PT1490392E - Quinóis esteroidais como pró-fármacos de antioxidantes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "QUINÓIS ESTEROIDAIS COMO PRÓ-FÁRMACOS DE ANTIOXIDANTES"

Antecedentes da Invenção A presente invenção diz respeito a pró-fármacos para terapia antioxidante. Em particular, a presente invenção diz respeito a quinóis esteroidais relacionados com estrogénio e seu uso como pró-fármacos para estrogénios de anel A e análogos de estrogénio.

As células de mamífero estão continuamente expostas a espécies de oxigénio reactivo (ROS=EOR) tais como peroxilo de lípido, oxoperoxinitrato, superóxido (O2·”), peróxido de hidrogénio (H2O2), radical hidroxilo (OH·) e oxigénio singuleto (¾) . In vivo, estes intermediários de oxigénio reactivo são gerados por células em resposta a metabolismo aeróbico, catabolismo de fármacos e outros xenobióticos, radiações ultravioleta e de raios X, e explosão respiratória de células fagocíticas (tais como glóbulos brancos) para matar células invasoras tais como as introduzidas através de feridas. 0 peróxido de hidrogénio, por exemplo, é produzido durante a respiração da maioria dos organismos vivos especialmente por células sujeitas a stresse ou lesionadas. 2 ΡΕ1490392

As EOR, quando presentes em excesso, podem ser prejudiciais para as células. Se o equilíbrio celular do nivel de espécies oxidantes (isto é, espécies de oxigénio reactivas e espécies de azoto reactivas) não é restaurado, são eliciados processos patológicos severos, incluindo danos no DNA, peroxidação de lipidos, perda de homeostase do cálcio intracelular e alteração na sinalização celular e caminhos metabólicos. O estresse oxidante causa danos celulares, resultando em alteração do estado redox (isto é, depleção de coenzimas de nucleótido e distúrbio de enzimas contendo sulfidrilo) e saturação e destruição da defesa antioxidante sistema de reparação de DNA.

Por exemplo, o peróxido de hidrogénio em excesso pode reagir dom o DNA para causar quebra da coluna vertebral, produzir mutações e alterar e libertar bases. Tal injúria bioquímica oxidante pode resultar na perda da integridade da membrana celular, actividade de enzima reduzida, mudanças na cinética do transporte, mudanças no conteúdo de lípido da membrana e fuga de iões potássio, aminoácidos e outro material celular.

Um outro exemplo da capacidade das EOR injuriarem células é a peroxidação de lípido, a qual envolve a degradação oxidante de lipidos insaturados. A peroxidação de lípido é altamente lesionadora para a estrutura e função da membrana e pode causar numerosos efeitos citopatológi-cos. Investigadores propõem que a aterosclerose e os seus efeitos mortais de ataque cardíaco e acidente vascular 3 ΡΕ1490392 cerebral se desenvolvem relacionando-se com a modificação por oxidação de lipoproteinas de baixa densidade (LDL) que carregam o colesterol no sangue. Teoriza-se que os radicais livres gerados pelas próprias células oxidam as LDL, as quais são captadas por células da íntima vascular iniciando a lesão aterosclerótica.

Por conseguinte, o stresse oxidante tem sido associado com uma variedade de doenças e desordens, incluindo o envelhecimento e morte celular neuronal (P. Jenner, "Oxidative damage in neurodegenerative disease" in Lancet, 344 (1994) 796-798). Por exemplo, o estresse oxidante está associado com a patologia de numerosas doenças e condições neurodegenerativas incluindo, mas sem constituir limitação, doença de Alzheimer, neuropatia periférica diabética, esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington e doença de Parkinson. O cérebro é um órgão especializado que concentra metais necessários para as funções neurológicas normais. Contudo, trauma, isquemia e muitos outros insultos de origem neuropatológica são conhecidos por libertarem iões metálicos de ligação a proteína tais como ferro a partir de células lesionadas. A libertação de iões metálicos aumenta o stresse oxidante no sistema nervoso central (SNC) pela promoção da geração das EOR.

Mostrou-se que os antioxidantes inibem os danos associados com EOR. Por exemplo, tem sido relatado que o 4 ΡΕ1490392 piruvato e outros alfa-cetoácidos reagem rapidamente e estequiometricamente com peróxido de hidrogénio para proteger células de efeitos citoliticos (0'Donnell-Tormey et ai., "Secretion of pyruvate. An antioxidant defense of mammalian cells" in J. Exp. Med., 165 (1987) 500-514). Verificou-se que o Seleginine, o qual pode actuar como antioxidante visto que inibe a desaminação oxidante, atrasa o começo da doença de Parkinson (Μ. B. H. Youdim e P. Riederer, "Understanding Parkinson's disease" in Scientific American, Janeiro (1997) 52-59). Foi demonstrado que a terapia de antioxidante abranda a velocidade do declínio motor precoce no curso da doença de Parkinson (C. E. Peyser et al., "Trial of d-alpha-tocopherol in Huntington's disease" in Am. J. Psychiatry, 152 (1995) 1771-1775). PROBUCOL {4,4'(1-metiletilideno)bis(tio)bis2,6-bis(1,1-di-metiletil) (Lorelco, Marion Merrell Dow)}, um antioxidante, é eficaz na redução da velocidade de restenose após angioplastia coronária de balão (J. C. Tardif et al., "Probucol and multivitamins in the prevention of restenosis after coronary angioplasty. Multivitamins and Probucol Study Group" in New Engl. J. Med., 337 (1997) 365-372.

Infelizmente, muitos antioxidantes são solúveis em gordura e restringidos na utilização devido à baixa solubilidade em água. Aqueles antioxidantes que são solúveis em água e menos restringidos no uso, tal como a vitamina C, podem actuar como um pró-oxidante, isto é, um promotor de oxidação na presença de um ião metálico, e têm a desvantagem de promover a peroxidação de lípido sob 5 ΡΕ1490392 certas condições. O ácido úrico é também solúvel em água, mas quando acumulado in vivo, pode gerar efeitos secundários desagradáveis tais como gota ou cálculos renais. O PROBUCAL demonstra pequena biodisponibilidade.

Os estrogénios têm sido reconhecidos como anti-oxidantes e agentes neuroprotectores potentes. Acredita-se que a sua acção antioxidante é devida à sua capacidade de eliminar radicais livres que causam a morte celular neuronal. Os estrogénios, tal como a vitamina E (a-toco-ferol) antioxidante andrógeno altamente potente, têm uma porção fenólica considerada uma caracteristica aprimorada no alcance da protecção contra o stresse oxidante. Os estudos, contudo, têm concluído que a potência do estro-génio estradiol como antioxidante fenólico na inibição da peroxidação de lípido induzida por ferro é maior do que a da vitamina E apesar da concentração global extremamente baixa dos estrogénios comparada com a da vitamina E. Além disso, a energia de dissociação da ligação (EDL=BDE) OH- de estradiol é maior do que a da vitamina E, o que implicará que a vitamina E é um desactivador mais forte de radicais oxi do que o estrogénio. A potência antioxidante é geralmente determinada não apenas pela reactividade química contra EOR, mas também pela mobilidade e/ou distribuição da molécula no microenvolvimento e do destino dos radicais derivados antioxidantes (isto é, a dinâmica da acção antioxidante). Por conseguinte, os estrogénios lipofílicos podem actuar in vivo como antioxidantes altamente localizados apesar dos seus pequenos níveis brutos devido à afi- 6 ΡΕ1490392 nidade de ligação à membrana e altas concentrações próximo dos locais de actividade. A terapia de substituição de estrogénio (ERT=TSE) tem sido associada a numerosos benefícios para a saúde, incluindo alivio de sintomas menopáusicos, protecção óssea e cardiovascular, redução da incidência da doença de Alzheimer, e melhoria das funções cognitivas, doença de Parkinson, e efeito de acidente vascular cerebral.

As diversas actividades dos estrogénios podem ser relacionadas com os seus efeitos citoprotectores e capacidades antioxidantes. O efeito neuroprotector dos estrogénios contra numerosos insultos tóxicos incluindo stresse oxidante tem sido extensivamente investigado in vivo e in vitro em vários tipos de células neuronais. Há evidência crescente que os estrogénios exercem o seu efeito neuroprotector contra o stresse oxidante pela supressão dos estímulos neurotóxicos através da sua directa actividade eliminadora de radicais.

