PT1534320E - Apolipoproteína l-i para o tratamento de doenças de tripanossomas - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
"APOLIPOPROTEÍNA L-I PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DE TRIPANOSSOMAS"
Campo da invenção A presente invenção refere-se à utilização de apolipoproteina L-I para a preparação de medicamentos para o tratamento e/ou prevenção de doenças induzidas em mamíferos por Tripanossoma, especialmente Tripanossoma Africano. A presente invenção refere-se também a um polipéptido derivado da referida sequência de apolipoproteina L-I que poderia também ser utilizada para aplicações terapêuticas e/ou diagnósticas dirigidas contra Tripanossoma, especialmente Tripanossoma Africano.
Um último aspecto da presente invenção refere-se a um bovídeo transgénico que é capaz de produzir naturalmente a referida apolipoproteina L I ou um polipéptido derivado da referida sequência de apolipoproteina L I e que é tolerante ou resistente à referida infecção de Tripanossoma.
Antecedentes da invenção 0 Trypanosoma brucei brucei infecta uma vasta gama de mamíferos mas é incapaz de infectar seres humanos porque esta subespécie de T. brucei é lisada por NHS1 '2. Em contraste, 0 Trypanosoma brucei rhodesiense apresenta sensibilidade ou 1 resistência ao soro humano normal (NHS), dependendo da variação antigénica. 0 último fenótipo surge porque a resistência codificada por gene, proteina associada com a resistência ao soro (SRA), está presente numa única das unidades policistrónicas múltiplas onde os genes para o antigénio variante, a glicoproteína de superfície variante (VSG), podem ser transcrirtos4. 0 produto da proteina associada com a resistência ao soro (SRA) é uma glicoproteína de superfície variante (VSG) atípica, mais curta do que a média (410 aa em vez de aproximadamente 4 90) 3. Os anticorpos anti-SRA detectaram uma proteína em torno de 50 kDa (Fig. 1 pistas 1, 2), que se acumula no lisossoma, como revelado com marcadores específicos para o compartimento endocítico, nomeadamente lectina de tomate (bolso flagelar, endossomas e lisossoma)5 e anticorpos contra a glicoproteína p67 da membrana lisossomal6 (Fig. 2a, b).
Sumário da invenção
Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se à utilização de uma molécula ou uma composição farmacêutica (incluindo uma vacina) compreendendo a referida molécula e um veículo ou diluente farmacêutico adequado, para a preparação de um medicamento no tratamento e/ou prevenção de doenças de mamíferos induzidas por Tripanossoma, especialmente Tripanossoma Africano seleccionado do grupo consistindo de Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma brucei rhodesiense e Trypanosoma gambiense. A molécula específica utilizada de acordo com a invenção é o polipéptido da apolipoproteína L-I, de um modo preferido a apolipoproteína L-I humana (ApoL-I) , seus fragmentos farmaceuticamente activos, suas variantes, um polinucleótido que codifica o(s) referido(s) polipéptido(s) , seus homólogos, fragmentos ou variantes, ou uma célula transformada pelo 2 referido polinucleótido e expressando o referido polipéptido ou fragmentos, ou um inibidor dirigido contra a referida apolipoproteina L-I. 0 polipéptido e polinucleótido da apolipoproteina L-I humana correspondem à sequência SEQ. ID. N°l. Os fragmentos farmaceuticamente activos preferidos são as sequências que começam do aminoácido 1 até ao aminoácido 342, a sequência que começa do aminoácido 343 até ao aminoácido 398, a sequência que começa do aminoácido 340 até ao aminoácido 362 e a sequência que começa do aminoácido 356 até ao aminoácido 398 . A molécula utilizada de acordo com a invenção também pode ser um inibidor dirigido contra a referida apolipoproteina L-I, tal como o polipéptido SRA de Tripanossoma, um seu fragmento farmaceuticamente activo (ligando especificamente o polipéptido de ApoL-I) ou qualquer molécula que pode mimetizar a interacção entre o polipéptido SRA e a apolipoproteina L-I. Por exemplo, esse inibidor, que pode mimetizar a referida interacção, é um anticorpo dirigido contra a apolipoproteina L-I especifica (ou uma sua porção hiper variável), especialmente dirigido contra o fragmento terminal de ApoL-I que interage com o polipéptido SRA. Esse inibidor poderia ser um anticorpo monoclonal ou policlonal.
Um último aspecto da presente invenção é um anticorpo anti-idiotipico monoclonal ou policlonal (ou uma sua porção hiper variável) dirigido contra o anticorpo anti-apolipoproteína L-I descrito acima que pode mimetizar a estrutura de um fragmento da referida apolipoproteina L-I (epitopo que interage com o polipéptido SRA) . A molécula da invenção também pode ser um complexo entre os referidos elementos (complexos entre fragmentos, complexo anticorpo-fragmento, etc.).
Estes vários polipéptidos, polinucleótidos, fragmentos ou inibidores poderiam ser utilizados para um objectivo terapêutico 3 (administração de ApoL-I ou seus derivados), profiláctico (vacina compreendendo o inibidor (SRA ou um fragmento ou polipéptido SRA)) ou diagnóstico (detecção de ApoL-I ou SRA através de inibidores dirigido contra estes) de modo a identificar, tratar e/ou prevenir infecções causadas por Tripanossoma num mamífero (especialmente num bovídeo ou num ser humano).
As várias moléculas de acordo com a invenção também poderiam ser utilizadas em kits de diagnóstico para caracterizar a reacção imune de um mamífero relativamente à administração da molécula ou da composição farmacêutica (vacina) de acordo com a invenção e para a detecção ou monitorização da produção de inibidores por um mamífero.
Além disso, as várias moléculas de acordo com a invenção também poderiam ser utilizadas para a purificação de apolipoproteína L-I, por exemplo, através da utilização de um ou mais dos referidos inibidores (polipéptido SRA, fragmento de polipéptido SRA ou anticorpo dirigido contra ApoL-I) numa coluna cromatográfica ou noutro dispositivo de purificação. A presente invenção será descrita em mais detalhe na seguinte descrição detalhada da invenção, com referência às figuras anexas.
