PT1417305E

PT1417305E - Identificação de uma variante de adn associada à hipolactasia do tipo da de adultos

Info

Publication number: PT1417305E
Application number: PT02794596T
Authority: PT
Inventors: Leena Peltonen; Nabil Enattah; Irma Jaervelae; Timo Sahi; Erkki Savilahti; Joseph Terwilliger
Original assignee: Nat Public Health Inst
Priority date: 2001-08-10
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2012-10-11
Also published as: CA2456516C; WO2003014342A2; WO2003014342A3; CN1541265B; EP1417305A2; ES2391173T3; CN1541265A; AU2002355471B2; MXPA04001279A; EP1417305B1; RU2004107086A; DK1417305T3; JP4521184B2; JP2005502336A; CA2456516A1; RU2391404C2

Description

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DESCRIÇÃO "IDENTIFICAÇÃO DE UMA VARIANTE DE ADN ASSOCIADA À HIPOLACTASIA DO TIPO DA DE ADULTOS" A invenção presente diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que inclui uma porção 5' de um gene de uma lactase-florizina hidrólase intestinal (LPH) que contribui para ou que indica uma hipolactasia do tipo da de adultos, em que a referida molécula de ácido nucleico é caracterizada pelas reivindicações apensas. A invenção presente diz também respeito a métodos para se testar a existência ou a predisposição para hipolactasia do tipo da de adultos, com base na análise de um SNP contido na molécula de ácido nucleico referida acima. A invenção presente diz adicionalmente respeito a uma composição para diagnóstico e a um estojo útil na detecção da existência ou da predisposição para uma hipolactasia do tipo da de adultos. 0 enzima lactase-florizina hidrólase (LPH), exclusivamente expresso por células epiteliais do intestino, hidrolisa a lactose, açúcar do leite, a glucose e galactose1. A expressão do enzima LPH declina fortemente até niveis muito pequenos no período de desmamem dos mamíferos quando a lactose deixa de ser parte essencial da dieta. Nos seres humanos, o estado conhecido como 2 hipolactasia do tipo de adultos, ou não persistência da lactase, afecta a maior parte das populações e limita de uma forma severa a utilização de leite fresco pelos adultos devido a uma intolerância à lactose. A idade a que se inicia o estado de não persistência da lactase varia de população para população, desde os 1-2 anos de idade entre os Tailandeses aos 10-20 anos de idade para os Finlandeses2-3. No entanto, nos Europeus Nórdicos e num pequeno conjunto de outros grupos étnicos, a actividade da LPH persiste ao longo da vida na maioria dos adultos, um estado denominado persistência da lactase. Foi demonstrado que o fenótipo persistência da lactase/não persistência era geneticamente determinado, sendo dominante em relação ao estado de não persistência 4-6. O diagnóstico da hipolactasia do tipo da dos adultos no estado da técnica baseia-se no teste da tolerância à lactose (LTT). Após um jejum de um dia para o outro (10 horas), administra-se 1 g/kg de lactose sob a forma de uma solução a 12,5 %, sendo a dose máxima de 50 g. Obtêm-se amostras de sangue de capilares antes, 20 e 30 minutos depois da ingestão da lactose. Determina-se a concentração em glucose pelo método da glucose oxidase (Hjelm e de Verdier, 1963). Anotam-se os sintomas abdominais no dia da LTT. Um aumento máximo da concentração em glucose no sangue de 1,1 mmol/L era tomado como significando uma má absorção da lactose (Gudman-Hoyer e Hamum 1968, Jussila 1970, Sahi 1972) . O LTT apresenta um risco de 10 % de diagnósticos falsos positivos e negativos, 3 isto é, a sensibilidade e a especificidade do LTT é de cerca de 90 % (Isokoski et al. 1972, Newcomer et al. 1975, Sahi 1983). A exactidão do LTT pode ser melhorada administrando 0,3 g/kg de etanol que inibe o metabolismo da galactose no figado (Tygstrup e Lundqvist 1962) e 15 minutos depois 1 g/kg de lactose sob a forma de uma solução a 12,5 %. Têm-se enviado as crianças que apresentam aumentos máximos inferiores a 0,2 mg/100 mL no primeiro LTT ou numa sua repetição, para exames por biópsia do intestino delgado, através de uma gastroscopia. Trata-se de um processo invasivo que necessita da intervenção de um perito e que em geral é levado a cabo nos hospitais das universidades e apenas por especialistas em gastroenterologia. Examinam-se as amostras da biópsia com um microscópio de dissecções e histologicamente, e determinam-se as actividades da maltase, da sacarase e da lactase na mucosa (Launiala et al., 1964) . Confirma-se o diagnóstico da hipolactasia em crianças quando a histologia da biópsia intestinal é normal e a actividade da lactase é inferior a 20 U/g de proteína, e a razão lactase/sacarase é inferior a 0,30, ou no LTT com administração de etanol se observa um aumento máximo da concentração em glucose no sangue inferior a 20 mg/100 mL e da concentração em galactose no sangue, menor ou igual a 5 mg/100 mL (Sahi et al., 1972). Tal como se descreveu acima, os métodos actuais 4 para diagnosticar uma hipolactasia do tipo da de adultos são laboriosos. 0 LTT é inexacto e portanto, é necessário um processo invasivo, a gastroscopia, para se conseguir confirmar o diagnóstico. Uma vez que a hipolactasia do tipo da dos adultos é muito habitual e é a causa principal de sintomas abdominais não específicos (um terço dos pacientes queixando-se de dores de estômago), existe uma clara necessidade de melhorar os diagnósticos para este problema de saúde muito comum.

No entanto, até à data não foi desenvolvido nenhum teste bioquímico que seja fácil de conduzir e, em simultâneo, proporcione resultados de uma forma rápida e exacta. A elucidação da causa da doença ao nível da expressão genómica no ADN também tem sido igualmente mal sucedida. Assim, a sequenciação das regiões codificante e promotora do gene LPH em adultos não revelou quaisquer variações do ADN correlacionáveis com a persistência/não persistência da lactase, nem emergiu qualquer evidência acerca de variantes emendadas de ADN nem de variantes de edição em mARN associadas com esta caracterí stica7’8. Os estudos anteriores mostraram que a característica da persistência/não persistência da lactase é possivelmente controlada por elemento(s) actuantes cis, residente (s) em ou adjacentes ao gene da lactase, e observou-se um forte desequilíbrio da ligação (LD) através dos 70 kb do haplotipo ocupados pelo gene da lactase9,10. Diversos estudos relatam dados mostrando que o controlo da expressão do gene LPH opera ao nível da regulação da transcrição11’13. 5

No entanto, foi sugerido que a variação influenciando tanto o controlo transcricional como o pós-transcricional da expressão do gene LPH pode estar envolvida na etiologia da hipolactasia do tipo da dos adultos14-15.

Atento quanto precede, o problema técnico subjacente à invenção presente era proporcionar meios e métodos permitindo um diagnóstico exacto e cómodo da hipolactasia dos adultos ou de uma predisposição para esta doença. A solução deste problema técnico é conseguida através das concretizações caracterizadas nas reivindicações.

Deste modo, a invenção presente diz respeito a uma molécula de ácido nucleico incluindo ou sendo constituída por uma porção 5' de um gene de lactase-florizina hidrolase intestinal (LPH) que contribui ou é indicativo de uma hipolactasia do tipo da de adultos, em que a referida molécula de ácido nucleico é caracterizada pelas reivindicações apensas.

