Viscontrans MPHC®)

No geral, sao utilizados excipientes pseudoplásticos em conjunto com agentes tixotrópicos.

Excipientes pseudoplásticos com baixa capacidade de fluidez

Os polímeros, a uma concentração suficiente, dão origem a um arranjo fluido estrutural que resulta numa solução de elevada viscosidade com uma baixa capacidade de fluidez em repouso. É necessário administrar uma certa quantidade de energia ao sistema para permitir fluir e transferir. São necessárias energias externas (agitação) para destruir, temporariamente, o rearranjo fluido estrutural de modo a obter uma solução fluida.

Exemplos de tais polímeros são o Carbopols® e a goma de Xantano.

Excipientes tixotrópicos

Com estes excipientes, em repouso, é obtida uma estrutura em gel; enquanto que sob agitação é obtida uma solução fluida.

Exemplos de excipientes tixotrópicos são: Veegum® (silicato de Alumínio-Magnésio) e Avicel RC® (cerca de 89% de celulose microcristalina e cerca de 11% de Carboximetilcelulose de Na). 53 6.3 Redução do tamanho das partículas

Uma redução no tamanho das partículas de CaC03 resultou numa diminuição na capacidade de antácido do composto. 6.4 Manter as partículas afastadas umas das outras

Este é o caso em Veegum® e Avicel®, para as quais as partículas insolúveis menores (cerca de 1 ym) que as partículas de CaC03, são colocadas entre as partículas de CaCC>3 de modo a evitar a agregação.

Exemplo 7: Concepção do produto

Os seguintes esquemas demonstram exemplos possíveis de concepções do produto. 7.1 CaC03 na seringa Já com liofilizados, reconstituição em frascos líquido de os lotes clínicos de Rotavírus o antácido pode ser colocado no contido na seringa.

Seringa com 1,3 mL de

CaC03 (60 mg/mL)

Agulha

Rotavírus liofilizado 54

Nesta apresentação do produto, a sedimentação de CaC03 deve estar sob controlo, não apenas durante os passos de enchimento, mas também durante todo o tempo de armazenamento estável do produto (pelo menos 2 anos). 7.2 CaC03 no frasco de liofilizado

Seringa com 1,3 mL de Água

Agulha

Frasco de Rotavírus liofilizado + CaC03 (60 mg) Xantano 7.3 liofilização em blister

Neste caso, o Rotavírus, CaCCR liofilizados em conjunto, directamente, e Goma de no blister. xantano sao

I 'V t -»Ί Γ~~\ I I 55

Exemplo δ: Liofilização de estirpes diferentes de Rotavirus

Lote n° Estirpe de Rotavirus Composição da formulação Titulo virai ao t = zero após a liofilização Titulo virai após a liof ilização e 1 semana a 37 °C 00F26/01 G1 SB purif n°61 PRO/0232 Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% 104'6 O \—1 00F26/02 G2 (DS-1) Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% O \—1 o \—1 00F26/03 G3 (P) Sacarose:2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% 104'6 104'5 00F26/04 G4 (VA-70) Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% 104'8 00 O \—1 00F26/05 G9 (W161) Sacarose: 2% Dextrano: 4% Sorbitol: 3% Aminoácidos: 2% 104'6 104'5

As estirpes DS-1, P e VA70 são descritas como estirpes humanas de Rotavirus de referência para o serotipo G2, G3 e G4 respectivamente, na página 1361 de "Fields" Raven Press 1990, segunda edição. 56

Nesta experiência, foram liofilizadas diferentes estirpes de Rotavirus.

Para todas, ambos os titulos virais foram mantidos durante a liofilização e foi apresentada uma estabilidade acelerada (uma semana a 37 °C).

Exemplo 9: Estudo de segurança de Fase I em adultos de uma administração oral da vacina de Rotavirus.

Foi efectuado um estudo de Fase I para avaliar a segurança e reactogenecidade de uma dose oral única de IO6,0 ffu da vacina P43 em adultos saudáveis com idades entre os 18 e os 45 anos. 0 ensaio clínico foi duplo cego e aleatório. Foi controlado por placebo e independente. 0 estudo foi efectuado num único centro na Bélgica.