Os estrogénios são degradados no tracto intestinal e rapidamente metabolizados pelo fígado. Especifi-camente, os estrogénios sofrem recirculação entero-hepática via sulfato e conjugação de glucoronide no fígado, secreção biliar de conjugados para o intestino, e hidrólise no intestino seguido por reabsorção. A concentração de estrogénio encontrada pelo fígado é geralmente quatro a cinco vezes maior do que os níveis de estrogénio no sangue 7 ΡΕ1490392 periférico (o "efeito de primeiro passo"). A administração de estrogénios orais apresenta altos níveis para o fígado e pode levar a um aumento indesejável na produção de certos factores de coagulação e substratos de renina pelo fígado. Por conseguinte, existe uma necessidade de agentes terapêuticos que sejam farmaceuticamente eficazes para aquelas regiões onde eles são requeridos.

Tem-se demonstrado que altas doses de estrogénio têm alcançado um efeito antioxidante in vitro. Foi demonstrado que a maior parte do estrogénio biologicamente activo, ΐνβ-estradiol, é um antioxidante potente e tem actividade neuroprotectora; contudo, o mecanismo de acção não é até agora claro. Tais doses, mesmo se eficazes em células in vivo, terá utilidade limitada no tratamento de condições associadas com stresse oxidante devido a problemas associados com toxicidade, incidência aumentada de algumas formas de cancro, e efeitos de efeminização nos homens. Por conseguinte, a utilidade de um tal método de tratamento é bastante limitada.

Numazawa et al., "Oxygenation of 2,4-Dibromo-estrogens with Nitric Acid: A New Synthesis of 19-Nor Steroids" in Chem. Pharm. Buli, 37 (8) (1989) 2058-2062) descrevem métodos para a síntese de 19-nor-esteróides a partir de 2,4-dibromoestrogénios. De acordo com Numazawa et al., 4-bromo-10p,17p-di-hidroxi-l,4-estradien-3-ona (7a) é um produto secundário obtido quando 2,4-dibromo-10p--acetoxi-1,4-estradieno-3,17-diona (2b) é hidro-desbromado ΡΕ1490392 usando ácido fórmico, paládio em carbono e trietilamina (ver p. 2059, Ia coluna). Numazawa et al. revelam meramente de passagem que não é claro porque 7a é sintetizado a partir de 2b quando se usa ácido fórmico; por outro lado, não há outra discussão a respeito de 7a porque parece que os 19-nor-esteróides não podem ser produzidos a partir de 7a. Numazawa et al. não descrevem o uso de 7a como pró-fármaco para a administração de compostos de estrogénio biologicamente activos para capturar espécies de oxigénio reactivo de radical livre.

Galdecki et al., "Structure of 2,4-Dibromo-10P,-17p-di-hidroxi-l,4-estradien-3-ona" in Acta Cryst., c43 (1987) 967-968) descrevem métodos para a síntese de 2,4-dibromo-10P,17p-di-hidroxi-l, 4-estradien-3-ona (composto I) bem como características estruturais específicas de composto I. Conforme acima notado, a reivindicação 1 já não relata a substituição de um halogéneo por Y ou Z. Galdecki et al. não descrevem um uso de tais quinóis como pró-fármacos para a administração de compostos de estrogénio biologicamente activos para a eliminação de átomos de oxigénio.

Kupfer et al., "Comparisons of hydroperoxide isomerase and monooxygenase activities of cytochrome P450 for conversions of allylic hydroperoxides and alcohols to epoxyalcohols and diols: probing substrate reorientation in the active site" in Biochemistry, 40 (38) (25 Set 2001) 11490-501) descrevem métodos para a identificação a regio e 9 ΡΕ1490392 a estereoquímica da actividade da citocromo P450-isomerase sobre ββ,10β,17p-tri-hidroxi-l,4-estradien-3-ona (também referida em Kupfer et al. como 6β-1ιίάηοχί-Ε20Η) . Kupfer et al. descrevem ainda E20H, também conhecido como 10β,17β-di-hidroxi-1,4-estradien-3-ona, como um produto secundário de estradiol quando reage com PIFA ou [bis(trifluoro-acetoxi)iodo]benzeno; a subsequente oxidação de E20H com citocromo P450-isomerase resulta em quantidades iguais de ββ-hidroxilação e 1,2-epoxidação (conforme entendido por um perito na técnica, esta reacção não envolve um mecanismo de separação O-O).

Ohe et al.f "Novel metabolic pathway of estrone and 17beta-estradiol catalyzed by cytochrome P-450" in Drug Metab. Dispôs., 28(2) (Fev 2000) 110-2) descrevem a síntese da formação de 10β, 17β-άί-ϊιίά^χί-1,4-estradien-3-ona a partir de estradiol por sistema de enzima (cytochrome P450) . Ohe et al. falham na descrição ou sugestão de quinóis e seus usos conforme reivindicado. Ohe et al. também não ensinam ou sugerem qualquer mecanismo de separação O-O.

Por conseguinte, existe uma necessidade de composições e métodos de administração de eliminadores de radical livre relacionados com estrogénio ou antioxidantes a tecidos demonstrando alterações em condições oxidantes. Em particular, existe uma necessidade de composições e métodos que possam proporcionar benefícios terapêuticos a indivíduos que sofrem de doenças neurodegenerativas asso- 10 ΡΕ1490392 ciadas com stresse oxidante. Além disso, existe uma necessidade de um composto de estrogénio terapeuticamente eficaz que retenha a sua actividade terapêutica sem quaisquer efeitos secundários relacionados com o sexo.

Breve Sumário da Invenção A presente invenção proporciona composições e métodos para a administração controlada de compostos anti-oxidantes a mamíferos. Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona quinóis esteroidais relacionados com estrogénio e seu uso como pró-fármacos para terapia de antioxidante para tratar e/ou prevenir várias desordens e doenças associadas com radicais livres e danos oxidantes.

Num aspecto da invenção presente, os quinóis esteroidais relacionados com estrogénio são administrados para tratar doenças neurológicas envolvendo stresse oxidante, tais como doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Noutros aspectos da invenção, os quinóis esteroidais relacionados com estrogénio são administrados para mitigar os efeitos adversos associados com a idade, acidente vascular cerebral e traumatismo.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona compostos inactivos que são convertidos in vivo em compostos terapêuticos biologicamente activos por transformação química ou enzimática. Os quinóis 11 ΡΕ1490392 relacionados com esteróides da presente invenção são vantajosos porque eles superam problemas associados com estabilidade, toxicidade, falta de especificidade e bio-disponibilidade limitada, os quais podem existir com a forma activa do esteróide. Os quinóis de acordo com a presente invenção são particularmente vantajosos como eliminadores de oxidantes. A invenção sujeita explora a identificação de um mecanismo pelo qual os estrogénios servem como eliminadores potentes de radicais hidroxilo através da captura de espécies de oxigénio reactivo perniciosas. Especificamente, numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona um quinol relacionado com estrogénio que é rapidamente convertido num composto de estrogénio biologicamente activo via redução catalisada por enzima que utiliza um agente de redução endógeno. O agente de redução endógeno pode ser, por exemplo, as formas reduzidas de nicotinamida-adenina-dinucleótido (NADH) ou de nicotinami-da-adenina-dinucleótido-fosfato (NADPH). Uma vantagem da reacção de conversão quimica é que o ciclo redox que se segue não gera espécies de oxigénio reactivo.

Numa forma de realização especifica da presente invenção proporciona quinóis esteroidais relacionados com estrogénio que estão relacionados com uma estrutura ΙΟβ-hi-droxiestra-1,4-dieno-3-ona. Tais quinóis são vantajosos porque eles podem ser convertidos in vivo num estrogénio de anel A fenólico progenitor, ou composto análogo de estro- 12 ΡΕ1490392 génio, aquando da exposição a um agente de redução incluindo, por exemplo, NADPH endógeno.

Com vantagem, a captura de um radical livre após redução in vivo à estrutura fenólica progenitora activa regenera os quinóis esteroidais relacionados com estrogénio da invenção sujeita. Isto é vantajoso porque outros pró--fármacos não são usualmente regenerados após a sua activação in vivo. Tendo a capacidade de se regenerarem, os efeitos terapêuticos benéficos dos quinóis são prolongados. A presente invenção também diz respeito a quinóis tendo propriedades físico-químicas melhoradas quando comparados a fenóis lipofílicos tais como estrogénios e análogos de estrogénio. Vantajosamente, os quinóis da invenção demonstram lipofilicidade diminuída. Para os compostos preferidos da invenção sujeita, existe uma diminuição de 10 vezes a 50 vezes no equivalente do coeficiente de partição n-octanol/água (P) com AlogP de 1,0 a 1,7.