De acordo com a invenção, o termo "gene de lactase-florizina hidrolase intestinal (LPH)" denota um gene que codifica para um enzima com a actividade de hidrolisar a lactose às suas componentes, glucose e galactose. Este enzima é caracterizado pela E .C. 3.2.1.23.62. 6 0 termo "hipolactasia do tipo da de adultos" refere-se a um estado também denominado intolerância à lactose, que é um estado autossomal recessivo resultante do declinio "fisiológico" da actividade enzimática da lactase-florizina hidrolase (LPH) nas células intestinais numa proporção significativa da população global. 0 termo "contribuindo para ou indicativo de hipolactasia do tipo da dos adultos", refere-se ao facto de que as SNP e portanto as correspondentes moléculas de ácido nucleico que se encontraram serem indicativas do estado e possivelmente também o provocando. Portanto, este termo obriga necessariamente a que a porção a 5' citada seja indicativa do estado. 0 termo referido, por outro lado, não obriga necessariamente a que a porção a 5' provoque ou contribua para o estado . No entanto, o termo referido não exclui que exista uma relação causativa ou um papel de contribuição de qualquer das ou de ambas as SNP. 0 termo "que se hibridiza sob condições severas" refere-se às condições de hibridização que são bem conhecidas ou podem ser estabelecidas por um individuo com conhecimentos da técnica recorrendo a protocolos convencionais. 0 termo refere-se, na acepção mais vantajosa, a condições altamente selectivas. Podem estabelecer-se as condições selectivas para cada sequência com base em parâmetros bem conhecidos tais como a temperatura, a composição das moléculas de ácido nucleico, 7 as condições de salinidade, etc.: veja-se, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"; CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989, ou Higgins e Hames (editores), "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford 1985, (referência 54), veja-se em especial o capitulo "Hybridization Strategy" por Britten & Davidson, 3 a 15. Condições tipicas (fortemente selectivas) incluem uma hibridização a 65°C em 0,5 x SSC e 0,1 % de SDS ou uma hibridização a 42°C em formamida a 50 %, 4 x SSC e 0,1 % de SDS. A hibridização é normalmente seguida por uma lavagem para ser removido o sinal não especifico. Incluem-se as condições de lavagem tais como 65°C, 0,2 x SSC e 0,1 % de SDS ou 2 x SSC e 0,1 % de SDS ou 0,3 x SSC e 0,1 % de SDS a 25°C - 65°C.

Tal como se descreve neste documento, a invenção presente também diz respeito a moléculas de ácido nucleico hibridizante contendo pelo menos 20 nucleótidos; vejam-se as reivindicações apensas. No entanto, a invenção presente também diz respeito a uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 150, ou pelo menos 200 nucleótidos. Preferivelmente, os referidos fragmentos hibridizantes incluem pelo menos 25, pelo menos 50, ou pelo menos 75 nucleótidos, pelo menos 100 nucleótidos, a 5' e a 3' da posição -13910 tal como definida nas reivindicações apensas ou da posição -22018 tal como definida nas reivindicações apensas. 0 termo "molécula de ácido nucleico" refere-se tanto a moléculas de ácido nucleico de ocorrência natural como não natural. Incluem-se na moléculas de ácido nucleico que não ocorrem na natureza cADN bem como derivados tais como APN. 0 termo "molécula de ácido nucleico [ . . . ] incluindo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:", ao longo da especificação presente, refere-se a moléculas de ácido nucleico que têm pelo menos mais um nucleótido no seu comprimento do que a molécula de ácido nucleico especificada pela SEQ ID NO #. Ao mesmo tempo, estas moléculas estendem-se, no máximo, a 30.000 nucleótidos ao longo das extremidades 5' e/ou 3' da molécula de ácido nucleico da invenção, especificada por exemplo pelas SEQ ID NO: 2 ou 1, 3 ou 4. com

Verificou.se de uma forma surpreendente de acordo com a invenção presente, que as duas variantes associadas com a hipolactasia se localizam a uma distância considerável do gene LPH, posicionado em intrões diferentes do gene MCM6. O gene MCM6 é um membro da família de genes (MCM 2-7), necessária para se iniciar a replicação do ADN e assegurando que ela apenas acontece uma vez durante o ciclo celular31. 0 MCM6, ao contrário do LPH, não tem uma distribuição restrita a determinados tecidos e não existe nenhuma correlação entre os teores dos transcritos de MCM6 e os de LPH18. Estes factos sugeririam que estes dois genes não partilham nenhuns elementos actuando cis 9 funcionalidade significativa que proporcionem especificidade para tecidos ou regulação do desenvolvimento18. 0 mais provável é as variantes identificadas possuírem significância funcional diferente para a expressão dos genes LPH e MCM6. Também de modo surpreendente, com base na associação completa à hipolactasia eles (ou um deles) estão associados a uma regulação em baixa dependente da idade do teor de transcritos do gene LPH no epitélio intestinal, mas têm pouco ou nenhum efeito sobre a transcrição do MCM6.

De um ponto de vista experimental, utilizando ligação, a associação de alelos e uma análise de haplotipo estendida levadas a cabo em nove famílias estendidas de Finlandeses, verificou-se que o local da hipolactasia do tipo da de adultos se restringia a um intervalo de 47 kb no 2q21. A análise da sequência da região revelou um único polimorfismo (SNP), C/T-13910 que se co-segregava por completo com a hipolactasia do tipo da de adultos em todas as famílias Finlandesas e num conjunto amostra de 236 indivíduos de quatro populações diferentes. Outra SNP G/A-22018 residindo a 8 kb teloméricos a partir de C/T -13910, estava associada a característica em todos menos em 7 casos. A prevalência da SNP C/T - 13910 em 1.047 amostras de ADN reflectia a prevalência reportada da hipolactasia do tipo da de adultos em três populações diferentes proporcionando dados adicionais acerca da sua importância para esta característica. 10 O facto surpreendente referido acima pela primeira vez permite o estabelecimento de sistemas de teste que são baseados na análise molecular do polimorfismos de um único nucleótido a montante do gene LPH. Enquanto ambas as SNP proporcionam uma base sólida para o diagnóstico de, ou de uma predisposição para, a hipolactasia do tipo da de adultos, prefere-se que a posição do nucleótido -13910 seja analisada, quer por si só, quer em combinação com a posição do nucleótido -22018. Isto porque a SNP na posição -13910 estava associada com a doença em 100 % dos casos analisados, enquanto a SNP na posição -22018 estava associada apenas a 98 % de todos os casos de hipolactasia do tipo da dos adultos. No entanto, as análises da posição do nucleótido -22018 por si só também proporcionará em geral uma base forte para um diagnóstico de uma predisposição para a hipolactasia do tipo da dos adultos.

Devido à abundância de métodos estabelecidos para avaliar a presença de SNP, é agora possivel de uma forma conveniente, num intervalo de tempo curto, a baixo custo, com uma exactidão elevada e sem incómodo significativo para a pessoa em investigação, diagnosticar uma predisposição genética para a hipolactasia do tipo da de adultos. A invenção relaciona-se também com a mudança com uma molécula de ácido nucleico que inclua ou seja constituída por uma porção a 5' de um gene de um enzima intestinal lactase-florizina hidrolase (LPH), em que a 11 referida molécula de ácido nucleico seja caracterizada pelas reivindicações apensas.