Definições "Polipéptido" refere-se a qualquer péptido ou proteína compreendendo dois ou mais aminoácidos ligados entre si através de ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, i. e., isoésteres peptídicos. "Polipéptido" refere-se tanto a cadeias curtas, geralmente referidas como péptidos, 4
oligopéptidos ou oligómeros, como a cadeias mais longas, geralmente referidas como proteínas. Os polipéptidos podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados por genes. "Polipéptidos" incluem sequências de aminoácidos modificadas quer por processos naturais, tais como processamento pós-traducional, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica. Essas modificações estão bem descritas em textos básicos e em mais detalhe, monografias, assim como numa volumosa literatura de investigação. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar num polipéptido, incluindo o esqueleto peptídico, as cadeias laterais de aminoácidos e nos terminais amino ou carboxilo. Deverá ser entendido que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou variados graus, em diversos locais num determinado polipéptido. Igualmente, um determinado polipéptido pode conter muitos tipos de modificações. Os polipéptidos podem ser ramificados em resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Podem resultar polipéptidos cíclicos, ramificados e ciclicos e ramificados a partir de processos naturais pós-traducionais ou podem ser realizados por métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma unidade hémica, ligação covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, ligação covalente de um lípido ou derivado de lípido, ligação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação perssulfureto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, adição mediada por ARN de transferência de amino de aminoácidos para proteínas, tais como arginilação, e ubiquitinação. Ver, por exemplo, PROTEINS 5 STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman e Comany, Nova Iorque, 1993 e Wolt, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pp. 1-12 em POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, 1983; Seifter et al. , "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646 e Rattan et al., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sei (1992) 663: 48-62. "Polinucleótido" refere-se, geralmente, a qualquer polirribonucleótido ou polidesoxirribonucleótido, que pode ser ARN ou ADN não modificado ou ARN ou ADN modificado. "Polinucleótidos" inclui, sem limitação, ADN de cadeia simples e dupla, ADN que é uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla, ARN de cadeia simples e dupla, e ARN é que uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla, moléculas híbridas compreendendo ADN e ARN que pode ser de cadeia simples ou, mais tipicamente, de cadeia dupla ou uma mistura de regiões de cadeia simples e dupla. Além disso, "Polinucleótido" refere-se a regiões de cadeia tripla compreendendo ARN ou ADN ou ambos ARN e ADN. O termo "Polinucleótido" inclui também DNAs ou RNAs contendo uma ou mais bases modificadas e DNAs ou RNAs com esqueletos modificados para estabilidade ou para outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases invulgares, tais como inosina. Foi realizada uma variedade de modificações ao ADN e ARN; assim, "Polinucleótido" abrange formas modificadas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente de polinucleótidos como encontradas tipicamente na natureza, assim como as formas químicas de ADN e ARN características de vírus e células. "Polinucleótido" também abrange polinucleótidos relativamente curtos, frequentemente referidos como oligonucleótidos. 6 "Variante", como o termo é aqui utilizado, é um polinucleótido ou polipéptido que difere de um polinucleótido ou polipéptido de referência, respectivamente, mas retém propriedades essenciais. Uma variante tipica de um polinucleótido difere na sequência de nucleótidos de outro polinucleótido de referência. As alterações na sequência de nucleótidos da variante podem ou não alterar a sequência de aminoácidos de um polipéptido codificado pelo polinucleótido de referência. As alterações de nucleótidos podem resultar em substituições, adições, delecções, fusões e truncamentos de aminoácidos no polipéptido codificado pela sequência de referência, como discutido abaixo. Uma variante tipica de um polipéptido difere na sequência de aminoácidos de um outro polipéptido de referência. De um modo geral, as diferenças são limitadas de modo que as sequências do polipéptido de referência e da variante sejam na globalidade intimamente semelhantes e, em muitas regiões, idênticas. Uma variante e um polipéptido de referência podem diferir na sequência de aminoácidos por uma ou mais substituições (de um modo preferido conservadoras) , adições e delecções em qualquer combinação. Um residuo de aminoácido substituído ou introduzido pode ou não ser um codificado pelo código genético. Uma variante de um polinucleótido ou polipéptido pode ser uma de ocorrência natural, tal como uma variante alélica, ou pode ser uma variante que não se sabe que ocorre naturalmente. As variantes de ocorrência não natural de polinucleótidos e polipéptidos podem ser realizadas através de técnicas de mutagénese ou por sintese directa. As variantes devem reter uma ou mais actividades biológicas do polipéptido de referência. Por exemplo, devem ter actividades antigénicas ou imunogénicas semelhantes como o polipéptido de referência. A antigenicidade pode ser testada utilizando experiências de imunotransferência convencionais, utilizando de um modo preferido soros policlonais contra o polipéptido de referência. A imunogenicidade pode ser testada através de medição de 7 respostas de anticorpo (utilizando soros policlonais produzidos contra o polipéptido variante) contra o polipéptido de referência purificado num teste de ELISA convencional. De um modo preferido, uma variante reteria todas as actividades biológicas acima. A variante irá apresentar, de um modo preferido, uma identidade de sequência superior a 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%-99% relativamente ao péptido original (SEQ. ID. N°l). "Identidade" é uma medida da identidade de sequências de nucleótidos ou de sequências de aminoácidos. Em geral, as sequências são alinhadas de modo a obter o melhor emparelhamento. "Identificar" per se tem um significado reconhecido na técnica e pode ser calculado utilizando técnicas publicadas. Ver, e. g.: (COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988/ BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GEMONA PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993/ COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds, Humana Press, New Jersey, 1994/ SEQUENCE ANALYSIS EM MOLECULAR BIOLOGY, von Heijne, G., Academic Press, 1987/ e SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M. e Devereux, J., eds, M Stockton Press, Nova Iorque, 1991). Embora exista uma variedade de métodos para medir a identidade entre duas sequências de polinucleótidos ou polipéptidos, o termo "identidade" é bem conhecido dos especialistas (Carillo, H., e Lipton, D., SIAM J Applied Math (1998) 48: 1073). Os métodos geralmente utilizados para determinar a identidade ou similaridade entre duas sequências incluem, mas não estão limitadas àquelas divulgadas em Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, e Carillo, H., e Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48: 1073. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador. Os métodos preferidos de programa de computador para determinar a identidade e similaridade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados, ao pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., J Molec Biol (1990) 215: 403). De um modo muito preferido, o programa utilizado para determinar os niveis de identidade foi o programa GAP, como foi utilizado no Exemplos daqui por diante. A titulo ilustrativo, por um polinucleótido possuindo uma sequência de nucleótidos que tem, pelo menos, por exemplo, 95% de "identidade" com uma sequência de nucleótidos de referência, é pretendido que a sequência de nucleótidos do polinucleótido seja idêntica à sequência de referência excepto que a sequência de polinucleótidos possa incluir uma média até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência. Por outras palavras, para obter um polinucleótido que tem uma sequência de nucleótidos, pelo menos, 95% idêntica a uma sequência de nucleótidos de referência, até 5% dos nucleótidos na sequência de referência podem ser removidos ou substituídos com outro nucleótido, ou um número de nucleótidos até 5% dos nucleótidos totais na sequência de referência podem ser introduzidos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da sequência de nucleótidos de referência ou em qualquer local entre aquelas posições terminais, intervaladas quer individualmente entre nucleótidos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.