Além disso, a presente invenção proporciona quinóis tendo distribuição melhorada no sistema nervoso central (SNC) quando comparado com fenóis lipofílicos tais como estrogénios e análogos de estrogénio. Além disso, os quinóis da invenção demonstram penetração aumentada através da barreira sangue-cérebro. A presente invenção também pertence a composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapêutica- 13 ΡΕ1490392 mente eficaz de um ou mais quinóis relacionados com este-róides em forma de dosagem farmacêutica para tratar e/ou prevenir doenças e desordens associadas com stresse oxidan-te. Usando quinóis relacionados com esteróides resulta na redução de picos e depressões caracteristicos da dosagem com um agente progenitor farmaceuticamente activo. Administrações de dose melhoradas resultam na redução de toxicidade comparadas com a administração de compostos de estro-génio activo. Além disso, composições farmacêuticas da presente invenção têm um índice terapêutico aumentado comparado com o esteróide progenitor activo.

Num outro aspecto, a presente invenção diz respeito a métodos terapêuticos para a administração controlada a um mamífero de uma quantidade eficaz de pelo menos um ou mais dos quinóis relacionados com esteróide aqui descritos para proporcionar terapia de antioxidante.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 - ilustra o mecanismo de activação dos quinóis esteroidais relacionados com estrogénio da presente invenção.

Figuras 2A, 2B e 2C - ilustram análises LC/APCI--MS, MS/MS e MS3 demonstrando ΙΟβ-hidroxiestra-l,4-dieno--3,17-diona (estrona-quinol) como produto da Reacção de Fenton a partir de estrona.

Figura 3 - ilustra esquemas preparatórios para a síntese de formas de pró-fármaco 4-substituído e 2-substi-tuído de compostos da presente invenção. 14 ΡΕ1490392

Figura 4 - ilustra esquemas preparatórios para a síntese de formas de pró-fármaco 2,4-dissubstituído de compostos da presente invenção.

Figura 5 - ilustra esquemas preparatórios para a síntese de formas de pró-fármaco 1,2,4-trissubstituído de compostos da presente invenção.

Figura 6 - ilustra traços cromatográficos para os analitos, estrona-quinol e estrona, e o padrão interno (etinil-estradiol) no experimento de controlo.

Figuras 7A e 7B - ilustram os traços cromatográficos para os analitos, estrona-quinol e estrona, e o padrão interno (etinil-estradiol) em NADPH, e as análises LC/APCI-MS/MS demonstrando a redução de estrona-quinol a estrona por NADPH, respectivamente.

Figuras 8A e 8B - ilustram as análises LC/APCI--MS/MS do extracto de acetato de etilo a partir do microdalisado cerebral in vivo obtido após perfusão de sonda a 1 pL/minuto com 10 picomole/pL de fluido cerebrospinal artificial de estrona-quinol.

Figura 9 - ilustra a viabilidade celular após exposição a stresse oxidante induzido por glutamato e tratamento com uma forma de realização da presente invenção quando comparado com o composto progenitor fenólico activo.

Figura 10 - ilustra o efeito de um quinol da presente invenção na lesão isquémica associada a reperfusão. 15 ΡΕ1490392

Revelação Detalhada da Invenção

De acordo com a presente invenção, certos compostos de quinol esteroidal relacionados com estrogénio são administrados para o tratamento e/ou prevenção de condições patológicas associadas com espécies de oxigénio reactivo (EOR). Os métodos e composições da invenção sujeita têm vantagem na identificação de um mecanismo pelo qual os estrogénios servem como eliminadores de hidroxilo potentes. Devido à capacidade dos compostos presentes serem convertidos nos compostos esteroidais relacionados com estrogénio activo via redução catalisada por enzima, a sua administração como pró-fármacos é bastante vantajosa.

Vantajosamente, a presente invenção proporciona formas de pró-fármaco de estrogénio e análogos de estrogénio que proporcionam efeitos farmacêuticos benéficos prolongados, propriedades fisico-quimicas melhoradas, distribuição em tecido melhoradas, biodisponibilidade aumentada, resistência a inactivação metabólica e toxicidade reduzida, em comparação com estrogénios e análogos de estrogénio fenólicos, lipofilicos. Os compostos pró-fármacos de acordo com a presente invenção são eliminadores de radicais únicos e vantajosos devido à sua capacidade para se regenerarem após activação redutora in vivo numa estrutura de fenol esteroidal activa.

Em contraste com a estrutura de catecol dos produtos de estrogénio fenólico bem conhecidos, os quinóis 16 ΡΕ1490392 esteroidais sujeitos conferem uma natureza não aromática ao anel A esteroidal. Por conseguinte, a bioquímica dos quinóis esteroidais de acordo com a invenção sujeita é substancialmente diferente da dos estrogénios de catecol para proporcionarem propriedades benéficas melhoradas. Numa forma de realização particular, os quinóis esteroidais são não aromáticos até à introdução num processo de aromati-zação redutora química ou enzimática para proporcionarem uma porção fenólica e neuroprotecção. Por conseguinte, o composto de quinol esteroidal serve como pró-fármaco para estrogénios neuroprotectores activos.

Numa forma de realização preferida, a presente invenção proporciona compostos de quinol esteroidal da fórmula:

em que R é H, alquilo, cicloalquilo, arilo, heterociclo, heteroarilo, alquilamino, hidroxialquilo, alcoxialquilo ou alquilarilo; X é hidrogénio, isopropilo, alquilo, alcenilo, alci-nilo, carbociclo, cicloalquilo, arilo, heterociclo, heteroarilo, alquilamino, hidroxialquilo, alcoxialquilo ou um hidrocarboneto linear ou ramificado de 1-15 átomos de carbono de comprimento, que pode facultativamente incluir um ou mais heteroátomos na cadeia; 17 ΡΕ1490392 Y é isopropilo, alquilo, alcenilo, alcinilo, carboci-clo, cicloalquilo, arilo, heterociclo, heteroarilo, alquil-amino, hidroxialquilo, alcoxialquilo ou um hidrocarboneto linear ou ramificado de 1-15 átomos de carbono de comprimento, que pode facultativamente incluir um ou mais hete-roátomos na cadeia; e Z é isopropilo, alquilo, alcenilo, alcinilo, carboci-clo, cicloalquilo, arilo, heterociclo, heteroarilo, alquil-amino, hidroxialquilo, alcoxialquilo ou um hidrocarboneto linear ou ramificado de 1-15 átomos de carbono de comprimento, que pode facultativamente incluir um ou mais hetero-átomos na cadeia.

Numa forma de realização, R é uma cadeia de alquilo C1-C20 linear ou ramificada e X é hidrogénio. O termo "composto de estrogénio", conforme aqui usado, refere-se a estrogénio; metabolitos de estrogénio; análogos, antagonistas ou moduladores de estrogénio; e compostos com atributos que são categorizados como similar ou análogo a estrogénio, metabolitos de estrogénio, ou análogos, antagonistas ou moduladores de estrogénio. 0 termo "paciente", conforme aqui usado, descreve um animal, incluindo mamíferos, ao qual é proporcionado tratamento com as composições de acordo com a presente invenção. As espécies de mamíferos que beneficiam dos métodos de tratamento revelados incluem, mas sem constituir limitação, macacos antropomorfos, chimpanzés, orangotangos, 18 ΡΕ1490392 humanos, macacos com cauda; e animais domesticados (e. g., pequenos animais de companhia) tais como cães, gatos, porquinhos-da-índia e cricetos.

Conforma aqui usado, o termo "pró-fármaco" indica uma molécula que é incapaz de exercer a actividade farmacológica do composto activo. 0 composto activo exercerá os seus efeitos terapêuticos após ser bioactivado por um agente de redução.