Esta concretização da invenção presente pode ser comodamente utilizada para demonstrar que uma pessoa não sofre de hipolactasia do tipo da de adultos e não tem predisposição para ela. Além disto, esta molécula de ácido nucleico que reflicta a situação "de tipo selvagem" da posição -13910 ou -22018 a montante do gene LPH, pode ser utilizada como meio de controlo em experiências em que se teste a predisposição para hipolactasia do tipo da dos adultos.

Para testes, os métodos tal como descritos ao longo de toda esta especificação podem ser utilizados.

Numa concretização preferida da invenção a molécula do ácido nucleico é o ADN genómico.

Esta concretização preferida da invenção reflecte o facto que habitualmente a análise seria levada a cabo com base no ADN genómico do fluido corporal, células ou tecidos isolados a partir da pessoa sob investigação.

Numa concretização adicional da molécula de ácido nucleico da invenção, o referido ADN genómico é parte de um gene. 12

De acordo com a invenção, prefere-se que seja analisado pelo menos um dos intrões do gene MCM6 contendo a posição -13910 ou a posição -22018 em relação ao gene LPH.

Além disto, a invenção diz respeito a um fragmento da molécula do ácido nucleico tal como descrito acima neste documento, contendo pelo menos 14 nucleótidos, em que o fragmento referido inclua a posição de nucleótido -13910 ou a posição de nucleótido -22018 (a montante) do gene LPH. O fragmento da invenção pode ter uma origem natural bem como uma origem (semi)sintética. Deste modo, o fragmento pode, por exemplo, ser uma molécula de ácido nucleico que tenha sido sintetizada de acordo com protocolos convencionais da química orgânica. De uma forma importante, o fragmento de ácido nucleico da invenção inclui a posição do nucleótido -13910 ou a do nucleótido -22018 a montante do gene LPH. Nestas posições, o fragmento pode conter quer o nucleótido de tipo selvagem, quer o nucleótido que contribui ou é indicativo de hipolactasia do tipo da de adultos (também referida como sequência "mutante"). Portanto, o fragmento da invenção pode ser utilizado, por exemplo, em ensaios que diferenciem entre a sequência de tipo selvagem e a mutante.

Prefere-se adicionalmente que o fragmento da invenção seja constituído por pelo menos 17 nucleótidos, sendo mais preferido pelo menos 21 nucleótidos, e de 13 preferência pelo menos 25 nucleótidos , tal como 30 nucleótidos. Além disto, a invenção diz respeito a uma molécula de ácido nucleico que seja complementar da molécula de ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento.

Esta concretização da invenção incluindo pelo menos 14 nucleótidos nos quais se inclua pelo menos a posição -13910 ou a posição -22018 da sequência a montante do gene LPH é especialmente útil na análise da montagem do gene nas posições enumeradas nos ensaios de hibridização. Assim, por exemplo, um 15âmero exactamente complementar quer da sequência de tipo selvagem (isto é com uma T na posição -13910 ou com uma A na posição -22018) , quer das variantes que contribuem ou são indicativas da hipolactasia do tipo da de adultos (isto é, com uma C na posição -13910 ou com uma G NA posição-22018) , pode ser utilizado para diferenciar entre as variantes polimórficas. Isto é porque uma molécula de ácido nucleico marcada com um rótulo detectável não exactamente complementar do ADN na amostra analisada não dará origem a um sinal detectável, caso se escolham as condições de hibridização e de lavagem apropriadas. A este respeito, é importante notar-se que a molécula de ácido nucleico da invenção, o seu fragmento bem como a molécula de ácido nucleico complementar, podem ser 14 marcados de uma forma detectável. Incluem-se nos marcadores detectáveis os marcadores radioactivos tais como H, ou P, ou marcadores fluorescentes. A marcação de ácidos nucleicos é bem entendida na técnica e está descrita, por exemplo, em Sambrook et al., loc. cit..

Além disto, a invenção diz respeito a um vector incluindo a molécula de ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento. 0 vector da invenção pode conter quer uma molécula de ácido nucleico que inclua a(s) sequência (s) de tipo selvagem, quer uma molécula de ácido que inclua a(s) sequência(s) mutantes.

Os vectores podem ser em especial plasmídeos, cosmideos, virus ou bacteriófagos utilizados convencionalmente em engenharia genética e que inclua a molécula de ácido nucleico da invenção. Preferivelmente, o referido vector é um vector de expressão e/ou um vector para transferência de genes ou alvejante. Podem utilizar-se vectores derivados de virus tais como retrovirus, virus vaccinia, virus adeno-associados, virus herpes, ou virus papiloma bovinos, para veicular a molécula de ácido nucleico da invenção até uma população celular alvejada. Podem utilizar-se métodos que são bem conhecidos dos especialistas da técnica para se construírem vectores virais recombinantes; vejam-se, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., loc. cit. e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989). Em 15 alternativa, as moléculas de ácido nucleico e os vectores da invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para serem veiculados às células alvo. Os vectores contendo as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser transferidos para dentro da célula hospedeira por métodos bem conhecidos, que podem variar consoante o tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, utiliza-se habitualmente uma transfecção com cloreto de cálcio para as células procarióticas, enquanto, por exemplo, de pode utilizar uma transfecção mediada por fosfato de cálcio ou por DEAE-Dextrana ou uma electroporação, para outros hospedeiros celulares; veja-se Sambrook, acima.

Podem incluir-se nestes vectores, genes adicionais tais como genes marcadores que permitem a selecção do vector referido numa célula hospedeira adequadas em condições adequadas. Preferivelmente, a molécula de ácido nucleico da invenção encontra-se operacionalmente ligada a sequências de controlo de expressão que permitam a expressão em células procarióticas ou eucarióticas. A expressão do polinucleótido referido inclui a transcrição desse polinucleótido num mARN traduzivel. Os elementos reguladores que asseguram a expressão nas células eucarióticas, preferivelmente em células de mamíferos, são bem conhecidos dos especialistas da técnica. Eles habitualmente contêm sequências reguladoras que asseguram a iniciação da transcrição e, opcionalmente, um sinal de poli-A assegurando a terminação da transcrição bem como a estabilização do transcrito, e/ou 16 um intrão aumentando mais a expressão do polinucleótido referido. Podem incluir-se em elementos reguladores adicionais os incrementadores da transcrição, bem como da tradução, e/ou regiões promotoras naturalmente associadas, ou heterólogas. Incluem-se nos elementos reguladores possiveis permitindo uma expressão em células hospedeiras procarióticas, por exemplo, os promotores PL, lac, trp ou tac em E. coli, e são exemplos de elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucarióticasos promotores A0X1 ou GAL1 em leveduras ou os promotores CMV, SV40, RSV (virus sarcoma Rous), incrementador de CMV, incrementador de SV40 ou intrão de globina em células de mamíferos e outras células animais. Para além dos elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição, estes elementos reguladores também podem incluir sinais de terminação da transcrição, tais como o local SV40-poli-A ou o local tk-poli-A, a jusante do polinucleótido. Opcionalmente, a sequência heteróloga pode codificar para uma proteína de fusão incluindo um péptido para identificação do terminal C ou do terminal N que proporcione as características pretendidas, por exemplo, uma estabilização ou uma purificação simplificada do produto recombinante expresso. Neste contexto, são conhecidos na técnica vectores de expressão adequados tais como o vector de expressão de cADN de Okayama-Berg, pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcADNl, pcADN3, o sistema de clonagem Echo™ (Invitrogen), pSPORTl (GIBCO BRL) ou pRevTet-ONpRevTet-Off ou ainda pCl (Promega). Preferivelmente, as sequências de controlo de expressão 17 serão sistemas promotores eucarióticos em vectores capazes de transformar ou de transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas também se podem as sequências de controlo para hospedeiros procarióticos.

