PT1573012E - Vacinas contra a malária de base viral recombinante - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "VACINAS CONTRA A MALÁRIA DE BASE VIRAL RECOMBINANTE"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção refere-se ao domínio da medicina. Mais em particular, a invenção refere-se à utilização de um vetor virai produzido de modo recombinante como transportador de um determinante antigénico selecionado de um grupo de patogénios de malária para o desenvolvimento de uma vacina contra infeções de malária.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A malária representa presentemente uma das infeções mais predominantes em áreas tropicais e subtropicais em todo o mundo. Por ano, as infeções de malária conduzem a doenças graves em centenas de milhões de indivíduos em todo o mundo, ao passo que mata anualmente 1 até 3 milhões de pessoas em países em desenvolvimento e emergentes. A ocorrência disseminada e elevada incidência da malária são uma consequência dos números crescentes de parasitas resistentes a fármacos e vetores de parasitas resistentes a inseticidas. Outros fatores incluem alterações ambientais e climáticas, perturbações civis e mobilidade aumentada de populações. A malária é causada pelos parasitas hematoprotozoários transmitidos por mosquitos pertencentes ao género Plasmodium. Quatro espécies de protozoários Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. ovale e P. malariae) são responsáveis pela doença no homem; muitas outras causam doença em animais, como P. yoelii e P. berghel em ratinhos. P. falciparum é responsável pela maior parte das infeções e é o tipo mais letal ("malária tropical") . Os parasitas da malária têm um ciclo de vida 2 que consiste em várias fases. Cada uma destas fases é capaz de induzir respostas imunológicas especificas dirigidas contra os ocorrentes antigénios correspondentes específicos de fases. Os parasitas da malária são transmitidos ao homem por várias espécies de mosquitos Anopheles fêmeas. Os mosquitos infetados injetam a forma "esporozoíta" do parasita da malária na corrente sanguínea de mamíferos. Os esporozoítos permanecem na circulação durante alguns minutos antes de invadirem hepatócitos. Nesta fase, o parasita está localizado no ambiente extracelular e está exposto ao ataque por anticorpos, maioritariamente dirigido à proteína "circunsporozoíta" (CS), um componente principal da superfície do esporozoíto. Depois de estarem no fígado, os parasitas replicam-se e desenvolvem-se nos denominados "esquizontes". Estes esquizontes ocorrem numa razão de até 20 000 por célula infetada. Durante esta fase intracelular do parasita, os principais atores da resposta imunológica do hospedeiro são linfócitos T, especialmente linfócitos T CD8+ (Romero et al. 1998) . Após cerca de uma semana de infeção do fígado, milhares de denominados "merozoítos" são libertados na corrente sanguínea e entram em glóbulos vermelhos, tornando-se alvos da resposta imunológica mediada por anticorpos e citoquinas secretoras de células T. Depois de invadirem eritrócitos, os merozoítos sofrem várias fases de replicação e transformam-se nos denominados "trofozoítos" e em esquizontes e merozoítos, que podem infetar novos glóbulos vermelhos. Esta fase está associada a doença clínica clara. Uma quantidade limitada de trofozoítos pode evoluir para "gametócitos", que é a fase sexual do parasita. Quando mosquitos suscetíveis ingerem eritrócitos, gametócitos são libertados dos eritrócitos, dando origem a vários gametócitos masculinos e um gametócito feminino. A fertilização destes gâmetas conduz à 3 formação de zigotos e subsequente transformação em oocinetos, depois em oocistos e por fim em esporozoitos das glândulas salivares. 0 direcionamento de anticorpos contra antigénios de superfície específicos da fase de gametócitos pode bloquear este ciclo no intestino médio do mosquito. Esses anticorpos não irão proteger o hospedeiro mamífero, mas irão reduzir a transmissão de malária por diminuição do número de mosquitos infetados e sua carga parasitária.

As abordagens correntes ao desenvolvimento de vacinas contra a malária podem ser classificadas de acordo com as diferentes fases em que o parasita pode existir, como descrito acima. Podem distinguir-se três tipos de vacinas possíveis:

Vacinas pré-eritrocíticas, que são dirigidas contra esporozoitos e/ou células infetadas com esquizontes. Estes tipos de vacinas são maioritariamente à base de CS e idealmente devem conferir imunidade por esterilização, mediada pela resposta imunológica humoral e celular, prevenindo a infeção de malária.

Vacinas para a fase assexual do sangue, que são concebidas para minimizar a gravidade clínica. Estas vacinas devem reduzir a morbidez e mortalidade e pretende-se que previnam a entrada e/ou desenvolvimento do parasita nos eritrócitos.

Vacinas de bloqueio da transmissão, que são concebidas para dificultar o desenvolvimento do parasita no hospedeiro de mosquito. Este tipo de 4 vacina deve favorecer a redução das taxas de infeção de malária em toda a população.

Para além destas vacinas, a exequibilidade do desenvolvimento de vacinas contra a malária que abordem de modo seletivo múltiplas fases do ciclo de vida do parasita está a ser procurada nas denominadas vacinas de múltiplos componentes e/ou para múltiplas fases. Presentemente não está disponível no mercado nenhuma vacina contra a malária, apesar de o desenvolvimento de vacinas contra a malária já ter sido iniciado há mais de 30 anos: imunização de roedores, primatas não humanos e humanos com esporozoítos atenuados por radiação conferiram proteção contra uma provocação subsequente com esporozoítos (Nussenzweig et al. 1967; Clyde et al. 1973) . No entanto, a ausência de um sistema de cultura em larga escala exequível para a produção de esporozoítos evita a aplicação disseminada dessas vacinas.

Até à data, os candidatos a vacinas mais promissores testados em humanos têm-se baseado num pequeno número de antigénios de superfície de esporozoítos. A proteína CS é o único antigénio de P. falcíparum que demonstrou prevenir malária de modo consistente quando utilizada como base de imunização ativa em humanos contra infeção transmitida por mosquitos, apesar de em níveis que muitas vezes são insuficientes. A análise teórica tem indicado que a cobertura da vacina bem como a eficiência da vacina devem ser superiores a 85%, caso contrário podem escapar mutantes que são mais virulentos (Gandon et al. 2001).

Um modo de induzir uma resposta imunológica num mamífero consiste em administrar um transportador infecioso que 5 albergue o determinante antigénico no seu genoma. Um desses transportadores é um adenovírus recombinante que foi tornado deficiente para replicação por remoção de regiões do genoma que normalmente são essenciais para replicação, como a região El. Exemplos de adenovírus recombinantes que compreendem genes codificadores de antigénios são conhecidos na área (WO 96/39178), por exemplo, foi demonstrado que componentes antigénicos derivados do HIV dão origem a uma resposta imunológica se forem distribuídos por adenovírus recombinantes (WO 01/02607; WO 02/22080). Também para malária foram desenvolvidas vacinas à base de adenovírus recombinantes. Estes vetores expressam toda a proteína CS de P. yoelii, que é um parasita específico de ratinho, e foi mostrado que estes vetores são capazes de induzir imunidade por esterilização em ratinhos em resposta a uma única dose de imunização (Bruna-Romero et al. 2001a). Além disso, foi recentemente mostrado que um vetor de vacina semelhante utilizando CS de P. berghei induz proteção de longa duração quando utilizado num regime de primário-reforço, em combinação com um vírus vacínia recombinante (Gilbert et al. 2002) em ratinhos. Foi descrito que vírus influenza e vacínia recombinantes que expressam P. falciparum humano induzem respostas imunológicas CD8+ em ratinhos (Miyahira et al., 1998). Foi demonstrado que células T CD8+ medeiam principalmente a proteção induzida por adenovírus. É improvável que os vetores virais à base de P. yoelii e P. berghei funcionem bem em humanos, uma vez que as doenças mais dramáticas relacionadas com a malária em humanos não são causadas por estes dois parasitas. Além disso, é preferido dispor de uma vacina que seja suficientemente potente para gerar proteção de longa duração após uma ronda de vacinação, em vez de múltiplas rondas de vacinação utilizando injeções de DNA nu 6 e/ou vacinas à base de vacinia como agentes de reforço ou primário. Foi descrita a otimização quanto a codões de uma vacina de DNA para P. yoelii (Nagata et al., 1999).

Apesar de todos os esforços para gerar uma vacina que induza uma resposta imunológica contra um determinante antigénico de malária e proteja de doenças causadas pelo parasita da malária, muitas vacinas ainda não cumprem todos os requisitos descritos acima. Enquanto algumas vacinas não conseguem proporcionar uma eficiência protetora superior a 85% em indivíduos vacinados, outras têm fraco desempenho em áreas como a produção ou distribuição nas células corretas do sistema imunológico do hospedeiro.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra o clone sintetizado de novo 02-148 (pCR-script.Pf), que se baseia numa gama de genes de Plasmodium falciparum conhecidos e que codifica a proteína circunsporozoíta (A) (SEQ ID NO: 3) , mais a sequência de ácido nucleico otimizada quanto a codões (B) (SEQ ID NO: 1) . A SEQ ID NO: 2 é o produto proteico traduzido da Sequência Codificadora da SEQ ID NO: 1, gerado por Patentln 3.1. O conteúdo da SEQ ID NO: 2 é idêntico ao da SEQ ID NO: 3. A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos (A) (SEQ ID NO: 6) e sequência de ácido nucleico (B) (SEQ ID NO: 4) do clone sintético denominado 02-659 (pf-aa-sub), que é o gene circunsporozoíta da estirpe 3D7 de P. falciparum, sem os 14 aminoácidos C-terminais. A SEQ ID NO: 5 é o produto proteico traduzido da Sequência Codificadora da SEQ ID NO: 4 gerado por Patentln 3.1. 0 conteúdo da SEQ ID NO: 5 é idêntico ao da SEQ ID NO: 6. 7 A Figura 3 mostra a sequência de aminoácidos (A) (SEQ ID NO: 9) e sequência de ácido nucleico (B) (SEQ ID NO: 7) do gene circunsporozoita otimizado quanto a codões de P. yoelii. SEQ ID NO: 8 é o produto proteico traduzido da Sequência Codificadora da SEQ ID NO: 7 gerado por Patentln 3.1. 0 conteúdo da SEQ ID NO: 8 é idêntico ao da SEQ ID NO: 9. A Figura 4 mostra a (A) resposta imunológica celular e a (B) resposta imunológica humoral em ratinhos por imunização com vetores à base de Ad5 e Ad35 que albergam o gene circunsporozoita de P. yoelii, administrados por duas vias: intramuscular e subcutânea, em diferentes doses. A Figura 5 mostra a inibição em ratinhos de uma provocação com esporozoítos de P. yoelii após imunização com vetores à base de Ad5 e Ad35 que albergam o gene circunsporozoita de P. yoelii, administrados em diferentes doses, ilustrada em percentagem de inibição (A) e na presença de moléculas de RNA especificas do parasita no fígado (B). A Figura 6 mostra a resposta imunológica celular dirigida por imunização com um vetor à base de Ad5 que alberga o gene circunsporozoita completo de P. falciparum, e dois mutantes de deleção, administrados em diferentes doses.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a diferentes tipos de vetores virais recombinantes deficientes para replicação compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica um determinante antigénico de vários protozoários Plasmodium. Refere-se a vetores virais que compreendem ácidos nucleicos que codificam a proteína circunsporozoita (CS) de P. falciparum. 0 referido vetor virai é um adenovírus, preferivelmente baseado num serotipo que é eficiente na distribuição do gene de interesse, que encontra baixos números de anticorpos neutralizadores no hospedeiro e que se liga às células imunológicas relevantes de um modo eficiente. Numa forma de realização preferida, a proteína CS é gerada de modo que irá originar uma resposta imunológica potente em mamíferos, preferivelmente humanos. Num aspeto, a expressão da proteína é elevada devido a otimização quanto a codões e, assim, altera a utilização de codões de modo a ajustar-se ao hospedeiro de interesse. A proteína CS para utilização na presente invenção está representada na figura 2A (SEQ ID NO: 6) , ao passo que os genes otimizados quanto a codões que codificam as referidas proteínas estão representados na figura 2B (SEQ ID NO: 4). A invenção também se refere a composições de vacinas compreendendo um vetor virai recombinante deficiente para replicação de acordo com a invenção, e um transportador farmaceuticamente aceitável, preferivelmente também compreendendo um adjuvante.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de vírus recombinantes, como definidos nas reivindicações, como transportadores de certos determinantes antigénicos específicos selecionados de um grupo de antigénios de malária, como reivindicado. 0 objetivo da presente invenção consiste em proporcionar uma solução para pelo menos uma parte dos problemas esboçados acima para vacinas existentes contra malária. 9 A presente invenção refere-se a um vetor virai recombinante deficiente para replicação compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica um determinante antigénico de Plasmodium falciparum. 0 referido vetor virai é um adenovirus, em que o referido adenovirus é derivado de um serotipo selecionado do grupo que consiste nos seguintes: Ad26 e Ad35. 0 vetor virai recombinante deficiente para replicação de acordo com a invenção, isto é, como reivindicado, compreende um determinante antigénico que é a proteína circunsporozoíta (CS) como ilustrada na Fig. 2A. Preferivelmente, o referido ácido nucleico heterólogo é otimizado quanto a codões para expressão elevada num mamífero, preferivelmente um humano. A otimização quanto a codões baseia-se no conteúdo requerido de aminoácidos, a utilização geral ótima de codões no mamífero de interesse e algumas condições de aspetos que devem ser evitados para assegurar expressão apropriada. Esses aspetos podem consistir em sítios dadores ou aceitadores de processamento, codões de terminação, sítios Chi, extensões poli(A), sequências ricas em GC e AT, caixas TATA internas, etc.