Uma variedade de agentes de redução endógenos é conhecida e pode ser usada para alcançar a bioactivação preferencial do composto activo no interior do corpo. Os agentes de redução candidatos que poderão ser usados para activar os pró-fármacos de acordo com a presente invenção incluem NADH ou NADPH. Como resultado da bioactivação, os pró-fármacos de quinol são convertidos num estrogénio ou análogo de estrogénio fenólico activo. Os quinóis esteroi-dais relacionados com estrogénio da invenção sujeita são vantajosos como pró-fármacos porque, uma vez reduzidos a um composto activo por um agente de redução, o composto activo é prontamente reoxidado de volta ao quinol esteroidal relacionado com estrogénio por um oxidante, tal como um radical de hidroxilo. Este processo é mostrado na Figura 1. Vantajosamente, a capacidade de regenerar os compostos pró-fármaco da invenção após bioactivação facilita o prolongamento dos efeitos farmacológicos benéficos.

Os compostos da invenção podem ser usados com 19 ΡΕ1490392 agentes de suporte, aditivos ou excipientes farmaceutica-mente aceitáveis, cujas proporções são determinadas pela solubilidade e natureza química do composto, caminho de administração escolhido e prática médica padrão. Numa forma de realização da presente invenção, as composições farmacêuticas incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um ou mais dos compostos da invenção em forma de dosagem farmacêutica para tratar e/ou prevenir doenças e desordens associadas com stresse oxidante. A quantidade terapeuticamente eficaz variará com a condição a ser tratada, a sua severidade, o regime de tratamento a ser empregue, a farmacocinética do agente usado, bem como do paciente tratado.

Os compostos pró-fármacos da invenção sujeita podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos para a preparação de composições farmaceuticamente úteis. As formulações são descritas em numerosas fontes, as quais são bem conhecidas e prontamente disponíveis para o perito na técnica. Por exemplo, E. W. Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 19a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, 1995., descreve formulações que podem ser usadas em conexão com a invenção sujeita. As formulações adequadas para administração parentérica incluem, por exemplo, soluções de injecção estéril aquosa, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacterios-táticos e solutos, que tornam a formulação isotónica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas, as quais incluem agentes de 20 ΡΕ1490392 suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de dose múltipla, por exemplo ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em condição de secas por congelação (liofilizadas) requerendo apenas a condição o agente de suporte liquido estéril, por exemplo, água para injecções, antes do uso. Soluções e suspensões para injecção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pó, grânulos, comprimidos, etc., estéreis. Deverá ser compreendido que para além dos ingredientes acima particularmente mencionados, as formulações da invenção sujeita podem incluir outros agentes convencionais na técnica tendo em vista o tipo de formulação em questão.

Os tecidos que são protegidos pelo uso dos compostos de quinol esteroidal relacionados com estrogénio como pró-fármacos podem ser de crianças, adultos e fetos e incluem, mas sem constituir limitação, células do tronco, sangue e todos os seus componentes, incluindo eritrócitos, leucócitos, plaquetas e soro, tecido nervoso central, incluindo tecido do cérebro e medula espinal, neurónios e neuróglia; tecido nervoso periférico, incluindo gânglios, glândula pituitária posterior, medula adrenal, e pineal; tecido conjuntivo, pele, ligamentos, tendões e fibro-blastos; tecido muscular, incluindo esquelético, tecidos lisos e cardíacos ou suas células; tecido endócrino, incluindo glândula pituitária anterior, glândula tiróide, glândula paratiróide, córtex adrenal, pâncreas e suas subpartes, testículos, ovários, placenta e as células 21 ΡΕ1490392 endócrinas que são uma parte de cada um destes tecidos; vasos sanguíneos, incluindo artérias, veias, capilares e as células provenientes de tais vasos; tecido do pulmão; tecido do coração e órgão completo; válvulas do coração; fígado; rim; intestinos; osso, incluindo osteócitos, osteo-blastos e osteoclastos; tecido imune, incluindo células do sangue, medula óssea e baço; olhos e suas partes; tecidos do tracto reprodutivo; ou tecido do tracto urinário.

Exemplos de doenças, desordens e condições degenerativas que podem ser tratadas com os compostos de quinol esteroidais relacionados com estrogénio da invenção sujeita incluem: doenças e condições neurológicas e neurodegenera-tivas tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (ELA), esclerose múltipla, neuropatia periférica, herpes-zóster, acidente vascular cerebral, lesão traumática e várias consequências neurológicas e outras degenerativas de cirurgias neurológicas e do peito, esquizofrenia, epilepsia, síndrome de Down e síndro-me de Turner; condições degenerativas associadas com SIDA; várias desordens ósseas incluindo osteoporose, osteomie-lite, doença óssea isquémica, displasia fibrosa, raquitismo, síndrone de Cushing e osteoartrite; outros tipos de artrite e condições de degeneração de tecido conjuntivo e cartilagem incluindo artrite reumatóide, psoriática e nfecciosa; várias doenças infecciosas; desordens de perda muscular ais como distofia muscular; deordens da pele tai como drmatite, eczema psoríase e envelhecimentoda pele; desordens degenerativas do olho incluindo degeneração 22 ΡΕ1490392 macular e degeneração da retina; desordens do ouvido tais como otsclerose; cura de ferimento enfraquecida; várias doenças e condições cardiovasculares incluindo acidente vascular cerebral, isquemia cardíaca, enfarte do miocárdio, insuficiência cardíaca aguda ou crónica, disritmias cardíacas, fibrilação artrial, taquicardia paroxísmica, fibrilação ventricular e insuficiência cardíaca congestiva; desordens circulatórias incluindo aterosclerose; esclerose arterial e doença vascular periférica, diabetes (Tipo I ou Tipo II); várias doenças do pulmão, desordens e doenças incluindo cancro do pulmão, pneumonia, doença pulmonar obstrutiva crónica (bronquite, enfisema, asma); desordens do tracto gastrointestinal tais como úlceras e hérnia; condições dentais tais como parodontite; doenças do fígado incluindo hepatite e cirrose; indisposições pancreáticas incluindo pancreatite aguda; doenças do rim tais como insuficiência renal aguda e glomerulonefrite; e várias doenças do sangue tais como amiloidose vascular, aneurismas, anemia, hemorragia, drepanocitose, doença auto-imune, síndrome da fragmentação do glóbulo vermelho, neutropenia, leucopenia, afasia da medula óssea, pancitopenia, tromboci-topenia e hemofilia. A lista precedente de doenças e condições que são tratáveis de acordo com a invenção sujeita não tem a intenção de ser exaustiva ou limitadora mas é apresentada na forma de exemplos de tais doenças e condições degenerativas.

Composições farmacêuticas baseadas nestes compostos de quinol esteroidal relacionados com estrogénio podem 23 ΡΕ1490392 ser formuladas por uma variedade de vias de administração, incluindo, por exemplo, formas oralmente administráveis tais como comprimidos, cápsulas ou semelhantes, ou via parentérica, intravenosa, intramuscular, transdérmica, bucal, subcutânea, por supositório ou outra via. Em certas formas de dosagem farmacêuticas, alguns dos presentes compostos podem ser mais apropriados que outros compostos, dependendo da via de administração e do sitio alvo no interior do paciente.

Os métodos terapêuticos conforme descritos na presente invenção incluem a administração controlada a um paciente de uma quantidade eficaz de pelo menos um ou mais dos compostos conforme acima indicados para proporcionar uma terapia antioxidante. A administração a um paciente pode variar desde continua (gotejamento intravenoso) a intramuscular, até várias administrações orais por dia (por exemplo, Q.I.D.) e pode incluir administração parentérica, incluindo intravenosa e intramuscular, oral, tópica, subcutânea, transdérmica (a qual pode incluir um agente de penetração) , bucal e por supositório, de entre outros caminhos de administração.

Para preparar as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de um ou mais dos compostos de acordo com a presente invenção é preferivelmente intimamente misturada com um agente de suporte farmaceuticamente aceitável facultativo de acordo com as técnicas de composição 24 ΡΕ1490392 farmacêutica convencionais para produzir uma dose. Um agente de suporte pode tomar uma variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para a administração, e. g., oral ou parentérica.

Para formulações parentéricas, o agente de suporte pode compreender água ou solução de cloreto de sódio aquoso estéreis em combinação com outros ingredientes que ajudam a dispersão, tais como etanol e outros solventes farmaceuticamente aceitáveis. Certamente, onde as soluções são para serem usadas e mantidas estéreis, as composições e agentes de suporte devem também ser esterilizados. As suspensões injectáveis também podem ser preparadas, caso em que agentes de suporte e agentes de suspensão líquidos apropriados e semelhantes podem ser empregues.