Tal como se mencionou acima, o vector da invenção presente também pode ser um vector de transferência de um gene ou um vector alvejante. A terapia genética, que se baseia na introdução de genes terapêuticos em células por técnicas ex vivo ou in vivo, é uma das aplicações mais importantes da transferência de genes. Estão descritos na literatura vectores e métodos adequados para uma terapia genética in vitro ou in vivo, e eles são do conhecimento do indivíduo com conhecimentos da técnica; veja-se, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539;

Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374;

Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature

Medicine 2 (1996), 714-716; W094/29.469; WO 97/00.957,

Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635- 640, ou Kay et al. (2001) Nature Medicine, 7, 33-40) e as referências citadas nestes documentos. Os polinucleótidos e os vectores da invenção podem ser concebidos para introdução directa ou para introdução via lipossomas na célula, ou via vectores virais (por exemplo adenovirais, retrovirais). Preferivelmente, a célula referida é uma linha celular de gérmen, uma célula embriónica, ou uma célula ovo, ou derivada destas, de preferência a células referida é uma célula estaminal. Encara-se a terapia 18 genética apenas com a molécula de ácido nucleico de tipo selvagem. A invenção também diz respeito a um iniciador ou a um par de iniciadores, em que o iniciador ou o par de iniciadores hibridizam em condições (fortemente) restritivas como ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento, incluindo o nucleótido na posição -13910 ou na -22018 do gene LPH, ou com a sua cadeia complementar.

Preferivelmente, os iniciadores da invenção têm um comprimento de pelo menos 14 nucleótidos, tal como 17 ou 21 nucleótidos. É também preferido que os iniciadores tenham um comprimento máximo de 24 nucleótidos. Pode utilizar-se a hibridização ou a falta de hibridização de um iniciador, em condições adequadas a uma sequência do genoma incluindo quer a posição -13910, quer a posição -22018, acoplada a um método de detecção apropriado tal como uma reacção de alongamento ou uma reacção de amplificação, passa se diferenciar entre as variantes polimórficas e depois para retirar conclusões no que toca a, por exemplo, a predisposição da pessoa sob investigação para uma hipolactasia do tipo da dos adultos. A invenção presente encara dois tipos de iniciadores ou pares de iniciadores. Um destes tipos hibridiza-se com uma sequência que inclui a sequência mutante. Por outras palavras, o iniciador é exactamente complementar de uma sequência que contém uma C na posição -13910 ou a G na posição -22018, ou a cadeia complementar delas. O outro tipo de iniciador é exactamente 19 complementar de uma sequência contendo uma T na posição -13910 ou uma A na posição -22018, ou da cadeia complementar delas. Uma vez que as condições de hibridização seriam preferivelmente escolhidas de modo a serem suficientemente exigentes, levar-se a um contacto, por exemplo, um iniciador exactamente complementar da sequência mutante com um alelo de tipo selvagem não resultaria numa hibridização eficiente devido à formação de não emparelhamentos. Depois da lavagem, não se detectaria nenhum sinal devido à remoção do iniciador.

Adicionalmente, a invenção diz respeito a um hospedeiro não humano transformado com o vector da invenção tal como se descreveu acima neste documento. O hospedeiro pode quer transportar o mutante, quer a sequência de tipo selvagem. Após selecção, etc., o hospedeiro pode ser quer heterozigótico, quer homozigótico, no que toca a uma ou ambas as SNP. O hospedeiro da invenção pode transportar o vector da invenção quer a titulo transiente, quer de forma estável, integrado no seu genoma. São bem conhecidos na técnica métodos para gerar o hospedeiro não humano da invenção. Por exemplo, podem empregar-se os protocolos convencionais de transfecção descritos em Sambrook et al., loc. cit., para gerar bactérias transformadas (tais como E. coli) ou leveduras transformadas. Pode utilizar-se o hospedeiro não humano da invenção, por exemplo, para elucidar o inicio da hipolactasia do tipo da dos adultos. 20

Numa concretização preferida da invenção o hospedeiro não humano da invenção é uma bactéria, uma célula de levedura, uma célula de insecto, uma célula de fungo, uma célula de mamifero, uma célula de uma planta, um animal transgénico ou uma planta transgénica.

Enquanto a E. coli é uma bactéria preferida, as células de levedura preferidas são de S. cerevisiae ou de Pichia pastoris. As células fúngicas preferidas são células de Aspergillus e as células de insecto preferidas incluem células de Spdoptera frugiperda. As células de mamifero preferidas são linhas de células de carcinoma do cólon que possuam expressão do enzima LPH, nelas se incluindo células CaCo2.

Um método para a produção de um animal transgénico não humano, por exemplo um murganho transgénico, inclui a introdução do polinucleótido mencionado acima ou de vector alvejante numa célula gérmen, numa célula embriónica, numa célula estaminal ou num ovo ou ainda numa célula derivadas dele. Pode utilizar-se o animal não humano de acordo com um método de despista da invenção que se descreve neste documento. Pode levar-se a cabo a produção de embriões transgénicos e o despiste dos que podem ser levados a cabo, por exemplo, tal como se descreveu em A. L. Joyner Editor, Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. O ADN das membranas dos embriões pode ser analisado utilizando, 21

por exemplo, transferências Southern com uma molécula de ácido nucleico complementar apropriada; veja-se acima. Um método geral para fabricar animais transgénicos não humanos está descrito na técnica, veja-se por exemplo o WO 94/24.274. Para produzir organismos transgénicos não humanos (nos quais se incluem animais não humanos alvejados homologamente), são preferidas células estaminais embrionárias (células ES) . Podem utilizar-se células ES murinas, tais como as da linha AB-1 cultivada em camadas de produção de células, mitoticamente inactivas, SNL76/7 (McMahon e Bradley, Cell 62: 1073-1085 (1990)) essencialmente tal como descrito (Robertson, E. J. (1987) em Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, editor (Oxford: IRL Press), págs. 71-112), para o alvejamento de genes homólogos. Incluem-se noutras linhas de células ES adequadas, sem que a estas elas se limitem, a linha E14 (Hooper et al., Nature 326: 292-295 (1987)), a linha D3 (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-45 (1985)), a linha CCE (Robertson et al., Nature 323: 445-448 (1986)), a linha AK-7 (Zhuang et al., Cell 77: 875-884 (1994)). O sucesso na geração de uma linha de murganhos a partir de células ES contendo uma mutação especifica alvejada depende da pluripotência das células ES (isto é, da sua capacidade, uma vez injectadas num embrião hospedeiro em desenvolvimento, tal como num blastoquisto ou morula, para participar na embriogénese e para contribuir para as células do gérmen do animal resultante). Deixam-se desenvolver os blastoquistos contendo as células ES 22 injectadas nos úteros das fêmeas pseudo-grávidas não humanas, e nascem murganhos quiméricos. Os murganhos transgénicos resultantes são quiméricos em relação a conterem a molécula de ácido nucleico pretendida, e são cruzados e despista-se neles a presença do(s) gene(s) modificado(s) correctamente alvejados por PCR ou por análise por transferência Southern do ADN de uma biópsia da cauda dos descendentes, de modo a identificar murganhos transgénicos heterozigóticos quanto à molécula de ácido nucleico da invenção.