Numa forma de realização preferida, a invenção refere-se a um vetor virai recombinante deficiente para replicação de acordo com a invenção, em que o teor de adenina mais timina no referido ácido nucleico heterólogo, em comparação com o teor de citosina mais guanina, é inferior a 87%, preferivelmente inferior a 80%, mais preferivelmente inferior a 59% e muito preferivelmente igual a aproximadamente 45%. A especificação divulga um vetor virai recombinante deficiente para replicação em que a referida proteína circunsporozoíta é a proteína circunsporozoíta ilustrada na figura IA e, noutra forma de realização, um 10 ácido nucleico heterólogo otimizado quanto a codões como ilustrado na figura 1B. As proteínas podem ser expressas in vivo a partir de veículos de distribuição de ácidos nucleicos, como os vetores virais recombinantes da presente invenção.

Noutra forma de realização, a invenção refere-se a um vetor virai recombinante deficiente para replicação como reivindicado, em que a proteína circunsporozoíta de P. falciparum, como definido nas reivindicações, está desprovida de uma sequência de ancoragem de GPI funcional.

Para além da utilização de novos genes e proteínas que podem ser aplicados para utilização em humanos, a presente especificação também divulga novos genes que podem ser utilizados em humanos, bem como noutros mamíferos. Em consequência, a divulgação também se refere a um vetor virai recombinante deficiente para replicação compreendendo um ácido nucleico heterólogo que codifica a proteína circunsporozoíta de Plasmodium yoelii, em que o referido ácido nucleico é otimizado quanto a codões para expressão elevada num mamífero. O referido vetor virai é um adenovírus recombinante que é selecionado do grupo que consiste nos seguintes: Ad26 e Ad35. Tal como em P. falciparum, para P. yoelii também é preferido utilizar um gene otimizado quanto a codões para expressão apropriada no hospedeiro de interesse. O teor de adenina mais timina no referido ácido nucleico, em comparação com o teor de citosina mais guanina, pode ser inferior a 87%, preferivelmente inferior a 80%, mais preferivelmente inferior a 59% e muito preferivelmente igual a aproximadamente 45%. 11 A especificação divulga um vetor virai recombinante deficiente para replicação de acordo com a invenção, em que a referida proteína circunsporozoíta é a proteína circunsporozoíta ilustrada na figura 3A, ao passo que outro vetor virai recombinante deficiente para replicação compreende o ácido nucleico ilustrado na figura 3B. A proteína circunsporozoíta, ou a sua parte imunogénica, pode estar desprovida de uma sequência de ancoragem de GPI funcional.

Também é divulgado um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum como ilustrada na figura 1B, em que o referido ácido nucleico é otimizado quanto a codões, e um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína circunsporozoíta da estirpe 3D7 de Plasmodium falciparum, ilustrada na figura 2B, em que o referido ácido nucleico é otimizado quanto a codões. Esses ácidos nucleicos isolados podem ser aplicados em procedimentos de subclonagem para a geração de vacinas de base virai, como divulgado aqui. A produção pode dar-se em todos os tipos de sistemas, como bactérias, leveduras ou células de mamífero conhecidas na área. É proporcionado um ácido nucleico isolado que codifica uma proteína circunsporozoíta de Plasmodium yoelii, ilustrado na figura 3B, em que o referido ácido nucleico é otimizado quanto a codões. Adicionalmente, é proporcionada uma composição de vacina compreendendo um vetor virai recombinante deficiente para replicação, como reivindicado, e um transportador farmaceuticamente aceitável. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis são bem 12 conhecidos na área e são extensamente utilizados numa gama ampla de produtos terapêuticos. Preferivelmente são aplicados transportadores que funcionam bem em vacinas. São mais preferidas vacinas compreendendo adicionalmente um adjuvante. É conhecido na área que os adjuvantes aumentam adicionalmente a resposta imunológica a um determinante antigénico aplicado. A invenção também se refere a uma composição de vacina, como reivindicado, para utilização no tratamento terapêutico, profilático ou de diagnóstico de malária. A presente invenção pode ser utilizada num método de tratamento de um mamífero quanto a uma infeção de malária, ou prevenção de uma infeção de malária num mamífero, cujo método compreende (em qualquer ordem, ou simultaneamente) os passos de administrar uma composição de vacina de acordo com a invenção e administrar uma composição de vacina compreendendo pelo menos uma proteína ou péptido derivado de malária purificado. A invenção também pode ser utilizada num método de tratamento de um mamífero quanto a uma infeção de malária, ou prevenção de uma infeção de malária num mamífero, cujo método compreende (em qualquer ordem, ou simultaneamente) os passos de administrar uma composição de vacina compreendendo um vetor virai recombinante deficiente para replicação compreendendo um antigénio circunsporozoíta de malária de acordo com a invenção, e administrar uma composição de vacina compreendendo um vetor virai recombinante deficiente para replicação, como reivindicado, compreendendo outro antigénio, como LSA-1 ou LSA-3, de acordo com a invenção.

As vantagens da presente invenção são múltiplas. Para além do conhecimento de que vírus recombinantes, como adenovírus 13 recombinantes, podem ser produzidos em títulos muito elevados utilizando células que são consideradas seguras e que podem crescer em suspensão para volumes muito elevados, utilizando meio que não contém quaisquer componentes derivados de animais ou humanos, a presente invenção combina estas características com um vetor que alberga o gene circunsporozoíta de Plasmodium falcíparum. P. falciparum é o parasita que causa malária tropical. Além disso, o gene foi otimizado quanto a codões para dar origem a um nível de expressão que é adequado para conferir uma resposta imunológica apropriada em humanos. A presente invenção proporciona uma vacina contra infeções de malária empregando, por exemplo, adenovírus que não encontram títulos elevados de anticorpos neutralizadores. Exemplos desses adenovírus são o serotipo 11 e 35 (Adll e Ad35, ver WO 00/70071 e WO 02/90665). 0 conteúdo de ácidos nucleicos entre o patogénio causador de malária, como P. falciparum, e o hospedeiro de interesse, como Homo sapiens, é muito diferente. A invenção proporciona agora uma solução para algumas das desvantagens de vacinas conhecidas na área, como níveis de expressão que são demasiado baixos para induzir uma resposta imunológica significativa no hospedeiro de interesse, preferivelmente humanos.

Vetores virais recombinantes têm sido utilizados em cenários de vacinas. Isto tem sido demonstrado para vacinas à base de adenovírus. É descrita a utilização de adenovírus recombinantes que são deficientes para replicação através de remoção de pelo menos parte da região EI do genoma adenoviral, uma vez que a região EI é requerida para processos de replicação, transcrição, tradução e 14 empacotamento de adenovírus produzidos de novo. Vetores deletados em EI são geralmente produzidos em linhas de células que complementam as funções da EI deletada. Essas linhas de células e a sua utilização para a produção de virus recombinantes têm sido extensamente descritas e são bem conhecidas na área. Preferivelmente empregam-se células PER.C6™, representadas pelas células depositadas ao abrigo de ECACC n° 96022940 no European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) no Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR, R.U.), para prevenir a produção de adenovírus competentes para replicação (rca). Noutra forma de realização preferida aplicam-se células que suportam o crescimento de adenovírus recombinantes diferentes dos derivados do serotipo de adenovírus 5 (Ad5) . Referem-se as publicações WO 97/00326, WO 01/05945, WO 01/07571, WO 00/70071, WO 02/40665 e WO 99/55132, quanto a métodos e meios para se obterem lotes adenovirais desprovidos de rca para Ad5, bem como para outros serotipos de adenovírus.

Vetores de base adenoviral que têm sido utilizados na área envolveram maioritariamente a utilização de vetores Ad5. No entanto, como foi descrito (WO 00/03029, WO 02/24730, WO 00/70071, WO 02/40665 e noutros relatos na área), a administração de Ad5 e distribuição eficiente nas células alvo de interesse, responsáveis por respostas imunogénicas suficientes, são dificultadas pela presença de títulos elevados de anticorpos neutralizadores em circulação na corrente sanguínea se um sujeito tiver previamente sofrido uma infeção por Ad5. Foi investigado quais os serotipos melhor adequados para utilização terapêutica, e verificou-se que um número limitado de serotipos encontrou anticorpos neutralizadores apenas numa pequena percentagem de indivíduos na população humana. Estas experiências foram 15 descritas em WO 00/70071. A invenção refere-se à utilização do serotipo de adenovirus 26 e 35.

Para além de evitar a presença de anticorpos neutralizadores dirigidos contra certos serotipos, também poderá ser benéfico dirigir os vetores virais recombinantes deficientes para replicação para um certo subconjunto de células envolvidas na resposta imunológica. Essas células são, por exemplo, células dendriticas. Verificou-se que certos serotipos de adenovirus, como Adi 6, Ad35 e Ad50, contêm proteínas capsídicas que se ligam especificamente a certos recetores presentes em células dendriticas (WO 02/24730) . O Ad5 é um serotipo de endereçamento principalmente para o fígado, o que pode ser uma desvantagem se números suficientes de partículas virais infetarem células do sistema imunológico. Verificou-se que, pelo menos em experiências in vitro, alguns dos serotipos diferentes de Ad5 podem infetar células dendriticas múltiplas vezes melhor do que Ad5, sugerindo que a distribuição nessas células é mais eficiente também in vivo. Ainda falta verificar se esta tradução in vitro para in vivo se mantém, e se serotipos diferentes de Ad5 darão origem ao nível de proteção requerido. São descritos os serotipos de eleição, no que se refere a anticorpos neutralizadores, com proteínas capsídicas, como a fibra ou respetiva parte de um serotipo que é capaz de reconhecer seletivamente células dendriticas. É agora conhecido que uma primeira administração com um serotipo adenoviral específico induz a produção de anticorpos neutralizadores no hospedeiro contra esse vetor específico. Assim, é desejável utilizar, num cenário subsequente (um reforço de acompanhamento ou na 16 administração de outra vacina não relacionada), uma composição baseada num serotipo de adenovirus diferente que não seja neutralizado por anticorpos dirigidos na primeira administração. Em consequência, a especificação também divulga métodos de vacinação de indivíduos mamíferos nos quais uma composição de vacina de primário compreende um adenovirus recombinante deficiente para replicação de um primeiro serotipo, ao passo que se emprega, numa composição de vacina de reforço, um adenovirus recombinante deficiente para replicação de um segundo serotipo. Cenários de primário/reforço foram descritos mais pormenorizadamente nos requerimentos de patentes internacionais PCT/NL02/00671 e PCT/EP03/50748 (não publicado); estes requerimentos referem-se à utilização de um vetor de adenovirus recombinante de um primeiro serotipo para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento ou prevenção de uma doença num humano ou animal tratado com um vetor de adenovirus recombinante de um segundo serotipo, em que o referido primeiro serotipo é diferente do referido segundo serotipo, e em que o referido primeiro serotipo é selecionado do grupo que consiste nos seguintes: Adll, Ad26, Ad34, Ad35, Ad46 e Ad49, e em que o referido segundo serotipo é preferivelmente o serotipo de adenovirus 5. Assim, refere-se à utilização de diferentes serotipos adenovirais que encontram baixas imunidades preexistentes em sujeitos a serem tratados. Exemplos preferidos desses serotipos são os mencionados recombinantes, em que Ad5 não está excluído para indivíduos que nunca sofreram uma infeção por Ad5. Os cenários descritos e reivindicados nos requerimentos acima mencionados referem-se à utilização de vetores adenovirais contendo transgenes como os de sarampo, ou gag de HIV (para tratamento de humanos) ou SIV (para tratamento e estudos em macacos). 17