Na preparação de composições farmacêuticas em forma de dosagem oral de acordo com a presente invenção, pode ser usado qualquer um ou mais dos meios farmacêuticos usuais. Por conseguinte, para preparações orais liquidas tais como suspensões, elixires e soluções, agentes de suporte e aditivos adequados incluindo água, glicóis, óleos, álcoois, agentes de aromatização, conservantes, agentes de coloração e semelhantes também podem ser usados. Para preparações orais sólidas tais como pós, comprimidos, cápsulas, e para preparações sólidas tais como supositórios, agentes de suporte e aditivos adequados incluindo amidos, agentes de suporte de açúcar, tais como dextrose, manitol, lactose e agentes de suporte relacionados, 25 ΡΕ1490392 diluentes, agentes de granulação, lubrificantes, ligantes, agentes de desintegração e semelhantes podem ser usados. Se desejado, comprimidos ou cápsulas podem ser de revestimento entérico ou de libertação sustentada por técnicas padrão.

Os quinóis esteroidais relacionados com estrogé-nio da presente invenção podem ser preparados usando reagentes e reacções conhecidos, incluindo por exemplo, oxidação de estradiol ou estrona com tálio, trifluoro-acetato, tetraacetato de chumbo, ácido para-nitroperoxi-benzóico, fotooxigenação ou semelhantes. Os seguintes Exemplos 1-10 são exemplares e proporcionados para fins de ilustração e não têm a intenção de serem limitantes.

Os exemplos 1-6 são esquemas preparatórios para compostos pró-fármacos de acordo com a presente invenção.

Exemplo 1 Síntese de Estrona-Quinol por Transformação Fenol-a-Quinol

Conforme entendido por um perito na técnica, ΙΟβ-hidroxiestra-l,4-dieno-3,17-diona (estrona-quinol) pode ser preparada por sintetização usando uma transformação fenol-a-quinol em recipiente único. O método de síntese utiliza ácido meta-cloroperbenzóico (m-CPBA) como oxidante, peróxido de dibenzoílo [(PheCO^Ct] como iniciador de radical e irradiação de luz visível que, em solvente apró-tico refluxante, produz excelentes rendimentos dos quinóis da presente invenção. 26 ΡΕ1490392 A título de exemplo, Milic et al., Tetrahedron Letters, 37:21 (1996) 3765-3768, revela um método de recipiente único para sintetizar estrona-quinol. A oxidação de estrona para sintetizar ΙΟβ-hidroxiestra-l,4-dieno-3,17-diona é realizada por aquecimento de uma solução agitada de estrona (10,00 g, 37,0 mmol), ácido meta-cloro-perbenzóico (m-CPBA) (22,53 g; 111,0 mmol; Jasen Chimica 85%) e (PheCO)202 (900 mg; 3,70 mmol) numa mistura de 2 L de CCl4/Me2CO (4/1) a refluxar durante 3 horas enquanto irradiada com uma lâmpada de tungsténio de 60 W. Após evaporação do solvente, a extracção é realizada com CHCI3 (3 x 200 mL) , lavando com NaHCC>3 (2 x 100 mL) e H20 (100 mL) , e secando sobre Na2S04 anidro. O resíduo é em seguida cromatografado em coluna de SÍO2. A eluição pode ser realizada com PhMe/EtOAc (1/1 e 7/3, respectivamente) e a cristalização a partir de benzeno produz 5,19 g (49%) de estrona-quinol na forma de agulhas incolores.

Os dados respeitantes aos estronas-quinóis resultantes, conforme observados por Milic et al. são como se segue: p.f. = 219-221 °C (benzeno); Lit.4 = 215-217 °C; [ot] 24,0 546 = +62, [a]24,o 578 = +68 (c=l, 32, chi.); UV: λ MeOH máx = 229 nm (15500); IR (KBr): 3359x, 2941m, 1736s 1664s, 1622s, 1601m cm-1; 1H-NMR (250 MHz, DMSO-d6) : 7,13 (d, J= 10,4 Hz, H-C(1)), 6,07 (dd, J= 10,4, 2,4 Hz, H-C(2)), 5,92 (irreg. T, J4,2 = 2,4, J4f6β = 1,2 Hz, H-C(4)), 5,67 (s, H-o, intermutável com 27 ΡΕ1490392 D20), 2, 67 (tdd, J = 15,2, 6,4, 1,2 Hz, Hp-C (6)) , 1,97-1,83 (m, Hp-C (8) e Hp-C (11) - a partir de NOE DIFF. Spectrum), 1,30-1,18 (m, Ha-C(ll)), 0,97 (s, H3C-C(13)); 13C-NMR (62,9 MHz, DMSO-d6) : 220, 33 (C (17)), 185,53 (C (3)), 165,09 (C (5)), 150,25 (C (1)), 128,30 (C(2)), 123,09 (C (4)), 70,10 (C(10)), 51,18 (C (0)), 50,10 (C(14)), 47,75 (C (13)), 35, 62 (C(16)) , 34,58 (C(8)), 32,19 (C(7)), 31,80 (C (6)), 31,03 (C (11)), 22,00 (C (12)), 21,90 (C (15)), 13,73 (c (18) ) ; MS (EI, m/z): 286 (M+, 84), 268 (M+ - H20, 39), 150 (68), 145(100), 124(75), 107(50), 91(50), 79(54), 55(60);

Anál. calca para C18H22O3 (286, 37): C-75,50, H-7,74; encontrado: C-75,41, H-7,76.

Os pontos de fusão foram determinados num aparelho Boetius PMHD e não foram corrigidos. As rotações especificas foram medidas em polarimetros Perkin-Elmer 141 MC e Karl Zeiss Polomat A em dadas temperaturas. Os espectros IR (ou IV) foram registados num espectrofotómetro FT-IR 1725X. Os espectros UV foram registados num espectrofotómetro Beckman DU-420. Os espectros de 1H-NMR (ou RMN) foram registados em espectrómetros Bruker AM-600, Bruker AM-250 e Varian Gemini-200 (em 600, 250 e 200 MHz, respectivamente). Os espectros 2D e 13C-NMR foram registados num espectrómetro Bruker AC-250 (em 62,9 e 250 MHz) no solvente indicado usando TMS como padrão interno. Os desvios químicos são expressos em valores ppm (δ) e as constante de acoplamento (J) em Hz. Os espectros de massa foram tomados num espectrómetro Finnigan-MAT 8230. A menção 28 ΡΕ1490392 de instrumentos específicos, regulações dos instrumentos e meios cromatográficos são para propósitos de exemplo e não pretendem ser limitantes.

Exemplo 2 Síntese de Estrona a Quinol Usando o Modelo de Reacção de

Fenton ΙΟβ-Hidroxiestra-l,4-dieno-3,17-diona (estrona--quinol) também pode ser sintetizada a partir de estrona usando o modelo de Reacção de Fenton. Conforme entendido pelos peritos na técnica, na reacção de Fenton, a velocidade para produzir os produtos hidroxilados de estrona, incluindo um quinol de ΙΟβ-hidroxiestra-l,4-dieno-3,17-diona da invenção sujeita, pode ser influenciada por vários parâmetros incluindo concentrações do substrato, Fe(II) e H2C>2, e pH do meio. Um mL a pH 3,0 de ácido sulfúrico contendo Fe(II) 300 μΜ, H202 1,3 mM e estrona 100 μΜ foram incubados a 37 °C durante 10 minutos e em seguida extraídos com diclorometano. (SUPELCO) com

Para avaliar os produtos de reacção de estrona sob as condições aplicadas acima, foram conduzidas análises de HPLC e LC/MS, incluindo espectros de ião produto MS/MS e MS/MS/MS (MS3) . A camada orgânica extraída foi lavada para a libertar de ácido com água destilada, seca sobre Na2S04 e o solvente foi evaporado sob corrente de azoto. A separação por LC foi realizada usando coluna de inversão de fases de 5 cm x 2,1 mm d.i. Discovery HS C-18 " 29 ΡΕ1490392 0,25 mL/min de água:metanol:2-propanol:ácido acético:diclo-rometano (53:35:5:5:2, v/v) como fase móvel. O resíduo amostra removido para análise foi dissolvido em 1 mL de fase móvel, e 5 pL da solução foram injectados para análise. Os espectros de massa foram registados por um instrumento de armadilha de ião quádruplo (LCQ, Finnigan MAT) usando APCI de ião positivo e modo de aquisição dependente de dados para registar espectros de massa de varrimento completo, e varrimentos de ião produto MS/MS e MS3 após dissociação induzida por colisão (CDI) com hélio como gás alvo.

