PT1625152E - Péptidos moduladores da actividade do factor de transcrição engrailed - Google Patents

Péptidos moduladores da actividade do factor de transcrição engrailed Download PDF

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Michel Volovitch
Laure Sonnier
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Description

1
DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS MODULADORES DA ACTIVIDADE DO FACTOR DE TRANSCRIÇÃO ENGRAILED" A invenção diz respeito a péptidos capazes de modificar a actividade dos factores de transcrição "Engrailed" .
As proteínas Engrailed são factores de transcrição da classe das proteínas como homeodomínio. Os mamíferos possuem dois homólogos de Engrailed : Engrailed-1 e Engrailed-2; estas duas proteínas, que possuem uma actividade semelhante, serão colectivamente designadas doravante neste documento sob a designação geral de Engrailed (EN).
Tanto no recém-nascido como no adulto a EN está expressa nos neurónios dopaminérgicos (DA) da substância negra (que sofrem degenerescência na doença de Parkinson) e nos núcleos da rafe e do locus coeruleus que desempenham um papel importante na regulação do humor e na criação dos comportamentos de vício.
Demonstrou-se (SIMON et al. J Neurosci. 21(9) : 3126-34, 2001) que à perda de EN durante o desenvolvimento se segue com bastante rapidez a degenerescência dos 2 neurónios dopaminérgicos, e que um dos alvos transcricionais da EN é a alfa-sinucleína, cuja ligação genética com determinadas formas de tipo familiar da doença de Parkinson foi demonstrada (POLYMEROPOULOS et al. , Science. 276,2045-7, 1997), e que constituiria um regulador negativo da transmissão dopaminérgica (ABELIOVICH et al., Neuron, 25, 239-52, 2000). O conjunto destas observações sugere fortemente a implicação da Engrailed nas patologias neurodegenerescentes, e nomeadamente nas patologias que afectem os neurónios dopaminérgicos, tais como a doença de Parkinson. A sua expressão nos neurónios da rafe e do locus coeruleus levanta a hipótese de uma implicação noutras patologias, tais como as disfunções do temperamento ou os vícios.
Aparenta portanto ser especialmente desejável dispor de moduladores da actividade da Engrailed.
Os Inventores investigaram se existiriam péptidos capazes de modular a actividade da Engrailed por fixação a essa proteína. Desta forma identificaram dois péptidos que se fixam sobre a Engrailed, e podem modular de modo específico a sua actividade, in vitro, bem como in vivo.
Estes péptidos: SWWETQLIASSG (Péptido 1 SEQ ID N° : 1) e WSWNEEVWFPFT (Péptido 2 ; SEQ ID N° . 2) são representados na figura 1. 3
Nas células transformadas que sobre expressam Engrailed, o péptido 1 tem um efeito activante, enquanto que o péptido 2 tem um efeito inibidor. Num contexto fisiológico, ambos os péptidos têm efeito activante.
Para além disto, os Inventores constataram que estes péptidos conferiam propriedades de activação da transcrição ao homeodomínio da Engrailed, que, por si próprio, não possui propriedades desse tipo. A invenção presente tem como objecto um péptido capaz de se fixar ao factor de transcrição Engrailed, e de regular a actividade do dito factor de transcrição.
De acordo com um modo de realização preferido da invenção presente, o péptido referido é escolhido entre os péptidos com a sequência SWWETQLIASSG e a WSWNEEVWFPFT. A invenção presente tem igualmente como objecto a utilização de um péptido para regular a actividade do factor de transcrição Engrailed numa célula viva.
Para a operacionalidade da invenção presente, o péptido referido pode ser introduzido na célula de diversos modos diferentes.
Ele pode vantajosamente ser associado a um péptido que contenha um domínio transdutor. 4
Designa-se pela expressão "domínio transdutor" uma sequência peptídica capaz de penetrar no interior de uma célula viva, independentemente da presença de transportadores ou de receptores específicos, e capaz de importar para a célula referida moléculas ou complexos moleculares de natureza variada (ácidos nucleicos, proteínas, péptidos/ácidos nucleicos, análogos de nucleótidos, liposomas), habitualmente designados sob a termo geral de "cargas". São conhecidos por eles próprios, péptidos transdutores de diferentes tipos. Pode encontrar-se uma revisão, por exemplo em LIDGREN et ai. , TiPS, 21, 99-102, (2000) ; SCHWARZE e DOWDY, TiPS, 21,45-48, (2000); SCHWARZE et al. Trends Cell. Biol., 10, 290-295, (2000); PROCHIANTZ Current Opinion in Cell Biology, 12, 400-406, (2000); Cell-Penetrating Peptides. Processes and applications. Ed. Ulo Langel. CRC Press (2002).