Um fragmento pode ser "autónomo" ou compreendido dentro de um polipéptido maior do qual forma uma parte ou região, de um modo muito preferido, como uma única região contínua. Os exemplos representativos de fragmentos polipeptídicos da invenção incluem, por exemplo, fragmentos a partir de cerca do número de aminoácidos 1-30, 31-60, 61-90, 91-120, 121-150, e 9 150, 200, 250 até à extremidade do polipéptido. Neste contexto "cerca de" inclui as gamas particularmente referidas, maiores ou menores em diversos, 5, 4, 3, 2 ou 1 aminoácidos em qualquer dos extremos ou em ambos os extremos.
Os fragmentos preferidos incluem, por exemplo, polipéptidos truncados que têm a sequência de aminoácidos dos polipéptidos, à excepção da remoção de uma série continua de resíduos que inclui o terminal amino, ou uma série contínua de resíduos que inclui o terminal carboxilo e/ou região transmembranar ou a remoção de duas séries contínuas de resíduos, uma incluindo o terminal amino e uma incluindo o terminal carboxilo. São também preferidos fragmentos caracterizados por atributos estruturais ou funcionais, tais como fragmentos que compreendem hélices alfa e regiões formadoras de hélices alfa, folhas beta e regiões formadoras de folhas beta, voltas e regiões formadoras de voltas, enrolamentos e regiões formadoras de enrolamentos, regiões hidrofílicas, regiões hidrofóbicas, regiões anfifílicas alfa, regiões anfifílicas beta, regiões flexíveis, regiões formadoras de superfície, região de ligação de substrato, e regiões de elevado índice antigénico. Outros fragmentos preferidos são fragmentos biologicamente activos.
Descrição dos desenhos A fig. 1 representa o vector pTSARib contendo, ou não (-) , versões diferentes da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) (WT = tipo selvagem; del = removido do péptido indicado; SRA/VSG = quimérico associando 1-192 de SRA e glicoproteína de superfície variante (VSG, péptidos 288-490). As células foram analisadas através do teste de resistência ao soro humano (HSRT) in vivo e in vitroA, e qualificadas como resistentes (R) ou sensíveis (S) . Os transformantes foram 10 cultivados em murganhos na presença de soro fetal de vitela (FCS) ou soro humano normal (NHS) . O significado da banda de 45 kDa (asterisco) é desconhecido. A fig. 2 representa os tripanossomas gue foram analisados através de microscopia confocal de fluorescência após incubação durante 1 h a 37 °C, na presença (c, d, e) ou ausência (a, b) de Alexa 594-apoL-I. Anticorpos monoclonais de DAPI, lectina de tomate (TL) e anti-p67 (p67) marcaram, respectivamente, o ADN (ponto grande: núcleo, ponto pequeno: cinetoplasto), compartimento endocitico e lisossoma5'6. A fig. 3. representa a. Os perfis de proteínas de NHS ligadas às resinas quer não contendo proteína (-) , ou versões
diferentes de His-SRA. NHS (pistas 1-8) ou [35S]-apoL-I sintetizadas in vitro (pistas 9, 10) foram incubadas com a resina. As proteínas ligadas foram eluídas quer com imidazole (pistas 1-4, 7-10) ou desoxicolato (pistas 5 ,6), e reveladas por coloração azul de Coomassie (pistas 1-6), ligação de anticorpos anti-apoL-I (pistas 7, 8) ou autorradiografia (pistas 9, 10). A seta dupla designa bandas especificamente ligadas com SRA funcional, e o asterisco marca His-SRA eluída. b. Imunoprecipitação com anticorpos anti-V5, de [35S]-SRA (kDa 48) sintetizada in vitro, incubada ou não com [35S]-V5-apoL-I (42 kDa). A proporção prevista de [35S]-metionina entre estas proteínas é de 4:9. c. Modelo do fragmento 31-79 da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) (fita azul escura) em interacção antiparalela com o fragmento 340-392 de apoL-I (fita azul clara). 158 (verde), L61 (cor-de-rosa) e 162 (cor-de-malva) estão em representação CPK. d. Características da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) e apoL-I mencionadas no texto (SP= péptido sinal; HT= Cauda hidrofóbica; as linhas tracejadas simbolizam interacções entre as hélices a). 11 A fig. 4 representa a. Incubação de ETat 1.2S com NHS diferentemente tratado (SRA-ft, L61P/I62P-ft, aApoL-ft = fracção de escoamento de SRA-, L61P/I62P SRA- e anti-apoL-I-Sepharose, respectivamente; aApoL-eL = eluato da fracção ligada à anti-apoL-I-Sepharose) . b. Incubação de ETat 1.2S quer em SRA-ft ou FCS suplementado com apoL-I recombinante (WT = tipo selvagem; C-del = faltando o péptido 343-398 do terminal C) ou com a fracção equivalente de células CHO de controlo (ctl). c. Incubação de ETat 1.2R em NHS ou em SRA-ft suplementado com apoL-I recombinante. d. Incubação de diferentes linhas celulares de Trypanosoma brucei brucei em proteina associada com a resistência ao soro (SRA)-ft suplementada ou não com apoL-I recombinante. Os transformantes de pTSARib (RibO, RibSRA) são formas pleomórficas que não crescem sob estas condições de incubação. A fig. 5 representa as sequências de aminoácidos e nucleótidos do polipéptido da apolipoproteína humana (SEQ. ID. N°1).