Ainda que nenhumas catecol-estronas (2-OH-E1 e 4-OH-El) pudessem ser detectadas, as análises de HPLC e LC/MS e os espectros de ião produto MS/MS e MS3 revelaram que estrona-quinol foi o principal produto de reacção, conforme mostrado nas Figuras 2A, 2B e 2C. Em particular, a co-eluição dos resultados para a monitorização de ião seleccionado (SIM; m/z 287 extraído dos espectros de massa de varrimento completo registados com sucesso), o espectro de massa APCI completo para o pico cromatográfico (tempo de retenção (tR) = 1,3 minutos), o varrimento de produto ião MS/MS (pico com m/z 287 isolado como ião precursor) e o varrimento de produto ião MS3 (pico com m/z 269) com um composto de referência sintético de estrona-quinol demonstraram inequivocamente que o produto de reacção era ΙΟβ-hidroxiestra-l,4-dieno-3,17-diona (estrona-quinol).

Estudos cinéticos demonstraram ainda que a 30 ΡΕ1490392 oxidação de estrona a estrona-quinol prosseguiu rapidamente sob as condições aplicadas acima. Os estudos cinéticos revelaram que a constante de velocidade de segunda ordem (k) da reacção foi cerca de 20 M_1 ·s_1 e a meia-vida da estrona e a velocidade inicial foram aproximadamente 2,5 minutos e 1 μΜ/s, respectivamente. Outro estudo dos produtos da reacção de Fenton formados a partir de estrona verificaram que o produto estrona-quinol não sofre ulterior oxidação (isto é, a um epóxido) e que as catecol estronas detectáveis permanecem relativamente estáveis sob as condições de Fenton.

Exemplo 3 Síntese de 17β-ΟΗ Alquilado de Quinóis Esteroidais Relacionados com Estrogénio

Para alquilar o grupo 17-OH dos quinóis esteroidais sujeitos, um quinol esteroidal é inicialmente sintetizado usando ou a transformação fenol-a-quinol em recipiente único ou o Modelo de Reacção de Fenton. O 3-OH do composto quinol esteroidal resultante é protegido na forma de éter benzilico (Bz) . O grupo 17-OH do composto quinol esteroidal de 3-benzilo é alquilado com um haleto de alquilo na presença de hidreto de sódio em N,N-dimetil-formamida (DMF). A remoção subsequente do grupo de protec-ção 3-benzilo pode ser realizada usando métodos conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, o grupo de protecção 3-benzilo pode ser removido usando um hidrogenador de Parr com paládio em carvão vegetal (Pd/C) como catalisador em ácido acético glacial. 31 ΡΕ1490392

Exemplo 4 Síntese de Quinóis Esteroidais Relacionados com Estrogénio 2-Substituídos e 4-Substituídos A Figura 3 ilustra a síntese de quinóis relacionados com estrogénio 4-substituídos ou 2-substituídos de acordo com a invenção sujeita. Como com a estrona-quinol, o primeiro passo na síntese de compostos de quinol esteroidal relacionado com estrogénio 2-substituído ou 4-substituído inclui uma transformação fenol-a-quinol em recipiente único. A título de exemplo, o passo inicial na síntese da 10p-hidroxiestra-4p,5p-epoxiestr-l-eno-3,17-diona inclui a agitação de uma solução de estrona, m-CPBA e (BzO)2 numa mistura de CH2Cl2/Me2CO (4/1) que é aquecida em refluxo durante 24 horas enquanto irradiada com uma lâmpada de tungsténio de 60 W (não mostrada). O composto quinol esteroidal relacionado com estrogénio resultante é em seguida sujeito a um composto modelo de hidroperóxido de lípido tal como hidroperóxido de terc-butilo (tBuOOH) e acetilace-tonato de vanadilo [VO(acac)2] . Um nucleófilo (e. g., brometo de sódio ou metilato de lítio) de qualquer um dos 2 ou 4-substituintes é adicionado aos compostos de epóxido resultantes. A adição de um nucleófilo resulta na remoção espontânea de H20 para proporcionar um quinol esteroidal 2-substituído ou 4-substituído de acordo com a presente invenção. 32 ΡΕ1490392

Exemplo 5 Síntese de Quinóis Esteroidais Relacionados com Estrogénio 2,4-Dissubstituídos A síntese de quinóis relacionados com estrogénio 2,4-dissubstituídos é ilustrada na Figura 4. Como com a síntese dos 2-substituídos ou 4-substituídos, o primeiro passo na síntese de compostos de quinol esteroidal relacionado com estrogénio 2, 4-substituídos inclui uma transformação fenol-a-quinol em recipiente único. O quinol esteroidal relacionado com estrogénio é em seguida sujeito a um composto modelo de hidroperóxido de lípido tal como hidroperóxido de terc-butilo (tBuOOH) e acetilacetonato de vanadilo [VO (acac)2] . Aos compostos epóxidos resultantes, um nucleófilo (e. g., brometo de sódio ou metilato de lítio) é introduzido para proporcionar um 2- ou 4-substi-tuinte. A adição de um nucleófilo resulta na remoção espontânea de H2O para proporcionar o quinol esteroidal 2-substituído ou 4-substituído de acordo com a presente invenção. O quinol esteroidal 2-substituído ou 4-substituído é em seguida sujeito a zinco em ácido acético para fazer os compostos fenólicos. Os compostos fenólicos são em seguida sujeitos a uma transformação fenol-a-quinol em recipiente único. Por analogia, o composto esteroidal relacionado com estrogénio 2-substituído ou 4-substituído fenólico é sujeito a um composto modelo de hidroperóxido de lípido tal como hidroperóxido de terc-butilo (tBuOOH) e acetilacetonato de vanadilo [VO(acac)2] . Aos compostos 33 ΡΕ1490392 epóxidos resultantes, um nucleófilo (e. g., brometo de sódio ou metilato de lítio) é introduzido para proporcionar um 2- ou 4-substituinte. A adição de um nucleófilo resulta na remoção espontânea de H2O para proporcionar um composto esteroidal 2,4-dissubstituído. 0 composto esteroidal 2,4-dissubstituido é em seguida agitado com m-CPBA e (PhCO)2C>2 em CCl4/Me2CO até refluxar enquanto é irradiado com uma lâmpada de tungsténio de 60 W para proporcionar um quinol esteroidal 2,4-dissubstituido de acordo com a presente invenção.

Exemplo 6 Síntese de Quinóis Esteroidais Relacionados com Estrogénio 1,2,4-Trissubstituídos A síntese de quinóis esteroidais 1,2,4-trissubs-tituídos é ilustrada na Figura 5. Como com a síntese dos 2.4- dissubstituídos, o primeiro passo na síntese de compostos de quinol esteroidal relacionado com estrogénio 2.4- substituídos inclui uma transformação fenol-a-quinol em recipiente único de um composto de estrogénio 1-substi-tuído. O quinol esteroidal relacionado com estrogénio 1-substituído é em seguida sujeito a um composto modelo de hidroperóxido de lípido tal como hidroperóxido de terc-butilo (tBuOOH) e acetilacetonato de vanadilo [VO(acac)2]· Aos compostos epóxidos resultantes, um nucleófilo (e. g., brometo de sódio ou metilato de lítio) é introduzido para proporcionar um 2- ou 4-substituinte. A adição de um nucleófilo resulta na remoção espontânea de H2O para 34 ΡΕ1490392 proporcionar um quinol esteroidal 1,2-dissubstituído ou 1.4- dissubstituído de acordo com a presente invenção. O quinol esteroidal 1,2-dissubstituído ou 1,4-dissubstituído é em seguida sujeito a zinco em ácido acético para fazer os compostos fenólicos. Os compostos fenólicos são em seguida sujeitos a uma transformação fenol-a-quinol em recipiente único. Por analogia, o composto de estrogénio 1,2-dissubstituído ou 1,4-dissubstituído fenólico é sujeito a um composto modelo de hidroperóxido de lípido tal como hidroperóxido de terc-butilo (tBuOOH) e acetilacetonato de vanadilo [V0(acac)2]. Aos compostos epóxidos resultantes, um nucleófilo (e. g., brometo de sódio ou metilato de lítio) é introduzido para proporcionar um 2- ou 4-subs-tituinte. A adição de um nucleófilo resulta na remoção espontânea de H2O para proporcionar um composto esteroidal 1.2.4- trissubstituído. O composto esteroidal 1,2,4-tris-substituído é em seguida agitado com m-CPBA e (PhCO) 202 em CCl4/Me2CO até refluxar enquanto é irradiado com uma lâmpada de tungsténio de 60 W para proporcionar um quinol esteroidal 1,2,4-trissubstituído de acordo com a presente invenção.