Um exemplo não limitador de um cenário primário-reforço para Malária é um cenário no qual podem ser utilizados, para além de diferentes serotipos de adenovirus, também diferentes determinantes antigénicos. Um exemplo não limitador de um antigénio diferente de CS é o Antigénio Especifico do Fígado 1 (LSA-1, Kurtis et al. 2001) . Esses cenários são úteis pelo menos por um motivo, nomeadamente por o antigénio CS ser expresso maioritariamente durante a fase sanguínea do parasita, ao passo que a sua expressão diminui na fase do fígado. Para LSA-1, esta situação é mais ou menos a oposta; é expresso em baixos níveis durante a fase sanguínea mas é altamente expresso durante a fase do fígado. Apesar de ser possível utilizar os dois antigénios em administrações subsequentes, também podem ser utilizados ao mesmo tempo para conferir proteção contra o parasita na fase sanguínea bem como na fase do fígado. Noutra forma de realização da presente invenção, os dois antigénios podem ser distribuídos apenas por um dos serotipos de adenovirus, como reivindicado, clonados em conjunto no mesmo vetor ou separadamente em vetores separados do mesmo serotipo). Noutra forma de realização, ambos os antigénios são distribuídos por diferentes serotipos, que podem ser distribuídos ao mesmo tempo ou separadamente no tempo, por exemplo, num cenário de primário-reforço. As vacinas da presente invenção também podem ser utilizadas em cenários nos quais administrações de primário-reforço são utilizadas em combinação com DNA nu ou outros meios de distribuição, não relacionados com os vetores virais deficientes para replicação da presente invenção, como proteínas purificadas, ou péptidos. Exemplos dessas proteínas que podem ser utilizadas em administrações de primário-reforço (Ad/proteína; proteína/Ad; proteína/Ad/Ad; Ad/proteína/Ad; Ad/Ad/proteína, etc.) são CS, LSA-1, LSA-3, MSP-1, MSP-119, 18 MSP-142 (ver em baixo), ou a composição de vacina contendo partículas de hepatite B e derivada de CS conhecida como RTS,S (ver Gordon et ai. (1995; US 6,306,625 e WO 93/10152) .

Uma sequência "provém" de um adenovírus, como usado aqui, se um ácido nucleico puder ser obtido, através de clonaqem direta, de Sequências do tipo selvagem obtidas de vírus do tipo selvagem, enquanto também pode ser obtido, por exemplo, através de PCR utilizando como modelo diferentes porções de DNA. Isto também significa que essas sequências podem estar na forma de tipo selvagem, bem como numa forma alterada. Outra opção para se obter o mesmo resultado é por meio de combinação de DNA sintético. Deve ser entendido que "provir" não significa exclusivamente uma clonagem direta do DNA de tipo selvagem. O profissional também estará ciente das possibilidades da biologia molecular para se obterem formas mutantes de uma certa porção de ácido nucleico. Os termos "respetiva parte, derivado e/ou análogo funcional" devem ser entendidos como equivalentes do ácido nucleico a que se referem. 0 profissional apreciará o facto de certas deleções, trocas, mutações (pontuais), adições, etc., poderem ainda originar um ácido nucleico que tem uma função semelhante à do ácido nucleico original. Em consequência, deve ser entendido que também são consideradas essas alterações que não modificam significativamente a funcionalidade dos ácidos nucleicos. Se um certo vetor adenoviral provier de um certo serotipo adenoviral de eleição, também deve ser entendido que o produto final pode ser obtido por vias indiretas, como clonagem direta e síntese de certas porções de DNA genómico, utilizando metodologia conhecida na área. Exemplos dessas alterações são, por exemplo, deleções na 19 cadeia principal virai para permitir a clonagem de porções maiores de ácidos nucleicos heterólogos. Exemplos dessas mutações são, por exemplo, deleções de E3 ou deleções e/ou alterações nas regiões que codificam as proteínas de E2 e/ou E4 de adenovírus. Essas alterações aplicadas à cadeia principal adenoviral são conhecidas na área e são muitas vezes aplicadas, uma vez que o espaço é um fator limitador para o adenovírus a ser empacotado; este é um motivo importante para proceder à deleção de certas partes do genoma adenoviral. Outros motivos para alterar as regiões E2, E3 e/ou E4 do genoma podem estar relacionados com a estabilidade ou integridade do vetor adenoviral, como descrito, por exemplo, nos requerimentos de patentes internacionais PCT/NL02/00280, PCT/EP03/50125, PCT/NL02/00281, PCT/EP03/50126 (não publicado). Estes requerimentos referem-se, entre outros, à utilização de um gene E4orf6 de um serotipo de um subgrupo na cadeia principal de um adenovírus de outro subgrupo, para assegurar compatibilidade entre a atividade de E4orf6 e a atividade de E1B-55K durante a replicação e empacotamento numa linha de células de empacotamento. Referem-se adicionalmente à utilização de um promotor pIX de funcionamento apropriado para se obterem níveis de expressão de pIX mais elevados e um vetor adenoviral recombinante mais estável. "Deficiente para replicação", como usado aqui, significa que os vetores adenovirais não se replicam em células não de complementação. Em células de complementação, as funções requeridas para replicação e, assim, para a produção do vetor virai são proporcionadas pela célula de complementação. Os vetores virais deficientes para replicação da presente invenção não albergam todos os 20 elementos que permitem a replicação numa célula hospedeira diferente de uma célula de complementação. "Heterólogo", como usado aqui em conjunção com ácidos nucleicos, significa que o ácido nucleico não se encontra em versões do tipo selvagem dos vetores virais onde é clonado o ácido nucleico heterólogo. Por exemplo, no caso de adenovirus, o ácido nucleico heterólogo que é clonado no vetor adenoviral deficiente para replicação não é um ácido nucleico adenoviral. "Determinante antigénico", como usado aqui, significa qualquer antigénio derivado de uma fonte patogénica que induz uma resposta imunológica num hospedeiro para o qual é distribuído (administrado) o determinante. Exemplos de determinantes antigénicos de Plasmodium que podem ser distribuídos utilizando os vírus recombinantes deficientes para replicação da presente invenção são a proteína circunsporozoíta, o polipéptido SE36, o polipéptido C-terminal de 119 kDa da proteína de superfície merozoíta (MSP-119), MSP-1, MSP-142, Antigénio da Fase do Fígado 1 ou 3 (LSA-1 ou 3) , ou um fragmento de quaisquer dos acima mencionados. Num aspeto preferido, a invenção refere-se à proteína circunsporozoíta (CS) de P. falciparum. "Otimizado quanto a codões", como usado aqui, significa que o conteúdo do ácido nucleico foi alterado de modo a serem obtidos níveis de expressão suficientemente elevados da proteína de interesse num hospedeiro de interesse no qual é distribuído o gene que codifica a referida proteína. Neste contexto, níveis de expressão suficientemente elevados significam que os níveis proteicos devem ser suficientemente elevados para induzir uma resposta 21 imunológica no hospedeiro com a finalidade de conferir proteção contra um parasita indutor de malária que pode entrar no hospedeiro tratado antes ou após o tratamento. É conhecido na área que algumas vacinas originam uma resposta imunológica em humanos, pelas quais aproximadamente 60% dos indivíduos vacinados ficam protegidos contra doenças induzidas por provocações subsequentes com o patogénio (por exemplo, esporozoítos). Em consequência, os níveis de expressão são considerados suficientes se 60% ou mais dos indivíduos tratados ficarem protegidos contra infeções subsequentes. Crê-se que essas percentagens podem ser atingidas com as combinações de aspetos adenovirais que podem ser aplicadas e a escolha do antigénio como divulgado aqui. Preferivelmente, 85% dos indivíduos são protegidos, sendo muito preferido ter proteção contra uma provocação subsequente em mais de 90% dos hospedeiros vacinados. Os ácidos nucleicos divulgados na presente invenção são otimizados quanto a codões para expressão em humanos. De acordo com Narum et al. (2001), o teor de adenina mais timina (A+T) no DNA de Homo sapiens é aproximadamente 59% em comparação com a percentagem de citosina mais guanina (C+G) . O teor de adenina mais timina em P. falciparum é aproximadamente 80%. O teor de adenina mais timina no gene CS de P. falciparum é aproximadamente 87%. Para se obter proteção suficiente crê-se ser necessário melhorar os níveis de produção no hospedeiro. Um modo de consegui-lo consiste em otimizar a utilização de codões por alteração do conteúdo do ácido nucleico do determinante antigénico no vetor de base virai, sem alterar a sua sequência de aminoácidos. Para esta finalidade, os vetores virais recombinantes deficientes para replicação de acordo com a invenção têm um teor de adenina mais timina, nos ácidos nucleicos heterólogos da presente invenção, inferior a 87%, 22 preferivelmente inferior a 80% e mais preferivelmente inferior ou igual a aproximadamente 59%. Com base na utilização de codões em humanos e no teor de aminoácidos dos genes CS de P. falciparum e yoelii, as percentagens dos genes otimizados quanto a codões foram ainda menores, atingindo aproximadamente 45% para o teor de aminoácidos, como divulgado pela presente invenção. Em consequência, no que se refere aos genes CS, é preferido ter um teor de adenina mais timina de aproximadamente 45%. Deve ser entendido que, se for pretendido tratar outra espécie diferente da humana, que pode ter uma concentração diferente de adenina mais timina (inferior ou superior a 59%) e/ou uma diferente utilização de codões, os genes que codificam as proteínas CS da presente invenção podem ser ajustados para se adequarem ao teor requerido e dar origem a níveis de expressão adequados para esse hospedeiro particular. Obviamente, também não pode ser excluído que ligeiras alterações do conteúdo possam originar ligeiras alterações do nível de expressão em diferentes áreas geográficas em todo o mundo. Também deve ser entendido que, ocorrendo ligeiras alterações do número de repetições incluídas na sequência de aminoácidos das proteínas, as percentagens podem diferir em conformidade. Todos estes conteúdos ajustados fazem parte da presente especificação.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Montagem do gene sintético circunsporozoita de Plasmodium falciparum

Estudos comparativos conduzidos com vacinas de DNA baseadas em genes nativos e otimizados quanto a codões que codificam proteínas merozoítas de P. falciparum indicaram a existência de uma correlação direta com níveis de expressão e imunogenicidade (Narum et al. 2001) . Foi concebida uma 23 nova sequência do gene que codifica a proteína circunsporozoíta (CS) de Plasmodium falciparum. Estudos em populações de parasitas da malária obtidos de regiões geográficas muito separadas revelaram a presença de polimorfismo da sequência CS. A nova sequência CS de P. falciparum foi montada por alinhamento das diferentes sequências proteicas disponíveis presentes na base de dados da GenBank (listadas na Tabela I). Em primeiro lugar, todas as diferentes sequências foram colocadas por ordem de subgrupos com base na localização global, ou por estirpe laboratorial de onde eram originários os isolados. Foram utilizadas todas as sequências CS completas ou parciais para identificar variações entre as diferentes áreas geográficas e estirpes laboratoriais identificadas. A sequência de consenso de aminoácidos final determinada foi extensamente examinada. Subsequentemente, os inventores da presente invenção ajustaram esta sequência de consenso e um novo gene CS foi sintetizado (Fig. 1). A nova sequência de aminoácidos está apresentada na Fig. IA. A nova proteína CS alberga os aspetos listados em baixo (do terminal N para o terminal C): A sequência de sinal N-terminal, que dirige a proteína para o retículo endoplasmático, permanece inalterada.