Os animais transgénicos não humanos podem ser, por exemplo, murganhos, ratos, cricetos, cães, macacos (símios), coelhos, porcos, ou vacas. Preferivelmente, os animal transgénico não humano referido é um murganho. Os animais transgénicos da invenção são, entre outras características, úteis para estudar a expressão/resultado fenotipico dos ácidos nucleicos e dos vectores da invenção presente. Além disto, os animais transgénicos da invenção presente são úteis para estudar a expressão do desenvolvimento do enzima LPH, por exemplo no intestino de roedores. Encara-se além disto que ao animais transgénicos não humanos da invenção possam ser empregues para testar agentes e composições em terapêutica ou noutras terapias possíveis que são úteis para melhorar a hipolactasia do tipo da dos adultos.

Além disto, a invenção diz respeito a um anticorpo ou um aptâmero ou um fago que se liguem 23 especificamente à molécula de ácido nucleico mutante da invenção, mas não à molécula de ácido nucleico de tipo selvagem correspondente.

Pode testar-se o anticorpo no que toca à sua ligação, e utilizar-se em qualquer metodologia sorológica bem conhecida na técnica, tal como em técnicas de aglutinação em tubos, geles, em fase sólida, e em técnicas de captura com ou sem anticorpos secundários, ou em citometria de fluxo com ou sem agentes para incremento da imunofluorescência (vejam-se, por exemplo, as técnicas descritas em Harlow e Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, USA, 1988 (veja-se a referência 53).

Na mesma linha da invenção, o anticorpo reconhece especificamente um epitopo que inclui a posição -13910 (na qual o nucleótido é C) ou a posição -22018 (na qual o nucleótido é G) . Não reage, ou não reage essencialmente de modo cruzado com um epitopo que inclua a posição -13910 que tenha uma T nesta posição, nem com o epitopo que inclua uma posição -22018 com uma G nessa posição. A especificidade de um anticorpo que se pode gerar de acordo com protocolos padrão, pode ser testada levando-o a um contacto com moléculas de ADN portadoras das sequências de tipo selvagem e mutante, tal como num ensaio ELISA. Só aqueles anticorpos que produzem um sinal sobre o ruido de fundo quando em contacto com a sequência mutante e não quando em contacto com a sequência de tipo selvagem é que são seleccionados. 24 0 anticorpo da invenção pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo derivado de ou incluido num soro policlonal. 0 termo "anticorpo", tal como se utiliza de acordo com a invenção presente, inclui também fragmentos do referido anticorpo, tais como fragmentos Fab, F(ab')2, Fv ou scFv; veja-se, por exemplo, Harlow e Lane53, loc. cit. 0 anticorpo ou o seu fragmento pode ter origem natural ou pode ser produzida de modo (semi)sintético. Estes produtos sintéticos também incluem material não proteico e semi-proteico que apresenta a mesma ou essencialmente a mesma especificidade de ligação que o anticorpo da invenção. Estes produtos podem, por exemplo, ser obtidos por peptidomimética. 0 termo "aptâmero" é bem conhecido na técnica e está definido, por exemplo, em Osbome et al., Curr. Opin. Chem. Biol. I (1997), 5-9 (veja-se a referência 51) ou em

Stall e Szoka, Pharm. Res. 12 (1995), 465-483 (veja-se a referência 52).

Além disto, a invenção diz respeito a um anticorpo ou a um aptâmero ou a um fago, que se ligue especificamente à molécula de ácido nucleico de tipo selvagem tal como se descreveu acima neste documento, mas não à sequência mutante correspondente que contribui para ou é indicativa de hipolactasia do tipo da de adultos. As afirmações com respeito à especificidade, etc. que se 25 fizeram para o anticorpo que é especifico para a sequência mutante aplicam-se neste caso, mutatis mutandis.

Além disto, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica incluindo a molécula de ácido nucleico de tipo selvagem tal como se descreveu acima neste documento. A composição farmacêutica da invenção pode ser utilizada em vias de terapia genética, em especial em terapia genética somática. A molécula de ácido nucleico de tipo selvagem a que se fez referência acima e contida na composição farmacêutica da invenção pode ser combinada com um veiculo e/ou com um diluente aceitável do ponto de vista farmacêutico. São bem conhecidos na técnica exemplos de veiculos farmacêuticos, e neles se incluem solução salina tamponizada com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões óleo/água, diversos tipos de agentes molhantes, soluções estéreis, etc. Podem formular-se composições que incluam estes veículos recorrendo a métodos convencionais, bem conhecidos. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao sujeito numa dose adequada. A administração das composições adequadas pode ser levada a cabo de diversos modos, por exemplo, por injecção endovenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, por 26 via tópica, intradérmica, intranasal ou intrabrônquica. 0 regime de dosagem será estabelecido pelo médico assistente levando em conta factores clinicos. Tal como se sabe bem em medicina, as dosagens para um determinado paciente especifico dependem de muitos factores, incluindo a dimensão do paciente, a área superficial do seu corpo, a sua idade, o composto especifico que se pretende administrar, o seu sexo, os instantes e a via de administração, o seu estado geral de saúde, e os outros fármacos que sejam administrados na mesma altura. Uma dose tipica pode ser, por exemplo, na gama de entre 0,001 e 1.000 yg de ácido nucleico para expressão ou inibição da expressão; no entanto, encaram-se doses maiores e menores do que esta gama exemplificativa, em particular levando em conta os factores enumerados acima. As dosagens poderão variar mas uma dosagem preferida para administração endovenosa do ADN é de entre cerca de 106 e 1012 cópias da moléculas de ADN. Pode monitorizar-se o progresso por avaliação periódica. As composições da invenção podem ser administradas localmente ou sistemicamente. A administração será em geral parentérica, por exemplo, endovenosa; o ADN também pode ser administrado directamente no local alvejado, por exemplo, por bombardeamento com projécteis revestidos com a composição (biolistica) de um local alvo, interno ou externo, ou com um cateter numa artéria até ao local. As preparações para administração parentérica incluem soluções aquosas ou não aquosas, suspensões, e emulsões. São exemplos de solventes não aquosos o propilenoglicol, o polietilenoglicol, os óleos vegetais 27 tais como o azeite, e ésteres orgânicos injectáveis, tais como oleato de etilo. Incluem-se nos veiculos aquosos a água, soluções alcoólicas aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soro salino e meios tamponizados. Incluem-se nos veiculos parentéricos uma solução de cloreto de sódio, de dextrose de Ringer, de dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer lactada, ou óleos fixos. Incluem-se nos veiculos endovenosos cargas fluidas e nutrientes, complementos do electrólito (tais como os que se baseiam na dextrose de Ringer), e outros semelhantes. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e gases inertes, e outros semelhantes.

