ES2431613T3 - Vacunas contra la malaria basadas en virus recombinante - Google Patents
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Abstract
Una composición de vacuna que comprende un adenovirus recombinante de replicación defectuosa quecomprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para proteína CS o una parte inmunogénica de ella de P.falciparum, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína CS o una parte inmunogénica deella comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, para uso en el tratamiento o la prevención demalaria.
Description
Vacunas contra la malaria basadas en virus recombinante
La invención se refiere al campo de la medicina. Más en particular, la invención se refiere al uso de un vector viral producido de manera recombinante como vehículo de un determinante antigénico seleccionado de un grupo de patógenos de malaria para el desarrollo de una vacuna contra infecciones por malaria.
La malaria representa actualmente una de las infecciones más prevalentes en áreas tropicales y subtropicales en todo el mundo. Al año, las infecciones por malaria conducen a dolencias graves en cientos de millones de individuos 15 en todo el mundo, mientras que mata a de 1 a 3 millones de personas en países emergentes y en vías de desarrollo cada año. La existencia generalizada y la incidencia elevada de malaria son una consecuencia del número creciente de parásitos resistentes a fármacos y vectores de parásitos resistentes a insecticidas. Otros factores incluyen cambios climáticos y medioambientales, disturbios civiles y el aumento de la movilidad de las poblaciones. La malaria se produce por parásitos hematoprotozoarios transmitidos por mosquitos que pertenecen al género Plasmodium. Cuatro especies de protozoarios de Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae) son responsables de la enfermedad en el hombre; muchas otras provocan la enfermedad en animales, tales como P. yoelii y P. berghei en ratones. P. falciparum representa la mayoría de infecciones y es del tipo más letal (“malaria tropical”). Los parásitos de la malaria tienen un ciclo de vida que consiste en varias fases. Cada una de estas fases puede inducir respuestas inmunitarias específicas dirigidas contra los antígenos específicos de fase que se 25 producen de manera correspondiente. Los parásitos de la malaria se transmiten al hombre por varias especies de mosquitos Anopheles hembra. Los mosquitos infectados inyectan la forma de “esporozoíto” del parásito de la malaria en el torrente sanguíneo del mamífero. Los esporozoítos permanecen durante algunos minutos en la circulación antes de invadir los hepatocitos. En esta fase, el parásito está ubicado en el entorno extracelular y está expuesto al ataque de anticuerpos, principalmente dirigidos a la proteína “circumsporozoíto” (CS), un componente principal de la superficie del esporozoíto. Una vez en el hígado, los parásitos se replican y se desarrollan en los denominados “esquizontes”. Estos esquizontes se producen en una razón de hasta 20.000 por célula infectada. Durante esta fase intracelular del parásito, los principales responsables de la respuesta inmunitaria del huésped son los linfocitos T, especialmente los linfocitos T CD8+ (Romero et al. 1998). Tras aproximadamente una semana de la infección del hígado, se liberan miles de los denominados “merozoítos” en el torrente sanguíneo y entran en los
35 glóbulos rojos, convirtiéndose en dianas de la respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos y citocinas segregadas por las células T. Tras invadir los eritrocitos, los merozoítos experimentan varias fases de replicación y se transforman en los denominados “trofozoítos” y en esquizontes y merozoítos, que pueden infectar nuevos glóbulos rojos. Esta fase está asociada con la enfermedad clínica manifiesta. Una cantidad limitada de trofozoítos puede evolucionar a “gametocitos”, que es la fase sexual del parásito. Cuando los mosquitos susceptibles ingieren eritrocitos, se liberan los gametocitos de los eritrocitos, dando como resultado varios gametocitos machos y un gametocito hembra. La fertilización de estos gametos conduce a la formación del cigoto y a la transformación posterior en oocinetos, luego en ooquistes, y finalmente en esporozoítos de las glándulas salivales.
Dirigir anticuerpos contra antígenos de superficie específicos de la fase del gametocito puede bloquear este ciclo
45 dentro de la parte media del intestino del mosquito. Tales anticuerpos no protegerán al huésped mamífero, pero reducirán la transmisión de malaria disminuyendo el número de mosquitos infectados y su carga parasitaria.
Los enfoques recientes con respecto al desarrollo de vacunas contra la malaria pueden clasificarse según las diferentes fases en las que puede existir el parásito, tal como se describió anteriormente. Pueden distinguirse tres tipos de vacunas posibles:
• Vacunas pre-eritrocíticas, que se dirigen contra las células infectadas con esquizontes y/o esporozoítos. Estos tipos de vacunas son en su mayor parte basadas en CS e idealmente deberían conferir inmunidad estéril, mediada por la respuesta inmunitaria celular y humoral, previniendo la infección por malaria.
- •
- Vacunas contra la fase en sangre asexual, que se diseñan para minimizar la gravedad clínica. Estas vacunas deben reducir la morbilidad y mortalidad y pretenden prevenir la entrada y/o desarrollo del parásito en los eritrocitos.
- •
- Vacunas que bloquean la transmisión, que se diseñan para dificultar el desarrollo del parásito en el mosquito huésped. Este tipo de vacuna debe favorecer la reducción de tasas de infección por malaria en la toda la población.
Junto a estas vacunas, se está buscando la viabilidad de desarrollar vacunas contra la malaria que seleccionen 65 como diana múltiples fases del ciclo de vida del parásito en las denominadas vacunas de múltiples componentes y/o múltiples fases. Actualmente, no se dispone comercialmente de vacunas contra la malaria, aunque el desarrollo de vacunas contra la malaria se ha iniciado ya hace más de 30 años: la inmunización de roedores, primates no humanos y seres humanos con esporozoítos atenuados con radiación confirió protección frente a una exposición posterior con esporozoítos (Nussenzweig et al. 1967; Clyde et al. 1973). Sin embargo, la falta de un sistema de
5 cultivo a gran escala viable para la producción de esporozoítos evita la aplicación generalizada de tales vacunas.
Hasta la fecha, los candidatos de vacunas más prometedoras sometidas a prueba en seres humanos se han basado en un número pequeño de antígenos de superficie de esporozoítos. La proteína CS es el único antígeno de P. falciparum que se ha demostrado que evita sistemáticamente la malaria cuando se usa como la base de inmunización activa en seres humanos contra infecciones transmitidas por mosquitos, aunque a niveles que a menudo son insuficientes. El análisis teórico ha indicado que la cobertura de la vacuna así como la eficacia de la vacuna deben ser superiores al 85%, o en caso contrario pueden escapar mutantes que son más virulentos (Gandon et al. 2001).
15 Una manera de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero es administrando un vehículo infeccioso, que alberga el determinante antigénico en su genoma. Un vehículo de este tipo es un adenovirus recombinante, que es de replicación defectuosa mediante la eliminación de regiones dentro del genoma que son normalmente esenciales para la replicación, tal como la región E1. Se conocen en la técnica ejemplos de adenovirus recombinantes que comprenden genes que codifican para antígenos (documento WO 96/39178), por ejemplo se ha demostrado que componentes antigénicos derivados del VIH proporcionan una respuesta inmunitaria si se administran mediante adenovirus recombinantes (documentos WO 01/02607; WO 02/22080). También para malaria, se han desarrollado vacunas basadas en adenovirus recombinantes. Estos vectores expresan la proteína CS entera de P .yoelii, que es un parásito específico de ratón y se ha demostrado que estos vectores pueden inducir inmunidad estéril en ratones, en respuesta a una única dosis de inmunización (Bruna-Romero et al. 2001 a). Además, se demostró recientemente
25 que un vector de vacuna similar usando el CS de P. berghei provoca protección duradera cuando se usa en un régimen de sensibilización y refuerzo, en combinación con un virus Vaccinia recombinante (Gilbert et al. 2002) en ratones. Se ha demostrado que las células T CD8+ ante todo median protección inducida por adenovirus. Es poco probable que los vectores de adenovirus basados en P. yoelii y P. berghei funcionen bien en seres humanos, puesto que las dolencias relacionadas con la malaria más graves en seres humanos no se producen por estos dos parásitos. Además, se prefiere tener una vacuna que sea lo suficientemente potente para generar protección duradera tras una ronda de vacunación, en lugar de múltiples rondas de vacunación usando o bien inyecciones de ADN desnudo y/o vacunas basadas en el virus Vaccinia como agentes de sensibilización o refuerzo.
A pesar de todos los esfuerzos para generar una vacuna que induzca una respuesta inmunitaria contra un
35 determinante antigénico de malaria y que proteja de las dolencias producidas por el parásito de la malaria, muchas vacunas no cumplen todos los requisitos tal como se ha descrito anteriormente. Mientras que algunas vacunas no proporcionan una eficacia protectora de más del 85% en individuos vacunados, otras no actúan bien en áreas tales como la producción o administración a las células correctas del sistema inmunitario del huésped.
La figura 1 muestra el clon recién sintetizado 02-148 (pCR-script.Pf), que está basado en una variedad de genes de Plasmodium falciparum conocidos, y que codifica para la nueva proteína circumsporozoíto (A) (SEQ ID NO:3), más la secuencia de ácido nucleico con codones optimizados (B) (SEQ ID NO:1). La SEQ ID NO:2 es el producto
45 proteico traducido a partir de la secuencia codificante de SEQ ID NO:1 tal como se generó mediante PatentIn 3.1. La SEQ ID NO:2 es idéntica a SEQ ID NO:3 en contenido.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (A) (SEQ ID NO:6) y la secuencia de ácido nucleico (B) (SEQ ID NO:4) del clon sintético denominado 02-659 (pf-aa-sub), que es el gen de circumsporozoíto de la cepa 3D7 de P. falciparum, que carece de los 14 aminoácidos del extremo C-terminal. La SEQ ID NO:5 es el producto proteico traducido a partir de la secuencia codificante de SEQ ID NO:4 tal como se generó mediante PatentIn 3.1. La SEQ IDNO:5 es idéntica a SEQ ID NO:6 en contenido.
La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos (A) (SEQ ID NO:9) y la secuencia de ácido nucleico (B) (SEQ ID
55 NO:7) del gen de circumsporozoíto con codones optimizados de P.yoelii. La SEQ ID NO:8 es el producto proteico traducido a partir de la secuencia codificante de SEQ ID NO:7 tal como se generó mediante PatentIn 3.1. La SEQ ID NO:8 es idéntica a SEQ ID NO:9 en contenido.
La figura 4 muestra (A) la respuesta inmunitaria celular y (B) la respuesta inmunitaria humoral en ratones tras la inmunización con vectores basados en Ad5 y Ad35 que albergan el gen de circumsporozoíto de P. yoelii, administrados mediante dos vías: intramuscular y subcutánea en diferentes dosis.
La figura 5 muestra la inhibición en ratones de una exposición a esporozoíto de P. yoelii tras la inmunización con vectores basados en Ad5 y Ad35 que albergan el gen de circumsporozoíto de P. yoelii, administrados en diferentes
65 dosis, representada en porcentaje de inhibición (A), y en presencia de moléculas de ARN específicas del parásito en el hígado (B).
La figura 6 muestra la respuesta inmunitaria celular generada por la inmunización con un vector basado en Ad5 que alberga el gen de circumsporozoíto de P. falciparum de longitud completa, y dos mutantes de deleción, administrado en diferentes dosis.
La presente divulgación se refiere a diferentes clases de vectores virales recombinantes de replicación defectuosa que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica para un determinante antigénico de varios protozoarios Plasmodium. La invención se refiere a vectores virales que comprenden ácidos nucleicos que codifican para la proteína circumsporozoíto (CS) de P. falciparum así como a un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 7, es decir, que codifica para esta proteína CS. Preferiblemente, dicho vector viral es un adenovirus, preferiblemente basado en un serotipo que es eficaz para administrar el gen de interés, que se encuentra con números bajos de anticuerpos neutralizantes en el huésped y que se une a las células inmunitarias relevantes de 15 una manera eficaz. La proteína CS se genera de tal manera que dará lugar a una respuesta inmunitaria potente en mamíferos, preferiblemente en seres humanos. En un aspecto, la expresión de la proteína es elevada debido a la optimización de codones y alterando así la utilización de codones de tal manera que se ajuste al huésped de interés. La proteína CS para su uso en la presente invención se representa en la figura 2A (SEQ ID NO:6), y mientras que los genes con codones optimizados que codifican para dicha proteína se representan en la figura 2B (SEQ ID NO:4).