Populaçao em Estudo

Foi recrutado um total de 33 indivíduos, 11 no grupo placebo e 22 no grupo de vacina e todos concluíram o estudo. Todos os voluntários eram Caucasianos. A sua idade média no momento da vacinação era de 35,3 anos, com uma gama de 18 a 44 anos. 0 ensaio começou em Janeiro e decorreu durante guase um mês. 57

Material

Vacina

Foram produzidos, purificados, formulados e lotes clínicos de P43, de acordo com as Boas Fabrico. Os lotes foram liberados por Quality Quality Assurance. Cada frasco da vacina continha componentes: liofilizados Práticas de Control and os seguintes

Ingrediente activo:

Estirpe P43

Min. 105'8 ffu

Excipientes, estabilizantes:

Sacarose Dextrano Sorbitol Aminoácidos 9 mg 18 mg 13,5 mg 9 mg

Placebo

Foram preparados e liberados frascos de placebo. Cada frasco de placebo continha os seguintes componentes: 58

Excipientes, estabilizantes: 9 mg 18 mg 13,5 mg 9 mg

Sacarose

Dextrano

Sorbitol

Aminoácidos

Diluente

Foi utilizada água para injecção como diluente para reconstituir a vacina e o placebo.

Administração

Aproximadamente 10 a 15 minutos antes da administração da vacina ou do placebo, foram administrados, oralmente, 10 mL de Mylanta® aos indivíduos de ambos os grupos. Mylanta® é um antácido registrado. O antácido aumenta o pH do estômago e previne a inactivação do rotavírus durante a sua passagem pelo estômago.

Para preparar a vacina, foram reconstituídos dois frascos de P43 liofilizados contendo 105'8 ffu por frasco, com 1,5 mL de água como diluente diluente para injecção. Isto atingiu um título virai calculado de 106'1 ffu por dose. A vacina reconstituída foi administrada prontamente como uma dose oral única. 59

Para preparar o placebo, foram reconstituídos dois frascos de placebo liofilizado com 1,5 mL de água para injeção e administrados oralmente como uma dose única.

Segurança e Reactogenicidade

Foram aplicados os seguintes critérios de segurança e reactogenicidade:

Os sintomas gerais solicitados foram febre, diarreia, vómitos, náuseas, dor abdominal e perda de apetite. Estes foram registrados durante oito dias após a administração.

Os sintomas não solicitados foram registrados durante 30 dias após administração.

Os efeitos aversos graves foram registrados durante todo o período de estudo.

As amostras de diarreia são para ser recolhidas durante oito dias após a administração.

Os resultados foram:

Durante os respectivos períodos de observação não foi informado nenhum sintoma solicitado, não solicitado e nenhum acontecimento adverso grave. Não foi registado nenhum caso de diarreia. 60

Conclusões segura em relação ao de um modo de dupla 106'1 ffu a voluntários A vacina P43 SB Biologicals foi placebo quando administrada oralmente, ocultação, como uma dose única na dose de adultos saudáveis dos 18 aos 44 anos.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> GlaxosmithKline Biologicals S.A. <120> Vacina <130> B45194 Divl <160> 34 <170> FastSEQ para Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 2350