Descrição detalhada da invenção A requerente descobriu que os anticorpos Anti-SRA detectam uma proteina em torno de 50 kDa (Fig. 1 pistas 1, 2), que se acumula no lisossoma de Tripanossoma, como revelado com marcadores específicos para o compartimento endocitico, nomeadamente lectina de tomate (bolso flagelar, endossomas e lisossoma)5 e anticorpos contra a glicoproteina p67 da membrana lisossomal6 (Fig. 2a, b). 12
Uma vez que a transfecção de SRA permite que Trypanosoma brucei brucei cresça em NHS4 (Fig. 1 pistas 3-5), a requerente investigou os requisitos minimos de SRA necessários para a resistência através da produção de tripanossomas expressando várias proteinas associadas com a resistência ao soro (SRA) mutantes (esquema SRA na Fig. 3d) . Estas células foram analisadas para a expressão da proteina associada com a resistência ao soro (SRA) e a sensibilidade ao soro humano normal (NHS) (Fig. 1) .
Embora a proteina associada com a resistência ao soro (SRA) contenha mananas elevadas ligadas a N, estas não foram envolvidas na resistência, uma vez que a recolocação individual ou colectiva dos locais putativos de N-glicosilação não afectou a resistência mediada por SRA (pistas 6,7) . 0 terminal C e o sinal de ancoramento GPI também foram dispensáveis uma vez que as versões truncadas da proteina associada com a resistência ao soro (SRA) que carecem desta região ainda conferem resistência (pistas 8,9). Similarmente, as delecções do péptido de sinal do terminal N ou da região mais hidrofóbica (aa 98-118) não tiveram efeito (pistas 10,11). Colectivamente, estes dados mapearam entre os aa 32-97 e/ou 119-192, os pedaços minimos da proteina associada com a resistência ao soro (SRA) requeridos para a resistência.
Uma vez que região anterior contém caracteristicas distintivas da hélice α anfifilica envolvida na dimerização de VSG, e. g., sequências repetitivas heptad7, a requerente introduziu mutações pontuais que prevêem a interrupção desta hélice. Duas mutações duplas independentes (L61P/I62P e I58Q/I62Q) aboliram o fenótipo de resistência, enquanto que as mutações numa região adjacente (V40Q/V43Q/L47Q) não (pistas 12-14) . Assim, a hélice α 54-65 contendo os resíduos 13 hidrofóbicos chave 158, L61 e 162 foi necessária para conferir resistência.
1. A proteína associada com a resistência ao soro (SRA) liga-se à Concanavalina A e contém glicanos de manose elevados ligados a N Métodos
Produção de tripanossomas transgénicos expressando mutantes de SRA. 0 gene da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) em pTSARib-SRA4 foi alterado através de mutagénese dirigida (Stratagene) e/ou digestão com endonucleases de restrição e ligação com fragmentos do AnTat 11.17 VSG11. Os plasmideos resultantes foram electroporados em formas pró-cíclicas de Trypanosoma brucei brucei que foram transmitidas ciclicamente através da mosca tsé-tsé para obter transformantes na forma da corrente sanguínea4.
Produção da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) A proteína associada com a resistência ao soro (SRA) foi produzida quer através de tradução de ARN in vitro utilizando BSDP1400HA65-5RA18, ou através de expressão em Escherichia coli utilizando pQE30, em que foi introduzido o fragmento de 1-753 bp da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) entre Bam Hl e Hind III para codificar um polipéptido marcado com His no terminal N. No último caso, a proteína foi solubilizada a partir de sedimentos de extractos celulares sonicados, através 14 de incubação durante 1 h à temperatura ambiente em 8 M de ureia, 2 mM de mercaptoetanol, 0,1 M de NaH2P04, 10 mM de Tris (pH 8), depois dialisada contra o mesmo tampão contendo sucessivamente 0,5 M de ureia, 0,35 M de ureia, 0,1 M de ureia e 1% de CHAPS.
Anticorpos
Os anticorpos anti-SRA foram produzidos através de imunização de coelho com o polipéptido 1-251 marcado com His, e purificados por afinidade através de ligação a filtros de nitrocelulose revestidos com antigénio e eluição ácida. Foram utilizados após diluição de 1:2 e 1:100, para imunofluorescência e análise de transferência de Western, respectivamente. Os anticorpos anti-apoL-I8 foram utilizados na diluição de 1:20.000. Os anticorpos anti-p67 foram do sobrenadante do hibridoma Ali 1-218 (presente de D.G. Russell).
Interacção da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) com soro humano normal (NHS)
Foi incubada His-SRA mutante ou de tipo selvagem recombinante (100 pg) com 500 pL de soro humano normal (NHS) durante 4 h a 4 °C em 0,6 M de NaCl, 0,35% de CHAPS, 0,15 M de Mes (pH 5,8) com um cocktail de inibidores de proteases (totalmente livre de EDTA, incluindo pepstatina, Roche) (tampão A) . A mistura foi depois incubada durante 30 min a 4 °C com 100 pL de esferas de Ni-NTA (Qiagen). O processamento destas esferas, incluindo eluição do material ligado com 250 mM de imidazole, foi realizada em tampão A como descrito por Qiagen. Alternativamente, His-SRA foi covalentemente acoplado a CH 15
Sepharose 4B activada (Pharmacia), e o material ligado foi eluído em 5% de desoxicolato de Na, 50 mM de Tris (pH 7,5).
Microscopia Confocal de fluorescência
Os tripanossomas foram fixos durante 10 minutos em 3,7% de paraformaldeido e permeabilizados durante 10 minutos em 0,1% de Triton X-100. Foram utilizados lectina de tomate Biotinilada, Alexa 488-estreptavidina e anticorpos secundários Alexa 488/594-anti-murganho ou anti-coelho. Para detectar apoL-I, o eluato de desoxicolato de SRA-Sepharose foi acoplado a Alexa 594 após diálise e depleção extensa da albumina sérica através de filtração em gel, e incubação com tripanossomas durante lha 37 °C. As amostras foram analisadas com um microscópio confocal TCS SP2 da Leica.
Produção de apoL-I nativa A apoL-I foi obtida através de eluição do material do soro humano normal (NHS) ligado a anti-apoL-I-Sepharose, utilizando 5% de CHAPS, 0,1 M de glicina (pH 2,8) seguido por neutralização com 1 M de Tris (pH 8.0). Os contaminantes residuais foram identificados por espectrometria de massa.