Numerosos outros quinóis para estrogénios ou análogos de estrogénio fenólicos de acordo com a presente invenção, bem como compostos relacionados equivalentes, podem ser prontamente sintetizados por analogia modificando simplesmente os caminhos de síntese acima descritos, utilizando métodos que são conhecidos dos peritos vulgares na técnica. 35 ΡΕ1490392

Os seguintes Exemplos 7-9 descrevem experimentos que demonstram a capacidade dos compostos da presente invenção serem reduzidos a uma estrutura de fenol este-roidal activo e regenerados por captura de radicais hidroxilo.

Exemplo 7

Estudo In Vitro Demonstrando a Redução de Quinol Esteroidal Relacionado com Estrogénio a uma Estrutura Activa

Estrona-quinol (0,1 mM) foi incubada a 37 °C em tampão fosfato 0,1 M pH 7,5 na presença de 1 mM de NADH, NADPH, ascorbato de sódio e glutationa (GSH). Alíquotas (500 yL) foram tomados após 60 minutos de incubação e extraídos com acetato de etilo. Após remoção do solvente, o resíduo dos extractos orgânicos combinados foi analisado ao seu conteúdo em estrona por LC/MS/MS usando etinil--estradiol como padrão interno. As incubações de controlo (estrona-quinol 0,1 mM em tampão fosfato 0,1 M a pH 7,5 e 37 °C sem a adição de um agente de redução foram realizadas, conforme mostrado na Figura 6, bem como a incubação com GSH encontraram-se livres de estrona mesmo após 12 horas. Quantidades traços de estrona puderam ser detectadas quando a incubação foi realizada na presença de NADH e, especialmente, NADPH, conforme mostrado nas Figuras 7A e 7B. 36 ΡΕ1490392

Exemplo δ

Redução In Vitro de um Quinol Esteroidal Relacionado com Estrogénio a uma Estrutura de Fenol Esteroidal Activa

Estrona-quinol (100 μΜ; 286 pg/mL) foi incubada a 37 °C em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,5) na presença de NADPH (1 mM) e microssomas de figado de ratazana (concentração final de proteína 1 mg/mL) . Alíquotas (500 pL) foram tomadas após 5 minutos de incubação com microssomas de fígado de ratazana. Verificou-se que a estrona-quinol sofreu redução para formar estrona. Além disso, a concentração de estrona alcançada após 5 minutos de incubação microssómica foi cerca de 12 vezes mais alta (15,1 pg/mL) do que o valor de 1,2 pg/mL medido sem a adição dos microssomas no experimento de controlo relevante (NADPH presente mas sem microssomas adicionados).

Exemplo 9

Experimento In Vivo Demonstrando a Redução de um Quinol Esteroidal Relacionado com Estrogénio a uma Estrutura Esteroidal de Fenol Activa

Experimentos de microdiálise cerebral foram realizados para estabelecer que a estrona-quinol sofre redução a estrona em células neuronais in vivo.

Ratazanas Sprague machos (300-400 g) foram anestesiadas, colocadas num instrumento estereotáxico e uma cânula-guia (cânula-guia CMA/12) foi implantada no hipocampo ventral sob condições assépticas. A cânula-guia foi 37 ΡΕ1490392 fixada ao crânio, em conjunto com parafusos de aço inoxidável fixados em dois orifícios adicionais, com acrílicos dentais. Antes de se iniciar o experimento (usualmente 5-7 dias após a implantação da cânula-guia) as ratazanas foram colocadas numa unidade de contenção (BAS, Inc.) durante pelo menos 30 minutos. Em seguida, uma sonda de microdiá-lise (membrana de policarbonato CMA/12 de diâmetro 0,5 mm; comprimento da membrana de 4 mm; corte molecular: 5000 Da) foi inserida no hipocampo ventral através da cânula-guia. Após a inserção, a sonda de microdiálise foi perfundida com um fluido cerebrospinal artificial (aCSF) a uma razão de fluxo de 1 pL/min mantido por uma bomba de microperfusão (BAS BeeStinger) ligada à sonda via tubagem de polietileno e um girador de líquido. Após equilibração durante 50 minutos, um colector de fracções refrigerado automático (BAS HoneyComb) foi usado para amostragem contínua do efluxo da sonda durante 24 horas em fracções de 60 minutos recolhidas em frascos de vidro de 300 pL (controlo) . O fluido cerebrospinal artificial foi em seguida trocado por uma solução de perfusão contendo 10 picomole/pL de estrona-quinol em aCSF (por medição da diminuição na concentração de composto a partir da solução perfundida, a estrona-quinol entrou no cérebro com um fluxo de cerca de 2 picomole/minuto). A recolha da amostra foi continuada durante mais 24 horas. Para análise LC/APCI-MS/MS, 50 pL de cada uma das 20 fracções (volume total de 1 mL) dos experimentos de controlo e de microdiálise de estrona-quinol, respectivamente, foram combinados e extraídos com acetato de etilo após a adição do padrão interno. 38 ΡΕ1490392

Ainda que a estrona não seja detectável nos microdialisados de controlo, ela estava presente numa quantidade detectável em amostras recolhidas durante a perfusão das sondas com a estrona-quinol contendo solução COMPOSTOS DE FÓRMULA, conforme mostrado nas Figuras 8A e 8B. Os traços cromatográficos revelaram SRM m/z 287 -» m/z 269 SRM para estrona-quinol e m/z 271 m/z 253 para estrona. 0 pico no ti = 4,5 minutos foi inequivocamente identificado, com base na co-eluição com um composto de referência autêntico e idênticos APCI, MS/MS (dado em conjunto com a origem dos fragmentos principais observados) e os espectros MS3, como estrona.

Os seguintes Exemplos 10 e 11 descrevem experimentos que demonstram a equivalência na bioactividade e eficácia dos quinóis da presente invenção quando se compara ao composto de estrogénio-fenólico.

Exemplo 10

Viabilidade Celular Neural In vitro após Exposição a Stresse Oxidante e Tratamento com um Quinol Esteroidal da Presente Invenção Comparando com a da Estrutura Fenólica

Activa Células HT-22 foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado de Dulbecco suplementado com soro bovino fetal 10%. Os experimentos foram realizados em placas de cultura de 96 cavidades contendo aproximadamente 5000 células/cavi-dade conforme determinado por um hemacitómetro de Neubauer. As células foram incubadas durante 24 horas. ΙΟβ-Hidroxi- 39 ΡΕ1490392 -17p-butoxiestra-l,4-dien-3-ona e a estrutura progenitora esteroidal fenólica 3-hidroxi-17p-butoxiestra-l,3,5-trieno foram cada uma dissolvidas em etanol absoluto e diluídas com o meio de cultura e a placa foi incubada durante 24 horas após adição de glutamato de sódio (20 mM) . A viabilidade celular foi quantificada por um ensaio de Calceína AM numa solução de tampão fosfato. Às concentrações de 1 μΜ e 10 μΜ de ΙΟβ-hidroxi--17p-butoxiestra-l,4-dien-3-ona, foi demonstrável a activi-dade neuroprotectora contra stresse oxidante induzido por glutamato em células neuronais HT22, conforme mostrado na Figura 9. Ainda que o composto 10p-hidroxi-17p-butoxi-estra-1,4-dien-3-ona não tenha um anel A fenólico considerado um componente essencial para a actividade elimina-dora de radical, a estrutura requisitada para a actividade eliminadora de radical, tal como uma porção fenólica, é proporcionada via uma activação redutora. Em essência, a 10p-hidroxi-17p-butoxiestra-l,4-dien-3-ona da presente invenção serve como pró-fármaco para a estrutura esteroidal activa 3-hidroxi-17p-butoxiestra-l,3,5-trieno.