Os aminoácidos do péptido de ligação de HLA (31 — 40), bem como a região 1 (epítopo de células B predominante) , estão conservados e, assim, estas sequências permanecem inalteradas.

Algumas repetições: há 14-41 repetições NANP (SEQ ID NO: 10) nos diferentes isolados e 4 repetições NVDP (SEQ ID NO: 11). Foi escolhido incorporar 27 24 repetições NANP, um aglomerado de 3 repetições NVDP e uma repetição NVDP separada.

Verificou-se que a sequência ENANANNÂVKN (SEQ ID NO: 12), diretamente a jusante das repetições mencionadas acima, está razoavelmente conservada entre estirpes. A região Th2R e o epitopo de CD8 imunodominante (Lockyer et ai. 1989; Zevering et ai. 1994) : determinou-se uma única sequência de consenso que difere, nalguns aspetos, da sequência conhecida e frequentemente utilizada da estirpe laboratorial 3D7. Esta sequência é por vezes referida na literatura como "epitopo universal" (Nardin et ai. 2001) . A região 2, que se sobrepõe à região Th2R, permaneceu conservada. A região Th3R, que é considerada um epitopo de CD8 menos importante, é utilizada na forma de uma sequência de consenso, uma vez que se encontraram apenas mutações pontuais.

Os 28 aminoácidos C-terminais, que constituem uma sequência de ancoragem de sinal de GPI que é ineficiente em células de mamífero (Moran e Caras, 1994) e que não é hidrófoba por si própria, servem de ancoragem membranar estável. O gene foi construído de modo que a totalidade da sequência não pode ser removida, mas também deixando aberta a possibilidade de permanecer presente. Isto permite uma comparação da antigenicidade de vetores de adenovírus contendo uma CS completa versus aqueles que expressam a proteína deletada na sequência de ancoragem de sinal de GPI. De facto, foi descrito que a 25 remoção da sequência de sinal de GPI de uma vacina de DNA de CS aumentou a indução da resposta imunológica contra infeção de malária em roedores (Scheiblhofer et al. 2001). A substituição de S em A na posição 373: esta substituição de aminoácidos foi introduzida para eliminar um sitio de glicosilação potencial reconhecido por células de mamífero.

Uma vez que a utilização de resíduos do parasita da malária (87% A e T) é significativamente diferente da do Homo sapiens, o gene que codifica a proteína CS concebida de novo foi otimizado quanto a codões para melhorar a sua expressão em células de mamífero, tomando em consideração os aspetos seguintes para evitar sequências de atuação cis: não devem estar presentes sítios poli(A) prematuros nem caixas TATA internas; devem ser evitados sítios Chi, sítios de entrada do ribossoma e aglomerados de sequências ricas em AT; não devem estar presentes sítios aceitadores e dadores de processamento (crípticos); devem ser evitadas, tanto quanto possível, extensões de sequências repetitivas; e também devem ser evitadas sequências ricas em GC. O gene final otimizado quanto a codões está apresentado na Fig. 1B. A sequência de consenso de CS concebida de novo foi sintetizada e clonada em pCR-script (Stratagene) pela GeneArt (Regensburg, Alemanha), utilizando metodologia conhecida de profissionais da área da geração de DNA sintético, dando origem a um clone denominado 02-148 (pCR-script.Pf) (SEQ ID NO: 1). 26

Seguidamente a este clone sintético gerou-se outro gene sintético, onde foram introduzidas algumas mutações para se obterem sequências de aminoácidos idênticas à proteína CS de P. falciparum da estirpe 3D7 na extremidade 3', que está adicionalmente deletada nos últimos 14 aminoácidos (Fig. 2). Este gene também foi otimizado quanto a codões empregando as mesmas condições descritas acima, e foi subsequentemente sintetizado e clonado em pCR-script (Stratagene) pela GeneArt. 0 clone foi denominado 02-659 (pf-aa-sub) (SEQ ID NO: 4).

Exemplo 2. Otimização quanto a codões do gene circunsporozoita do parasita da malária especifico de roedores Plasmodlum yoelii.

Espécies de malária que foram adaptadas a modelos de roedores robustos, como P. berghei e P. yoelii, têm sido ferramentas poderosas para a identificação e teste de vacinas candidatas contra a malária. Uma vez que a infetividade de esporozoítos de P. yoelii se assemelha à de P. falciparum, foi decidido utilizar o modelo de P. yoelii para exemplificação da capacidade de vetores de Ad35 contendo proteínas CS otimizadas quanto a codões para proporcionar imunidade por esterilização e, consequentemente, proteção contra infeção de malária. O gene CS de P. yoelii, que codifica os resíduos 1-356, como previamente descrito (Rodrigues et al. 1997), foi otimizado quanto a codões utilizando as mesmas condições descritas acima, e foi sintetizado pela GeneArt (GmbH-Regensburg, Alemanha) . A sequência do gene CS de P. yoelii otimizado quanto a codões (plasmídeo 02-149) está ilustrada na Fig. 3. 27

Exemplos 3. Geração de vetores adenovirais recombinantes baseados em Ad5.

Adenovírus recombinantes sem RCA podem ser gerados de modo muito eficiente utilizando plasmideos adaptadores, como pAdApt, e cadeias principais plasmidicas de adenovírus, como pWE/Ad.Af111-rITRsp. Métodos e ferramentas foram extensamente descritos noutro local (WO 97/00326, WO 99/55132, WO 99/64582, WO 00/70071, WO 00/03029). Em geral, o plasmídeo adaptador contendo o transgene de interesse na cassete de expressão desejada é digerido com enzimas adequadas, para libertar as sequências de adenovírus recombinantes da cadeia principal do vetor plasmídico. De modo semelhante, o plasmídeo de complementação adenoviral pWE/Ad.Af111-rITRsp é digerido com enzimas adequadas, para libertar as sequências de adenovírus do DNA plasmídico do vetor. A clonagem do gene que codifica a proteína CS do parasita P. yoelii em pIPspAdaptl foi realizada do modo seguinte. O plasmídeo 02-149 (GeneArt, ver acima) contendo o gene CS otimizado quanto a codões foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI. O fragmento de 1,1 kb correspondente ao gene CS de P. yoelii foi isolado de gel de agarose e ligado ao vetor pIPspAdaptl digerido com HindIII e BamHI (descrito em WO 99/64582). 0 plasmídeo resultante foi denominado pAdapt.CS.Pyoel e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do citomegalovírus (CMV) inicial imediato (IE) humano completo e um sinal poli(A) do SV40 a jusante. A clonagem do gene que codifica a proteína CS completa do parasita P. falciparum em pIPspAdaptl foi realizada do modo seguinte. O plasmídeo 02-148 pCR-script.Pf (ver acima) 28 contendo o gene CS otimizado quanto a codões foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI. 0 fragmento de 1,2 kb correspondente ao gene CS foi isolado de gel de agarose e ligado ao vetor pIPspAdaptl digerido com HindIII e BamHI. O plasmideo resultante foi denominado pAdapt. CS. Pf alc e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do citomegalovirus (CMV) inicial imediato (IE) humano completo e o sinal poli(A) do SV40 a jusante. A clonagem do gene que codifica a proteína CS de P. falciparum menos a sequência de ancoragem de GPI, e assim com a deleção dos últimos 28 aminoácidos, em pIPspAdaptl foi realizada do modo seguinte. Um fragmento de PCR de 1,1 kb foi amplificado utilizando como modelo o plasmideo 02-148, com os "primers" Forw.Falc |£hCCA ÂGC TTG CCA CCA. ISA TGA GG-3'jí (SEQ ID NO: 13) e