<212> ADN <213> Homo Sapiens <400> 1 atggcttcac tcatttatag acaacttctc actaattcat attcagtaga tttacatgat 60 gaaatagagc aaattggatc agaaaaaact cagaatgtaa ctataaatcc gggtccattt 120 gcacagacta gatatgctcc agtcaattgg gatcatggag agataaatga ttcgactaca 180 gtagaaccaa ttttagatgg tccttatcag ccaactacat ttactccacc taatgattat 240 tggatactta ttaattcaaa tacaaatgga gtagtatatg aaagtacaaa taatagtgac 300 ttttggactg cagtcgttgc tattgaaccg cacgtcaacc cagtagatag acaatatatg 360 atatttggtg aaagcaagca atttaatgtg agtaacgatt caaataaatg gaagttttta 420 gaaatgttta gaagcagtag tcaaaatgaa ttttataata gacgtacatt aacttctgat 480 accagacttg taggaatatt taaatatggt ggaagagtat ggacatttca tggtgaaaca 540 ccgagagcta ctactgacag ttcaagtact gcaaatttaa ataatatatc aattacaatt 600 cattcagaat tttacattat tccaaggtcc caggaatcta aatgtaatga atatattaat 660 aatggtctgc caccaattca aaatactaga aatgtagttc cattgccatt atcatctaga 720 tcgatacagt ataagagagc acaagttaat gaagacatta tagtttcaaa aacttcatta 780 tggaaagaaa tgcagtataa tagggatatt ataattagat ttaaatttgg taatagtatt 840 gtaaagatgg gaggactagg ttataaatgg tctgaaatat catataaggc agcaaattat 900 caatataatt acttacgtga cggtgaacaa gtaaccgcac acaccacttg ttcagtaaat 960 ggagtgaaca attttagcta taatggaggg tttctaccca ctgattttgg tatttcaagg 1020 tatgaagtta ttaaagagaa ttcttatgta tatgtagact attgggatga ttcaaaagca 1080 tttagaaata tggtatatgt tagatcatta gcagctaatt taaattcagt gaaatgtaca 1140 ggtggaagtt attatttcag tataccagta ggtgcatggc cagtaatgaa tggtggcgct 1200 gtttcgttgc attttgccgg agttacatta tccacgcaat ttactgattt tgtatcatta 1260 aattcactac gatttagatt tagtttgaca gttgatgaac cacctttctc aatactgaga 1320 acacgtacag tgaatttgta tggattacca gccgctaatc caaataatgg aaatgaatac 1380 tacqaaatat caggaaggtt ttcactcatt tctttagttc caactaatga tgattatcag 1440 61 actccaatta tgaattcagt gacggtaaga caagatttag agcgccaact tactgattta 1500 cgagaagaat ttaactcatt gtcacaagaa atagctatgg cacaattgat tgatttagca 1560 ctgttgcctc tagatatgtt ttccatgttt tcaggaatta aaagtacaat tgatttaact 1620 aaatcaatgg cgactagtgt aatgaagaaa tttagaaaat caaaattagc tacatcaatt 1680 tcagaaatga ctaattcatt gtcagatgct gcttcatcag catcaagaaa cgtttctatt 1740 agatcgaatt tatctgcgat ttcaaattgg actaatgttt caaatgatgt gtcaaacgta 1800 actaattcat tgaacgatat ttcaacacaa acatctacaa ttagtaagaa acttagatta 1860 aaagaaatga ttactcaaac tgaaggaatg agctttgacg acatttcagc agctgtacta 1920 aaaacaaaaa tagatatgtc tactcaaatt ggaaaaaata ctttacctga tatagttaca 1980 gaagcatctg agaaatttat tccaaaacga tcatatcgaa tattaaagga tgatgaagta 2040 atggaaatta atactgaagg aaaattcttt gcatacaaaa ttaatacatt tgatgaagtg 2100 ccattcgatg taaataaatt cgctgaacta gtaacagatt ctccagttat atcagcgata 2160 atcgatttta agacattgaa aaatttaaat gataattatg gaatcactcg tacagaagcg 2220 ttaaatttaa ttaaatcgaa tccaaatatg ttacgtaatt tcattaatca aaataatcca 2280 attataagga atagaattga acagttaata ctacaatgta aattgtgaga acgctattga 2340 ggatgtgacc 2350

<210> 2 <211> 1009 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 atgtatggtc ttgaatatac cacaattcta atctttctga tatcaattat tctactcaac 60 tatatattaa aatcagtaac tcgaataatg gactacatta tatatagatc tttgttgatt 120 tatgtagcat tatttgcctt gacaagagct cagaattatg ggcttaactt accaataaca 180 ggatcaatgg acactgtata cgctaactct actcaagaag gaatatttct aacatccaca 240 ttatgtttgt attatccaac tgaagcaagt actcaaatta atgatggtga atggaaagac 300 tcattgtcac aaatgtttct cacaaaaggt tggccaacag gatcagtcta ttttaaagag 360 tattcaagta ttgttgattt ttctgtcgat ccacaattat attgtgatta taacttagta 420 ctaatgaaat atgatcaaaa tcttgaatta gatatgtcag agttagctga tttaatattg 480 aatgaatggt tatgtaatcc aatggatata acattatatt attatcaaca atcgggagaa 540 tcaaataagt ggatatcaat gggatcatca tgtactgtga aagtgtgtcc actgaatacg 600 caaatgttag gaataggttg tcaaacaaca aatgtagact cgtttgaaat ggttgctgag 660 aatgagaaat tagctatagt ggatgtcgtt gatgggataa atcataaaat aaatttgaca 720 actacgacat gtactattcg aaattgtaag aagttaggtc caagagagaa tgtagctgta 780 atacaagttg gtggctctaa tgtattagac ataacagcag atccaacgac taatccacaa 840 actgagagaa tgatgagagt gaattggaaa aaatggtggc aagtatttta tactatagta 900 gattatatta accaaatcgt gcaggtaatg tccaaaagat caagatcatt aaattctgca 960 gctttttatt atagagtata gatatatctt agattagatc gatgtgacc 1009