Adicionalmente, a invenção diz respeito a uma composição diagnóstica incluindo a molécula de ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento, o vector tal como se descreveu acima neste documento, o iniciador ou par de iniciadores tal como se descreveram acima neste documento, e/ou o anticorpo, aptâmero e/ou fago tal como se descreveram acima neste documento. A composição para diagnóstico é útil para avaliar o estado genético da pessoa com respeito à sua predisposição para desenvolver hipolactasia do tipo da dos adultos ou com respeito ao diagnóstico de um estado agudo. As diversas componentes possíveis da composição para diagnóstico podem ser empacotadas em um ou mais frascos, num solvente ou de outra forma tal como uma forma 28 liofilizada. Quando dissolvida num solvente, a composição para diagnóstico é preferivelmente arrefecida até pelo menos entre + 8°C e +4°C. Pode ser preferida uma congelação noutros casos. A invenção também diz respeito a um método para testar a presença de ou a predisposição para hipolactasia do tipo da dos adultos ou de traços associados, que inclui testar-se uma amostra obtida de um possível paciente ou de uma pessoa que se suspeita ser portadora de uma predisposição deste tipo à presença da molécula de ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento num estado homozigótico ou heterozigótico. Em concretizações diversas, pode testar-se quer a presença da(s) sequência (s) de tipo selvagem, quer a presença da(s) sequência(s) mutante(s). 0 método da invenção é útil para detectar o perfil genético da referida pessoa/paciente e dele retirar as conclusões apropriadas acerca de a hipolactasia do tipo da dos adultos ser ou não o estado de que o referido sujeito padece. Em alternativa, pode avaliar-se se uma pessoa que não sofre deste estado tem uma predisposição para a hipolactasia do tipo da dos adultos. No que toca à posição -13910 a montante do gene LPH, só quando existe citosina num estado homozigótico é que um estado será diagnosticado como hipolactasia do tipo da dos adultos ou se manifestará uma predisposição correspondente. Por outro lado, caso se encontre timidina num estado homozigótico ou 29 se o indivíduo for heterozigótico (C/T), então pode concluir-se que o estado de que o indivíduo sofra não se relaciona com uma hipolactasia do tipo da dos adultos e além disso, que o paciente não é portador de uma predisposição para desenvolver este estado. Pode, no entanto, concluir-se que crianças de pessoas portadoras do qenótipo heteroziqótico poderão desenvolver este estado se o cromossoma portador do resíduo C vier a emparelhar-se com um cromossoma correspondente proveniente do outro progenitor. A situação é semelhante e aplicam-se essencialmente as mesmas conclusões para a análise da SNP na posição -22018. Um resíduo G ocorrendo homozigoticamente marca uma predisposição para ou a ocorrência de hipolactasia aguda do tipo da dos adultos. Um estado heterozigótico G/A correlaciona-se com uma alta probabilidade de não desenvolver o estado. Os indivíduos portadores de A num estado homozigótico provavelmente não desenvolverão este estado. De forma semelhantes, os pacientes que sofram de um estado seriam diagnosticados como não sofrendo de hipolactasia do tipo da dos adultos.

Numa concretização preferida do método da invenção, o teste referido inclui hibridizar-se a molécula de ácido nucleico complementar tal como se descreveu acima neste documento, que é complementar da molécula de ácido nucleico que contribui ou é indicativa de hipolactasia do tipo da dos adultos ou a molécula de ácido nucleico tal 30 como se descreveu acima neste documento que é complementar da sequência de tipo selvagem a titulo de sonda em condições (fortemente) restritivas, a uma molécula de ácido nucleico incluida na referida amostra e detectar-se a referida hibridização.

Mais uma vez, consoante a sonda de ácido nucleico utilizada, detectar-se-iam quer as sequências de tipo selvagem, quer a mutante (isto é, sequências contribuindo para ou indicativas de hipolactasia do tipo da dos adultos). Entende-se que as condições de hibridização seriam seleccionadas de tal modo que a molécula de ácido nucleico complementar às sequências de tipo selvagem não se hibridizaria, ou essencialmente não se hibridizaria com a sequência mutante. De forma semelhante, a molécula de ácido nucleico complementar da sequência mutante não se hibridizaria, ou essencialmente não se hibridizaria com a sequência de tipo selvagem. Para diferenciar entre os resultados obtidos de genótipos homozigóticos e heterozigóticos nos métodos de hibridização da invenção, pode por exemplo monitorizar-se/detectar-se a intensidade do sinal de detecção respectivo depois da hibridização. Para se diferenciar entre alelos de tipo selvagem homozigóticos, heterozigóticos e/ou mutantes homozigóticos, nos métodos de hibridização da invenção, incluir-se-ão amostra de controlo interno dos genótipos correspondentes na análise. 31

Em mais uma concretização preferida, o método da invenção inclui também digerir-se o produto da referida hibridização com uma endonuclease de restrição ou sujeitar-se o produto da referida hibridização a uma digestão com uma endonuclease de restrição e analisar-se o produto da digestão referida.

Esta concretização preferida da invenção permite por meios convenientes, a diferenciação entre uma hibridização de facto e uma hibridização não eficaz. Por exemplo, se a sequência de ADN adjacente à posição -13910 ou à posição -22018 incluir um local de endonuclease de restrição, o produto hibridizado será clivável por um enzima de restrição apropriado quando sofreu uma hibridização eficaz, enquanto uma falta de hibridização não originará produto de dupla cadeia ou o produto não conterá o local de restrição reconhecível e, portanto, não será clivado. Em especial, os enzimas de restrição específicos para a sequência da variante de ADN C/T-13910 é CviJ I, para a variante de ADN G/A-22018 são os Hhal e Aci I. Os enzimas de restrição referidos que cortam rg/cy foram encontrados utilizando o programa Webcutter. A análise do produto de digestão pode ser levada a cabo por meios convencionais, tal como por electroforese sobre gel, que pode opcionalmente ser combinada com uma contrastação do ácido nucleico com, por exemplo, brometo de etídio. Também se encaram combinações com outras técnicas, tais como transferência Southern. 32

Pode conseguir-se a detecção da hibridização referida, por exemplo, com um anticorpo anti-ADN de cadeia dupla ou empregando um oligonucleótido marcado. De uma forma conveniente, o método da invenção é empregue em conjunto com técnicas de transferência tais como as de transferência Southern ou Northern, e com técnicas relacionadas. A marcação pode ser levada a cabo, por exemplo, por protocolos padrão, e inclui marcação com marcadores radioactivos, com marcadores fluorescentes, fosforescente, quimioluminescentes, marcadores enzimáticos, etc. (veja-se também acima).

De acordo com quanto consta acima, noutra concretização do método preferido da invenção, a sonda referida é marcada de forma detectável, por exemplo pelos métodos e recorrendo aos marcadores que se descreveram acima neste documento.

Noutra concretização preferida ainda do método da invenção, o teste referido inclui determinar-se a sequência de ácido nucleico de pelo menos uma porção da molécula de ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento, desde que a porção referida inclua a posição nucleotidica -13910 e/ou a posição nucleotidica -22018 do gene LPH.

Pode levar-se a cabo a determinação da molécula de ácido nucleico de acordo com um dos protocolos convencionais, tais como os protocolos de Sanger ou de 33

Maxam/Gilbert (veja-se Sambrook et al., loc. cit., para mais pormenores).