La invención también se refiere a composiciones de vacuna que comprenden un vector viral recombinante de replicación defectuosa según la reivindicación 1, y a un vehículo farmacéuticamente aceptable, que comprende además preferiblemente un adyuvante. Además, la invención también se refiere a una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2 para uso en el tratamiento terapéutico, profiláctico o diagnóstico de malaria.
La presente invención se refiere al uso de virus recombinantes tal como se define en las reivindicaciones como vehículos de ciertos determinantes antigénicos específicos seleccionados de un grupo de antígenos de malaria tal como se reivindica. El objetivo de la presente invención es proporcionar una solución a al menos una parte de los problemas señalados anteriormente para las vacunas contra la malaria ya existentes.
La presente invención se refiere a un vector viral recombinante de replicación defectuosa como se define en la reivindicación 9 que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un determinante antigénico de 35 Plasmodium falciparum. En una realización preferida, dicho vector viral es un adenovirus, un alfavirus o un virus Vaccinia. En una realización más preferida, dicho vector viral es un adenovirus, en el que dicho adenovirus se deriva preferiblemente de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en: Ad11, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 y Ad50. En un aspecto particular de la invención, el vector viral recombinante de replicación defectuosa de acuerdo con la invención comprende un determinante antigénico que es la proteína circumsporozoíto (CS), o una parte inmunogénica de ella. Preferiblemente, dicho ácido nucleico heterólogo tiene codones optimizados para la expresión elevada en un mamífero, preferiblemente en un ser humano. La optimización de codones se basa en el contenido en aminoácidos requerido, en la utilización del codón óptimo general en el mamífero de interés y en varias previsiones de aspectos que deben evitarse para garantizar una expresión apropiada. Tales aspectos pueden ser sitios de donador y aceptor de corte y empalme, codones de parada, sitios Chi, tramos de poli(A), secuencias ricas en GC y
45 AT, cajas de TATA internas, etcétera.
En una realización preferida, la invención se refiere a un vector viral recombinante de replicación defectuosa según la reivindicación 9, en el que el contenido en adenina más timina en dicho ácido nucleico heterólogo, en comparación con el contenido en citosina más guanina, es inferior al 87%, preferiblemente inferior al 80%, más preferiblemente inferior al 59% y lo más preferiblemente igual a aproximadamente el 45%. La invención proporciona, en una realización, un vector viral recombinante de replicación defectuosa, en el que dicha proteína circumsporozoíto es la proteína circumsporozoíto según se representa en la figura 2A y, en otra realización, un ácido nucleico heterólogo con codones optimizados según se representa en la figura 2B. Las proteínas pueden expresarse in vivo a partir de vehículos de administración de ácido nucleico tales como los vectores virales recombinantes de la
55 presente invención.
En otra realización, la invención se refiere a un vector viral recombinante de replicación defectuosa tal como se reivindica en el que la proteína circumsporozoíto de P. falciparum o la parte immunogénica de la misma carece de una secuencia de anclaje GPI funcional.
Aparte del uso de nuevos genes y proteínas que pueden aplicarse para el uso en seres humanos, son también descritos genes novedosos que pueden usarse en seres humanos así como en otros mamíferos.
En una realización preferida, el vector viral es un adenovirus, un alfavirus o un virus Vaccinia, y se prefiere aún más
65 utilizar un adenovirus recombinante, que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en: Ad11, Ad26, Ad34, Ad35, Ad48, Ad49 y Ad50. En la P. falciparum se prefiere utilizar un gen con codones optimizados para la expresión apropiada en el huésped de interés. Por lo tanto, en una realización preferida el contenido de adenina más tiamina en dicho ácido nucleico, con respecto al contenido de citosina más guanina, es menos del 87%, preferiblemente menos del 80%, más preferiblemente menos del 59% y lo más preferiblemente igual a aproximadamente el 45%.
La memoria descriptiva da a conocer un vector viral recombinante de replicación defectuosa, en el que dicha proteína circumsporozoíto es la proteína circumsporozoíto tal como se representa en la figura 3A, mientras que otro vector viral recombinante de replicación defectuosa comprende el ácido nucleico tal como se representa en la figura 3B. La proteína circumsporozoíto, o la parte inmunogénica de la misma, puede carecer de una secuencia de anclaje GPI funcional.
La invención se refiere adicionalmente a un ácido nucleico aislado que codifica para una proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum según se representa en la figura 2B, en el que dicho ácido nucleico está con codones optimizados, y a un ácido nucleico aislado que codifica para una proteína circumsporozoíto de la cepa 3D7 de
15 Plasmodium falciparum, según se representa en la figura 2B, en el que dicho ácido nucleico está con codones optimizados. Tales ácidos nucleicos aislados se pueden aplicar en procedimientos de subclonación para la generación de otros tipos de vacunas basadas en virus. La producción puede ser en toda clase de sistemas, tales como bacterias, levaduras o células mamíferas conocidas en la técnica.
Se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica para una proteína circumsporozoíto de Plasmodium yoelii tal como se representa en la figura 3B, teniendo dicho ácido nucleico codones optimizados. Además, se proporciona una composición de vacuna que comprende un vector viral recombinante de replicación defectuosa tal como se reivindica y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se conocen bien en la técnica vehículos farmacéuticamente aceptables y se usan exhaustivamente en una amplia variedad de productos terapéuticos. Preferiblemente, se
25 aplican vehículos que funcionan bien en vacunas. Más preferidas son las vacunas, que comprenden además un adyuvante. Se conoce en la técnica que los adyuvantes aumentan adicionalmente la respuesta inmunitaria a un determinante antigénico aplicado. La invención también se refiere a una composición de vacuna según la invención para su uso en el tratamiento terapéutico, profiláctico o diagnóstico de malaria.
La divulgación se refiere a un método para tratar un mamífero de una infección por malaria o prevenir una infección por malaria en un mamífero, comprendiendo dicho método (en cualquier orden, o simultáneamente) las etapas de administrar una composición de vacuna según la invención, y administrar una composición de vacuna que comprende al menos una proteína o péptido purificado, derivado de malaria. La divulgación se refiere a un método para tratar un mamífero de una infección por malaria o prevenir una infección por malaria en un mamífero,
35 comprendiendo dicho método (en cualquier orden, o simultáneamente) las etapas de administrar una composición de vacuna que comprende un vector viral recombinante de replicación defectuosa que comprende un antígeno del circumsporozoíto de malaria según la invención; y administrar una composición de vacuna que comprende un vector viral recombinante de replicación defectuosa que comprende otro antígeno, tal como LSA-1 o LSA-3.
Las ventajas de la presente invención son múltiples. Junto con el conocimiento de que los virus recombinantes, tal como los adenovirus recombinantes, pueden producirse a títulos muy altos usando células que se consideran seguras, y que pueden hacerse crecer en suspensión a volúmenes muy altos, usando un medio que no contenga ningún componente derivado de animal o de ser humano, la presente divulgación combina estas características con un vector que albergan el gen de circumsporozoíto de Plasmodium falciparum. P. falciparum es el parásito que
45 produce la malaria tropical. Además, el gen tiene codones optimizados para proporcionar un nivel de expresión que es adecuado para proporcionar una respuesta inmunitaria apropiada en seres humanos. La presente invención proporciona una vacuna contra las infecciones por malaria, haciendo uso de por ejemplo adenovirus que no se encuentran con títulos altos de anticuerpos neutralizantes. Ejemplos de tales adenovirus son los serotipos 11 y 35 (Ad11 y Ad35, véanse los documentos WO 00/70071 y WO 02/40665).
El contenido en ácido nucleico entre el patógeno que produce la malaria, tal como P. falciparum, y el huésped de interés, tal como Homo sapiens, es muy diferente. La invención proporciona ahora una solución a algunas de las desventajas de las vacunas conocidas en la técnica, tales como niveles de expresión que son demasiado bajos como para provocar una respuesta inmunitaria significativa en el huésped de interés, preferiblemente en seres
55 humanos.
Los vectores virales recombinantes se han usado en sistemas de vacunas. Esto se ha demostrado para vacunas basadas en Vaccinia y para vacunas basadas en adenovirus. Por otra parte, se está desarrollando asimismo una plataforma basada en alfavirus para vacunas. En una realización preferida, la invención se refiere a el uso de adenovirus recombinantes que tienen replicación defectuosa a través de la eliminación de al menos parte de la región E1 en el genoma adenoviral, puesto que se requiere la región E1 para los procesos de replicación, transcripción, traducción y empaquetamiento de los adenovirus recién formados. Los vectores con la región E1 delecionada se producen generalmente en líneas celulares que complementan las funciones de la región E1 delecionada. Tales líneas celulares y el uso de las mismas para la producción de virus recombinantes se han 65 descrito ampliamente y se conocen bien en la técnica. Preferiblemente, se usan células PER.C6 ™, representadas por las células depositadas con ECACC n.º 96022940 en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales
(ECACC) en el Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR, RU), para prevenir la producción de adenovirus de replicación competente (rca). Se pueden aplicar células que soportan el crecimiento de adenovirus recombinantes distintos de los derivados del serotipo 5 de adenovirus (Ad5). Se hace referencia a las publicaciones WO 97/00326, WO 01/05945, WO 01/07571, WO 00/70071, WO 02/40665 y WO 99/55132, para métodos y medios
5 para obtener reservas de adenovirus libres de rca para Ad5 así como para otros serotipos de adenovirus.
Los vectores basados en adenovirus que se han usado en la técnica implican principalmente el uso de vectores Ad5. Sin embargo, tal como se ha descrito (documentos WO 00/03029, WO 02/24730, WO 00/70071, WO 02/40665 y en otros informes en la técnica), se dificulta la administración de Ad5 y la administración eficaz a las células diana de interés, responsables de respuestas inmunogénicas suficientes, por la presencia de altos títulos de anticuerpos neutralizantes que circulan en el torrente sanguíneo si se ha encontrado previamente una infección por Ad5 en un sujeto. Se ha investigado qué serotipos se adecuan mejor al uso terapéutico, y el resultado ha sido que un número limitado de serotipos encontraban anticuerpos neutralizantes en sólo un pequeño porcentaje de individuos en la población humana. Estos experimentos se han descrito en el documento WO 00/70071. Por lo tanto, en una
15 realización preferida, la invención se refiere al uso del serotipo 11, 26, 34, 35, 48 y 50 de adenovirus, y preferiblemente a Ad11 y Ad35, puesto que estos serotipos no se encontraron con ningún anticuerpo neutralizante en la inmensa mayoría de las muestras probadas.
Aparte de evitar la presencia de anticuerpos neutralizantes dirigidos contra ciertos serotipos, también puede ser beneficioso dirigir los vectores virales recombinantes de replicación deficiente a un determinado subconjunto de células implicadas en la respuesta inmunitaria. Tales células son por ejemplo células dendríticas. Se ha encontrado que determinados serotipos de adenovirus, tales como Ad16, Ad35 y Ad50, portan proteínas de la cápsida que se unen específicamente a determinados receptores presentes en células dendríticas (documento WO 02/24730). Ad5 es un serotipo que principalmente migra al hígado, lo que puede ser una desventaja si un número suficiente de
25 partículas virales debe infectar a células del sistema inmunitario. Se encontró que al menos en experimentos in vitro algunos de los serotipos, diferentes de Ad5, podrían infectar células dendríticas múltiples veces mejor que Ad5, lo que sugiere que también la administración in vivo a tales células es más eficaz. Aún está por ver si esta traducción in vitro a in vivo se mantiene, y si serotipos distintos de Ad5 darán lugar al nivel de protección requerido. Se describen los serotipos de elección, en lo que concierne a anticuerpos neutralizantes, con proteínas de la cápsida, tales como la fibra o una parte de la misma de un serotipo que puede reconocer selectivamente células dendríticas.