De acordo com um modo preferido de desempenho da invenção presente, pode associar-se um péptido regulador consoante a invenção, a um péptido contendo um domínio transdutor, do tipo penetratina, derivado da terceira hélice de um homeodomínio; São descritos alguns péptidos da família das penetratinas, por exemplo nas publicações de JOLIOT et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 1864-1868, (1991); DEROSSI et al. J. Biol. Chem., 269, 14, 10444-10450, (1994); BRUGIDOU et al. Biophys. Biochem. Res.Com., 5 214, 685-693, (1995), bem como na Patente US 5.888.762, na Patente US 6.080.724, ou no Pedido PCT WO 00/01.417 ou no Pedido PCT WO 00/29.427. A invenção presente tem igualmente como objecto uma composição contendo um péptido regulador de acordo com a invenção, associado a um péptido contendo um domínio transdutor, de preferência um domínio transdutor do tipo penetratina.
De acordo com um modo de realização preferido de uma composição de acordo com a invenção, o péptido regulador de acordo com a invenção está associado à Engrailed, ou a um fragmento de Engrailed que inclua pelo menos o seu homeodomínio. A associação entre estes péptidos pode efectuar-se por ligação covalente, tal como descrito nos domínios mencionados adiante, ou também por ligação não covalente, tal como descrito no Pedido FR 03/00093. A invenção presente engloba também todos os polipéptidos quiméricos que incluam um péptido de acordo com a invenção, fundido a um péptido heterólogo. De acordo com um moo de realização particular da invenção presente, o péptido heterólogo referido inclui pelo menos um domínio transdutor, de preferência um domínio transdutor do tipo penetratina. De acordo com um modo de realização preferido de um polipéptido quimérico de acordo com a invenção, 6 trata-se de um factor de transcrição quimérico, incluindo um péptido de acordo com a invenção fundido a um fragmento de Engrailed que inclua pelo menos o seu homeodomínio. A invenção presente tem igualmente como objecto um polinucleótido seleccionado de entre: - um polinucleótido que codifique para um péptido regulador de acordo com a invenção; um polinucleótido que codifica para um polipéptido quimérico de acordo com a invenção. A invenção presente engloba igualmente um vector recombinante que inclui um polinucleótido de acordo com a invenção. A invenção presente engloba também uma composição contendo um polinucleótido que codifica para um péptido regulador de acordo com a invenção e para um polinucleótido que codifique para um péptido heterólogo, nomeadamente um péptido contendo um domínio transdutor, de preferência um domínio transdutor do tipo penetratina. Uma composição de acordo com a invenção pode por exemplo incluir um vector recombinante incluindo uma codificando para um péptido regulador de acordo com a invenção, e uma sequência que codifique para o péptido heterólogo referido, podendo as duas sequências ser adjacentes ou não. Em alternativa, uma composição de acordo com a invenção pode incluir dois 7 vectores diferentes, um deles contendo uma sequência codificando para um péptido regulador de acordo com a invenção, e a outra contendo uma sequência codificando para o péptido heterólogo.
Podem ser utilizados vectores que incluam um polinucleótido de acordo com a invenção, se tal se pretender, para introduzir e expressar esse polinucleótido na célula na qual se pretende regular a expressão da Engrailed.
Podem empregar-se para este efeito os vectores habitualmente utilizados para exprimir um gene que tenha interesse, em células animais, por exemplo vectores virais. De forma vantajosa, pode utilizar-se como vector um bacteriófago sobre o qual esteja absorvido um péptido transdutor, tal como os que foram descritos no Pedido FR 03/00093. A invenção presente tem igualmente como objecto a utilização de um péptido, de um polinucleótido, ou de uma composição tal como as que se definiram acima, para a obtenção de um medicamento, utilizável nomeadamente no quadro do tratamento de patologias do sistema nervoso, por exemplo de patologias neurodegenescentes, tais como a doença de Parkinson. A invenção presente será mais bem compreendida recorrendo ao complemento da especificação que se seguirá. 8 que se refere a exemplos não limitativos ilustrando a obtenção de péptidos capazes de se fixar sobre a Engrailed, e de modular a sua actividade.