Em mais uma concretização preferida do método da invenção leva-se a cabo a deternminação da sequência de ácido nucleico por mini-sequenciação em fase sólida. A mini-sequenciação em fase sólida baseia-se numa análise quantitativa de uma solução do nucleótido de tipo selvagem e do mutante. Em primeiro lugar, amplifica-se por PCR a região genómica contendo a mutação, com um iniciador biotinilado e um iniciador não biotinilado, em que o iniciador biotinilado é ligado a uma placa revestida com estreptavidina (SA) . Desnatura-se o produto de PCR a uma sua forma de cadeia singela para permitir que um iniciador da mini-sequenciação se ligue a esta cadeia logo antes do local da mutação. Os nucleótidos mutado e selvagem marcados com tritio (H3) ou com marcador fluorescente, em conjunto com dNTP não marcados, são adicionados à mistura de mini-sequenciação sequenciados utilizando Taq polimerase. 0 resultado baseia-se na quantidade de nucleótidos de tipo selvagem e mutante na mistura reaccional, medidos com um contador beta ou com um fluorimetro, e expressos sob a forma de uma razão R. Veja-se também Syva nen AC, Sajantila A, Lukka M. Am. J. Hum. Genet, 1993: 52, 46-59 e Suomalainen A. e Syvanen AC. Methods Mol. Biol. 1996; 65: 73-79.

Uma concretização preferida do método da invenção inclui também antes de se determinar o referido a 34 sequência de ácido nucleico referida, amplificar-se pelo menos a referida porção da referida molécula de ácido nucleico.

Preferivelmente, a amplificação é levada a cabo por reacção de polimerase em cadeia (PCR). Também podem ser utilizados outros métodos de amplificação, tais como a reacção de ligase em cadeia.

Numa concretização preferida do método da invenção o teste referido inclui levar- se a cabo uma reacção de amplificação na qual pelo menos um dos iniciadores empregues na reacção de amplificação referida é o iniciador tal como se descreveu acima neste documento, ou pertence ao para de iniciadores tal como se descreveu acima neste documento, incluindo determinar-se um produto de amplificação. Nesta concretização e consoante a informação que o investigador/médico pretenda obter, podem ser empregues iniciadores hibridizando-se com sequências que sejam quer do tipo selvagem, quer mutantes. 0 método da invenção resultará numa amplificação apenas da sequência alvo, caso a sequência alvo contenha uma sequência exactamente complementar da do iniciador utilizado para a hibridização. Isto deve-se a que o polinucleótido iniciador em condições de hibridização preferivelmente (fortemente) selectivas, não se hibridizará com a sequência de tipo selvagem/mutante - dependendo de qual o tipo de iniciador utilizado - (com a consequência de 35 que não se obtém nenhum produto de amplificaão), mas apenas com a sequência exactamente correspondente. Podem naturalmente utilizar-se combinações de pares de iniciadores hibridizando-se com ambas as SNP. Neste caso, a análise dos produtos de amplificação esperados (que podem ser nenhum, um, dois, três ou quatro produto (s) de amplificação caso o segundo iniciador, não diferenciante, seja o mesmo para cada local) proporcionando informação acerca do estado genético de ambas as posições, - 13910 e -22018.

Numa concretização preferida do método da invenção, a amplificação referida é levada a cabo por reacção de polimerase em cadeia (PCR). A PCR está bem estabelecida na técnica. Incluem-se nas condições tipicas que se utilizam de acordo com a invenção presente, por exemplo, um total de 35 ciclos para um total de volume de 50 pL, exemplificado com um passo de desnaturação a 93°C durante 3 minutos; um passo de recozimento a 55°C durante 30 segundos; um passo de extensão a 72°C durante 75 segundos e um passo final de extensão a 72°C durante 10 minutos. A invenção diz além disto respeito a um método para testar a presença de, ou a predisposição para, hipolactasia do tipo da dos adultos, que inclua ensaiar-se uma amostra obtida de um ser humano quanto à ligação especifica ao anticorpo, ou aptâmero, ou fago, tal como se 36 descreveu acima neste documento. Neste contexto observar-se-á uma contrastação mais fraca aquando da presença de antigénio da invenção, em comparação com as amostras homozigóticas de tipo selvagem utilizadas para controlo (incluindo dois alelos persistentes), é indicativa do tipo selvagem heterozigótico (um alelo persistente e um alelo hipolactásico, enquanto que para o indivíduo hipolactásico homozigótico não se espera qualquer contrastação quando se utiliza o anticorpo apropriado. Preferivelmente, o método da invenção é levado a cabo na presença de amostras de controlo correspondente a todas as três combinações de alelos possíveis, a título de controlos internos. Pode conduzir-se o teste com um anticorpo, etc., que seja específico para a sequência de tipo selvagem ou que seja específico para a sequência mutante.

Mais uma vez, quando se testa a ligação, pode envolver-se a utilização de técnicas-padrão, tais como ELISA; veja-se, por exemplo, Harlow e Lane53, loc. cit.

Numa concretização preferida do método da invenção, o referido anticorpo ou aptâmero ou fago é marcado de forma detectável.

Se por um lado os aptâmeros são preferivelmente marcados radioactivamente com 3H ou com 32P, ou com um marcador fluorescente tal como se descreveu acima, o fago ou o anticorpo podem ser marcados quer de uma forma correspondente (com 131I a título de marcador radioactivo 37 preferido) ou ser marcados com um marcador tal como His-tag, FLAG-tag ou myc-tag.

Numa concretização preferida adicional do método da invenção, o teste é um imuno-ensaio.

Noutra concretização preferida do método da invenção, a amostra referida é sangue, soro, plasma, tecido fetal, saliva, urina, tecido das mucosas, muco, tecido vaginal, tecido fetal obtido da vagina, pele, cabelo, foliculo de cabelo ou outro tecido humano.

Numa concretização preferida adicional do método da invenção, a referida molécula de ácido nucleico da amostra referida é fixada sobre um suporte sólido. A fixação da molécula de ácido nucleico sobre um suporte sólido permitirá uma manipulação fácil do ensaio em teste e além disto, pelo menos alguns suportes sólidos tais como aparas, hóstias de sílica ou placas de microtitulação permitem a análise em simultâneo de maiores números de amostras. De uma forma ideal, o suporte sólido permite que se conduza o teste sob automação, empregando, por exemplo, dispositivos robóticos.

Numa concretização especialmente preferida do método da invenção o referido suporte é uma apara, uma hóstia de sílica, uma pérola ou uma placa de microtitulação. 38

Além disto, a invenção diz respeito à molécula de ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento para a utilização na análise da presença de ou da predisposição para a hipolactasia do tipo da dos adultos. A molécula de ácido nucleico permite simultaneamente a análise da ausência do estado ou da predisposição para o estado, tal como se descreveu em pormenor acima neste documento.

Além disto, a diz respeito a um estojo incluindo a molécula de ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento, o iniciador ou par de iniciadores tal como se descreveram acima neste documento, o vector tal como se descreveu acima neste documento, e/ou o anticorpo, aptâmero e/ou fago tal como se descreveram acima neste documento, num ou em diversos contentores.

Também se descreveu neste documento a utilização da molécula de ácido nucleico tal como se descreveu acima neste documento ou do vector tal como se descreveu acima neste documento, em terapia genética.