Rev. Fale . CS-28 (S-CCG 6AT CCT CAG GAG ATO TTC TFC TCG-3') (SEQ ID NO: 14) . Os "primers" foram sintetizados pela Invitrogen. Para a PCR utilizou-se a enzima Pwo DNA polimerase (Inno-train Diagnostic), tendo-se aplicado o seguinte programa: 1 ciclo de 5 minutos a 94 °C, 1 minuto a 50 °C, 2 minutos 30 segundos a 72°C; 5 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 50°C, 2 minutos 50 segundos a 72°C; 20 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 54 °C, 2 minutos 50 segundos a 72 °C; e 1 ciclo de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 54 °C, seguido de 10 minutos a 72"C. O produto de PCR amplificado foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI e depois foi clonado em pIPspAdaptl que também foi digerido com HindIII e BamHI. O plasmideo resultante foi denominado pAdapt. CS. Pf alc (-2 8) e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do citomegalovirus (CMV) inicial 29 imediato (IE) humano completo e o sinal poli(A) do SV40 a jusante. A clonagem do gene que codifica a proteína CS de P. falciparum menos a âncora de GPI, e assim com a deleção dos últimos 14 aminoácidos, em pIPspAdaptl foi realizada do modo seguinte. Um fragmento de PCR de 1,1 kb foi amplificado utilizando como modelo o plasmídeo 02-148, com os "primers" Forw.Falc (SEQ ID NO: 13) e Rev.Fale.CS-14 Í5’-C0G GAT C€:T GAG CTG TTCACC ACGTTGAT) (SEQ ID NO: 15) . Os "primers" foram sintetizados pela Invitrogen. Para a PCR utilizou-se a enzima Pwo DNA polimerase (Inno-train Diagnostic), tendo-se aplicado o seguinte programa: 1 ciclo de 5 minutos a 94°C, 1 minuto a 50°C, 2 minutos 30 segundos a 12° Z) 5 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 1 minuto a 50°C, 2 minutos 50 segundos a 72°C; 20 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 54°C, 2 minutos 50 segundos a 72°C; e 1 ciclo de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 54°C, seguido de 10 minutos a 72 °C. O produto de PCR amplificado foi digerido com as enzimas de restrição HindiII e BamHI e depois foi clonado em pIPspAdaptl também digerido com HindiII e BamHI. O plasmídeo resultante foi denominado pAdapt.CS.Pfalc(-14) e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do citomegalovírus (CMVj inicial imediato (IE) humano completo e o sinal poli(A) do SV40 a jusante. A clonagem do gene que codifica a proteína CS de P. falciparum menos a âncora de GPI, exibindo uma sequência C-terminal como na estirpe 3D7, em pIPspAdaptl é realizada do modo seguinte. O plasmídeo 02-659 pf-aa-sub (ver acima) contendo o gene CS otimizado quanto a codões é digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI. O fragmento de 1,1 kb correspondente ao gene CS é ligado ao vetor pIPspAdaptl 30 digerido com HindIII e BamHI. O plasmídeo resultante é denominado pAdapt.CS.Pfalc (pf-aa-sub) e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do citomegalovirus (CMV) inicial imediato (IE) humano completo e o sinal poli(A) do SV40 a jusante. A geração do virus recombinante denominado Ad5AE3.CS.Pyoel foi realizada do modo seguinte. O pAdapt.CS.Pyoel foi digerido com a enzima de restrição PacI para libertar a porção da extremidade esquerda do genoma de Ad. O plasmídeo pWE/Ad.Af111-rITRsp contendo a parte da extremidade direita remanescente do genoma de Ad tem uma deleção de 1878 bp na região E3 (deleção por Xbal). Esta construção também foi digerida com PacI. O pAdapt.CS.Pyoel foi separadamente transfetado, com pWE.Ad.AflIIrITRsp digerido com PacI, em células produtoras PER-E1B55K (as células foram descritas em WO 02/40665) utilizando o reagente de transfeção lipofectamina (Invitrogen), empregando métodos conhecidos na área e como descrito em WO 00/70071. A recombinação homóloga entre sequências sobrepostas conduziu à geração do virus recombinante denominado Ad5AE3.CS.Pyoel. Deve ser entendido que vetores baseados em Ad5 também podem ser produzidos em células PER.C6™, cujas células são representadas pelas células depositadas ao abrigo de ECACC n° 96022940 (ver acima). O vetor adenoviral, em lisatos em bruto, resultante desta transfeção foi purificado em placas utilizando métodos conhecidos dos profissionais. Analisaram-se placas isoladas quanto à presença do transgene CS e foram amplificadas, para produção em larga escala, em balões de camadas triplas (3x175 cm2/balão). Por amplificação, as células são recolhidas a CPE completo e o virus é purificado por um procedimento de purificação com Cloreto de Césio (CsCl) em dois passos, como rotineiramente 31 feito pelos profissionais e geralmente como descrito em WO 02/40665. A geração do vírus recombinante denominado Ad5AE3.CS.Pfalc foi realizada do modo seguinte. O pAdapt.CS.Pfalc foi digerido com a enzima de restrição PacI, para libertar a porção da extremidade esquerda do genoma do Ad. O plasmídeo pWE/Ad.Af111-rITRsp contendo a parte da extremidade direita remanescente do genoma de Ad tem uma deleção de 1878 bp na região E3 (deleção por Xbal). Esta construção também foi digerida com PacI. O pAdapt.CS.Pfalc foi transfetado, com pWE.Ad.Af111-rITRsp digerido com PacI, em células produtoras PER-E1B55K utilizando reagente de transfeção de lipofectamina. A recombinação homóloga entre sequências sobrepostas conduziu à geração do vírus recombinante denominado Ad5AE3.CS.Pfalc. O vetor adenoviral, em lisatos em bruto, resultante desta transfeção foi purificado em placas utilizando métodos conhecidos dos profissionais. Analisaram-se placas isoladas quanto à presença do transgene CS e foram amplificadas, para produção em larga escala, em balões de camadas triplas (3x175 cm2/balão) . As células foram recolhidas a CPE completo e o vírus foi purificado por um procedimento de purificação com CsCl em dois passos, como rotineiramente feito pelos profissionais e geralmente como descrito em WO 02/40665. A geração dos vírus recombinantes denominados Ad5AE3.CS.Pfalc(-28) e Ad5AE3.CS.Pfalc(-14) foi realizada do modo seguinte. pAdapt.CS.Pfalc (-2 8) e pAdapt.CS.Pfalc(-14) foram digeridos separadamente com a enzima de restrição PacI, para libertar a porção da extremidade esquerda do genoma do Ad. O plasmídeo pWE/Ad.Af111-rITRsp contendo a parte da extremidade direita remanescente do genoma de Ad 32 tem uma deleção de 1878 bp na região E3 (deleção por Xbal). Esta construção também foi digerida com PacI. pAdapt.CS.Pfalc (-28) e pAdapt.CS.Pfalc(-14) foram separadamente transfetados, com pWE.Ad.Af111-rITRsp digerido com PacI, em células produtoras PER-E1B55K utilizando reagente de transfeção de lipofectamina. A recombinação homóloga entre sequências sobrepostas conduziu à geração dos virus recombinantes denominados, respetivamente, Ad5AE3.CS.Pfalc(-28 ) e Ad5AE3.CS.Pfalc(-14). Vetores adenovirais, em lisatos em bruto, resultantes destas transfeções são purificados em placas utilizando métodos conhecidos dos profissionais. Analisam-se placas isoladas quanto à presença do transgene CS e são amplificadas, para produção em larga escala, em balões de camadas triplas (3x175 cm2/balão) . As células são recolhidas a CPE completo e o virus é purificado por um procedimento de purificação com CsCl em dois passos, como rotineiramente feito pelos profissionais e geralmente como descrito em WO 02/40665. A geração do virus recombinante denominado Ad5AE3.CS.Pfalc(pf-aa-sub) é realizada do modo seguinte. pAdapt.CS.Pfalc(pf-aa-sub) é digerido com a enzima de restrição PacI, para libertar a porção da extremidade esquerda do genoma do Ad. 0 plasmideo pWE/Ad.Af111-rITRsp contendo a parte da extremidade direita remanescente do genoma do Ad também é digerido com PacI. pAdapt.CS.Pfalc (pf-aa-sub) é transfetado, com pWE .Ad.Af HI-rITRspAE3 digerido com PacI, em células produtoras PER.C6™ ou PER-E1B55K utilizando reagente de transfeção de lipofectamina, ou por outros meios, como eletroporação, ou outros métodos de transfeção conhecidos dos profissionais. A recombinação homóloga entre sequências sobrepostas conduz à geração do 33 vírus recombinante denominado Ad5AE3.CS.Pfalc (pf-aa-sub). O vetor adenoviral, em lisatos em bruto, resultante desta transfeção é purificado em placas utilizando métodos conhecidos dos profissionais. Analisam-se placas isoladas quanto à presença do transgene CS e são amplificadas, para produção em larga escala, em balões de camadas triplas (3x175 cm2/balão). As células são recolhidas a CPE completo e o vírus é purificado por um procedimento de purificação com CsCl em dois passos, como rotineiramente feito pelos profissionais e geralmente como descrito em WO 02/40665.

Depois destes procedimentos efetuou-se a geração do adenovírus recombinante de controlo denominado Ad5AE3.empty como descrito acima, utilizando como adaptador o plasmídeo pAdapt, desprovido de um transgene.

Exemplo 4. Geração de vetores de vacinas adenovirais recombinantes à base de Ad35.

Gerou-se um primeiro fragmento de PCR de 101 bp contendo o promotor pIX de Ad5 (nucleótidos 1509-1610) com os "primers" SV40for (S‘-GAATGTATCTTATCATGTCTAG-3*) (SEQ ID NO: 16) e pIX5Rmfe (ff-CTC TCT CAA TTG CAG ATA CAA AAC TAC ATA AGACG*3’) (SEQ ID NO: 17) . A reação foi conduzida com Pwo DNA polimerase, de acordo com as instruções dos fabricantes, mas com 3% DMSO na mistura final. Utilizou-se pAdApt como modelo. O programa foi realizado do modo seguinte: 2 minutos a 94°C; 30 ciclos de: 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 52°C e 30 segundos a 72°C; seguido de 8 minutos a 72°C. O fragmento de PCR resultante contém a extremidade 3' do sinal poli(A) do SV40 de pAdApt e a região promotora Ad5-pIX, como presente no Número de acesso da Genbank M73260, desde o nucleótido 3511 até ao nucleótido 3586, e um sítio Mfel na extremidade 3'. Gerou-se um segundo 34

fragmento de PCR como descrito acima mas com os primers pIX35Fmfe ^-CTC TCTCftATTGTCTGTCTTGCAGCTGTCATG-3't (SEQ ID NO: 18) e 35R4 (para referências quanto à sequência do "primer" 35R4, ver WO 00/70071) . O pAdApt35IPl (descrito em WO 00/70071) foi utilizado como modelo, a hibridização foi fixada a 58°C durante 30 segundos e o alongamento do programa de PCR foi fixado a 72°C durante 90 segundos. Este procedimento de PCR amplifica sequências Ad35 desde o nucleótido 3467 até ao nucleótido 4669 (numeração de sequências tal como em WO 00/70071) e adiciona um sitio Mfel à extremidade 5' . Os dois fragmentos de PCR foram digeridos com Mfel e purificados utilizando o estojo de purificação de PCR Qiagen (Qiagen). Utilizaram-se quantidades equimolares aproximadas dos dois fragmentos numa reação de ligação. Após uma incubação de duas horas com enzima ligase nos tampões corretos, à temperatura ambiente, a mistura foi carregada num gel de agarose e os fragmentos de DNA de 1,4 kb de comprimento foram isolados com o estojo Geneclean II (BI0101, Inc) . O DNA purificado foi utilizado numa reação de amplificação por PCR com os "primers" SV40for e 35R4. A PCR foi realizada como descrito acima com uma temperatura de hibridização de 52 °C e um tempo de alongamento de 90 segundos. O produto resultante foi isolado do gel utilizando o estojo de extração de gel Qiagen e foi digerido com Agel e BglII. O fragmento de 0,86 kb resultante contendo o promotor pIX de 100 nucleótidos completo de Ad5, o sitio Mfel e a ORF de pIX (fragmento Mfel-Agel, incluindo o sitio de inicio ATG) de Ad35, mas sem uma sequência poli(A), foi isolado do gel utilizando o estojo Geneclean II.