EXEMPLO 1 : OBTENÇÃO DE PÉPTIDOS CAPAZES DE
MODULAR A ACTIVIDADE DA ENGRAILED 1) Sistema de teste da actividade da Engrailed
Avalia-se a actividade transcricional da Engrailed tal como foi descrito por MONTESINOS et al. (J.
Neurosci., 21, 3350-9, 2001), pela medição da expressão do gene de reporte da luciferase colocado no plasmídeo pMAP-luc sob o controlo de um promotor alvo da Engrailed, o promotor MAP1B (proteína 1B associada a microtúbulos).
Colocam-se em cultura células da linhagem neuroepitelial CHP 100 (SCHLESINGER et al., Câncer Res. 36, 3904-3100, 1976), em meio RPMI 1640 (Life Technologies,
Gaithersburg, MD) com adição de glucose 16 mM, soro fetal bovino a 15%, 5U/mL de penicilina e 5 μg/mL de estreptomicina, e co-transfectadas por electroporação com pMAP-luc e com um dos vectores seguintes: pCL9mEn2 (MAINGUY et al., Nat Biotechnol. 18: 746-749, 2000), que contém a sequência que codifica para a proteína Engrailed-2 de frango inteira, sob controlo do promotor CMV ; 9 pCL9mEn2AHl (JOLIOT et ai. , Curr Biol. 8 : 856-863, 1998), que contém a sequência de codificação para a proteína Engrailed-2 de frango, na qual foram retirados os aminoácidos 36 a 46 do homeodomínio (sequência que permite a ligação ao ADN), sob o controlo do promotor CMV; pCL9mHDEn2C, que contém a sequência que codifica para a proteína Engrailed-2 de frango, à qual foram retirados aminoácidos 10 a 185, sob o controlo do promotor CMV; A electroporação é efectuada com 10 pg de ADN plasmídico no máximo (2 μg de plasmídeo de reporte pMAP-luc + quantidades variáveis de vector de expressão de En2) de para 8xl05 células em 350 μΐι de meio, a 1050 pF e 260 mV. Adiciona-se em seguida 400 μΐι de meio e deixa-se repousar durante 10 min. Colocam-se então as células em cultura, após uma lavagem, em duas caixas (com diâmetro de 3,5 cm).
Doseia-se a actividade da luciferase 24 horas depois da transfecção. Lavam-se as células com PBS. Adiciona-se às células tampão de lise (Tris/H3P04 pH 7,8 20 mM, MgCl2 10 mM, glicerol a 15%, EDTA 1 mM, Triton-X 100 a 1%, ATP 1,25 mM, luciferina a 10 pg/mL). Depois da incubação durante 30 min a 4°C, leva-se a cabo a medição da actividade da luciferase por luminometria (luminómetro Lumat LB 9501 Berthold). 10
Os resultados estão ilustrados nas figuras 2A e 2B. A Figura 2A mostra que a proteína Engrailed-2 (En2) é capaz de activar a expressão do promotor MAP1B de um modo dependente da dose. A Figura 2B mostra que essa activação necessita de uma ligação do homeodomínio ao promotor. Este não é com efeito activado pela proteína recombinante ΕΝ2ΔΗ1. O promotor MAP1B também é activado por uma outra proteína com homeodomínio, a HOXA5. 2) Selecção de péptidos capazes de se fixarem à
Engrailed.
Pesquisaram-se péptidos que se ligam especificamente à Engrailed por despiste utilizando um banco de fagos (PhD-12, New England Biolabs) expressando na sua superfície péptidos aleatórios com 12 aminoácidos.
Obtiveram-se dessa forma diversos péptidos capazes de se fixarem sobre a Engrailed.
Os dois péptidos mais representados são o SWWETQLIASSG (Pepl; SEQ ID N°: 1) e WSWNEEVWFPFT (Pep2; SEQ ID N° : 2) . Escolheram-se estes péptidos para testar o seu efeito sobre a actividade transcricional da Engrailed. Ilustram-se as sequências desses péptidos pela figura 1.