Se sabe ahora que una primera administración con un serotipo de adenovirus específico provoca la producción de anticuerpos neutralizantes en el huésped contra ese vector específico. Por tanto, es deseable usar en una práctica posterior (un refuerzo de seguimiento o en la administración de otra vacuna no relacionada) una composición 35 basada en un serotipo de adenovirus diferente, que no se neutraliza por anticuerpos generados en la primera administración. Por tanto, la memoria descriptiva da a conocer además métodos para vacunar individuos mamíferos en los que una composición de vacuna de sensibilización comprende un adenovirus recombinante de replicación defectuosa de un primer serotipo, mientras que en una composición de vacuna de refuerzo se usa un adenovirus recombinante de replicación defectuosa de un segundo serotipo. Las prácticas de sensibilización/refuerzo se han descrito en más detalle en las solicitudes de patente internacional PCT/NL02/00671 y PCT/EP03/50748 (sin publicar); estas solicitudes se refieren al uso de un vector de adenovirus recombinante de un primer serotipo para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un ser humano o animal tratado con un vector de adenovirus recombinante de un segundo serotipo, en el que dicho primer serotipo es diferente de dicho segundo serotipo, y en el que dicho primer serotipo se selecciona del grupo que consiste en:
45 Ad11, Ad26, Ad34, Ad35, Ad46 y Ad49, y en el que dicho segundo serotipo es preferiblemente el serotipo 5 de adenovirus. Por tanto, se refiere al uso de diferentes serotipos de adenovirus que encuentran inmunidades preexistentes bajas en sujetos que van a tratarse. Ejemplos preferidos de tales serotipos son los recombinantes mencionados, en los que no se excluye Ad5 para individuos que nunca han experimentado una infección por Ad5. Las prácticas descritas y reivindicadas en las solicitudes mencionadas anteriormente se refieren al uso de vectores de adenovirus que portan transgenes tales como los del sarampión, o gag del VIH (para el tratamiento de seres humanos) o VIS (para el tratamiento y estudios en monos).
Un ejemplo no limitativo de un sistema de sensibilización-refuerzo contra la malaria es una práctica en la que pueden usarse, a continuación de diferentes serotipos de adenovirus, también diferentes determinantes antigénicos. 55 Un ejemplo no limitativo de un antígeno diferente de CS es el antígeno específico del hígado 1 (LSA-1, Kurtis et al. 2001). Tales sistemas son al menos por un motivo útiles, concretamente que el antígeno CS se expresa principalmente durante el fase en sangre del parásito, mientras su expresión disminuye en la fase en el hígado. Para LSA-1, esta situación es más o menos la opuesta; se expresa a niveles bajos durante la fase en sangre, pero se expresa altamente durante la fase en el hígado. Aunque podrían usarse ambos antígenos en administraciones posteriores, también pueden usarse al mismo tiempo para proporcionar protección, contra el parásito en la fase en sangre así como en la fase en el hígado. Ambos antígenos pueden suministrarse mediante uno sólo de los serotipos de adenovirus o bien clonados juntos en el mismo vector, o bien por separado en vectores separados del mismo serotipo). O ambos antígenos se suministran mediante diferentes serotipos que pueden suministrarse al mismo tiempo o por separado en el tiempo, por ejemplo en una práctica de sensibilización-refuerzo. Las vacunas de la 65 presente invención también pueden usarse en prácticas en las que se usa sensibilización-refuerzo en combinación con ADN desnudo u otros medios de administración, sin relación con los vectores virales de replicación defectuosa
de la presente invención, tales como péptidos o proteínas purificados. Ejemplos de tales proteínas que pueden usarse en sensibilización-refuerzo (Ad/proteína; proteína/Ad; proteína/Ad/Ad; Ad/proteína/Ad; Ad/Ad/proteína, etc.) son CS, LSA-1, LSA-3, MSP-1, MSP-119, MSP-142 (véase a continuación), o la composición de la vacuna derivada de CS y que contiene partículas de hepatitis B conocida como RTS,S (véase Gordon et al. (1995; documento US
5 6.306.625 y documento WO 93/10152).
Una secuencia es “derivada” tal como se usa en el presente documento si puede obtenerse un ácido nucleico a través de clonación directa a partir de secuencias de tipo natural obtenidas de virus de tipo natural, mientras que también pueden, por ejemplo, obtenerse a través de PCR usando diferentes trozos de ADN como molde. Esto significa también que tales secuencias pueden estar en la forma de tipo natural así como en forma alterada. Otras opción para alcanzar el mismo resultado es a través de la combinación de ADN sintético. Debe entenderse que “derivado” no siginifica exclusivamente una clonación directa del ADN de tipo natural. Un experto en la técnica también será consciente de las posibilidades de la biología molecular para obtener formas mutantes de un determinado trozo de ácido nucleico. Las expresiones “parte funcional, derivado y/o análogo del mismo” deben 15 entenderse como equivalentes del ácido nucleico con el que están relacionados. Un experto en la técnica apreciará el hecho de que determinadas deleciones, cambios, mutaciones (puntuales), adiciones, etcétera pueden todavía dar como resultado un ácido nucleico que tiene una función similar que el ácido nucleico original. Se debe entender por lo tanto que tales alteraciones que no alteran significativamente la funcionalidad de los ácidos nucleicos están dentro del alcance de la presente invención. Si un determinado vector de adenovirus es derivado de un determinado serotipo de adenovirus de elección, debe entenderse que el producto final puede obtenerse a través de modos indirectos, tales como clonación directa y síntesis de determinados trozos de ADN genómico, usando metodología conocida en la técnica. Todavía se considera que ciertas deleciones, mutaciones y otras alteraciones del contenido genómico que no alteran los aspectos específicos de la invención son parte de la invención. Ejemplos de tales alteraciones son, por ejemplo, deleciones en la estructura principal del virus para permitir la clonación de trozos más 25 grandes de ácidos nucleicos heterólogos. Ejemplos de tales mutaciones son por ejemplo deleciones de E3 o deleciones y/o alteraciones en las regiones que codifican para las proteínas E2 y/o E4 del adenovirus. Tales cambios aplicados a la estructura principal del adenovirus se conocen en la técnica y se aplican a menudo, puesto que el espacio es un factor limitante para que el adenovirus se empaquete; este es un motivo importante para delecionar determinadas partes del genoma adenoviral. Otros motivos para alterar las regiones E2, E3 y/o E4 del genoma pueden estar relacionadas con la estabilidad o integridad del vector de adenovirus, tal como se describe, por ejemplo, en las solicitudes de patente internacional PCT/NL02/00280, PCT/EP03/50125, PCT/NL02/00281, PCT/EP03/50126 (sin publicar). Estas solicitudes se refieren entre otros al uso de un gen E4orf6 de un serotipo de un subgrupo en la estructura principal de un adenovirus de otro subgrupo, para garantizar la compatibilidad entre la actividad de E4orf6 y la actividad de E1B-55K durante la replicación y el empaquetamiento en una línea celular de
35 empaquetamiento. Se refieren además al uso de un promotor pIX de funcionamiento apropiado para obtener niveles de expresión de pIX superiores y un vector de adenovirus recombinante más estable.
“De replicación defectuosa” tal como se usa en el presente documento significa que los vectores virales no se replican en células de no complementación. En células de complementación, las funciones requeridas para la replicación, y por tanto la producción del vector viral, se proporcionan por la célula de complementación. Los vectores virales de replicación defectuosa de la presente invención no albergan todos los elementos que permiten la replicación en una célula huésped distinta de una célula de complementación.
“Heterólogo” tal como se usa en el presente documento conjuntamente con ácidos nucleicos significa que el ácido
45 nucleico no se encuentra en versiones de tipo natural de los vectores virales en los que se clona el ácido nucleico heterólogo. Por ejemplo, en el caso de los adenovirus, el ácido nucleico heterólogo que se clona en el vector de adenovirus de replicación defectuosa no es un ácido nucleico de adenovirus.
“Determinante antigénico” tal como se usa en el presente documento significa cualquier antígeno derivado de una fuente patógena que provoca una respuesta inmunitaria en un huésped hacia el determinante que se suministra (se administra). Ejemplos de determinante antigénicos de Plasmodium que pueden suministrarse usando los virus recombinantes de replicación defectuosa de la presente invención son la proteína circumsporozoíto, el polipéptido SE36, el polipéptido C-terminal de 119 kDa de la proteína de superficie de merezoito (MSP-119), MSP-1, MSP-142, antígeno de la fase en el hígado 1 o 3 (LSA-1 o 3), o un fragmento de cualquiera de los mencionados anteriormente.
55 En un aspecto preferido la invención se refiere a la proteína circumsporozoíto (CS) de P. falciparum.
“Con codones optimizados” tal como se usa en el presente documento significa que se ha alterado el contenido enl ácido nucleico para alcanzar niveles de expresión suficientemente altos de la proteína de interés en un huésped de interés a la que se suministra el gen que codifica para dicha proteína. Niveles de expresión suficientemente altos en este contexto significa que los niveles de proteína deben ser lo suficientemente altos como para provocar una respuesta inmunitaria en el huésped con el fin de proporcionar protección frente a un parásito que induce la malaria que puede entrar en el huésped tratado antes o después del tratamiento. Se sabe en la técnica que algunas vacunas proporcionan una respuesta inmunitaria en seres humanos, a través de la cual aproximadamente el 60% de los individuos vacunados están protegidos contra las dolencias inducidas por exposiciones posteriores con el patógeno 65 (por ejemplo, esporozoítos). Por tanto, se considera que los niveles de expresión son suficientes si el 60% o más de los individuos tratados están protegidos contra infecciones posteriores. Se cree que con las combinaciones de aspectos de adenovirus que pueden aplicarse y la elección del antígeno tal como se da a conocer en el presente documento, pueden alcanzarse tales porcentajes. Preferiblemente, el 85% de los individuos están protegidos, mientras que lo más preferido es tener protección frente a una exposición posterior en más del 90% de los huéspedes vacunados. Los ácidos nucleicos dados a conocer en la presente invención tienen codones optimizados 5 para la expresión en seres humanos. Según Narum et al. (2001), el contenido en adenina más timina (A+T) en el ADN de Homo sapiens es de aproximadamente el 59%, en comparación con el porcentaje de citosina más guanina (C+G). El contenido en adenina más timina en P. falciparum es de aproximadamente el 80%. El contenido en adenina más timina en el gen de CS de P. falciparum es de aproximadamente el 87%. Para obtener suficiente protección se cree que es necesario mejorar los niveles de producción en el huésped. Un modo de lograr esto es optimizar la utilización de codones alterando el contenido en ácido nucleico del determinante antigénico en el vector basado en virus, sin alterar la secuencia de aminoácidos del mismo. Para esto, los vectores virales recombinantes de replicación defectuosa según la invención tienen un contenido en adenina más timina en los ácidos nucleicos heterólogos de la presente invención inferior al 87%, preferiblemente inferior al 80% y más preferiblemente inferior o igual a aproximadamente el 59%. Basándose en la utilización de codones en seres humanos y el contenido en 15 aminoácidos de los genes de CS de P. falciparum y yoelii, los porcentajes de los genes con codones optimizados eran incluso inferiores, alcanzando aproximadamente el 45% para el contenido en aminoácidos tal como se da a conocer por la presente invención. Por tanto, en lo que concierne a los genes de CS, se prefiere tener un contenido en adenina más timina de aproximadamente el 45%. Debe entenderse que, si va a tratarse otra especie distinta de seres humanos, que puede tener una concentración diferente de adenina más timina (inferior o superior al 59%), y/o una utilización de codones diferente, los genes que codifican para las proteínas CS de la presente invención pueden ajustarse para adecuarse al contenido requerido y dar a lugar a niveles de expresión adecuados para ese huésped particular. Por supuesto, no puede excluirse tampoco que esos ligeros cambios en el contenido puedan dar como resultado ligeros cambios en el nivel de expresión en diferentes zonas geográficas alrededor del mundo. También debe entenderse que ligeros cambios en el número de repeticiones incluidas en la secuencia de aminoácidos de las 25 proteínas, que los porcentajes pueden diferir en consecuencia. Todos estos contenidos ajustados son parte de la
presente invención.
Ejemplo 1. Ensamblaje del gen sintético de circumsporozoíto de Plasmodium falciparum.
Estudios comparativos llevados a cabo con vacunas de ADN basadas en genes con codones optimizados y nativos
que codifican para proteínas de merozoítos de P. falciparum han indicado una correlación directa con los niveles de
expresión e inmunogenicidad (Narum et al. 2001). Se diseñó una nueva secuencia del gen que codifica para la 35 proteína circumsporozoíto de Plasmodium falciparum (CS). Estudios en poblaciones de parásitos de la malaria
obtenidas de regiones geográficas ampliamente separadas han revelado la presencia de polimorfismo de secuencia
de CS. Se ensambló la nueva secuencia de CS de P. falciparum mediante la alineación de las diferentes secuencias
de proteína disponibles presentes en la base de datos de genBank (enumerada en la tabla I). En primer lugar, se
colocaron todas las diferentes secuencias en el orden de subgrupos basándose en la ubicación global o por la cepa
de laboratorio en el que se originaron los aislados. Se usaron todas las secuencias parciales o completas de CS con
el fin de identificar la variación entre las diferentes zonas geográficas e identificar cepas de laboratorio. Se examinó
exhaustivamente la secuencia consenso de aminoácidos final determinada. Los inventores de la presente invención
ajustaron posteriormente esta secuencia consenso y para tener un nuevo gen de CS sintetizado (figura 1). Se
muestra la secuencia de aminoácidos novedosa en la figura 1A. La nueva proteína CS alberga los aspectos 45 enumerados a continuación (del extremo N-terminal al extremo C-terminal):
- -
- La secuencia señal N-terminal, que dirigiría a la proteína al retículo endoplasmático, se deja sin cambiar.