Adenovirus recombinantes sem RCA baseados em Ad35 podem ser gerados de modo muito eficiente utilizando plasmideos 35 adaptadores, como pAdApt535 (descrito em baixo) e cadeias principais plasmidicas de adenovirus, como pWE/Ad35.pIX-rITRAE3 (descrito em W002/40665). Para gerar pAdApt535, pAdApt35.Luc (descrito em WO00/70071) foi digerido com BglII e Agel e o vetor de 5,8 kb resultante foi isolado do gel. Este fragmento foi ligado ao fragmento BglII-Agel de O, 86 kb isolado contendo o promotor de pIX quimérico Ad5-Ad35 descrito acima, dando origem a um plasmideo denominado pAdApt535.Luc que foi subsequentemente digerido com BglII e Apal. A inserção de 1,2 kb resultante foi purificada em gel. O pAdApt35IPl foi digerido com BglII e Apal e o fragmento vetorial de 3,6 kb foi isolado em gel. A ligação da inserção BglII-Apal de 1,2 kb de pAdApt535. Luc e do vetor digerido com BglII-Apal de 3,6 kb deu origem a pAdApt535. A clonagem do gene que codifica a proteina CS do parasita P. yoelii em pIPspAdapt535 foi realizada do modo seguinte. O plasmideo 02-149 contendo o gene CS de P. yoelii otimizado quanto a codões (ver acima) foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI. O fragmento de 1,1 kb correspondente ao gene CS foi isolado de gel de agarose e ligado ao vetor pAdapt535 digerido com HindIII e BamHI. O plasmideo resultante foi denominado pAdapt535-CS.Pyoel e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor CMV humano completo e o sinal poli(A) do SV40 a jusante. A clonagem do gene que codifica a proteina CS completa do parasita P. falciparum em pAdapt535 foi realizada do modo seguinte. O plasmideo 02-148 (pCR-script.Pf) contendo o gene CS otimizado quanto a codões de P. falciparum foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI. O fragmento de 1,2 kb correspondente ao gene CS foi isolado 36 de gel de agarose e ligado ao vetor pAdapt535 digerido com HindiII e BamHI. 0 plasmídeo resultante foi denominado pAdapt535-CS. Pfalc e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do CMV humano completo e o sinal poli (A) do SV40 a jusante. A clonagem do gene que codifica a proteína CS de P. falciparum menos a sequência de ancoragem de GPI, e assim com a deleção dos últimos 28 aminoácidos, em pAdapt535 é realizada do modo seguinte. 0 fragmento de PCR de 1,1 kb obtido como descrito acima utilizando os "primers" Forw.Falc e Rev.Fale.CS-28 é digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI e depois é clonado no vetor pAdapt535 também digerido com HindIII e BamHI. 0 plasmídeo resultante é denominado pAdapt535.CS.Pfalc(-28) e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do CMV humano completo e o sinal poli (A) do SV40 a jusante. A clonagem do gene que codifica a proteína CS de P. falciparum menos a sequência de ancoragem de GPI, agora com a deleção dos últimos 14 aminoácidos, em pAdapt535 é realizada do modo seguinte. 0 fragmento de PCR de 1,1 kb obtido como descrito acima utilizando os "primers" Forw.Falc e Rev.Fale.CS-14 é digerido com as enzimas de restrição HindIII e BamHI e depois é clonado no vetor pAdapt535 também digerido com HindIII e BamHI. 0 plasmídeo resultante é denominado pAdapt535.CS.Pfalc(-14) e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do CMV humano completo e o sinal poli(A) do SV40 a jusante. A clonagem do gene que codifica a proteína CS de P. falciparum menos a sequência de ancoragem de GPI, exibindo uma sequência C-terminal como na estirpe 3D7, em pAdapt535 37 é realizada do modo seguinte. 0 plasmídeo 02-659 pf-aa-sub (ver acima) contendo o gene CS otimizado quanto a codões é digerido com as enzimas de restrição HindiII e BamHI. 0 fragmento de 1,1 kb correspondente ao gene CS é ligado ao vetor pAdapt535 digerido com HindiII e BamHI. O plasmídeo resultante é denominado pAdapt535.CS.Pfalc(pf-aa-sub) e contém o gene CS sob o controlo de transcrição do promotor do CMV humano completo e o sinal poli(A) do SV40 a jusante. A geração do vírus recombinante denominado Ad35AE3.CS.Pyoel foi realizada do modo seguinte. O pAdapt535.CS.Pyoel foi digerido com a enzima de restrição PacI, para libertar a porção da extremidade esquerda do genoma de Ad. O plasmídeo pWE.Ad35.pIX-rITRAE3, contendo a parte da extremidade direita remanescente do genoma de Ad com uma deleção de 2673 bp na região E3, é digerido com NotI. O pAdapt535.CS.Pyoel foi transfetado, com pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 digerido com NotI, em células produtoras PER-E1B55K utilizando o reagente de transfeção lipofectamina. A geração da linha de células PER-E1B55K foi descrita em pormenor em WO 02/40665. Em resumo, esta publicação descreve que células PER.C6™ foram transfetadas de modo estável com DNA de pIG35-55K linearizado com Seal, contendo o gene E1B-55K do serotipo de adenovírus 35, após o que um procedimento de seleção com G41-8 deu origem a 196 colónias tríadas. Cultura adicional de um número limitado de colónias em bom crescimento deu origem a linhas de células estáveis que, por numerosas subculturas, expressaram de modo estável o gene E1B-55K de Ad35 e suportaram o crescimento de adenovírus Ad35 recombinantes, ao passo que as células PER.C6™ originais foram muito ineficientes neste suporte. 38 A recombinação homóloga entre sequências sobrepostas conduziu à geração do vírus recombinante denominado Ad35AE3.CS.Pyoel. 0 vetor adenoviral, em lisatos em bruto, resultante desta transfeção foi purificado em placas utilizando métodos conhecidos dos profissionais. Analisaram-se placas isoladas quanto à presença do transgene CS e foram amplificadas, para produção em larga escala, em balões de camadas triplas (3x175 cm2/balão). Por amplificação, as células foram recolhidas a CPE completo e o vírus foi purificado por um procedimento de purificação com CsCl em dois passos, como rotineiramente feito pelos profissionais e geralmente como descrito em WO 02/40665. A geração do vírus recombinante denominado Ad35AE3.CS.Pfalc foi realizada do modo seguinte. O pAdapt535.CS.Pfalc foi digerido com a enzima de restrição PacI, para libertar a porção da extremidade esquerda do genoma do Ad. 0 plasmídeo pWE.Ad35.pIX-rITRAE3, contendo a parte da extremidade direita remanescente do genoma de Ad com uma deleção de 2673 bp na região E3, foi digerido com NotI. O pAdapt535.CS.Pfalc foi transfetado, com pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 digerido com NotI, em células produtoras PER-E1B55K utilizando reagente de transfeção de lipofectamina. A recombinação homóloga entre sequências sobrepostas conduziu à geração do vírus recombinante denominado Ad35AE3.CS.Pfalc. O vetor adenoviral, em lisatos em bruto, resultante desta transfeção foi purificado em placas utilizando métodos conhecidos dos profissionais. Analisaram-se placas isoladas quanto à presença do transgene CS e foram amplificadas, para produção em larga escala, em balões de camadas triplas (3x175 cm2/balão). Por amplificação, as células foram recolhidas a CPE completo e o vírus foi purificado por um procedimento de purificação 39 com CsCl em dois passos, como rotineiramente feito pelos profissionais e geralmente como descrito em WO 02/40665. A geração dos virus recombinantes denominados Ad35AE3.CS.Pfalc(-28) e Α035ΔΕ3.CS.Pfalc(-14) é realizada do modo seguinte. pAdapt535.CS.Pfalc(-28) e pAdapt535.CS.Pfalc(-14) foram digeridos separadamente com a enzima de restrição PacI, para libertar a porção da extremidade esquerda do genoma do Ad. O plasmideo pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 contendo a parte da extremidade direita remanescente do genoma de Ad é digerido com NotI. pAdapt535.CS.Pfalc(-28) e pAdapt535.CS.Pfalc(-14) são separadamente transfetados, com pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 digerido com NotI, em produtor PER-E1B55K. A recombinação homóloga entre sequências sobrepostas conduz à geração de virus recombinantes denominados, respetivamente, Ad35AE3.CS.Pfalc (-28) e Ad35AE3.CS.Pfalc (-14) . Vetores adenovirais, em lisatos em bruto, resultantes destas transfeções são purificados em placas utilizando métodos conhecidos dos profissionais. Analisam-se placas isoladas quanto à presença do transgene CS e são amplificadas, para produção em larga escala, em balões de camadas triplas (3x175 cm2/balão). As células são recolhidas a CPE completo e o virus é purificado por um procedimento de purificação com CsCl em dois passos, como rotineiramente feito pelos profissionais e geralmente como descrito em WO 02/40665. A geração do virus recombinante denominado Ad35AE3.CS.Pfalc(pf-aa-sub) é realizada do modo seguinte. O pAdapt535.CS.Pfalc(pf-aa-sub) é digerido com a enzima de restrição PacI, para libertar a porção da extremidade esquerda do genoma do Ad. O plasmideo pWE.Ad35.pIX-rITRAE3 contendo a parte da extremidade direita remanescente do 40 genoma do Ad é digerido com NotI. O pAdapt535.CS.Pfalc(pf-aa-sub) é transfetado, com pTnTE.Ad35.pIX-rITRAE3 digerido com NotI, em células produtoras PER-E1B55K utilizando reagente de transfeção de lipofectamina (Invitrogen) empregando métodos conhecidos na área e como descrito em WO 00/70071, ou por eletroporação ou outros métodos de transfeção conhecidos dos profissionais. A recombinação homóloga entre sequências sobrepostas conduz à geração do virus recombinante denominado Ad35AE3.CS.Pfalc(pf-aa-sub). 0 vetor adenoviral, em lisatos em bruto, resultante desta transfeção é purificado em placas utilizando métodos conhecidos dos profissionais. Analisam-se placas isoladas quanto à presença do transgene CS e são amplificadas, para produção em larga escala, em balões de camadas triplas (3x175 cm2/balão). As células são recolhidas a CPE completo e o virus é purificado por um procedimento de purificação com CsCl em dois passos, como rotineiramente feito pelos profissionais e geralmente como descrito em WO 02/40665.

Exemplo 5. Indução de proteção contra infeção de malária por P. yoelii utilizando vacinas de base adenoviral recombinante in vivo

Foi mostrado que vetores à base do serotipo 5 de adenovírus (Ad5) geneticamente manipulados para expressarem o antigene CS da malária de roedores P. yoelii são capazes de induzir proteção completa contra infeção por P. yoelii (Rodrigues et ai. 1997). Concebeu-se uma comparação lado a lado entre vetores de Ad5 e Ad35 contendo o gene CS de P. yoelii otimizado quanto a codões para investigar a resposta imunológica que é induzida, e para investigar a sua capacidade em conferir proteção contra infeção pelo parasita P. yoelii em ratinhos. Este estudo envolveu ratinhos Balb/C que foram imunizados por injeção 41 intramuscular ou subcutânea de 108-1010 partículas virais (vp) de vetores virais à base de Ad5AE3 ou Ad35úE3 (como descrito acima) contendo o gene CS de P. yoelii (Ad5úE3-CS.Pyoel e Ad35úE3-CS.Pyoel) ou nenhum transgene ((Ad5úE3-empty e Ad35AE3-empty). A Figura 4 mostra os resultados das experiências nas quais se comparou a via de administração utilizando ambos os vetores. Determinou-se o número de células secretoras de IFN-γ numa população de 106 esplenócitos (Fig. 4A) , bem como os títulos de anticorpos no soro (Fig. 4B) . As experiências foram conduzidas em ratinhos que foram sacrificados duas semanas após a injeção com os adenovírus recombinantes. Cada uma das barras representa a média de 5 ratinhos. Quando os ratinhos não foram sacrificados, foram utilizados para uma provocação com esporozoítos vivos, após o que foi determinada a taxa de proteção (Fig. 5A e B) . Cada uma destas barras representa a média de 5 ratinhos. As experiências acerca de respostas imunológicas humorais e celulares são realizadas com ensaios imunológicos bem conhecidos dos profissionais e como descrito, por exemplo, por Bruna-Romero et al. (2001a). A imunização, provocação e leituras estão esquematizadas na Tabela II e III. Os títulos de anticorpos contra esporozoítos podem ser determinados por um ensaio de imunofluorescência indireta ou com um ELISA. A Figura 4B mostra os resultados calculados com um ELISA. As respostas imunológicas celulares foram determinadas por ensaio ELISPOT ex vivo, medindo o número relativo de células específicas de CS, secretoras de IFN-γ, T CD8+ e CD4+. A proteção contra infeção de malária foi monitorizada determinando os níveis de inibição do parasita nos fígados de ratinhos imunizados por quantificação, por PCR com transcriptase reversa, de cópias de RNA ribossómico de P. yoelii. 42 A imunização com vetores baseados em Ad5 e Ad35 foi realizada do modo seguinte. Aliquotas de adenovirus recombinantes, que estavam armazenados a -70°C, foram gradualmente descongeladas em gelo e diluídas para 100 pL, na concentração desejada, em PBS com 1% Soro de Ratinho Normal inativado pelo calor. Subsequentemente, as amostras foram sonicadas durante 5 segundos. Efetuou-se administração subcutânea de ambos os lados da base da cauda, com um volume de 50 pL em cada lado. Efetuou-se administração intramuscular em ambas as coxas, com um volume de 50 pL em cada coxa. 0 Ensaio de Imunofluorescência Indireta (IFA) é realizado de acordo com Bruna-Romero et ai. (2001a) . Em primeiro lugar geram-se mosquitos infetados dispondo inicialmente de um ratinho nativo infetado com um mosquito infetado, em que o ratinho é mordido em três sítios diferentes. Remove-se sangue do ratinho passados 8 dias quando a parasitemia é 4-8%, sendo diluído para 1%. Em seguida, outros ratinhos não manipulados são injetados i.p. com a amostra de sangue diluído. Recolhe-se sangue passados 3 dias, que serve de refeição de sangue para mosquitos desnutridos. Estes são alimentados durante 2 dias. Após 14 dias isolam-se esporozoítos de P. yoelii dos mosquitos nutridos com sangue por anestesia de mosquitos infetados em gelo e subsequente saturação em 70% etanol. Em seguida, os mosquitos são transferidos para PBS pH 7,4 e efetua-se a dissecção das glândulas salivares. Estas são subsequentemente trituradas em gelo, e os esporozoítos são separados dos detritos por centrifugação. Utilizando este método, aproximadamente 35 000 esporozoítos de P. yoelii podem ser obtidos de 1 mosquito. Em seguida, lâminas de vidro numa placa de 12 43 múltiplas cavidades são revestidas com aproximadamente 10 000 esporozoitos de P. yoelii cada em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) mais 10% Soro Fetal de Bovino, por secagem ao ar. Uma gama de diluições de soros dos ratinhos vacinados (num volume de 10 pL em PBS mais 5% FBS) é subsequentemente incubada com os esporozoitos secos ao ar durante 30 minutos à temperatura ambiente num ambiente húmido. As lâminas são então aspiradas e lavadas duas vezes com PBS, adicionam-se 10 pL de anticorpo anti-Ratinho de Cabra conjugado a FITC diluído 30 vezes (Kirkegaard & Perry Laboratories, E.U.A., n° catálogo 02-18-06) e o sistema é incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente. As cavidades foram novamente aspiradas e lavadas duas vezes. Para a contracoloração, uma solução de 100 pg/mL de Brometo de Etídio é incubada durante 10 minutos, após o que se repete o passo de aspiração e as cavidades são lavadas com água. As lâminas são montadas utilizando Permount contendo fenilenodiamina/ "anti fade". Determinam-se os títulos de anticorpos anti-esporozoítos na forma da diluição mais elevada de soro que produz fluorescência. Para a determinação dos títulos de anticorpos também é possível utilizar um ELISA. Para esta finalidade, placas de ELISA (Immulon II, Dynatech) foram revestidas com 2 pg/mL de antigénio em PBS por adição de 100 pL desta solução por cavidade e deixando o sistema durante a noite a 4°C. O antigénio utilizado consistiu numa repetição de 3x6 aminoácidos da proteína CS de P. yoelii: QGPGAFOGPGAFQGPGAP (SEQ ID NO: 19) . As placas foram subsequentemente lavadas três vezes com tampão de lavagem (lx PBS, 0,05% Tween) e adicionaram-se 200 pL de tampão de bloqueio (10% FCS em solução de lavagem) por cavidade. As placas foram incubadas durante 1-2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, as placas foram lavadas três vezes 44 novamente com tampão de lavagem incluindo 5% FCS. Fizeram-se diluições dos soros do modo seguinte: adicionaram-se 50 μL de tampão de lavagem mais 5% FCS às cavidades 2-12. Depois adicionam-se 100 pL de tampão de lavagem mais 5% FCS à primeira cavidade e fazem-se diluições em série 1:2 por transferência de 50 pL da cavidade 1 para a 2, depois da 2 para a 3, etc. As placas são incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, as placas são lavadas três vezes com tampão de lavagem, adicionam-se 100 pL de um IgG anti-Ratinho de Cabra etiquetado com peroxidase diluído 1:2000 (anti cadeia Pesada e Leve, absorvido em humano, Kirkegaard & Perry Laboratories, n° catálogo 074-1806) por cavidade e o sistema é incubado. As placas são então lavadas três vezes com tampão de lavagem e uma vez com PBS e depois adicionam-se a cada cavidade 100 pL de solução de substrato ABTS (ABTS 1-Componente, Kirkegaard & Perry Laboratories, número do catálogo 50-66-18). A reação é terminada pela adição de 50 pL de 1% SDS, e as placas são lidas a 405 nm num leitor de ELISA. O ensaio ELISPOT para determinar o número relativo de células secretoras de IFN-γ específico de CS, T CD8+ e CD4+ no baço, e a PCR com transcriptase reversa e PCR em tempo real para quantificar a quantidade de RNA específico do parasita no fígado dos ratinhos provocados foram realizados como descrito por Bruna-Romero et al. (2001a e 2001b), excetuando o facto de o número de ciclos da PCR em tempo real ter sido 45.