Clonagem de apoL-I O gene da apoL-I foi amplificado através de utilizando ARN total de células HepG2 e o seguinte oligonucleótidos: 5'-TGTCCTCTGCGGTACCATGAGTGCACTTTTCCTTGGTGTGAGAG-3'; RT-PCR par de Apol-F: Apol-R: 16 5'-CCCTGCCCTGCTCGAGCAGTTCTTGGTCCGCCTGCAGAATC-3'. 0 fragmento de 1,15 kb foi digerido por Kpnl + XhoI e ligado com o plasmideo pcDNA3.l/V5-HisA (InVitrogen) digerido com Kpnl/Xhol. Foram produzidos vários mutantes através de mutagénese dirigida (Stratagene), seguida ou não por delecções/ligações para remover fragmentos especificos. A proteina associada com a resistência ao soro (SRA) contém três locais potenciais de N-glicosilação e de modo a determinar se a proteina foi glycosilada, foram fraccionados em Concanavalina A Sepharose extractos em detergente de Trypanosoma brucei rhodesiense. A proteina associada com a resistência ao soro (SRA) estava claramente presente no material aplicado na coluna mas não foi detectável nas fracções de escoamento, assim foi claro que a proteina associada com a resistência ao soro (SRA) está glicosilada (pistas 1, 2) . Interessante, após eluição com 0,3 M de metilmanósido foi apenas detectado um dupleto em torno de 30 kDa (pista 3) . Este dupleto de 30 kDa é também ligeiramente visível na pista 1 e é às vezes, mas não sempre, detectado ao sondar transferências de Western de extractos da forma da corrente sanguínea de Trypanosoma brucei rhodesiense com anticorpos anti-SRA. Este resulta, muito provavelmente, da clivagem endopeptídica perto do centro da proteína. O dupleto de 50 kDa estava ligado muito firmemente à lectina e não pode ser eluído mesmo com 0,6 M de metilmanósido (dados não mostrados). Contudo, tanto o de 50 kDa como o dupleto inferior foram libertados quando a resina foi fervida em tampão de amostra de SDS-PAGE (pista 4). O material de 30 kDa continha glicanos ligados a N uma vez que se verificou uma diminuição ligeira no tamanho após digestão com pNGaseF (comparar pistas 5 ,6) ou endoglicosidase H (comparar pistas 5, 7). A mesma diminuição foi observada quando comparando a mobilidade electroforética aparente do tipo selvagem e do mutante N86D/N231D/N320D da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) (Fig. 1, 17 comparar pistas 4-7) . Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram claramente que a proteína associada com a resistência ao soro (SRA) contêm N-glicanos do tipo de manana elevada, como é o caso do N-glicano do terminal C da glicoproteina de superfície variante (VSG). A verificação de que a região helicoidal α semelhante àquela envolvida na dimerização de VSGs foi requerida para resistência mediada por SRA, levantou a possibilidade de que a proteina associada com a resistência ao soro (SRA) neutralizou constituintes tripanoliticos do soro humano normal (NHS), através de um interacção enrolamento-enrolamento. Deste modo, submeteu-se o soro humano normal (NHS) a cromatografia de afinidade utilizando uma versão marcada com His no terminal N da proteina associada com a resistência ao soro (SRA) (aa 1-251) imobilizada em agarose de ácido Ni-nitrilotriacético (NTA). Foi retido, especificamente, um dupleto de 40 kDa pela proteina associada com a resistência ao soro (SRA) (Fig. 3a pistas 1, 2), e isto ocorreu em várias condições (pH 7,5 ou 5,8, 0 ou 0,6 M de NaCl) . Interessante, o dupleto não foi observado utilizando a proteina associada com a resistência ao soro (SRA) L61P/I62P, a versão de hélice interrompida que não confere resistência, enquanto que estava ainda presente com um mutante funcional de SRA (pistas 3, 4). Foram obtidos resultados semelhantes utilizando proteina associada com a resistência ao soro (SRA) covalentemente ligada a Sepharose. Neste caso, o dupleto foi o único componente ligado, para além de um contaminante de 65 kDa (pistas 5 , 6) . A espectrometria de massa identificou o dupleto de 40 kDa como apoL-I, uma apolipoproteina humana associado com HDL8"11 (a proteina de 65 kDa era albumina sérica) . Anticorpos anti-apoL-I confirmaram esta observação (pistas 7, 8). O gene apoL-I foi amplificado através de RT-PCR de ARN de células HepG2 e clonado num vector de expressão. Foram produzidos vários mutantes, concentrando na sequência para um péptido (aa 343-355) 18 que apresenta actividade de interrupção da membrana in vitro. Em particular, a requerente construiu duas versões truncadas que terminam respectivamente nos aa 342 e 355 e um mutante com propriedades comprometidas de destabilização de lípidos (L345Y/L352A/Y354L)12. Foram sintetizadas in vitro versões de [35S]-tipo selvagem e mutante da apoL-I e incubadas com His-SRA. A [35S]-apoL-I ligou-se à proteína associada com a resistência ao soro (SRA) como a proteína nativa (Fig. 3a pista 10). Não ocorreu ligação utilizando resinas de controlo apropriadas (nenhuma proteína ou proteína marcada com His irrelevante) . Significativamente, a [35 S]-apoL-I não se ligou a um dos mutantes de hélice interrompida da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) (L61P/I62P, pista 9), e mostrou uma ligação significativamente reduzida (50%) ao outro (I58Q/I62Q). A remoção do terminal C de apoL-I do aa 343 reduziu a ligação para 5% enquanto que o mutante de delecção de aa 356 e o mutante pontual L345Y/L352A/Y354L mostraram ligação de 24% e 67%, respectivamente.
Estes dados indicaram que a região do terminal C da apoL-I, que contêm uma hélice anfifílica8, é importante para a interacção com a proteína associada com a resistência ao soro (SRA) . A interacção SRA/apoL-I foi confirmada através doutra abordagem, uma vez que a incubação com apoL-I marcada com V5 conduziu a co-imunoprecipitação de proteína associada com a resistência ao soro (SPA) por anticorpos anti-V5 (Fig. 3b).