- -
- Los aminoácidos (31-40) del péptido de unión a HLA, así como la región 1 (epítopo de células B predominante) se conservan, por tanto estas secuencias se dejan sin cambiar.
- -
- Un número de repeticiones: existen 14-41 repeticiones NANP (SEQ ID NO:10) en los diferentes aislados y 4 repeticiones NVDP (SEQ ID NO:11). Se eligió incorporar 27 repeticiones NANP, una agrupación de 3 repeticiones NVDP y una repetición NVDP separada.
- -
- La secuencia ENANANNAVKN (SEQ ID NO:12) directamente en el sentido 3’ de las repeticiones mencionadas anteriormente, se encontró que estaban razonablemente conservadas entre cepas.
- -
- La región Th2R y el epítopo CD8 inmunodominante (Lockyer et al. 1989; Zevering et al. 1994): se determinó una única secuencia consenso que difiere en algunos aspecto de la conocida, y la secuencia 3D7 de la cepa de laboratorio frecuentemente usada. Esta secuencia se denomina algunas veces “epítopo universal” en la bibliografía (Nardin et al. 2001).
- -
- La región 2, que se solapa con la región Th2R, se mantuvo conservada.
- -
- La región TH3R, que se considera que es un epítopo CD8 menos importante, se usa en forma de una secuencia
consenso, puesto que sólo se encontraron mutaciones puntuales.
- -
- Los 28 aminoácidos C-terminales, que constituyen una secuencia de anclaje de señal GPI, que es ineficaz en células de mamíferos (Moran y Caras, 1994), y no es hidrófoba por sí misma para servir como anclaje a la
5 membrana estable. Se construyó el gen de manera que puede eliminarse la secuencia completa, pero también dejando abierta la posibilidad de permanecer presente. Esto permite una comparación de la antigenicidad de los vectores de adenovirus que portan un CS de longitud completa frente a los que expresan la proteína delecionada en la secuencia de anclaje de señal GPI. De hecho, se ha descrito que la eliminación de la secuencia señal GPI de una vacuna de ADN de CS potenciaba la inducción sobre la respuesta inmunitaria contra la infección por malaria en roedores (Scheiblhofer et al. 2001).
- -
- La sustitución de S por A en la posición 373: se introdujo esta sustitución de aminoácido para eliminar un posible sitio de glicosilación reconocido por células de mamíferos.
15 Puesto que la utilización de residuos del parásito de la malaria (el 87% de A y T) es significativamente diferente de la del Homo sapiens, el gen que codifica para la proteína CS recién diseñada tenía codones optimizados con el fin de mejorar su expresión en células de mamíferos, teniendo cuidado de los siguientes aspectos para evitar secuencias de actuación en cis: no deben estar presentes sitios de poli(A) prematuros y cajas TATA internas; deben evitarse sitios Chi, sitios de entrada del ribosoma y agrupaciones de secuencias ricas en A-T; no deben estar presentes sitios aceptores y donadores de corte y empalme (crípticos); deben evitarse tanto como sea posible tramos de secuencia repetitivos; y deben evitarse también las secuencias ricas en GC. Se muestra el gen con codones optimizados final en la figura 1B.
Se sintetizó la secuencia consenso CS recién diseñada y se clonó en un pCR-script (Stratagene) por GeneArt
25 (Regensburg, Alemania), usando metodología conocida por los expertos en la técnica de generación de ADN sintético, dando lugar a un clon denominado 02-148 (pCR-script.Pf) (SEQ ID NO:1).
A continuación de este clon sintético, se generó otro gen sintético, en el que se introdujeron varias mutaciones en el extremo 3’ para obtener una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la proteína CS de P. falciparum de la cepa 3D7, que se deleciona en los últimos 14 aminoácidos (figura 2). Este gen también tenía codones optimizados usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente y se sintetizó y clonó posteriormente en pCRscript (Stratagene) por GeneArt. El clon se denominó 02-659 (pf-aa-sub) (SEQ ID NO:4).
Ejemplo 2. Optimización de codones del gen de circumsporozoíto del parásito de la malaria específico de 35 roedor Plasmodium yoelii.
Las especies de malaria que se han adaptado a modelos de roedores robustos, tales como P. berghei y P. yoelii, han sido potentes herramientas para la identificación y las pruebas de vacunas candidatas contra la malaria. Puesto que la infectividad de esporozoítos de P. yoelii se asemeja a la de P. falciparum, se decidió hacer uso del modelo de
P. yoelii para la ejemplificación de la capacidad de los vectores de Ad35 que portan proteínas CS con codones optimizados para proporcionar inmunidad estéril y por tanto protección contra la infección por malaria. Se sometió a optimización de codones al gen de CS de P.yoelii, que codifica para los residuos 1-356 tal como se describió anteriormente (Rodrigues et al. 1997), usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente y se sintetizó mediante GeneArt (GmbH-Regensburg, Alemania). La secuencia del gen de CS de P.yoelli con codones
45 optimizados (plásmido 02-149) se representa en la figura 3.
Ejemplo 3. Generación de vectores de adenovirus recombinantes basados en Ad5.
Pueden generarse adenovirus recombinantes libres de RCA muy eficazmente usando plásmidos adaptadores, tales como pAdApt, y estructuras principales de plásmidos de adenovirus, tales como pWE/Ad.AflII-rITRsp. Se han descrito métodos y herramientas extensamente en otro sitio (documentos WO 97/00326, WO 99/55132, WO 99/64582, WO 00/70071, WO 00/03029). Generalmente, se digiere el plásmido adaptador que contiene el transgén de interés en el casete de expresión deseado con enzimas adecuadas para liberar las secuencias de adenovirus recombinante de la estructura principal del vector de plásmido. De manera similar, se digiere el plásmido de
55 complementación de adenovirus pWE/Ad.AflII-rITRsp con enzimas adecuadas para liberar las secuencias de adenovirus del ADN del plásmido vector.
Se realizó la clonación del gen que codifica para la proteína CS del parásito P. yoelii en pIPspAdapt1 tal como sigue. Se digirió el plásmido 02-149 (GeneArt, véase anteriormente) que contiene el gen de CS con codones optimizados con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Se aisló el fragmento de 1,1 Kb que corresponde al gen de CS de P. yoelii del gel de agarosa y se ligó al vector pIPspAdapt1 digerido con HindIII y BamHI (descrito en el documento WO 99/64582). El plásmido resultante se denominó pAdapt.CS.Pyoel y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) inmediato-temprano (IE) humano de longitud completa y una señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realizó la clonación del gen que codifica para la proteína CS de longitud completa del parásito P. falciparum en pIPspAdapt1 tal como sigue. Se digirió el plásmido 02-148 pCR-script.Pf (véase anteriormente) que contiene el gen de CS con codones optimizados con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Se aisló el fragmento de 1,2 kb correspondiente al gen de CS del gel de agarosa y se ligó al vector pIPspAdapt1 digerido con HindIII y BamHI. El plásmido resultante se denominó pAdapt.CS.Pfalc y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del
5 promotor de citomegalovirus (CMV) inmediato-temprano (IE) humano de longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realizó la clonación del gen que codifica para la proteína CS de P. falciparum menos la secuencia de anclaje GPI, por tanto con la deleción de los últimos 28 aminoácidos, en pIPspAdapt1 tal como sigue. Se amplificó un fragmento de PCR de 1,1 kb usando el plásmido 02-148 como molde, con los cebadores Forw.Falc (5’-CCA AGC TTG CCA CCA TGA TGA GG-3’) (SEQ ID NO:13) y Rev.Falc.CS-28 (5’-CCG GAT CCT CAG CAG ATC TTC TTC TCG-3’) (SEQ ID NO:14). Invitrogen sintetizó los cebadores. Para la PCR, se usó la enzima Pwo ADN polimerasa (Inno-train Diagnostic), mientras que se aplicó el siguiente programa: 1 ciclo de 5 min. a 94ºC, 1 min. a 50ºC, 2 min. 30 s a 72ºC; 5 ciclos de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 50ºC, 2 min. 50 s a 72ºC; 20 ciclos de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 54ºC, 2 min.
15 50 s a 72ºC; y 1 ciclo de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 54ºC, seguido por 10 min. a 72ºC. Se digirió el producto de PCR amplificado con las enzimas de restricción HindIII y BamHI y luego se clonó en pIPspAdapt1 que también se digirió con HindIII y BamHI. El plásmido resultante se denominó pAdapt.CS.Pfalc(-28) y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) inmediato-temprano (IE) humano de longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realizó la clonación del gen que codifica para la proteína CS de P. falciparum menos el anclaje GPI, por tanto con la deleción de los últimos 14 aminoácidos, en pIPspAdapt1 tal como sigue. Se amplificó un fragmento de PCR de 1,1 kb usando el plásmido 02-148 como molde, con los cebadores Forw.Falc (SEQ ID NO:13) y Rev.Falc.CS-14 (5’-CCG GAT CCT CAG CTG TTC ACC ACG TTG-3’) (SEQ ID NO:15). Invitrogen sintetizó los cebadores. Para la PCR,
25 se usó la enzima Pwo ADN polimerasa (Inno-train Diagnostic), mientras que se aplicó el siguiente programa: 1 ciclo de 5 min. a 94ºC, 1 min. a 50ºC, 2 min. 30 s a 72ºC; 5 ciclos de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 50ºC, 2 min. 50 s a 72ºC; 20 ciclos de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 54ºC, 2 min. 50 s a 72ºC; y 1 ciclo de 1 min. a 94ºC, 1 min. a 54ºC, seguido por 10 min. a 72ºC. Se digirió el producto de PCR amplificado con las enzimas de restricción HindIII y BamHI y luego se clonó en pIPspAdapt1 también digerido con HindIII y BamHI. El plásmido resultante se denominó pAdapt.CS.Pfalc(14) y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) inmediatotemprano (IE) humano de longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realizó la clonación del gen que codifica para la proteína CS de P. falciparum menos el anclaje GPI, que muestra una secuencia C-terminal como en la cepa 3D7, en pIPspAdapt1 tal como sigue. Se digiere el plásmido 02-659 pf
35 aa-sub (véase anteriormente) que contiene el gen de CS con codones optimizados con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Se ligó el fragmento de 1,1 kb correspondiente al gen de CS al vector pIPspAdapt1 digerido con HindIII y BamHI. El plásmido resultante se denominó pAdapt.CS.Pfalc (pf-aa-sub) y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus (CMV) inmediato-temprano (IE) humano de longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realizó la generación del virus recombinante denominado Ad54E3.CS.Pyoel tal como sigue. Se digirió pAdapt.CS.Pyoel con la enzima de restricción PacI para liberar la parte del extremo izquierdo del genoma de Ad. El plásmido pWE/Ad.AflII-rITRsp que contiene la parte del extremo derecho restante del genoma de Ad tiene una deleción de 1878 pb en la región E3 (deleción XbaI). También se digirió este constructo con PacI. Se transfectó por 45 separado pAdapt.CS.Pyoel con PWE.Ad.AflII-rITRsp digerido con PacI en células productoras PER-E1B55K (células que se han descrito en el documento WO 02/40665) usando reactivo de transfección lipofectamina (Invitrogen) usando métodos conocidos en la técnica y tal como se describe en el documento WO 00/70071. La recombinación homóloga entre secuencias solapantes condujo a la generación del virus recombinante denominado Ad5ΔE3.CS.Pyoel. Debe entenderse que también pueden producirse vectores basados en Ad5 en células PER.C6 ™, células que están representadas por las células depositadas con el n.º de la ECACC 96022940 (véase anteriormente). Se purificó en placa el vector de adenovirus, en lisados brutos, resultante de esta transfección usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se analizaron placas individuales para detectar la presencia del transgén CS y se amplificaron para producción a gran escala en matraces de triple capa (3 x 175 cm2/matraz). Se recogen las células tras la amplificación a CPE completo y se purifica el virus mediante un
55 procedimiento de purificación con cloruro de cesio (CsCl) de dos etapas tal como realizan de manera rutinaria los expertos en la técnica y generalmente tal como se describe en el documento WO 02/40665.