Enquanto se prevê atenuação de infeção por P. yoelii em recetores da vacina Ad5AE3-CS.Pyoel (Rodrigues et al. 1997), é esperado que a vacinação com Ad35AE3-CS.Pyoel seja superior ou pelo menos igualmente eficaz. 45 A Figura 4A mostra que, com uma administração de 109 e IO10 partículas virais por ratinho, o vetor à base de Ad35 é pelo menos tão eficaz na indução de uma resposta imunológica celular quanto o vetor à base de Ad5, se não superior. Pode concluir-se que, com este cenário, não há uma diferença dramática da resposta celular, indicado pelo número de células secretoras de IFN-γ após distribuição intramuscular e subcutânea. A Figura 4B mostra os títulos de anticorpos na mesma experiência e determinados nos mesmos soros utilizando a experiência de imunofluorescência indireta esboçada acima. Se comparados com os resultados mostrados na Figura 4A, fica claro que, a uma dose de 109 partículas virais, o vetor à base de Ad35 induz uma resposta imunológica celular significativa mas não origina títulos muito elevados de anticorpos anti-esporozoítos. Novamente, não há nenhuma diferença significativa entre as duas vias de administração.

Os animais que receberam doses diferentes de vetores à base de Ad5 e Ad35 expressando o antigénio CS de P. yoelii otimizado quanto a codões foram subsequentemente provocados i.v. com 105 esporozoítos purificados como descrito acima. Os resultados destas experiências estão apresentados na Figura 5A e B. Calculou-se a percentagem de inibição em comparação com ratinhos não manipulados que não foram imunizados.

Ratinhos que foram imunizados receberam s.c. 109 ou IO10 partículas virais (vp), foram provocados, passados 14 dias, com os esporozoítos e depois foram sacrificados após 48 46 horas. Os controlos negativos consistiram em vetores vazios sem o antigénio e ratinhos não imunizados. Claramente obtém-se uma elevada percentagem de inibição quando se utiliza o vetor à base de Ad5, bem como com o vetor à base de Ad35, aplicando as duas doses, ao passo que não se detetou proteção nos controlos negativos (Fig. 5A). É importante notar que só foi possível determinar um pequeno número de RNAs ribossómicos 18S específicos do parasita no fígado dos ratinhos imunizados, ao passo que os ratinhos que não receberam vetor adenoviral ou que receberam vetores vazios continham grandes números destes RNAs (Fig. 5B) . Isto indica fortemente que o vetor à base de Ad35, tal como o vetor à base de Ad5, pode conferir proteção significativa contra o parasita da malária, mesmo após uma única ronda de imunização.

Exemplo 6. Indução de imunidade contra infeção de malária por P. falciparum utilizando vacinas de base adenoviral recombinante in vivo.

Concebe-se uma comparação lado a lado entre vetores do serotipo de Adenovírus 5 (Ad5) e serotipo de Adenovírus 35 (Ad35) para investigar a capacidade para induzir respostas imunológicas humorais e celulares contra o antigénio CS do parasita P. falciparum em ratinhos. Adicionalmente, comparam-se as imunogenicidades de vetores de Adenovírus contendo CS completa e menos GPI. Este estudo envolve ratinhos B10.BR. Os animais são imunizados por injeção intramuscular de 108-1010 vp de vetores virais Ad5AE3 ou Ad35úE3 contendo o gene CS completo (Ad5AE3-CS.Pfalc e Ad35úE3-CS.Pfalc) ou o gene CS menos a sequência de ancoragem de GPI (Ad5AE3-CS.Pfalc.(-28)/(-14) e Ad35AE3-CS.Pfalc. (-28)/ (-14) ou nenhum transgene (Ad5úE3-empty e Ad35AE3-empty) . Às duas semanas e seis até oito semanas 47 pós-vacinação, as respostas celulares e humorais são monitorizadas com ensaios imunológicos bem conhecidos dos profissionais como descrito acima. A imunização, provocação e leitura estão esquematizadas na Tabela IV e V. É esperado que a imunogenicidade dos vetores à base de Ad35 seja superior, ou pelo menos comparável, à imunogenicidade desencadeada por vetores à base de Ad5. A Figura 6 mostra os resultados que foram obtidos utilizando o vetor à base de Ad5 contendo o gene completo que codifica a proteína CS de P. falciparum, o gene que codifica a proteína com a deleção de 14 aminoácidos e o gene que codifica a proteína com a deleção de 28 aminoácidos. Os resultados indicam que os três vetores (à base de Ad5) são capazes de induzir uma resposta imunológica celular, medido pelo número de células secretoras de IFN-γ específico de CS numa população de esplenócitos, determinado pelo ensaio ELISPOT ex vivo descrito acima e genericamente como em Bruna-Romero et al. (2001a).

Exemplo 7. Indução de uma proteção de longa duração contra infeção de malária por P. yoelii através de regimes de primário-reforço com vacinas à base de serotipos de adenovirus diferentes.

Verificou-se que o serotipo de Adenovirus Recombinante 5 que expressa um antigénio CS de P. yoelii induz proteção quando utilizado num regime de primário-reforço em combinação com um vírus vacínia recombinante contendo o mesmo antigénio (Bruna-Romero et al. 2001a). Concebeu-se uma experiência para investigar a capacidade de regimes de primário/reforço baseados em vetores de adenovirus contendo CS otimizado quanto a codões e derivados de dois serotipos diferentes para induzir proteção de longa duração contra o 48 antigénio CS de P. yoelii. Este estudo envolve ratinhos Balb/C distribuídos em grupos experimentais de 12 ratinhos cada. Os animais são imunizados por injeção intramuscular de uma dose ótima de vetores virais Ad5áE3 ou Ad35AE3 contendo o gene CS de P. yoelii (Ad5áE3-CS.Pyoel e Ad35AE3-CS.Pyoel) ou nenhum transgene (Ad5áE3-empty e Ad35AE3-empty). Um grupo de animais recebe primário na semana 0 de Ad5áE3-CS.Pyoel e é reforçado na semana 8 com Ad35AE3-CS.Pyoel. Outro grupo de ratinhos recebe primário na semana 0 de Ad35AE3-CS.Pyoel e é reforçado na semana 8 com Ad5AE3-CS.Pyoel. Outros grupos de ratinhos recebem primário na semana 0 de Ad35AE3-CS.Pyoel ou Ad5áE3-CS.Pyoel e são reforçados na semana 8 com o mesmo vetor. Por fim, um grupo de controlo de ratinhos recebe primário na semana 0 de Ad5AE3-empty e é reforçado na semana 8 com Ad35áE3-empty. Na semana 2 pós-reforço, 6 ratinhos de cada grupo são sacrificados para permitir a avaliação e caracterização de respostas imunológicas humorais e celulares com ensaios imunológicos bem conhecidos dos profissionais, e os restantes 6 ratinhos de cada grupo são provocados com esporozoítos vivos. A imunização, provocação e leitura estão esquematizadas na Tabela VI. A proteção contra infeção de malária será monitorizada e medida utilizando ensaios bem conhecidos dos profissionais como descrito acima. É esperado que regimes de vacinas à base de Ad35 isoladamente ou combinações Ad5/Ad35 tenham eficácia superior, ou pelo menos comparável, em comparação com regimes baseados apenas em Ad5.

Exemplo 8. Indução de uma imunidade de longa duração contra infeção de malária por P. falciparum através de regimes de primário-reforço com vacinas à base de serotipos de adenovirus diferentes. 49

Foi concebida uma experiência para investigar a capacidade de regimes de primário/reforço baseados em vetores de adenovirus derivados de dois serotipos diferentes para induzir imunidade de longa duração contra o antigénio CS de P. falciparum. 0 estudo envolve ratinhos B10.BR distribuídos em grupos experimentais de 24 ratinhos cada. Os animais são imunizados por injeção intramuscular de uma dose ótima de vetores adenovirais contendo o gene CS completo (Ad5AE3-CS.Pfalc e Ad35AE3-CS.Pfalc) ou o gene CS menos a sequência de ancoragem de GPI (Ad5AE3-CS.Pfalc(-28)/(-14) e Ad35áE3-CS.Pfalc(-28) /(-14) ) ou nenhum transgene (Ad5áE3-empty e Ad35áE3-empty). Um grupo de animais recebe primário na semana 0 de Ad5áE3-CS.Pfalc ou Ad5AE3-CS.Pfalc(-28)/(-14) e é reforçado na semana 8 com Ad35AE3-CS.Pfalc ou Ad35AE3-CS.Pfalc(-28)/(-14) . Outro grupo de ratinhos recebe primário na semana 0 de Ad35áE3-CS.Pfalc ou Ad35AE3-CS.Pfalc(-28)/(-14) e é reforçado na semana 8 com Ad5AE3-CS.Pfalc ou AdSAE3-CS.Pfalc(-28)/(-14). Outro grupo de ratinhos recebe primário na semana 0 de Ad35AE3-CS.Pfalc ou Ad35AE3-CS.Pfalc(-28)/(-14) e é reforçado na semana 8 com o mesmo vetor. Por fim, um grupo de controlo de ratinhos recebe primário na semana 0 de Ad5AE3-empty e é reforçado na semana 8 com Ad35áE3-empty. Na semana 2 e 6 ou 10 ou 16 pós-reforço, 6 ratinhos são sacrificados em cada instante e monitorizam-se as respostas celulares e humorais com ensaios imunológicos bem conhecidos dos profissionais e como descrito acima. A imunização, provocação e leitura estão esquematizadas na Tabela VII. É esperado que regimes de vacinas baseados em Ad35 isoladamente ou combinações Ad5/Ad35 tenham eficácia superior, ou pelo menos comparável, em comparação com regimes baseados apenas em Ad5. 50

Exemplo 9. Indução de uma resposta imunológica contra o antigénio CS de P. falciparum por regimes de primário/ reforço utilizando vacinas à base de serotipos de Adenovirus diferentes em primatas não humanos.

Descreve-se um exemplo de uma experiência útil para investigar a capacidade de regimes de primário/reforço baseados em vetores de adenovirus derivados de dois serotipos diferentes para induzir imunidade contra o antigénio CS de P. falciparum em primatas não humanos. Além disso avalia-se o efeito de duas vias diferentes de administração de vacinas, intramuscular e intradérmica.