Além disso, um péptido sintético correspondente à hélice da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) (aa 54-65) pareceu interagir directamente com o péptido 345-355 de apoL-I uma vez que aboliu a actividade fusogénica lipossomal do último. Foi construído um modelo das hélices que interactuam nas da glicoproteína de superfície variante (VSG) (Fig. 3c, d) . Os parceiros estariam em configuração antiparalela (-88 e 19 -72 kcal/mol para a respectiva energia hidrofóbica do emparelhamento NC/CN e NC/NC, a ser comparado com -89 e -77 kcal/mol para a interacção entre as hélices A e B na glicoproteina de superfície variante (VSG) de referência MiTat 1.27 e na proteína associada com a resistência ao soro (SRA), respectivamente). O efeito fenotípico dos mutantes da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) poderia ser explicado através das diferenças de estabilidade do complexo, com -77 e -91 kcal/mol para a respectiva energia hidrofóbica dos complexos entre apoL-I e os mutantes de SRA I58Q/I62Q e V40Q/V43Q/L47Q, enquanto que em L61P/I62P a estrutura helicoidal é quebrada e assim não pode ser formado complexo estável. A requerente investigou o possível envolvimento da apoL-I na lise de tripanossoma. Verificou-se que a apoL-I é internalizada através da via endocítica (Fig. 2c), e co-localiza-se com a proteína associada com a resistência ao soro (SRA) no lisossoma (Fig. 2d, e) . 0 fraccionamento de soro humano normal (NHS) na proteína associada com a resistência ao soro (SRA)-Sepharose, que retém essencialmente apoL-I (Fig. 3a pistas 5 ,6), resultou reprodutivelmente na perda total da actividade lítica, como testado tanto in vitro (Fig. 4a) como em murganhos (ver Métodos). Este resultado não foi obtido com resinas desprovidas da proteína associada com a resistência ao soro (SRA), ou contendo L61P/I62P SRA (Fig. 4a). A actividade lítica foi também perdida quando soro humano normal (NHS) foi fraccionado em anti-apoL-I-Sepharose (Fig. 4a). Como esperado, esta resina reteve apoL-I, conjuntamente com várias quantidades de albumina sérica, apolipoproteína J, proteína amilóide P e transtiretina. Enquanto que a eluição da apoL-I da coluna de proteína associada com a resistência ao soro (SRA) requereu concentrações elevadas de detergentes, a apoL-I nativa foi facilmente eluída da anti-apoL-I Sepharose. A adição desta fracção a soros esgotados quer da proteína associada com a resistência ao soro (SRA)- ou 20 anti-apoL-I-Sepharose, restaurou completamente a sua actividade lítica (Fig. 4a) . Para se ter a certeza de que a apoL-I foi responsável por esta reconstituição, expressou-se His-apoL-I recombinante em células CHO e adicionou-se a proteína purificada ao soro humano normal (NHS) esgotado utilizando SRA-Sepharose. A adição de concentrações fisiológicas de apoL-I recombinante (em torno de 8 pg/mL)8, restaurou inteiramente a actividade lítica quer em Trypanosoma brucei brucei (transformantes AnTat 1.3A e pTSARib-0) ou Trypanosoma brucei rhodesiense sensível ao NHS ETat 1.2S, enquanto que um extracto equivalente de células CHO de controlo não (Fig. 4b, d) . Significativamente, foi obtido o mesmo efeito lítico da apoL-I se fosse utilizado soro fetal de vitela em vez de soro humano normal esgotado em apoL-I- (NHS) (Fig. 4b), e a lise não foi observada em célula resistentes ao soro humano normal (NHS) (quer em Trypanosoma brucei rhodesiense ETatl.2R ou Trypanosoma brucei brucei pTSARib-SRA) (Fig. 4c, d). Sob a mesmas condições, a apoL-I recombinante que carece do péptido do terminal C de 343-398, ainda induziu lise total de tripanossomas sensíveis ao soro humano normal (NHS), mas também afectou células resistentes ao soro humano normal (NHS) (Fig. 4b, c). Esse efeito por um mutante de apoL-I deficiente na interacção com a proteína associada com a resistência ao soro (SRA) confirmou que esta interacção está envolvida na resistência à lise.
Estes dados mostram que a apoL-I é o factor tripanolítico do soro humano normal (NHS) e que a proteína associada com a resistência ao soro (SRA) neutraliza a sua actividade, presumivelmente através de interacção enrolamento-enrolamento. Estudos anteriores identificaram o factor lítico de NHS como a proteína relacionada com a haptoglobina (Hpr), outra proteína sérica ligada a HDL, encontrada apenas nos primatas13, mas este ponto de vista foi debatido2'14. Além disso, a sugestão de que Hpr pode ser necessário para permitir a incorporação de partículas 21 líticas em tripanossomas15, é contradito por esta observação de que apoL-I mata tripanossomas em meio sem Hpr. 0 mecanismo de lise pela apoL-I não é compreendido. De facto, apesar da evidência de que a lise por soro humano normal (NHS) é devida à interrupção da membrana lisossomal1'16, estes dados mostram que não é requerido o péptido fusogénico 343-355 de apoL-I. A resistência à lise parece ser devida à inibição mediada por SRA do efeito litico da apoL-I dentro do lisossoma.
Interacção da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) com apoL-I sintetizada in vitro
Foi produzida [35S]-apoL-I através de tradução in vitro em lisados de reticulócito, utilizando a construção apoL-I-pcDNA3.1/V5-His ou derivados mutantes, como molde para a transcrição. Todos os polipéptidos de apoL continham um marcador V5 em grelha nos seus terminais C, e foram adicionalmente flanqueados ou não com um marcador His do terminal C, dependendo da inserção de um codão de terminação em grelha entre as duas sequências marcadoras. Para a interacção com His-SRA, foi utilizada a apoL-Ι apenas com o marcador V5. Neste caso, foram incubados 5 pL de lisado de reticulócito contendo [35S]-apoL-I durante 4 h a 4 °C com 15 pg de His-SRA em tampão A. Foi realizado tratamento adicional com esferas de Ni-NTA, como acima descrito. A apoL-Ι ligada/não ligada foi revelada através de autorradiografia e quantificada através de contagem de cintilações liquidas após precipitação em 10% de ácido tricloroacético. 22
Modelação
Foi construído um modelo 3D do complexo peptídico terminal C da apoL-I/terminal N da SRA utilizando os programas Swissmodel e Swiss-PDB Viewer19. A estrutura 3D do domínio enrolado (aa 7-112) do MiTat 1.2 VSG7 (código PDB: 2VSG) foi utilizado como molde. Assumiu-se que os fragmentos do terminal N de SRA e terminal C da apoL-I interagem como as duas hélices de VSG. A sequência 31-7 9 de SRA foi alinhada com os resíduos 7 a 54 de VSG madura (primeira hélice) , uma vez que o fragmento de SRA é o mais semelhante ao último domínio de VSG. A sequência 340-392 da apoL-I foi, deste modo, alinhada com os resíduos 59-112 da glicoproteína de superfície variante (VSG) (segunda hélice). Foram construídos emparelhamentos paralelos (N-C versus N-C) e anti-paralelos (N-C versus C-N) . As estruturas resultantes foram minimizadas utilizando Hyperchem 5.0 (Hypercube, Inc.), com o método do gradiente conjugado e campo de força AMBER. Foi mantida a estrutura de mais baixa energia. A qualidade estereoquímica do modelo foi verificada com Procheck20: 98% dos resíduos estavam nas regiões permitidas da representação de Ramachandran. As perspectivas moleculares foram desenhadas com o programa WinMGM21.