Se realizó la generación del virus recombinante denominado Ad5ΔE3.CS.Pfalc tal como sigue. Se digirió pAdapt.CS.Pfalc con la enzima de restricción PacI para liberar la parte del extremo izquierdo del genoma de Ad. El plásmido pWE/Ad.AflII-rITRsp que contiene la parte del extremo derecho restante del genoma de Ad tiene una deleción de 1878 pb en la región E3 (deleción XbaI). También se digirió este constructo con PacI. Se transfectó pAdapt.CS.Pfalc con PWE.Ad.AflII-rITRsp digerido con PacI en células productoras PER-E1B55K usando reactivo de transfección lipofectamina. La recombinación homóloga entre secuencias solapantes condujo a la generación del virus recombinante denominado Ad5ΔE3.CS.Pfalc. Se purificó en placa el vector de adenovirus, en lisados brutos, 65 resultante de esta transfección usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se analizaron placas individuales para detectar la presencia del transgén CS y se amplificaron para la producción a gran escala en
matraces de triple capa (3 x 175 cm2/matraz). Se recogieron las células a CPE completo y se purificó el virus mediante un procedimiento de purificación con CsCl de dos etapas tal como realizan de manera rutinaria los expertos en la técnica y generalmente tal como se describe en el documento WO 02/40665.
5 Se realizó la generación de los virus recombinantes denominados Ad5ΔE3.CS.Pfalc(-28) y Ad5ΔE3.CS.Pfalc(-14) tal como sigue. Se digirieron pAdapt.CS.Pfalc(-28) y pAdapt.CS.Pfalc(-14) por separado con la enzima de restricción PacI para liberar la parte del extremo izquierdo del genoma de Ad. El plásmido pWE/Ad.AflII-rITRsp que contiene la parte del extremo derecho restante del genoma de Ad tiene una deleción de 1878 pb en la región E3 (deleción XbaI). También se digirió este constructo con PacI. Se transfectaron por separado pAdapt.CS.Pfalc(-28) y pAdapt.CS.Pfalc(-14) con PWE.Ad.AflII-rITRsp digerido con PacI en células productoras PER-E1B55K usando reactivo de transfección lipofectamina. La recombinación homóloga entre secuencias solapantes condujo a la generación de virus recombinantes denominados respectivamente Ad5ΔE3.CS.Pfalc(-28) y Ad5ΔE3.CS.Pfalc(-14). Se purifican en placa los vectores de adenovirus en lisados brutos que resultan de estas transfecciones usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se analizaron placas individuales para detectar la presencia del
15 transgén CS y se amplificaron para la producción a gran escala en matraces de triple capa (3 x 175 cm2/matraz). Se recogen las células a CPE completo y se purifica el virus mediante un procedimiento de purificación con CsCl de dos etapas tal como realizan de manera rutinaria los expertos en la técnica y generalmente tal como se describe en el documento WO 02/40665.
Se realizó la generación del virus recombinante denominado Ad5ΔE3.CS.Pfalc(pf-aa-sub) tal como sigue. Se digiere pAdapt.CS.Pfalc(pf-aa-sub) con la enzima de restricción PacI para liberar la parte del extremo izquierdo del genoma de Ad. El plásmido pWE/Ad.AflII-rITRsp que contiene la parte del extremo derecho restante del genoma de Ad también se digiere con PacI, se transfecta pAdapt.CS.Pfalc(pf-aa-sub) con PWE.Ad.AflII-rITRsp digerido con PacIΔE3 en células productoras PER.C6® o PER-E1B55K usando reactivo de transfección lipofectamina, o
25 mediante otros medios tales como electroporación u otros métodos de transfección conocidos por los expertos en la técnica. La recombinación homóloga entre secuencias solapantes conduce a la generación del virus recombinante denominado Ad5ΔE3.CS.Pfalc (pf-aa-sub). Se purifica en placa el vector de adenovirus, en lisados brutos, resultante de esta transfección usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se analizaron placas individuales para detectar la presencia del transgén CS y se amplificó para la producción a gran escala en matraces de triple capa (3 x 175 cm2/matraz). Se recogen las células a CPE completo y se purifica el virus mediante un procedimiento de purificación de CsCl de dos etapas tal como realizan de manera rutinaria los expertos en la técnica y generalmente tal como se describe en el documento WO 02/40665.
A continuación de estos procedimientos, se llevó a cabo la generación del adenovirus recombinante de control
35 denominado Ad5ΔE3.empty tal como se describió anteriormente, usando como adaptador el plásmido pAdapt, que carece de un transgén.
Ejemplo 4. Generación de vectores de vacuna de adenovirus recombinante basados en Ad35.
Se generó un primer fragmento de PCR de 101 pb que contenía el promotor pIX de Ad5 (nucleótidos 1509-1610) con los cebadores SV40for (5’-CAA TGT ATC TTA TCA TGT CTA G-3’) (SEQ ID NO:16) y pIX5Rmfe (5’-CTC TCT CAA TTG CAG ATA CAA AAC TAC ATA AGA CC-3’) (SEQ ID NO:17). Se realizó la reacción con Pwo ADN polimerasa según las instrucciones de los fabricantes pero con DMSO al 3% en la mezcla final. Se usó pAdApt como molde. Se estableció el programa tal como sigue: 2 min. a 94ºC; 30 ciclos de: 30 s a 94ºC, 30 s a 52ºC y 30 s a 45 72ºC; seguido por 8 min. a 72ºC. El fragmento de PCR resultante contiene el extremo 3’ de la señal de poli(A) de SV40 de pAdApt y la región promotora Ad5-pIX tal como está presente en el número de registro de Genbank M73260 desde el nucleótido 3511 hasta el nucleótido 3586 y un sitio MfeI en el extremo 3’. Se generó un segundo fragmento de PCR tal como se describió anteriormente pero con los cebadores pIX35Fmfe (5’-CTC TCT CAA TTG TCT GTC TTG CAG CTG TCA TG-3’) (SEQ ID NO:18) y 35R4 (para la referencia de la secuencia del cebador 35R4, véase el documento WO 00/70071). Se usó pAdApt35IP1 (descrito en el documento WO 00/70071) como molde, se estableció la hibridación a 58ºC durante 30 s y se estableció el alargamiento del programa de PCR a 72ºC durante 90 s. Este procedimiento de PCR amplifica secuencias de Ad35 desde el nucleótido 3467 hasta el nucleótido 4669 (numeración de la secuencia como en el documento WO 00/70071) y añade un sitio MfeI al extremo 5’. Se digirieron ambos fragmentos de PCR con MfeI y se purificaron usando el kit de purificación de PCR Qiagen (Qiagen). Se
55 usaron cantidades equimolares aproximadas de los dos fragmentos en una reacción de ligación. Tras una incubación de dos horas con la enzima ligasa en los tampones correctos, a temperatura ambiente, se cargó la mezcla en un gel de agarosa y se aislaron los fragmentos de ADN de 1,4 kb de longitud con el kit Geneclean II (BI0101, Inc). Se usó el ADN purificado en una reacción de amplificación por PCR con los cebadores SV40for y 35R4. Se realizó la PCR tal como se describió anteriormente con una temperatura de hibridación de 52ºC y tiempo de alargamiento de 90 s. Se aisló el producto resultante del gel usando el kit de extracción de gel Qiagen y se digirió con AgeI y BglII. Se aisló del gel el fragmento de 0,86 kb resultante que contenía el promotor pIX de 100 nucléotidos completo de Ad5, el sitio MfeI y el ORF de pIX (fragmento MfeI-AgeI, que incluye el sitio de iniciación ATG) de Ad35, pero sin una secuencia de poli(A), usando el kit Geneclean II.
65 Pueden regenerarse adenovirus recombinantes libres de RCA basados en Ad35 muy eficazmente usando plásmidos adaptadores, tales como pAdApt535 (descrito a continuación) y estructuras principales de plásmidos de adenovirus, tales como pWE/Ad35.pIX-rITRΔE3 (descrito en el documento WO 02/40665). Para generar pAdApt535, se digirió pAdApt35.Luc (descrito en el documento WO 00/70071) con BglII y AgeI y se aisló el vector de 5,8 kb resultante del gel. Se ligó este fragmento con el fragmento BglII-AgeI de 0,86 kb resultante que contenía el promotor pIX quimérico
5 de Ad5-Ad35 descrito anteriormente, para dar como resultado un plásmido denominado pAdApt535.Luc, que se digirió posteriormente con BglII y ApaI. Se purificó el inserto de 1,2 kb resultante sobre gel. Se digirió pAdApt35IP1 con BglII y ApaI y se aisló el fragmento de vector de 3,6 kb sobre gel. La ligación del inserto de BglII-ApaI de 1,2 kb a partir de pAdApt535.Luc y el vector digerido con BglII-ApaI de 3,6 kb dio como resultado pAdApt535.
10 Se realizó la clonación del gen que codifica para la proteína CS del parásito P. yoelii en padapt535 tal como sigue. Se digirió el plásmido 02-149 que contenía el gen de CS de P. yoelli con codones optimizados (véase anteriormente) con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Se aisló el fragmento de 1,1 kb correspondiente al gen de CS sobre gel de agarosa y se ligó al vector pAdapt535 digerido con HindIII y BamHI. El plásmido resultante se denominó pAdapt535-CS.Pyoel y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de CMV humano de
15 longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realizó la clonación del gen que codifica para la proteína CS de longitud completa del parásito P. falciparum en pAdapt535 tal como sigue. Se digirió el plásmido 02-148 (pCR-script.Pf) que contenía el gen de CS con codones optimizados de P. falciparum con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Se aisló el fragmento de 1,2 kb
20 correspondiente al gen de CS sobre gel de agarosa y se ligó al vector pAdapt535 digerido con HindIII y BamHI. El plásmido resultante se denominó pAdapt535-CS.Pfalc y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de CMV humano de longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realizó la clonación del gen que codifica para la proteína CS de P. falciparum menos la secuencia de anclaje GPI,
25 por tanto con la deleción de los últimos 28 aminoácidos, en pAdapt535 tal como sigue. Se digirió el fragmento de PCR de 1,1 kb obtenido tal como se describió anteriormente usando los cebadores Forw.Falc y Rev.Falc.CS-28, con las enzimas de restricción HindIII y BamHI y luego se clonó en el vector pAdapt535 también digerido con HindIII y BamHI. El plásmido resultante se denominó pAdapt535.CS.Pfalc(-28) y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de CMV humano de longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
30 Se realiza la clonación del gen que codifica para la proteína CS de P. falciparum menos la secuencia de anclaje GPI, ahora con la deleción de los últimos 14 aminoácidos, en pAdapt535 tal como sigue. Se digiere el fragmento de PCR de 1,1 kb obtenido tal como se describió anteriormente usando los cebadores Forw.Falc y Rev.Falc.CS-14, con las enzimas de restricción HindIII y BamHI y luego se clona denle el vector pAdapt535 también digerido con HindIII y
35 BamHI. El plásmido resultante se denomina pAdapt535.CS.Pfalc(-14) y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de CMV humano de longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realiza la clonación del gen que codifica para la proteína CS de P. falciparum menos la secuencia de anclaje GPI, que muestra una secuencia del extremo C-terminal como en la cepa 3D7, en pAdapt535 tal como sigue. Se digiere
40 el plásmido 02-659 pf-aa-sub (véase anteriormente) que contiene el gen de CS con codones optimizados con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Se liga el fragmento de 1,1 kb correspondiente al gen de CS al vector pAdapt535 digerido con HindIII y BamHI. El plásmido resultante se denomina pAdapt535.CS.Pfalc(pf-aa-sub) y contiene el gen de CS bajo el control transcripcional del promotor de CMV humano de longitud completa y la señal de poli(A) de SV40 en el sentido de 3’.