As sequências que codificam para Pepl ou para Pep2 foram colocadas no vector pCS2+ (TURNER e WEINTRAUB, Genes and Development. 8: 1311-1323, 1994), para se obterem respectivamente os vectores de expressão pCS2-pepl e pCS2-pep2. 3) Teste do efeito dos péptidos seleccionados sobre a actividade da Engrailed nas células CHP100.
As células CHP100 são co-transfectadas por electroporação, tal como descrito adiante neste documento, com pMAP-luc (2 μ9), com pCL9mEn2 ou com pCL9mHDEn2C (4 μ9) e com 4 μ9 de pCS2-pepl ou de pCS2-pep2. A Figura 3A mostra que quando o péptido 1 é introduzido nas células ao mesmo tempo que a Engrailed (pepl+En2), a activação do MAP1B é aumentada em cerca de 50%. O péptido por si só não tem acção sobre esse promotor (pepl). O promotor MAP1B não é activo por si próprio nesse tipo celular (maplb). A Figura 3B mostra que o péptido HDEn2C (constituído principalmente pelo homeodomínio da Engrailed) não activa senão fracamente o promotor MAP1B (HDEn2C), e que essa activação é fortemente aumentada pelo péptido 1 (HDEn2C+pepl). A Figura 4A mostra que o péptido 2, que não tem 12 efeito por ele próprio sobre MAP1B (pep2), é inibidor da activação de MAP1B pela Engrailed (pep2+En2), e pelo contrário, aumenta a activação da MAP1B pelo péptido HDEn2C (HDEn2 C+pep2) . A Figura 4B mostra que um péptido de controlo (aOTX2) da sequência KVWDIRYTTPHA (SEQ ID N° : 3) e que se fixa especificamente à homeoproteína 0TX2 não modifica a activação de MAP1B pela Engrailed (aOTX2+En2). O efeito do péptido aOTX2 e o da Engrailed são puramente aditivos. 4) Teste do efeito dos péptidos seleccionados sobre a actividade da Engrailed nas culturas primárias de neurónios do mesencéfalo.
Com a finalidade de verificar a funcionalidade dos péptidos 1 e 2 num contexto celular fisiológico, o efeito desses péptidos foi testado nas culturas primárias de neurónios do mesencéfalo de embrião de murganho.
Incubam-se fragmentos do mesencéfalo de murganho (do dia embrionário 13,5) durante 5 min. a 24°C em tripsina-EDTA, e depois lavam-se com um tampão fosfato de pH 7,5 ao qual se adicionou glucose 33 mM, (PBS) e 10 % de soro fetal bovino, e em seguida incubam-se durante 10 min. a 37°C em Dnasel (Sigma, Saint Louis, MO) a 30 μΜ/mL. Dissociam-se as células mecanicamente, lavam-se por três 13
vezes com o PBS, e colocam-se em cultura, à densidade celular de 200.000 células/cm2, em poços anteriormente saturados com D, L-poliornitina (a 1,5 μ9/πιΙ>) e com laminina (a 5 μ9/ιηΒ) . O meio de cultura (MMS) é constituído por DMEM/F12 (a 1/1, Life Technologies, Cergy, France), 33 mM em glucose, 2 mM em glutamina, 10 mM em HEPES, pH 7,4, 9 mM em NaHC03, contendo 5 U/mL de penicilina e 5 μg/mL de estreptomicina. Adicionam-se ao MSS 0,1 % de ovalbumina, 25 μg/mL de insulina, 100 μg/mL de transferrina, torna-se 20 nM em progesterona, 60 μΜ em putrescina e 30 nM em selénio (M20V).
No dia seguinte ao da colocação em cultura, o meio é substituído, em cada poço, por 600 μΕ de MSS, sem penicilina nem estreptomicina. Adiciona-se a cada poço 100 μΕ da mistura de transfecção que inclui pMAP-luc (0,5 μg) e 0,5 μg de pCS2-pepl ou de pCS2-pep2, bem como 1 mg/ml de LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen) , em meio OPTI-MEM (qbp 100 μΕ) , previamente misturados durante 20 min a 24°C. Incubam-se então as células durante 2 horas e meia a 37 °C. Em seguida o meio é substituído por M20V.
Ilustram-se os resultados na Figura 5.
Estes resultados mostram que o promotor MAP1B é activado nesses neurónios (maplb), e que essa activação é aumentada pelo péptido 1 (maplb+pepl), bem como pelo péptido 2 (maplb+pep2), aparecendo o efeito activante do péptido 2, neste contexto, como sendo mais importante do 14 que o do péptido 1.