Exemplo 11

Protecção Celular Neural In Vivo Contra Acidente Vascular Cerebral e Tratamento com um Qulnol Esteroidal da Presente Invenção Comparando com a da Estrutura Fenólica Activa A restauração aguda do fluxo sanguíneo após isquemia leva à produção de EOR (L. G. Forman et al., 40 ΡΕ1490392 "Augmentation of nitric oxide, superoxide, and peroxy-nitrite production during cerebral ischemia and reperfusion in the rat" in Neurochem. Res., 23 (1998) 141-148; 0. Peters et ai., "Increased formation of reactive oxygen species after permanent and reversible middle cerebral artery occlusion in the rat" in J. Cereb. Blood Flow Metab., 18 (1998) 196-205; e R. B. Mason et al., "Production of reactive oxygen species after reperfusion in vitro and in vivo: protective effect of nitric oxide" in J. Neurosurg., 93 (2000) 99-107) que são directamente tóxicas para os neurónios. A eliminação terapêutica não enzimática de radicais livres pode ser uma estratégia viável para a redução de lesão do tecido cerebral isquémico.

Ratazanas Sprague-Dawley fêmeas (pesando 200--250 g, Charles River, Wilmington, MA) foram aclimatadas durante três dias antes da cirurgia. A ovariectomia bilateral foi realizada 2 semanas antes da oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Os animais foram anestesiados por injecção intraperitoneal de cetamina (60 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). A temperatura rectal foi mantida a 37,5+0,5 °C durante o procedimento. A artéria cerebral média foi ocludida durante uma hora e em seguida a sutura foi retirada por reperfusão. Estrona e um quinol da presente invenção (El-quinol) foram dissolvidos em óleo de milho e administrados numa dose de 200 yg/kg subcutane-amente (sc) 2 h antes do começo da MCAO de 1 h.

Os animais foram decapitados 24 horas após a 41 ΡΕ1490392 reperfusão. Os cérebros foram recolhidos e colocados numa matriz de cérebro para fatiamento (Harvard Apparatus, Holliston, MA) . Sete fatias foram feitas aos 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15 mm posteriores ao bolbo olfactivo. As fatias foram incubadas durante 30 minutos em solução 2% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio a 37 °C, e em seguida fixadas em formalina 10%. As fatias coradas foram fotografadas e subsequentemente medidas no volume da lesão isquémica (Image-Pro Plus 4.1, Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Quando administrado antes da isquemia, o estro-génio (estrona) reduziu significativamente o volume do enfarte por 53% (P<0,05) comparado ao do controlo após MCAO transiente seguida por reperfusão de 24 h em ratazanas ova-riectomizadas. Além disso, o El-quinol da presente invenção foi equipotente com o estrogénio (estrona) progenitor na redução da lesão, conforme ilustrado na Figura 10. Os dados na Figura 10 são expressos como média ± DPM. As avaliações estatísticas foram feitas por ANOVA de uma via seguido por teste de Dunnett (comparação com um grupo de controlo único) ou de Student-Newman-Keuls (comparações múltiplas).

Este Exemplo e estudos prévios demonstram que os estrogénios naturais empregues em concentrações suprafisio-lógicas (S. H. Yang et al., "Estradiol exerts neuropro-tective effects when administered after ischemic insult" in Stroke, 31 (2000) 745-749, e J. Shi et al., "Estrogens decrease reperfusion-associated cortical ischemic damage: an MRI analysis in a transient focal ischemia model" in 42 ΡΕ1490392

Stroke, 32 (2001) 987-992) e análogos de estrogénio sem afinidade a receptores de estrogénio (R. Liu et al., "Neuroprotective effects of a novel non-receptor-binding estrogen analogue: in vitro and in vivo analysis" in Stroke, 33 (2002) 2485-2491) são neuroprotectores. Por conseguinte, o efeito observado não só da estrona mas também do El-quinol da presente invenção pode ser devido em parte a um mecanismo antioxidante neste Exemplo. O El-quinol da presente invenção mostrou uma diminuição da lesão isquémica associada a reperfusão equivalente à do estrogénio progenitor (estrona) no paradigma in vivo, o que indica a conversão do quinol ao composto de estrogénio de anel A fenólico biologicamente activo. Além disso, os quinóis da presente invenção são farmaceuticamente mais aceitáveis (isto é, como pró-fármacos) devido à sua capacidade in vivo de serem menos lipofílicos, mais resistentes a metabolismo oxidante, mais seguros/menos tóxicos, e menos provavelmente a causa de um efeito hormonal não desejado, do que os compostos progenitores <RTI fenólicos/de estrogénio.

Lisboa, 12 de Abril de 2007

Claims (12)

1. ΡΕ1490392 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um quinol tendo a estrutura geral GR

   em que R é seleccionado do grupo constituído por H, alquilo, cicloalquilo, arilo, heterociclo, heteroarilo, alquilamino, hidroxialquilo, alcoxialquilo ou alquilarilo; X é seleccionado do grupo constituído por hidrogénio, isopropilo, alquilo, alcenilo, alcinilo, carbociclo, cicloalquilo, arilo, heterociclo, heteroarilo, alquilamino, hidroxialquilo, alcoxialquilo e um hidrocarboneto linear ou ramificado de 1-15 átomos de carbono de comprimento, que pode facultativamente incluir um ou mais heteroátomos na cadeia; Y é seleccionado do grupo constituído por isopropilo, alquilo, alcenilo, alcinilo, carbociclo, cicloalquilo, arilo, heterociclo, heteroarilo, alquilamino, hidroxialquilo, alcoxialquilo e um hidrocarboneto linear ou ramificado de 1-15 átomos de carbono de comprimento, que pode facultativamente incluir um ou mais heteroátomos na cadeia; e 2 ΡΕ1490392 Z é seleccionado do grupo constituído por hidrogénio, isopropilo, alquilo, alcenilo, alcinilo, carbociclo, ciclo-alquilo, arilo, heterociclo, heteroarilo, alquilamino, hidroxialquilo, alcoxialquilo e um hidrocarboneto linear ou ramificado de 1-15 átomos de carbono de comprimento, que pode facultativamente incluir um ou mais heteroátomos na cadeia.
2. 2. 0 quinol de acordo com a reivindicação 1, em que R é uma cadeia de alquilo C1-C20 linear ou ramificada e X é hidrogénio.
3. 3. Um método ín vitro para a produção de um composto de estrogénio biologicamente activo, compreendendo a provisão de um quinol de acordo com as reivindicações 1 ou 2, e a conversão do referido quinol via redução catalisada por enzima a um composto de estrogénio biologicamente activo.
4. 4. Um método in vitro para a produção de um quinol regenerado, compreendendo 0 método de acordo com a reivindicação 3, e regeneração do referido quinol através da captura de uma espécie de oxigénio reactivo de radical livre pelos referidos compostos de estrogénio biologicamente activo.
5. 5. Uma composição farmacêutica compreendendo um quinol que é convertido num composto de estrogénio biologicamente activo via redução catalisada por enzima de 3 ΡΕ1490392 acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, em que a referida composição compreende ainda um agente de suporte farmaceuticamente aceitável.
6. 6. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, em que a redução catalisada por enzima ocorre com NADH ou NADPH como agente de redução.
7. 7. Uso de um quinol que é convertido num composto de estrogénio biologicamente activo via redução catalisada por enzima de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, para a produção de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma condição patológica associada com espécies de oxigénio reactivo de radical livre.
8. 8. Uso de acordo com a reivindicação 7, compreendendo ainda a administração do quinol por uma via selec-cionada do grupo constituído por oral, bucal, intramuscular, transdérmica, intravenosa e subcutânea.
9. 9. Uso de acordo com a reivindicação 7, em que o quinol é regenerado quando os compostos de estrogénio biologicamente activos capturam uma espécie de oxigénio reactivo de radical livre.
10. 10. Uso de acordo com a reivindicação 7, em que a redução catalisada por enzima ocorre com NADH ou NADPH como agente de redução. 4 ΡΕ1490392
11. 11. Uso de acordo com a reivindicação 7, em que a condição patológica associada com espécies de oxigénio reactivo de radical livre é uma doença neurodegenerativa.
12. 12. Uso de acordo com a reivindicação 7, em que os compostos de estrogénio biologicamente activos são proporcionados ao mamifero para o tratamento ou prevenção de condições cardíacas ou para o tratamento ou prevenção de condições associadas com o osso. Lisboa, 12 de Abril de 2007