Se realizó la generación del virus recombinante denominado Ad35ΔE3.CS.Pyoel tal como sigue. Se digirió pAdapt535.CS.Pyoel con la enzima de restricción PacI para liberar la parte del extremo izquierdo del genoma de Ad. Se digirió el plásmido pWE.Ad35.pIX-rITRDE3, que contiene la parte del extremo derecho restante del genoma de Ad con una deleción de 2673 pb en la región E3, con NotI. Se transfectó pAdapt535.CS.Pyoel con PWE.Ad35.pIX50 rITRDE3 digerido con NotI en células productoras PER-E1B55K usando reactivo de transfección lipofectamina. Se ha descrito en detalle la generación de la línea celular PER-E1B55K en el documento WO 02/40665. En resumen, esta publicación describe que se transfectaron de manera estable células PER.C6® con ADN de pIG35-55K linealizado con ScaI, que porta el gen E1B-55K del serotipo 35 de adenovirus, tras lo cual un procedimiento de selección con-G418 produjo 196 colonias recogidas. El cultivo adicional de un número limitado de colonias que
55 crecen bien dio como resultado líneas celulares estables que tras numerosos subcultivos expresaban de manera estable el gen E1B-55K de Ad35 y soportaban el crecimiento de virus Ad35 recombinantes, mientras que la célula PER.C6® original era muy ineficaz en el soporte de esto.
La recombinación homóloga entre secuencias solapantes condujo a la generación del virus recombinante
60 denominado Ad35ΔE3.CS.Pyoel. Se purificó en placa el vector de adenovirus, en lisados brutos, resultante de esta transfección usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se analizaron placas individuales para determinar la presencia del transgén CS y se amplificaron para la producción a gran escala en matraces de triple capa (3 x 175 cm2/matraz). Tras la amplificación, se recogieron las células a CPE completo y se purificó el virus mediante un procedimiento de purificación con CsCl de dos etapas tal como realizan de manera rutinaria los
65 expertos en la técnica y generalmente tal como se describe en el documento WO 02/40665.
Se realizó la generación del virus recombinante denominado Ad35ΔE3.CS.Pfalc tal como sigue. Se digirió pAdapt535.CS.Pfalc con la enzima de restricción PacI para liberar la parte del extremo izquierdo del genoma de Ad. Se digirió el plásmido pWE.Ad35.pIX-rITRDE3, que contiene la parte del extremo derecho restante del genoma de Ad con una deleción de 2673 pb en la región E3, con NotI. Se transfectó pAdapt535.CS.Pfalc con PWE.Ad35.pIX5 rITRDE3 digerido con NotI en células productoras PER-E1B55K usando reactivo de transfección lipofectamina. La recombinación homóloga entre secuencias solapantes condujo a la generación del virus recombinante denominado Ad35ΔE3.CS.Pfalc. Se purificó en placa el vector de adenovirus, en lisados brutos, resultante de esta transfección usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se analizaron placas individuales para detectar la presencia del transgén CS y se amplificaron para la producción a gran escala en matraces de triple capa (3 x
10 175 cm2/matraz). Tras la amplificación, se recogieron las células a CPE completo y se purificó el virus mediante el procedimiento de purificación con CsCl de dos etapas tal como realizan de manera rutinaria los expertos en la técnica y generalmente tal como se describe en el documento WO 02/40665.
Se realiza la generación de los virus recombinantes denominados Ad35ΔE3.CS.Pfalc(-28) y Ad35ΔE3.CS.Pfalc(-14)
15 tal como sigue. Se digirieron por separado pAdapt535.CS.Pfalc(-28) y pAdapt535.CS.Pfalc(-14) con la enzima de restricción PacI para liberar la parte del extremo izquierdo del genoma de Ad. Se digirió el plásmido pWE.Ad35.pIXrITRDE3 que contiene la parte del extremo derecho restante del genoma de Ad con NotI. Se transfectan por separado pAdapt535.CS.Pfalc(-28) y pAdapt535.CS.Pfalc(-14) con PWE.Ad35.pIX-rITRDE3 digerido con NotI en un productor PER-E1B55K. La recombinación homóloga entre secuencias solapantes conduce a la generación de virus
20 recombinantes denominados respectivamente Ad35ΔE3.CS.Pfalc(-28) y Ad35ΔE3.CS.Pfalc(-14). Se purifican en placa los vectores de adenovirus, en lisados brutos, resultantes de estas transfecciones usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se analizan placas individuales para detectar la presencia del transgén CS y se amplificaron para la producción a gran escala en matraces de triple capa (3 x 175 cm2/matraz). Se recogieron las células a CPE completo y se purifica el virus mediante el procedimiento de purificación con CsCl de dos etapas tal
25 como realizan de manera rutinaria los expertos en la técnica y generalmente tal como se describe en el documento WO 02/40665.
Se realiza la generación del virus recombinante denominado Ad35ΔE3.CS.Pfalc(pf-aa-sub) tal como sigue. Se digiere pAdapt535.CS.Pfalc(pf-aa-sub) con la enzima de restricción PacI para liberar la parte del extremo izquierdo 30 del genoma de Ad. Se digiere el plásmido pWE.Ad35.pIX-rITRDE3 que contiene la parte del extremo derecho restante del genoma de Ad con NotI. Se transfecta pAdapt535.CS.Pfalc(pf-aa-sub) con pWE.Ad35.pIX-rITRDE3 digerido con NotI en células productoras PER-E1B55K usando reactivo de transfección lipofectamina (Invitrogen) usando métodos conocidos en la técnica y tal como se describe en el documento WO 00/70071 o mediante electroporación u otros métodos de transfección conocidos por los expertos en la técnica. La recombinación 35 homóloga entre secuencias solapantes conduce a la generación del virus recombinante denominado Ad35ΔE3.CS.Pfalc(pf-aa-sub). Se purifica en placa el vector de adenovirus, en lisados brutos, resultante de esta transfección usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se analizan placas individuales para la detectar la presencia del transgén CS y se amplifican para la producción a gran escala en matraces de triple capa (3 x 175 cm2/matraz). Se recogen las células a CPE completo y se purifica el virus mediante el procedimiento de
40 purificación con CsCl de dos etapas tal como realizan de manera rutinaria los expertos en la técnica y generalmente tal como se describe en el documento WO 02/40665.
45 Los vectores basados en el serotipo 5 de adenovirus (Ad5) modificados mediante ingeniería genética para expresar el antígeno CS de la malaria de roedor por P. yoelii han mostrado que pueden inducir protección completa contra la infección por P. yoelii (Rodrigues et al. 1997). Se diseñó una comparación lado a lado entre los vectores Ad5 y Ad35 que portan el gen CD de P.yoelli con codones optimizados para investigar la respuesta inmunitaria que se induce, y
50 para investigar su capacidad en la generación de protección contra la infección por el parásito P. yoelii en ratones. El estudio incluyó ratones Balb/C que se inmunizaron mediante inyección subcutánea o intramuscular de 108-1010 partículas virales (pv) de vectores virales basados en Ad5ΔA3- o Ad35ΔE3 (tal como se describió anteriormente) que
o bien portaban el gen de CS de P. yoelii(Ad5AE3-CS.Pyoel y Ad35ΔE3-CS.Pyoel) o bien sin transgén (Ad5ΔE3empty y Ad35ΔE3-empty). La figura 4 muestra los resultados de los experimentos en los que se comparó la vía de 55 administración usando ambos vectores. Se determinó el número de células que segregan IFN-D en una población de 106 esplenocitos (figura 4A) así como los títulos de anticuerpos en el suero (figura 4B). Se realizaron los experimentos en ratones que se sacrificaron dos semanas tras la inyección con los adenovirus recombinantes. Cada una de las barras representa el promedio de 5 ratones. Si los ratones no se sacrificaron, se usaron para una exposición con esporozoítos vivos, tras lo que se determinó la tasa de protección (figuras 5A y B). Cada una de 60 estas barras representa el promedio de 5 ratones. Se realizan los experimentos sobre las respuestas inmunitarias celular y humoral con ensayos inmunológicos bien conocidas por los expertos en la técnica y tal como se describe por ejemplo por Bruna-Romero et al. (2001a). Se programan la inmunización, la exposición y las lecturas en las tablas II y III. Pueden determinarse los títulos de anticuerpos contra esporozoítos mediante un ensayo de inmunoflorescencia indirecta o con un ELISA. La figura 4B muestra los resultados tal como se calcularon con un
65 ELISA. Se determinaron las respuestas inmunitarias celulares mediante ensayo ELISPOT ex-vivo que mide el número relativo de células T CD8+ y CD4+ específicas de CS, que segregan IFN-D. Se monitorizó la protección contra la infección por malaria determinando los niveles de inhibición parasitaria en los hígados de ratones inmunizados a través de cuantificación por PCR con transcriptasa inversa de las copias de ARN ribosómico de P.yoelii.
Se realizó la inmunización con vectores basados en Ad5 y Ad35 tal como sigue. Se descongelaron gradualmente en hielo alícuotas de adenovirus recombinantes que se almacenaron a -70ºC y se diluyeron hasta 100 μl en la concentración deseada en PBS con suero de ratón normal inactivado por calor al 1%. Posteriormente, se sonicaron las muestras durante 5 s. Se realizó la administración subcutánea en ambos lados de la base de la cola con un volumen de 50 μl en cada lado. Se realizó la administración intramuscular en ambos muslos con un volumen de 50 μl en cada muslo.
Se realiza el ensayo de inmunoflorescencia indirecta (IFA) según Bruna-Romero et al. (2001a). En primer lugar, se generan mosquitos infectados infectando inicialmente un ratón sin tratamiento previo con un mosquito infectado 15 haciendo que piquen al ratón en tres sitios diferentes. Se extrae sangre del ratón tras 8 días cuando la parasitemia es del 4-8% y se diluye hasta el 1%. Entonces, se les inyecta i.p. a otros ratones la muestra de sangre diluida. Tras 3 días, se toma la sangre que sirve como alimento de sangre para mosquitos hambrientos. Estos se alimentan durante 2 días. Tras 14 días, se aíslan esporozoítos de P. yoelii a partir de los mosquitos alimentados con sangre anestesiando mosquitos infectados sobre hielo y posteriormente saturándolos en etanol al 70%. Entonces, se transfieren los mosquitos a PBS pH 7,4 y se disecan las glándulas salivales. Posteriormente se muelen éstas sobre hielo y se separan los esporozoítos del residuo mediante centrifugación. Usando este método, pueden obtenerse aproximadamente 35.000 esporozoítos de P. yoelii a partir de 1 mosquito. Entonces, se recubren portaobjetos de vidrio en una placa de 12 múltiples pocillos con aproximadamente 10.000 esporozoítos de P. yoelii cada uno en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) más suero bovino fetal al 10% mediante secado al aire. Se 25 incuban posteriormente una gama de diluciones de sueros de los ratones vacunados (en un volumen de 10 μl en PBS mas FBS al 5%) con los esporozoítos secados al aire durante 30 min. a temperatura ambiente en un entorno húmedo. Entonces, se aspiran los portaobjetos, se lavan dos veces con PBS y se añaden 10 μl de un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con FITC diluido 30 veces (Kirkegaard & Perry Laboratories, EE.UU., n.º de catálogo 0218-06) y se incuba durante 30 min. a temperatura ambiente. Se aspiran de nuevo los pocillos y se lavan dos veces. Para la contratinción, se incuba una disolución de bromuro de etidio 100 μg/ml durante 10 min., tras lo que se repite la etapa de aspiración y se lavan los pocillos con agua. Se montan los portaobjetos usando Permount que contiene fenilendiamina/anti-desvanecimiento. Se determinan los títulos de anticuerpos anti-esporozoíto como la dilución de suero más alta que produce fluorescencia. Para la determinación de los títulos de anticuerpos, también puede usarse un ELISA. Para esto, se recubrieron placas de ELISA (Immulon II, Dynatech) con antígeno 2 μg/ml en PBS 35 añadiendo 100 μl por pocillo de esta disolución y dejándola durante la noche a 4ºC. El antígeno que se usó es una repetición de 3x6 aminoácidos de la proteína CS de P.yoelii: QGPGAPQGPGAPQGPGAP (SEQ ID NO:19). Se lavaron las placas posteriormente tres veces con tampón de lavado (1x PBS, Tween al 0,05%), y se añadieron 200 μl de tampón de bloqueo (FCS al 10% en disolución de lavado) por pocillo. Se incubaron las placas durante 12 h a temperatura ambiente. Entonces, se lavaron las placas tres veces de nuevo con tampón de lavado que incluía FCS al 5%. Se prepararon diluciones de los sueros tal como sigue: Se añadieron 50 μl tampón de lavado más FCS al 5% a los pocillos 2-12. Entonces, se añaden 100 μl de tampón de lavado más FCS al 5% al primer pocillo y se preparan diluciones en serie 1:2 transfiriendo 50 μl del pocillo 1 al 2, luego del 2 al 3, etc. Se incuban las placas durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces, se lavan las placas tres veces con tampón de lavado y se añaden 100 μl de un anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa diluido 1:2000 (anti-cadena pesada y
45 ligera, absorbido humano, Kirkegaard & Perry Laboratories, n.º de catálogo 074-1806) por pocillo y se incuba. Entonces, se lavan las placas con tampón de lavado tres veces y una vez con PBS y luego se añaden 100 μl de disolución de sustrato ABTS (ABTS 1-Component, Kirkegaard & Perry Laboratories, número de catálogo 50-66-18) a cada pocillo. Se termina la reacción mediante la adición de 50 μl de SDS al 1%, y se leen las placas a 405 nm en un lector de ELISA.