<210> 3 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 3 ggctttaaaa gagagaattt ccgtctgg 28 62

<210> 4 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 4

ggttagctcc ttttaatgta tggta 25 <210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 5

ggtcacatcg aacaattcta atctaag 27 <210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 6

caagtactca aatcaatgat gg 22 <210> 7 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial 63 <220> <223> oligonucleótido <400> 7 tgttgatttt tctgtcgatc cac 23

<210> 8 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 8 ggttgctgag aatgagaaat tagctatagt gg 32

<210> 9 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 9 ccactatagc taatttctca ttctcagcaa cc 32

<210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <40 0> 10 tggcttcgcc attttataga ca 22 64

<210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 11 atttcggacc atttataacc 20

<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 12 tggcttcact catttataga ca 22

<210> 13 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 13 atttcagacc atttataacc tag 23 <210> 14 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido 65 29 <4 Ο 0> 14 ggagtagtat atgaaagtac aaataatag <210> 15 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 15 ctattatttg tactttcata tactactcc 29 <210> 16 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <40 0> 16 tcgatacagt ataagagagc acaag 25 <210> 17 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 17 ttcattaact tgtgctctct tatactg 27 <210> 18 <211> 22 66

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 18 gtatatgtag actattggga tg 22 <210> 19 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <40 0> 19 catcccaata gtctacatat ac 22 <210> 20 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 20 tgtaactccg gcaaaatgca acg 23 <210> 21 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido 67 23 <4Ο0> 21 cgttgcattt tgccggagtt aca <210> 22 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <40 0> 22 gtaagacaag atttagagcg cca 23 <210> 23 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 23 tggcgctcta aatcttgtct tac 23 <210> 24 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artific :ial <22 0> <223> oligonucleótido <40 0> 24 cttgatgctg atgaagcagc atctg 25 <210> 25 <211> 25 68

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 25 cagatgctgc ttcatcagca tcaag 25

<210> 26 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 26 cgatcatatc gaatattaaa ggatg 25

<210> 27 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 27 catcctttaa tattcgatat gatcg 25

<210> 28 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 28 agcgttcaca caatttacat tgtag 25 69

<210> 29 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 29 agtattttat actatagtag attatattaa tc 32

<210> 30 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 30 agtattttat actatggtag attatattaa tc 32 <210> 31 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <40 0> 31 atccccatta tactgcattc ctttc 25 <210> 32 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido 70 <4Ο0> 32 atccctatta tactgcattt ctttc 25

<210> 33 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> <223> oligonucleótido <400> 33 atccccatta tactgcattt ctttc 25

<210> 34 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> oligonucleótido <400> 34 atccctatta tactgcattc ctttc 25