Dissociação e reconstituição da actividade tripanolitica do soro humano normal (NHS)
Foi adicionado soro não tratado, esgotado por afinidade e/ou suplementado ao meio HMI-9 contendo 5% de CHAPS, a uma concentração final de 25%. Foi utilizada apoL-I recombinante à concentração fisiológica (8 yg/mL). Após incubação de 2 h, o CHAPS foi removido através de extensa diálise. Os tripanossomas foram inoculados a 5.105 células/mL. Os resultados mostrados são representativos de, pelo menos, três experiências separadas, e 23 foram confirmados in vivo: quando injectadas directamente em murganhos NMRI, as misturas de incubação testadas como não liticas ou liticas conduziram a parasitemia detectável após dois dias ou, pelo menos, 10 dias, respectivamente.
Os tripanossomas do clone ETat 1.2R de Trypanosoma brucei rhodesiense foram purificados a partir da crosta inflamatória utilizando PSGSA (3 mM de NaH2P04, 50 mM de Na2HP04, 44 mM de NaCl, 100 mM de sacarose, 83 mM de glucose, 0,1 mM de adenosina, pH 8,0) . As células foram lavadas três vezes em PSGSA e depois ressuspensas a 109/mL em CST (150 mM de NaCl, 1% de CHAPS, 25 mM de Tris-HCl pH 7,5) contendo leupeptina (30 pg/mL), PMSF (0,2 mM) , E-64 (20 μΜ) , TLCK (50 μΜ) , aprotinina (10 pg/mL),
TPCK (50 μΜ) , pepstatina (10 pg/mL) e DNAse I (1 pg/mL) . O lisado foi incubado em gelo durante 1 h com agitação ocasional e depois centrifugado a 20.000 g durante 1 h a 4 °C. O sobrenadante foi dializado duas vezes contra 10 volumes de CST antes de aplicação em Concanavalina A-Sepharose (14 mg/mL de resina). Antes da aplicação, o sobrenadante foi ajustado a 0,1 mM de CaCl2 e aplicado (0,2 mL/min) a uma coluna de Con A (3 mL de volume de coluna) ambos equilibrados com CST. A coluna foi lavada com CST antes de se inverter o fluxo e eluir as glicoproteinas ligadas utilizando CST contendo quer uma mistura de quito-oligossacáridos que competem especificamente com a-metilmanósido (0,3 M) . Foram recolhidas fracções (0,65 mL) do principio ao fim e submetidas a análise de transferência de Western utilizando anticorpos anti-SRA.
As primeiras experiências foram concebidas para avaliar o papel de aparentes anomalias de sequência de SRA, nomeadamente a possivel falta do péptido de sinal do terminal N e a ausência de duas cisternas do terminal C, ambas as caracteristicas normalmente encontradas em VSGs. A adição da sequência para o péptido de sinal da glicoproteína de superfície variante (VSG) 24 (aa 1 a 14) à proteína associada com a resistência ao soro (SRA), ou inversamente removendo esta sequência da glicoproteína de superfície variante (VSG) , não mudou o seu efeito respectivo no fenótipo de células transfectadas, nomeadamente a resistência e sensibilidade ao soro humano normal (NHS) para a proteína associada com a resistência ao soro (SRA) e glicoproteína de superfície variante (VSG), respectivamente. Similarmente, a restauração das duas cisteínas do terminal C à proteína associada com a resistência ao soro (SRA), assim como removendo estas cisteínas da glicoproteína de superfície variante (VSG), não mudou o efeito destas proteínas na resistência, nomeadamente resistência e sensibilidade, respectivamente. As regiões que codificam o domínio do terminal N (aa 1-192 e 1-286 na proteína associada com a resistência ao soro (SRA) e glicoproteína de superfície variante (VSG), respectivamente) foram trocadas, produzindo proteínas quiméricas de glicoproteína de superfície variante (VSG)-SRA e de proteína associada com a resistência ao soro (SRA)-VSG. Apenas a construção SRA-VSG conduziu a resistência. Uma outra construção associando o domínio do terminal C da glicoproteína de superfície variante (VSG) a um fragmento mais longo da proteína associada com a resistência ao soro (SRA), até aa 286, também conduziu a resistência. Em conjunto estes dados indicaram que a extremidade do terminal C da proteína associada com a resistência ao soro (SRA), a jusante do aa 192, não é requerida para a resistência. Isto foi confirmado através da troca da segunda metade dos domínios do terminal C das duas proteínas (aa 348-410 e 436-490 na proteína associada com a resistência ao soro (SRA) e glicoproteína de superfície variante (VSG), respectivamente), que conservou as suas capacidades respectivas para conferirem resistência. A introdução da região exposta à superfície da VSG (aa 287 a 367) a jusante do resíduo 286 de SRA, restaurando, deste modo, um tamanho normal de glicoproteína de superfície variante (VSG) à proteína associada com a resistência ao soro (SRA), permitiu 25 ainda à última conferir resistência ao soro humano normal (NHS). Inversamente, a remoção desta região da VSG não permitiu conferir resistência a NHS. Foi também avaliado o possivel envolvimento da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI). A SRA foi mutada nos três codões que se prevêem ser essenciais para a transamidação do GPI para a proteína (DSS). Estes aminoácidos foram substituídos quer por três codões de terminação ou pelo tripleto HKR que não é suposto ser reconhecido pela maquinaria de transamidação. Assim, no caso anterior o precursor da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) deve carecer da cauda hidrofóbica do terminal C normalmente trocada com o GPI, enquanto que no último caso esta cauda hidrofóbica não deve ser permutável com o GPI. Ambas as construções génicas conferiram resistência total ao soro humano normal (NHS) , sugerindo fortemente que nem o GPI nem o ancoramento de GPI são essenciais para conferir resistência.
Actividade fusogénica da região do terminal C da apoL-I Materiais e Métodos Síntese peptídica. Os seguintes péptidos foram sintetizados utilizando química FMOC, purificados através de HPLC e verificados por espectrometria de massa: ApoL 345-355: LALDVVYLVYES; ApoL 340-362: PVSFFLALDVVYLVYESKHLHEG; SRA 54-65: ALAKINNLIKQ.