Se realizaron el ensayo ELISPOT para determinar el número relativo de células T CD8+ y CD4+ específicas de CS, que segregan IFN-D en el bazo, y la PCR con transcriptasa inversa y PCR en tiempo real para cuantificar la cantidad de ARN específico de parásito presente en el hígado de los ratones expuestos tal como se describió por Bruna-Romero et al. (2001a y 2001b) excepto por el hecho de que el número de ciclos en la PCR en tiempo real fue
55 de 45.
Aunque se predijo la atenuación de la infección por P. yoelii en receptores de la vacuna Ad5ΔE3-CS.Pyoel (Rodrigues et al. 1997), se espera que la vacunación con Ad35ΔE3-CS.Pyoel sea superior o al menos igualmente eficaz.
La figura 4A muestra que con una administración de 109 y 1010 partículas virales por ratón, el vector basado en Ad35 es al menos tan eficaz en la inducción de una respuesta inmunitaria celular como el vector basado en Ad5, si no superior. Puede concluirse que con este sistema no hay diferencia drástica en la respuesta celular tal como se indicó por el número de células que segregan IFN-D tras la administración intramuscular y subcutánea.
La figura 4B muestra los títulos de anticuerpos en el mismo experimento y realizado sobre los mismos sueros usando el experimento de inmunofluorescencia indirecta tal como se resumió anteriormente. Si se compara con los resultados mostrados en la figura 4A, queda claro que a una dosis de 109 partículas virales, el vector basado en Ad35 induce una respuesta inmunitaria celular significativa pero no da lugar a títulos muy altos de anticuerpos
5 antiesporozoítos. De nuevo, no hay diferencia significativa entre las dos vías de administración.
Posteriormente, se expusieron i.v. los animales que recibieron diferentes dosis de vectores basados en Ad5 y Ad35 que expresan el antígeno CS de P. yoelii con codones optimizados con 105 esporozoítos purificados tal como se describió anteriormente. Se muestran los resultados de estos experimentos en la figura 5A y B. Se calculó el porcentaje de inhibición en comparación con ratones sin tratamiento previo que no se inmunizaron.
Los ratones que se inmunizaron recibieron s.c. 109 ó 1010 partículas virales (pv) y se expusieron tras 14 días con los esporozoítos y luego se sacrificaron tras 48 h. Los controles negativos eran vectores vacíos sin antígeno y ratones no inmunizados. Claramente, se obtiene un alto porcentaje de inhibición cuando se usa el vector basado en Ad5 así
15 como con el vector basado en Ad35, aplicando las dos dosis, mientras que no se encontró protección en los controles negativos (figura 5A). De manera importante, sólo un bajo número de ARN ribosómico 18S específico de parásito pudo determinarse en el hígado de los ratones inmunizados, mientras que los ratones que no recibieron vector de adenovirus o recibieron vectores vacíos contenían grandes números de estos ARN (figura 5B). Esto indica fuertemente que el vector basado en Ad35, como el vector basado en Ad5, puede dar lugar a protección significativa contra el parásito de la malaria, incluso tras una única ronda de inmunización.
Ejemplo 6. Inducción de inmunidad contra la infección por malaria de P. falciparum usando vacunas basadas en adenovirus recombinante in vivo.
25 Se diseña una comparación lado a lado entre los vectores de serotipo 5 de adenovirus (Ad5) y de serotipo 35 de adenovirus (Ad35) para investigar la capacidad para inducir respuestas inmunitarias celular y humoral contra el antígeno CS del parásito P. falciparum en ratones. Además, se comparan las inmunogenicidades de los vectores de adenovirus que contienen CS de longitud completa y menos GPI. Este estudio incluye ratones B10.BR. Se inmunizan los animales mediante inyección intramuscular de 108-1010 pv de los vectores virales Ad5ΔE3 o Ad35ΔE3 que portan o bien el gen de CS de longitud completa (Ad5ΔE3-CS.Pfalc y Ad35ΔE3-CS.Pfalc) o bien el gen de CS menos la secuencia de anclaje GPI (Ad5ΔE3-CS.Pfalc.(-28)/(-14) y Ad35ΔE3-CS.Pfalc.(-28)/(-14) o sin transgén (Ad5ΔE3-empty y Ad35ΔE3-empty). A las dos semanas y de seis a ocho semanas tras la vacunación, se monitorizan las respuestas celular y humoral con ensayos inmunológicos bien conocidos por los expertos en la técnica tal como se describió anteriormente. Se programan la inmunización, la exposición y la lectura en la tabla IV y V.
35 Se espera que la inmunogenicidad de los vectores basados en Ad35 sea superior o al menos comparable a la inmunogenicidad desencadenada por los vectores basados en Ad5. La figura 6 muestra los resultados que se obtuvieron usando el vector basado en Ad5 que contenía el gen de longitud completa que codifica para la proteína CS de P. falciparum, el gen que codifica para la proteína con la deleción de 14 aminoácidos y el gen que codifica para la proteína con la deleción de 28 aminoácidos. Los resultados indican que los tres vectores (basados en Ad5) pueden inducir a la respuesta inmunitaria celular tal como se midió mediante el número de células que segregan IFN-γ específicas de CS en una población de esplenocitos, determinado por el ensayo ELISPOT ex-vivo descrito anteriormente, y generalmente como en Bruna-Romero et al. (2001 a).
Se mostró que el serotipo 5 de adenovirus recombinante que expresa un antígeno CS de P. yoelii provoca protección cuando se usa en un régimen de sensibilización-refuerzo en combinación con un virus vaccinia recombinante que porta el mismo antígeno (Bruna-Romero et al. 2001 a). Se diseñó un experimento para investigar la capacidad de los regímenes de sensibilización/refuerzo basados en vectores de adenovirus que portan CS con codones optimizados y derivados de dos serotipos diferentes para inducir protección duradera contra el antígeno CS de P. yoelii. Este estudio incluye ratones Balb/C distribuidos en grupos experimentales de 12 ratones cada uno. Se
55 inmunizan los animales mediante inyección intramuscular de una dosis óptima de vectores virales Ad5ΔE3 o Ad35ΔE3 que portan o bien el gen de CS de P.yoelli (Ad5ΔE3-CS.Pyoel y Ad35ΔE3-CS.Pyoel) o bien no portan transgén (Ad5ΔE3-empty y Ad35DE3-empty). Se sensibiliza un grupo de animales en la semana 0 con Ad5ΔE3CS.Pyoel y se refuerza en la semana 8 con Ad35ΔE3-CS.Pyoel. Se sensibiliza otro grupo de ratones en la semana 0 con Ad35ΔE3-CS.Pyoel y se refuerza en la semana 8 con Ad5ΔE3-CS.Pyoel. Se sensibilizan otros grupos de ratones en la semana 0 con Ad35ΔE3-CS.Pyoel o Ad5ΔE3-CS.Pyoel y se refuerzan en la semana 8 con el mismo vector. Finalmente, se sensibiliza un grupo control de ratones en la semana 0 con Ad5ΔE3-empty y se refuerza en la semana 8 con Ad35ΔE3-empty. En la semana 2 tras el refuerzo, se sacrifican 6 ratones de cada grupo para permitir la evaluación y caracterización de las respuestas inmunitarias celular y humoral con ensayos inmunológicos bien conocidos por los expertos en la técnica, se exponen los 6 ratones restantes de cada grupo con esporozoítos vivos.
65 Se programan la inmunización, la exposición y la lectura en la tabla VI. Se monitorizará la protección contra la infección por malaria y se medirá usando ensayos bien conocidos por los expertos en la técnica tal como se describió anteriormente. Se espera que los regímenes de vacunas basados en Ad35 solo o combinaciones Ad5/Ad35 sean superiores o al menos comparables en eficacia en comparación con los regímenes basados solamente en Ad5.
Ejemplo 8. Inducción de una inmunidad duradera contra la infección por malaria de P. falciparum mediante regímenes de sensibilización-refuerzo con vacunas basadas en diferentes serotipos de adenovirus.
Se diseñó un experimento para investigar la capacidad de los regímenes de sensibilización/refuerzo basados en
10 vectores de adenovirus derivados de dos serotipos diferentes para inducir inmunidad duradera contra el antígeno CS de P. falciparum. El estudio incluye ratones B10.BR distribuidos en grupos experimentales de 24 ratones cada uno. Se inmunizan los animales mediante inyección intramuscular de una dosis óptima de vectores de adenovirus que portan o bien el gen de CS de longitud completa (Ad5ΔE3-CS.Pfalc y Ad35ΔE3-CS.Pfalc) o bien el gen de CS menos la secuencia de anclaje GPI (Ad5ΔE3-CS.Pfalc(-28)/(-14) y Ad35ΔE3-CS.Pfalc(-28)/(-14)) o no portan
15 transgén (Ad5ΔE3-empty y Ad35ΔE3-empty). Se sensibiliza un grupo de animales en la semana 0 con Ad5ΔE3CS.Pfalc o Ad5ΔE3-CS.Pfalc(-28)/(-14) y se refuerza en la semana 8 con Ad35ΔE3-CS.Pfalc o Ad35ΔE3-CS.Pfalc(28)/(-14). Se sensibiliza otro grupo de ratones en la semana 0 con Ad35ΔE3-CS.Pfalc o Ad35ΔE3-CS.Pfalc(-28)/(14) y se refuerza en la semana 8 con Ad5ΔE3-CS.Pfalc o Ad5ΔE3-CS.Pfalc(-28)/(-14). Se sensibiliza otro grupo de ratones en la semana 0 con Ad35ΔE3-CS.Pfalc o Ad35ΔE3-CS.Pfalc(-28)/(-14) y se refuerza en la semana 8 con el
20 mismo vector. Finalmente, se sensibiliza un grupo control de ratones en la semana 0 con Ad5ΔE3-empty y se refuerza en la semana 8 con Ad35ΔE3-empty. En las semanas 2 y 6 ó 10 ó 16 tras el refuerzo, se sacrifican 6 ratones en cada punto de tiempo y se monitorizaron las respuestas celular y humoral con ensayos inmunológicos bien conocidos por los expertos en la técnica y tal como se describió anteriormente. Se programan la inmunización, la exposición y la lectura en la tabla VII. Se espera que los regímenes de vacunas basados en Ad35 sólo o
25 combinaciones de Ad5/Ad35 sean superiores o al menos comparables en eficacia en comparación con regímenes basados solamente en Ad5.
Ejemplo 9. Inducción de una respuesta inmunitaria contra el antígeno CS de P. falciparum mediante regímenes de sensibilización/refuerzo usando vacunas basadas en diferentes serotipos de adenovirus en
Se describe un ejemplo de un experimento útil para investigar la capacidad de los regímenes de sensibilización/refuerzo basados en vectores de adenovirus derivados de dos serotipos diferentes para provocar inmunidad contra el antígeno CS de P. falciparum en primates no humanos. Además, se evalúa el efecto de dos vías
35 de administración diferentes de la vacuna, intramuscular e intradérmica.
Se vacunan monos Rhesus con vectores de adenovirus que portan o bien el gen de CS de longitud completa (Ad5ΔE3-CS.Pfalc o Ad35ΔE3-CS.Pfalc) o bien el gen de CS menos la secuencia de anclaje GPI (Ad5ΔE3CS.Pfalc(pf-aa-sub) o Ad35ΔE3-CS.Pfalc(pf-aa-sub)). Se comparan los regímenes de sensibilización/refuerzo (Ad5 40 seguido por Ad35 o Ad35 seguido por Ad5) con regímenes de sensibilización/refuerzo generalmente aplicados (Ad5 seguido por Ad5 o Ad35 seguido por Ad35). Se monitorizan las respuestas inmunitarias celular y humoral usando ensayos inmunológicos bien conocidos por los expertos en la técnica. Se somete a prueba el suero de monos inmunizados mediante ensayo ELISA para determinar la naturaleza y magnitud de la respuesta de anticuerpos contra la región de repetición de CS. Se mide la respuesta inmunitaria celular mediante el ensayo ELISPOT para
45 determinar la cantidad de células que segregan IFN-D específicas de antígeno.