Lisboa, 26 de Março de 2010 71

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Reassociação de rotavírus compreendendo, pelo menos, um antigénio ou, pelo menos, um segmento ou parte de um segmento da variante de rotavírus designada por P43 e depositada com a ECACC sob o número de acesso 99089301, descendentes de rotavírus e seus derivados imunologicamente activos e materiais obtidos a partir destes e em que a referida variante é definida por uma sequência nucleotídica codificando, pelo menos, uma das proteínas virais principais designadas por VP4 e VP7.
2. 2. Reassociação de rotavírus, como reivindicado na reivindicação 1, em que a variante substancialmente simples é uma variante na qual o gene VP4 compreende uma sequência nucleotídica compreendendo, pelo menos, um dos seguintes: uma base adenina (A) na posição 788, uma base adenina (A) na posição 802 e uma base timina (T) na posição 501, a partir do codão de iniciação.
3. 3. Reassociação de rotavírus, de acordo com a reivindicação 2, em que o gene VP4 compreende uma sequência nucleotídica compreendendo uma base adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma base timina (T) , na posição 501 a partir do codão de iniciação.
4. 4. Reassociação de rotavírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a variante substancialmente simples é uma variante na qual o gene VP7 compreende uma sequência nucleotídica compreendendo, pelo menos, um dos seguintes: uma timina (T) na posição 605, uma adenina (A) 1 na posição 897 e uma guanina (G) na posição 897 a partir do codão de iniciação.
5. 5. Reassociação de rotavírus, de acordo com a reivindicação 4, em que o gene VP7 compreende uma sequência nucleotídica compreendendo uma timina (T) na posição 605 e uma adenina (A) ou uma guanina (G) na posição 897 a partir do codão de iniciação.
6. 6. Reassociaçao de rotavírus, de acordo com uma das reivindicações 2 a 5, em que o gene VP4 compreende uma sequência nucleotídica compreendendo uma adenina (A) nas posições 788 e 802 e uma timina (T) na posição 501, a partir do codão de iniciação: e o gene VP7 compreende uma sequência nucleotídica compreendendo uma timina (T) na posição 605 e uma adenina (A) na posição 897 a partir do codão de iniciação.
7. 7. Reassociação de rotavírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que compreende uma sequência nucleotídica codificando uma proteína VP4, em que a sequência nucleotídica é como apresentado na Figura 1 e/ou uma sequência nucleotídica codificando uma proteína VP7, em que a sequência nucleotídica é como apresentado na Figura 2.
8. 8. Reassociação de rotavírus, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o segmento ou segmento parcial codificando para NSP4 é um segmento ou segmento parcial de P43 .
9. 9. Composição de vacina, compreendendo um reassociação de rotavírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 8, misturada com um veículo ou adjuvante farmacêutico adequado.
10. 10. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 9, adaptada para administração oral.
11. 11. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 10, na qual a reassociação de rotavírus é formulada com uma composição de antácido.
12. 12. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, em que a composição de antácido compreende um antácido orgânico.
13. 13. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12, em que o antácido é o citrato de sódio.
14. 14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, em que a composição de antácido compreende um antácido inorgânico.
15. 15. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 14, em que o antácido é hidróxido de alumínio.
16. 16. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 14, em que o antácido é o carbonato de cálcio.
17. 17. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 16, que compreende ainda um agente de viscosidade.
18. 18. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 17, em que o agente de viscosidade é goma de xantano.
19. 19. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-18, em que a reassociação de rotavírus é 3 formulada com carbonato de cálcio e goma de xantano e reconstituída com solução aquosa.
20. 20. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 19, em que a reassociação de rotavírus é formulada com a composição de antácido e liofilizada numa embalagem de blister.
21. 21. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 20, em que o vírus está na forma liofilizada.
22. 22. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 21, em que a reassociação de rotavírus e a composição de antácido estão presentes em recipientes separados para formulação como uma composição de vacina líquida antes da administração.
23. 23. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 21, em que a reassociação de rotavírus e a composição de antácido estão presentes no mesmo recipiente para formulação como uma composição de vacina liofilizada, para ser reconstituída com solução aquosa antes da administração.
24. 24. Método de preparação de uma vacina de rotavírus compreendendo misturar uma reassociação de rotavírus, como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 8, com um antácido e um agente de viscosidade.
25. 25. Método de preparação de uma vacina de rotavírus, como reivindicado em qualquer das reivindicações 9 a 23, compreendendo misturar uma reassociação de rotavírus com um veículo ou adjuvante farmaceuticamente adequado. 4 Utilização de uma reassociaçao de rotavirus na preparaçao 26 . de uma vacina, como reivindicado em qualquer reivindicações 9 a 23, para a prevenção de infecção rotavirus num indivíduo humano.
26. 27. Formulação de vacina, como reivindicado em qualquer reivindicações 9 a 23, para utilização em medicina. Lisboa, 26 de Março de 2010 das por das 5