Ensaios de fusão lipossomal. Foram preparadas vesículas unilamelares grandes (LUV) através da técnica de extrusão de Hope et ai.24, utilizando um dispositivo de extrusão (Lipex Biomembranes Inc, Vancouver, Canadá). Resumidamente, películas secas de lípido que são misturas em peso de 26,6% de 26 fosfatidilcolina (PC), 26,6% de esfingomielina (SM), 26,6% de fosfatidiletanolamina (PE) e 20,2% de colesterol foram hidratadas durante 1 h a 37 °C. A suspensão resultante foi submetida a 5 ciclos sucessivos de congelamento e descongelamento, e posteriormente extrudida 10 vezes através de 2 filtros de policarbonato sobrepostos (tamanho de poro de 0,08 pm), sob uma pressão de azoto de 20 bar. A concentração das suspensões lipossomais foi determinada através de análise de fósforo25.
Experiências de mistura de lipidos. A mistura de membranas lipossomais foi seguida por medição do aumento da fluorescência de R18 (cloreto de octadecilrodamina), uma sonda solúvel lipidica, que ocorre após a fusão de lipossomas marcados e não marcados. Os lipossomas marcados foram obtidos através de incorporação de R18 na película seca de lípido a uma concentração de 6,3% do peso total de lípido. Os lipossomas marcados e não marcados foram misturados numa proporção em peso de 1:4, a uma concentração final de 50 μΜ em tampão. Dependendo das condições de pH, foram utilizados tampões diferentes: pH 7,4: 10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,01% de EDTA, 1 mM de NaN3; pH 6: 10 mM de acetato, 150 mM de NaCl, 0,01% de EDTA, 1 mM de NaN3; pH 4: 100 mM de ácido acético, 57 mM de acetato. Os
péptidos foram dissolvidos em trifluoroetanol (TFE). A percentagem final de TFE foi 1,6% em vol. Numa experiência de controlo, foi adicionado apenas o mesmo volume de TFE à mistura lipossomal. A fluorescência foi registada à temperatura ambiente (Xexc: 560 nm, Xem: 590 nm) num fluorímetro LS-50B da Perkin Elmer. O péptido 345-355 de apoL-I tem propriedades hidrofóbicas próximas daquelas de péptidos inclinados12'22. Foi demonstrado que os últimos têm propriedades de destabilização de lipidos e, deste modo, testou-se o péptido de apoL-I em lipossomas. Este 27 péptido aumentou claramente a fluorescência da sonda R18 lipofílica devido à sua diluição após a fusão lipídica. 0 processo foi dependente da dose e foi mais eficiente a uma proporção molar de péptido e lípido de 0,1. Sob as mesmas condições, 0 péptido 340-362 mais longo foi ainda mais fusogénico. 0 maior aumento de fluorescência foi observado a pH 4, mas foi também significativo a pH 6 ou 7,4 (dados não mostrados).
Quando as últimas condições foram testadas, a fusão ocorreu numa escala temporal mais longa (uma hora em vez de 15 minutos). Finalmente, a composição lipidica dos lipossomas não afectou significativamente as propriedades fusogénicas do péptido (dados não mostrados). A interacção com o péptido 54-65 da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) afectou claramente a fusão induzida pelo péptido 345-355 de apoL-I. Aumentando o tempo de pré-incubação dos péptidos, aumentou a inibição da fusão. Isto foi também verdadeiro para o péptido 340-362 de apoL-I (dados não mostrados) . A diminuição na fluorescência de R18 no seguimento da co-incubação da proteína associada com a resistência ao soro (SRA) e péptidos de apoL-I foi indicativo de uma interacção directa entre estas regiões, como já observado para outros péptidos23.
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Lisboa, 13 de Fevereiro de 2007 29
Claims (11)
- REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo um veiculo ou diluente farmacêutico adequado e uma quantidade suficiente de um elemento seleccionado do grupo consistindo da apolipoproteina L-I, um seu fragmento farmaceuticamente activo, um polinucleótido que codifica o referido polipéptido, uma célula transformada pelo referido polinucleótido ou um inibidor dirigido contra a referida apolipoproteina L-I.
- 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que a apolipoproteina L-I é a apolipoproteina L-I humana correspondente à sequência SEQ. ID. N°1 ou um polipéptido homólogo.
- 3. Composição farmacêutica da reivindicação 2, em que o fragmento da apolipoproteina L-I humana é seleccionada do grupo consistindo da sequência que começa do aminoácido 1 até ao aminoácido 342, a sequência que começa do aminoácido 343 ao aminoácido 398, a sequência que começa do aminoácido 340 até ao aminoácido 362 e a sequência que começa do aminoácido 356 até ao aminoácido 398 da sequência do polipéptido da apolipoproteina humana SEQ. ID. N° 1.
- 4. Composição farmacêutica da reivindicação 1, em que o inibidor é um anticorpo.
- 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor dirigido contra a apolipoproteina L-I é o polipéptido SRA de tripanossoma ou um seu fragmento 1 farmaceuticamente activo ou qualquer molécula que mimetiza a interacção entre o polipéptido SRA e a apolipoproteina L-I.
- 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, em que o fragmento farmaceuticamente activo do polipéptido SRA de Tripanossoma é o fragmento do referido polipéptido, que interage especificamente com a apolipoproteina L-I.
- 7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, em que a molécula que mimetiza a interacção entre o polipéptido SRA e a apolipoproteina L-I é um anticorpo ou uma sua porção hiper variável dirigido contra a apolipoproteina L-I, de um modo preferido, um anticorpo ou uma sua porção hiper variável dirigido contra o fragmento terminal da apolipoproteina L-I, que interage com o polipéptido SRA de Tripanossoma.
- 8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor é um anticorpo anti-idiotipico ou uma sua porção hiper variável dirigido contra o anticorpo anti-apolipoproteina L-I ou uma sua porção hiper variável.
- 9. Utilização da composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações anteriores 1 a 8, para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de doenças induzidas em mamíferos, incluindo o ser humano, por Tripanossoma, especialmente Tripanossoma africano.
- 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o Tripanossoma é seleccionado do grupo consistindo de Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma brucei rhodesiense e Trypanosoma gambiense. 2
- 11. Utilização de acordo com a reivindicação 9 ou 10 para o tratamento de Nagana induzida em bovideos por Trypanosoma brucei brucei. Lisboa, 13 de Fevereiro de 2007 3
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