Tabla 1. Nombres y números de entrada de la base de datos de Genbank de las secuencias de aminoácidos de circumsporozoíto de P. falciparum usadas para generar la secuencia consenso final.
- Aislados de tipo natural
- Números de entrada Cepas de lab. Números de entrada
- China
- AAG37074 3D7 CAA33421
- Tailandia
- CAB64171 CAB38998
- CSP_PLAFT CSP_PLAFO
- AAA29542 - AAA29552 NP _473175
- AAA29555 - AAA29576 7G8 CSP_PLAFA
- Brasil
- AB64167 C60657
- CAB64190 - CAB64197 AAA29524
- Senegal
- CAB64180 - CAB64189 NF54 AAA29521
- Myanmar
- CAB64237 - CAB64243 AAA29527
- Aislados de tipo natural
- Números de entrada Cepas de lab. Números de entrada
- India
- CAB64169 S05428
- Tanzania
- CAB64168 CSP_PLAFL
- AB64170 AB64172 WELLCOME A54529
- AAA29554
- Gambia
- AAF03134 - AAF03136 CSP_PLAFW
- A38869 D60657
- B60657 LE5 CSP_PLAFL
- B38869 AAA57043
- H60657 B29765
- Uganda
- CAA27599
- CAB64177
- Liberia
- CAB64176
- Honduras
- CAB64174
- Sureste de Asia
- AAA29516 - AAA29519
- CAB64175
- CAB64178
- CAB64179
Tabla II. Programa de inmunización, exposición y lectura para las vacunaciones de ratones con Ad5.CS.Pyoel (Ad5-
PyCS), pv = partículas virales por ratón.
- Programa de inmunización
- Vector viral pv n.ºratones de ELISPOT/suero Exposición
- Sensibilización/exposición
- Ad5-PyCS 108 12 2 semanas (6 ratones) 2 semanas (6 ratones)
- Sensibilización/exposición
- Ad5-PyCS 109 12 2 semanas (6 ratones) 2 semanas (6 ratones)
- Sensibilización/exposición
- Ad5-PyCS 1010 12 2 semanas (6 ratones) 2 semanas (6 ratones)
- Sensibilización/exposición
- Ad5-vacío 1010 8 2 semanas (4 ratones) 2 semanas (4 ratones)
Tabla III. Programa de inmunización, exposición y lectura para vacunaciones de ratones con Ad35.CS.Pyoel (Ad35-PyCS), pv = partículas virales por ratón.
- Programa de inmunización
- Vector viral pv n.ºratones de ELISPOT/suero Exposición
- Sensibilización/exposición
- Ad35-PyCS 108 12 2 semanas (6 ratones) 2 semanas (6 ratones)
- Sensibilización/exposición
- Ad35-PyCS 109 12 2 semanas (6 ratones) 2 semanas (6 ratones)
- Sensibilización/exposición
- Ad35-PyCS 1010 12 2 semanas (6 ratones) 2 semanas (6 ratones)
- Sensibilización/exposición
- Ad35-vacío 1010 8 2 semanas (4 ratones) 2 semanas (4 ratones)
Tabla IV. Programa de inmunización, exposición y lectura para vacunaciones de ratones con Ad5.CS.Pfalc (Ad5-PfCS, con o sin anclaje), pv = partículas virales por ratón.
- Programa de inmunización
- Vector viral pv n.º de ratones ELISPOT/suero ELISPOT/suero
- Sensibilización
- Ad5-PfCS 108 12 2 semanas (6 ratones) 6-8 semanas (6 ratones)
- Sensibilización
- Ad5-PtCS 109 12 2 semanas (6 ratones) 6-8 semanas (6 ratones)
- Sensibilización
- Ad5-PtCS 1010 12 2 semanas (6 ratones) 6-8 semanas (6 ratones)
- Programa de inmunización
- Vector viral pv n.º de ratones ELISPOT/suero ELISPOT/suero
- Sensibilización
- Ad5-vacío 1010 8 2 semanas (4 ratones) 6-8 semanas (4 ratones)
Tabla V. Programa de inmunización, exposición y lectura para vacunaciones de ratones con Ad35.CS.Pfalc (Ad35- PfCS, con o sin anclaje), pv = partículas virales por ratón.
- Programa de inmunización
- Vector viral pv n.º de ratones ELISPOT/suero ELISPOT/suero
- Sensibilización
- Ad35-PtCS 108 12 2 semanas (6 ratones) 6-8 semanas (6 ratones)
- Sensibilización
- Ad35-PfCS 109 12 2 semanas (6 ratones) 6-8 semanas (6 ratones)
- Sensibilización
- Ad35-PfCS 1010 12 2 semanas (6 ratones) 6-8 semanas (6 ratones)
- Sensibilización
- Ad35-vacío 1010 8 2 semanas (4 ratones) 6-8 semanas (4 ratones)
Tabla VI. Programa de inmunización, exposición y lectura para ratones en un sistema de vacunación de sensibilización-refuerzo usando Ad5.CS.Pyoel (Ad5-PyCS) y Ad35.CS.Pyoel (Ad35-PyCS).
- Programa de
- Vector viral- Vector viral n.º de ELISPOT/suero exposición
- inmunización
- sensibilización refuerzo (tras 8 ratones
- semanas)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad5-PyCS Ad5-PyCS 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad35-PyCS Ad35-PyCS 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad5-PyCS Ad35-PyCS 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad35-PyCS Ad5-PyCS 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad5- vacío Ad35- vacío 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
Tabla VII. Programa de inmunización, exposición y lectura para ratones en un sistema de vacunación de sensibilización-refuerzo usando Ad5.CS.Pfalc (Ad5-PfCS) y Ad35.CS.Pfalc (Ad35-PfCS), con o sin anclaje GPI.
- Programa de
- Vector viral- Vector viral n.º de ELISPOT/suero ELISPOT/suero
- inmunización
- sensibilización refuerzo (tras 8 ratones
- semanas)
- Sensibilización
- Ad5-PfCS Ad5-PfCS 12 2 semanas tras el 6/10/16 semanas tras
- refuerzo/exposición
- refuerzo (6 ratones) el refuerzo (6
- ratones)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad35-PfCS Ad35-PfCS 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad5-PfCS Ad35-PfCS 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad35-PfCS Ad5-PfCS 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
- Sensibilizaciónrefuerzo/exposición
- Ad5- vacío Ad35- vacío 12 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones) 2 semanas tras el refuerzo (6 ratones)
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<220>
- <221>
- CDS 35 <222> (13) .. (1170)
<223>
<220>
- <221>
- péptido_sig 40 <222> (13) .. (102)
<223>
<400> 1
<210> 2
<211> 386
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: gen de circumsporozoíto con codones optimizados de Plasmodium falciparum, clon 02-148
10 <400> 2 Leu Asn 385
<210> 3
5 <211> 386
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
- <220>
- 10 <221> SEÑAL
<222> (1) .. (30)
<223>
- <220>
- 15 <221> REPETICIÓN
<222> (124) .. (259)
<223> Región de 4 N VDP y en total 30 repeticiones PdAVP
- <220>
- 20 <221> LÍPIDO
<222> (359) .. (386)
<223> ANCLAJE GPI
- <220>
- 25 <221> MUTAGEN
<222> (373) .. (373)
<223> sustitución de Ser por Ala, eliminación de sitio de glicosilación
<400> 3
<210> 4
<211> 1154
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: gen de circumsporozoíto con codones optimizados de Plasmodium 10 falciparum cepa 3D7, clon 02-659
<220>
<221> CDS
- <222>
- (13) .. (1128) 15 <223>
<220>
<221> péptido_sig
- <222>
- (13) .. (102) 20 <223>
<400> 4
- 5
- <210> 5 <211> 372 <212> PRT <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Gen de circumsporozoítofalciparum cepa 3D7, clon 02-659 con codones optimizados de Plasmodium
- <400> 5
<210> 6
5 <211> 372
<212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
- <220>
- 10 <221> SEÑAL
<222> (1) .. (30)
<223>
- <220>
- 15 <221> REPETICIÓN
<222> (124) .. (259)
<223> Región de 4 NVDP y en total 30 repeticiones NAVP
<220>
<221> LÍPIDO
<222> (359) .. (372)
<223> ANCLAJE GPI
<400> 6
<210> 7
<211> 1115
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: Gen de circumsporozoíto con codones optimizados de Plasmodium yoelii, 10 clon 02-149
<220>
<221> CDS
- <222>
- (17) .. (1084) 15 <223>
<220>
<221> péptido_sig
- <222>
- (17) .. (73) 20 <223>
<400> 7
<210> 8
<211> 356
<212> PRT
5 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: Gen de circumsporozoíto con codones optimizados de Plasmodium yoelii, clon 02-149
<400> 8 <210> 9
<211> 356
5 <212> PRT
<213> Plasmodium yoelii
<220>
- <221>
- SEÑAL 10 <222> (1)..(19)
<223>
<220>
- <221>
- REPETICIÓN 15 <222> (138) .. (225)
<223> Región de 15 repeticiones QGPGAP
<220>
- <221>
- REPETICIÓN 20 <222> (229) .. (254)
<223> Región de 7 repeticiones PQQP
<400> 9
- 5
- <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum
- <400> 10
- 10 15
- <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <400> 11
<210> 12
<211> 11 20 <212> PRT
<213> Plasmodium falciparum
<400> 12
<210> 13
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido Forw.Falc
<400> 13
5 <210> 14
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
10 <220>
<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido Rev.Falc.CS-28
<400> 14
<210> 15
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido Rev.Falc.CS -14
<210> 16
<211> 22
<212> ADN 30 <213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido SV40for
<210> 17
<211> 35 40 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido pIXRmfe
<400> 17
<210> 18 50 <211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 55 <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido pIX35mfe
<400> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> Plasmodium yoelii
<400> 19
Claims (8)
- REIVINDICACIONES1. Una composición de vacuna que comprende un adenovirus recombinante de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para proteína CS o una parte inmunogénica de ella de P.5 falciparum, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína CS o una parte inmunogénica de ella comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:6, para uso en el tratamiento o la prevención de malaria.
- 2. Una composición de vacuna para uso en el tratamiento o la prevención de malaria de acuerdo con la10 reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico que codifica para una proteína CS o una parte inmunogénica de ella comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:4.
- 3. Una composición de vacuna para uso en el tratamiento o la prevención de malaria de acuerdo con unacualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que dicho adenovirus se selecciona del grupo que consiste en serotipo 15 de adenovirus humano 11, 26, 34, 35, 48, 49 y 50.
- 4. Una composición de vacuna para uso en el tratamiento o la prevención de malaria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicho adenovirus es un adenovirus humano de serotipo 26 ó 35.
- 20 5. Una composición de vacuna para uso en el tratamiento o la prevención de la infección por malaria en la que el tratamiento o la prevención comprende administrar la composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y administrar adicionalmente una proteina CS purificada o RTS,S, en la que la administración puede ser o bien en orden o bien simultáneamente.
- 25 6. Una composición de vacuna para el tratamiento o la prevención de la infección por malaria de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la composición de vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 se administra como sensibilización y la proteina CS purificada o RTS,S se administra como refuerzo.
- 7. Un ácido nucleico aislado que codifica para una proteína circumsporozoíto de la cepa 3D7 de Plasmodium30 falciparum, según se representa en la figura 2A (SEQ ID NO:6), en el que dicho ácido nucleico está con codones optimizados.
- 8. Un ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:4.
- 9. Un vector viral recombinante de replicación defectuosa que comprende un ácido nucleico heterólogo que codifica para un determinante antigénico de Plasmodium falciparum, en el que el ácido nucleico heterólogo es un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.40 10. Un vector viral recombinante de replicación defectuosa de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho vector viral es un adenovirus, un alfavirus o un virus Vaccinia.
- 11. Un vector viral recombinante de replicación defectuosa de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho vector viral es un adenovirus.
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-
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