EXEMPLO 2: EFEITO DOS PÉPTIDOS PEP-1 e PEP-2 IN VIVO. O efeito de pepl ou de pep2 sobre a actividade transcricional da Engrailed foi avaliado através da medição da expressão do gene de reporte da β-galactosidase colocado no plasmídeo pMAP-lacZ (descrito por MONTESINOS et al. , 2001, citado acima) sob o controle do promotor MAP1B no tubo neural de embriões de frango no estado HH8-HH10.
Os vectores pCS2-pepl ou pCS2-pep2, bem como o vector pMAP-lacZ (cada um dos vectores é utilizado a uma concentração de 1 μg/μL) foram introduzidos no tubo neural de embriões de frango no estado HH8-HH10 por electroporação, de acordo com o protocolo de MURAMATSU et al. (1997), com um electroporador BTX, ECM 830 (4 pulsos de 25 V e 50 mseg.) (Genetronics, San Diego, CA). Injectaram-se os vectores no tubo neural por intermédio de uma micropipeta. Passadas 24 h de incubação a 37°C, fixaram-se os embriões e revelou-se a actividade de β-galactosidase, tal como foi descrito por HOGAN et al. , (Manipulating the mouse embryo. A laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1994).
Os resultados estão ilustrados na Figura 6 (A-C): A figura 6A (pMap-LacZ) mostra que o promotor 15 ΜΑΡ1Β é activado in vivo na região mensencefálica correspondente à expressão normal da Engrailed. Essa expressão está confinada às regiões ventrais que são as únicas acessíveis aos plasmídeos pela técnica de electroporação no tubo nervoso. A figura 6B (pMap-LacZ + pCS2-Pepl) mostra que essa activação é aumentada pelo péptido 1. A marcação parece também ser mais extensa. A Figura 6C (pMap-LacZ + pCS2-Pep2) mostra que o péptido 2 aumenta também a actividade de MAP1B.
LISTAGEM DA SEQUÊNCIA <110> CENTRO NACIONAL DA INVESTIGAÇÃO CIENTÍFICA ESCOLA NORMAL SUPERIOR UNIVERSIDADE DE PARIS 13 PROCHIANTZ, Alain LESAFFRE, Brigitte VOLOVITCH, Michel SONNIER, Laure <120> PÉPTIDOS MODULADORES DA ACTIVIDADE DO FACTOR DE TRANSCRIÇÃO ENGRAILED <130> MJPbv644/Gl 16 <150> 03 06023 <151> 2003-05-20 <160> 3 <170> Patente na versão 3.1 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0 > ÍÉw péptido <4 0 0 > 1
Ser Trp Trp Glu Thr Gin Leu Ile Ala Ser Ser Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213 > Sequência artificial <220> <223> péptido <400> 2 17
Trp Ser Trp Asn Glu Glu Vai Trp Phe Pro Phe Thr 1 5 10
<210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> péptido <400> 3
Lys Vai Trp Asp Ile Arg Tyr Thr Thr Pro His Ala 15 10
Lisboa, 13 de Dezembro de 2006

Claims (8)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Péptido capaz de se fixar ao factor de transcrição Engrailed, seleccionado de entre: - o péptido com a sequência SWWETQLIASSG; - o péptido com a sequência WSWNEEVWFPFT.
2. Composição contendo um péptido de acordo com a reivindicação 1, associado a um péptido que inclua um domínio transdutor.
3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o péptido transdutor referido ser uma penetratina.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo péptido transdutor referido ser a proteína Engrailed, ou um fragmento dessa proteína que contenha pelo menos o seu homeodomínio.
5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo facto de ela ser constituída por um polipéptido quimérico.
6 . Polinucleótido seleccionado de entre: 2 -um polinucleótido codificando para um péptido de acordo com a reivindicação 1; -um polinucleótido codificando para um polipéptido quimérico tal como se definiu na reivindicação 5.
7. Utilização de um péptido de acordo com a reivindicação 1, composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, ou polinucleótido de acordo com a reivindicação 6, para regular in vitro a actividade do factor de transcrição Engrailed numa célula viva.
8. Péptido de acordo com a reivindicação 1, composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, ou polinucleótido de acordo com a reivindicação 6, para utilização como medicamento. Lisboa, 13 de Dezembro de 2006
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