Macacos Rhesus são vacinados com vetores adenovirais contendo o gene CS completo (Ad5AE3-CS.Pfalc ou Ad35úE3-CS.Pfalc) ou o gene CS menos a sequência de ancoragem de GPI (Ad5AE3-CS.Pfalc(pf-aa-sub) ou Ad35úE3-CS.Pfalc(pf-aa-sub)). Regimes de primário/reforço (Ad5 seguido de Ad35 ou Ad35 seguido de Ad5) são comparados com regimes de primário/reforço geralmente aplicados (Ad5 seguido de Ad5 ou Ad35 seguido de Ad35). Respostas imunológicas humorais e celulares são monitorizadas utilizando ensaios imunológicos bem conhecidos dos profissionais. O soro de macacos imunizados é testado por ensaio ELISA para determinar a natureza e magnitude da resposta de anticorpos contra a região de repetição de CS. A resposta imunológica celular é medida por ensaio ELISPOT para determinar a quantidade de células secretoras de IFN-γ especifico do antigénio.

Tabela I. Nomes e números de entrada na base de dados Genbank das sequências de aminoácidos circunsporozoitas de P. falciparum utilizadas para gerar a sequência de consenso final. 51

Isolados de Estirpes Números t-lpo médio de entrada laboratoriais de entrada Cftííss AAGS7074 807 CÂA3342? Tailândia 0Α38417Ϊ CAB3S3S8 GSP.PLAFT OSP..PLAFG 4ΛΑ29542 - Ê4P.. .473175 AAA38552 AAA2S5SS -AAA2S578 7í3B- CSPPLAFA B?3Zg GABS4187 G6S657 CA8S439C· -0,4864137 '3524 SensgaS 04864183 -GAS6418S 71F54 AAA29S21 Birmânia CAS64237 -04864243 AAAS527 índia A86418S 05428 Tanzânia AS641S8 SPPLAFL CAS64*7C WELLCOME A54S23 CA3S4172 AAA29S54 Cambia AAF03Í34- fkAFúmm CSP.PLAFW mme$ 060857 860657 LES CSP..PLAFL szmm AAAS7043 B6S657 B2S785 Ugsnds CAA27533 CA864177 Libéria 04864176 Honduras C4864174 Sudeste AAA28S16 - Asiático AAA29518 CAS6WS CA384178 04364179

Tabela II. Esquema da imunização, provocação e leituras para vacinações de ratinhos com Adõ.CS.Pyoel (Ad5-PyCS), vp = partículas virais por ratinho.

Esquema de imunização Vetor virai vp # ratinhos ELISPOT/ soro Provocação Primário/ provocação Ad5-PyCS 108 12 2 semanas (6 ratinhos) 2 semanas (6 ratinhos) Primário/ provocação Ad5-PyCS 108 12 2 semanas (6 ratinhos) 2 semanas (6 ratinhos) Primário/ provocação Ad5-PyCS IO10 12 2 semanas (6 ratinhos) 2 semanas (6 ratinhos) Primário/ provocação Ad5-empty IO10 8 2 semanas (4 ratinhos) 2 semanas (4 ratinhos) 52

Tabela III. Esquema da imunização, provocação e leituras para vacinações de ratinhos com Ad35.CS.Pyoel (Ad35-PyCS), vp = partículas virais por ratinho.

Esquema de imunização Vetor virai vp # ratinhos ELISPOT/ soro Provocação Primário/ provocação Ad35-PyCS 108 12 2 semanas (6 ratinhos) 2 semanas (6 ratinhos) Primário/ provocação M35-PyCS 108 12 2 semanas (6 ratinhos) 2 semanas (6 ratinhos) Primário/ provocação Ad35-PyCS IO10 12 2 semanas (6 ratinhos) 2 semanas (6 ratinhos) Primário/ provocação Ad35-empty IO10 8 2 semanas (4 ratinhos) 2 semanas (4 ratinhos)

Tabela IV. Esquema da imunização, provocação e leituras para vacinações de ratinhos com Adõ.CS.Pfalc (Ad5-PfCS, com ou sem âncora), vp = partículas virais por ratinho.

Esquema de imunização Vetor virai vp # ratinhos ELISPOT/ soro Provocação Primário Ad5-PfCS 108 12 2 semanas (6 ratinhos) 6-8 semanas (6 ratinhos) Primário Ad5-PfCS 108 12 2 semanas (6 ratinhos) 6-8 semanas (6 ratinhos) Primário Ad5-PfCS IO10 12 2 semanas (6 ratinhos) 6-8 semanas (6 ratinhos) Primário Ad5-empty IO10 8 2 semanas (4 ratinhos) 6-8 semanas (4 ratinhos)

Tabela V. Esquema da imunização, provocação e leituras para vacinações de ratinhos com Ad35.CS.Pfalc (Ad35-PfCS, com ou sem âncora), vp = partículas virais por ratinho.

Esquema de imunização Vetor virai vp # ratinhos ELISPOT/ soro Provocação Primário Ad35-PfCS 108 12 2 semanas (6 ratinhos) 6-8 semanas (6 ratinhos) Primário Ad35-PfCS co O \—1 12 2 semanas (6 ratinhos) 6-8 semanas (6 ratinhos) Primário Ad35-PfCS IO10 12 2 semanas (6 ratinhos) 6-8 semanas (6 ratinhos) Primário Ad35-empty IO10 8 2 semanas (4 ratinhos) 6-8 semanas (4 ratinhos)

Tabela VI. Esquema da imunização, provocação e leituras para ratinhos num cenário de vacinação de primário-reforço utilizando Ad5.CS.Pyoel (Ad5-PyCS) e Ad35.CS.Pyoel (Ad35-PyCS) . 53

Esquema de imunização Primário de vetor virai Reforço de vetor virai (após 8 semanas) # rati nhos ELISPOT/ soro Provocação Primário- reforço/ provocação Ad5-PyCS Ad5-PyCS 12 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) Primário- reforço/ provocação Ad35- PyCS Ad35-PyCS 12 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) Primário- reforço/ provocação Ad5-PyCS Ad35-PyCS 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) Primário- reforço/ provocação Ad35- PyCS Ad5-PyCS 12 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) Primário- reforço/ provocação Ad5- empty Ad35-empty 12 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos)

Tabela VII. Esquema da imunização, provocação e leituras para ratinhos num cenário de vacinação de primário-reforço utilizando Ad5.CS.Pfalc (Ad5-PfCS) e Ad35.CS.Pfalc (Ad35-PfCS), com ou sem âncora de GPI.

Esquema de imunização Primário de vetor virai Reforço de vetor virai (após 8 semanas) # ratinhos ELISPOT/ soro ELISPOT/ soro Primário- reforço/ provocação Ad5-PfCS Ad5-PfCS 12 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) 6/10/16 ssnanas pós-reforço (6 ratinhos) Primário- reforço/ provocação Ad35- PfCS Ad35-PfCS 12 2 semanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 serranas pós-reforço (6 ratinhos) Primário- reforço/ provocação Ad5-PfCS Ad35-PfCS 12 2 ssnanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 serranas pós-reforço (6 ratinhos) Primário- reforço/ provocação Ad35- PfCS Ad5-PfCS 12 2 ssnanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 serranas pós-reforço (6 ratinhos) Primário- reforço/ provocação Ad5- empty Ad35-empty 12 2 ssnanas pós-reforço (6 ratinhos) 2 serranas pós-reforço (6 ratinhos)

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<210> 1 <211> 1193 <212> DNA 58 <213> Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Gene circunsporozoita otimizado quanto a codões de Plasmodium falciparum, clone 02 -148 <22 0>

<221> CDS <222> (13) .. (1170) <223> <22 0> <221> péptido_sin <222> (13) .. (102) <223> <4 0 0> 1 e# atg afg aa# ate: efcf «g# ffeg ags ags fcta St t&et Mf Ma m# sw sfcs £ s m efef fete ftf fss i&fe gas Me se§ fef© ts© fge ©se ase ff I#a E&s Siti Ala Ma Sã# Slã èls St® Cy® fysr éíy Ses M© 15 tf age aec m<z «st tag etg sa# ga® sas tae *#e tf# ®®e Xff Ma tfcjs A»f m£ m® m# ak m® to :iys Mm. m* sty ϊμ 3® Ji «3 asa afef sm «*® «*$ «te® a*e ta* Me fge a#f ea® fes *»« ifi

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<212> PRT <213> Plasmodium falciparum <22 0> <221> SINAL <222> (1) .. (30) <223> <22 0> <221> REPETIÇÃO <222> (124) .. (259)

<223> Região de 4 NVDP e no total 30 repetições NAVP <22 0> <221> LÍPIDO <222> (359) .. (386 <223> ÂNCORA DE GPI <22 0> <221> MUTAGÉNIO <222> (373) .. (373 <223> Substituição Ser em Ala, eliminação do sitio de glicosilação <400> 3 63

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<221> CDS <222> (13) .. (1128) <223> <22 0> <221> péptido sin <222> (13) .. (102) <223> <400> 4 66 tegetig®®# m sig «m efcf ifce cfef m® g&g «g® «g® **« Μ* mt **f lys usa al® im *m &&» mi mx mt ^ is m «sgf Stee «t* wm fe® cfcg fett ea$ M® itss vai sia Alâ hm tm hln ii age aae aee C9S S*§ efeg «a® ®agr ®fei is® IèIs® **9 V®1 % 1 1 M u ®ae éfet ts« mm wr ®feg gmf stt ®*e te íe« $Vé As® iiu hm éi® iiaà te 50 feff tsa áfâ; «sg aag aaf ãsã age egg Tí® %» i««: isa l^S &3s *s® Saa 3tat fl 7fl Vf® aaa aaa aa® sae fia fia as® na sif M® M«. Ám Mb mv Aap Asa 4lv as SS ess «si gae tf®. aa<s aa® gag gsc aa® ASf m& M® A a® âla ítóp Ms ss ϊϋ ea® e.aa efefe. eag sas ff® gae Ma %a &®a IfS mn. toa te Aag? ili aa® «a® aa® iSf ta® çça asa gço sst Aá® tos? Asa Vai Mp @ϊ®. Ato. te te 1Μ aafe ®ÍÍSf sae gfete gSfe ae® set n asa As® toe Ma Vai Μβ toe As® Ate Asa 14Í 13-5 sa® e®s aat V®® mt as® mt gês ®®t Ma F.m A»H M« mm M® Ato Aí* Asa 1« Mi ase ®efe sat gct aafe ete àte fet. asfe Asa toê km MA. ÁS»: toe Àâa Ala As® «» m essa aae gfe® gafe ®st aae gea aat ^atta to® feg® HW km to® As a 30® As® im MS ecs ms «Sfe sàe «eg te® gca .ããc M to® te Ma Ãs® Fto? M& Mi te ÈW aae «ea Mt® fí® mm eef àâe get àãfe M® toe Asa M® AiS®. to® mft AM A®S m 33& ®aS eefe aa® ffeâ aã.® éea. safe φ» ®ae .Ma tm %at Ma. to toã &s Mi M® 24« £41 t*® sag *m fe»e %m ®ge a^ fg* ste eya *¥* m$ ter ter m te® feto *f*e M® 4®s tf® ae® M» fjfír Msp Mb Má Slf 33sa? m 4i

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Lisboa, 3 de Fevereiro de 2012

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Adenovirus recombinante deficiente para replicação de um serotipo selecionado do grupo que consiste nos seguintes: Ad26 e Ad35, em que o referido adenovirus recombinante compreende um ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

2. Adenovirus recombinante deficiente para replicação de acordo com a reivindicação 1, em que o referido ácido nucleico é otimizado quanto a codões para expressão elevada num humano, e compreende a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 4.

3. Adenovirus recombinante deficiente para replicação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que o referido adenovirus também compreende um gene que codifica um antigénio especifico do fígado para Plasmodium falciparum como determinante antigénico, ou uma respetiva parte imunogénica.

4. Adenovirus recombinante deficiente para replicação de acordo com a reivindicação 3, em que o referido antigénio específico do fígado é LSA-1.

5. Composição de vacina compreendendo um adenovirus recombinante deficiente para replicação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 5, que também compreende um adjuvante. Lisboa 3 de Fevereiro de 2012