As vias de terapia genética têm sido descritas acima neste documento em ligação ao vector da invenção e também se aplicam aqui. Também os fragmentos da molécula de ácido nucleicos tal como se definiram neste documento, acima e tal como, em especial, se representa nas SEQ ID NO: 39 3 e 4, tal como descritos neste documento para serem empregues em vias de terapia genética. Os fragmentos referidos incluem o nucleótido na posição -13910 tal como se definiu em (c) acima neste documento (e também se ilustra pela SEQ ID NO: 3) ou o na posição -22018 tal como se definiu em (d) acima neste documento (e tal como se ilustra na SEQ ID NO: 4) . Preferivelmente, os fragmentos referidos incluem pelo menos 200, pelo menos 250, pelo menos 300, pelo menos 400 e de preferência pelo menos 500 nucleótidos.

Também se descreveu neste documento que a referida terapia genética trata ou evita a hipolactasia do tipo da dos adultos.

As figuras mostram:

Fig. 1: Estudaram-se familias Finlandesas com hipolactasia do tipo da dos adultos. Os simbolos cheios a negro indicam individuos com hipolactasia, o asterisco (*) indica que não se encontrava disponivel nenhuma amostra, um ponto de interrogação (?) indica um estado de afectação desconhecido. t indica os individuos utilizados para sequenciação para identificação das SNP (Tabela 2). 40

Fig 2: Mapa físico do local da hipolactasia do tipo da dos adultos. Ilustram-se os clones BAC acima da linha horizontal. Ilustram-se os três genes LPH, MCM6 e DARS por setas negras espessas apontando para o terminal 3 do gene acima das caixas negras. Ilustra-se a posição dos 10 marcadores micro-satélites polimórficos utilizados para o mapeamento pormenorizado do local. Os símbolos // na linha horizontal denotam uma interrupção da sequência representada. A posição do marcador D2S2169 foi confirmada ligando a folga através de PAC 106020 isolado da biblioteca de PAC tal como se descreveu anteriormente40. A organização do gene MCM6 está ilustrada incluindo a posição do fenótipo de persistência da lactase na variante correspondente, nos intrões 9 e 13 localizados a 13,9 kb e a 22 kb a 5' do primeiro ATG de LPH.

Fig. 3: Análise estendida do haplotipo dos cromossomas persistentes derivados das famílias Finlandesas com hipolactasia do tipo da dos adultos utilizando sete micro-satélites marcadores ligados de perto. Os haplotipos representando o cromossoma persistente fundador ancestral 41 estão sombreados. Só estão ilustrados os haplotipos de cromossomas não persistentes que também estavam presentes nos cromossomas persistentes. Com base nas recombinações ancestrais, o local da hipolactasia do tipo da dos adultos conseguiu ser restringido a um intervalo de 47 kb entre os marcadores LPHl e AC3.

Fig. 4: A sequência incluída na sequência do intrão 13 do gene MCM6 (3220 pb) incluindo a SNP na posição -13910 na qual a T, que é especifica para a persistência da lactase, se encontra substituída por uma C. Indica-se a posição referida pela utilização de uma letra minúscula. Esta sequência refere-se à SEQ ID NO: 1.

Fig. 5: A sequência incluída na sequência do intrão 9 do gene MCM6 (1295 pb) incluindo a SNP na posição -22018 na qual a A, que é específica para a sequência do tipo de persistência da lactase é substituída por uma G. Indica-se a posição referida pela utilização de uma letra minúscula. Esta sequência refere-se à SEQ ID NO: 2.

Fig. 6: A sequência incluída na sequência do intrão 13 do gene MCM6 (3220 pb) 42 incluindo na posição -13910 uma T. Indica-se a posição referida pela utilização de uma letra minúscula. Esta sequência refere-se à SEQ ID NO: 3.

Fig. 7: A sequência incluída na sequência do intrão 9 do gene MCM6 (1295 pb) incluindo na posição -22018 uma A. Indica-se a posição referida pela utilização de uma letra minúscula. Esta sequência refere-se à SEQ ID NO: 4.

Fig. 8: A sequência do intrão 13 do gene MCM6 (3220 pp) incluindo a SNP na posição - 13910, na qual a T, que é específica para a sequência do tipo de persistência da lactase é substituída por uma C. Indica-se a posição referida pela utilização de uma letra minúscula. Esta sequência refere-se à SEQ ID NO: 5.

Fig. 9: A sequência do intrão 9 do gene MCM6 (1295 pb) incluindo a SNP na posição - 22018 na qual a A, que é específica para a sequência do tipo de persistência da lactase é substituída por uma G. Indica-se a posição referida pela utilização de uma letra minúscula. Esta sequência refere-se à SEQ ID NO: 6.

Os exemplos ilustram a invenção.

Exemplo 1: Análise de ligação e de desequilíbrio da ligação

Analisaram-se sete micro-satélites marcadores polimórficos entre D2S114 e D2S2385, flanqueando o gene LPH em 2q21, em 9 famílias Finlandesas no sentido lato, com hipolactasia (Fig. 1) . Observaram-se dados significativos sobre ligação a partir dos marcadores D2S314, D2S442, D2S2196 e D2S1334, com uma classificação de carga máxima de 7,67 a Θ = 0 obtida para o marcador D2S2196 (Tabela 1) . Detectaram-se acontecimentos obrigatórios de recombinação com o marcador D2S114 (família B, IV3), o que define a fronteira centromérica para o local da persistência/não persistência da lactase, e com o marcador D2S2385 (família B, IV17) (Fig. 1, Tabela 1), que define o a fronteira telomérica do local. No mapa pormenorizado da região crítica, analisaram-se mais nove marcadores polimórficos (Tabela 1) . Monitorizou-se a ligação desequilibrada (LD) por toda a região, condicionada à ligação detectada tratando as frequências dos alelos e a fracção de recombinação como parâmetros de ruído16" 17. Seis de nove marcadores (LPH13, LPH2, LPH1, AC3, AC4, e AC10), cobrindo um intervalo de -200 kb mostraram sinais fortemente significativos de LD (p < 10"4) enquanto os marcadores a 3' do gene LPH não apresentavam quaisquer dados de LD (Tabela 1) . Dois marcadores, LPH2 e AC3, apresentavam o 44 desequilíbrio de ligação mais significativo nos alelos de persistência da lactase (p<10“7) . 0 material acerca das famílias era constituído por nove genealogias Finlandesas estendidas originalmente estudadas por Sahi5. Testou-se todo o material sobre as famílias quanto a hipolactasia do tipo da dos adultos na década de 1970. O material familiar para este estudo foi enriquecido obtendo-se ADN dos membros das famílias pertencendo às gerações mais jovens. O material de famílias para este estudo respeitava no total a 194 indivíduos (Fig. 1) . Confirmou-se o estado fenotípico de todos os membros das famílias recorrendo a testes de tolerância à lactose com etanol (LTTE)4”5 em todos menos 49 indivíduos. Excluiu-se a enteropatia ao glúten em todos os pacientes afectados, medindo a transglutaminase anti-tecido no IgA do soro45. Extraiu-se ADN de amostras de sangue obtidas de todos os membros das famílias participantes recorrendo a protocolos padrão48, depois de se obter o seu consentimento informado. A título de caso de controlo no estudo, sequenciaram-se 196 amostras aleatórias de ADN isoladas de espécimenes de biópsias em jejum para os quais e haviam determinado as actividades de dissacaridase47 no Hospital de Universidade de Helsínquia. Isolou-se ADN de biópsias intestinais de acordo com o protocolo padrão48. Esta série incluía 137 amostras com lactase persistente e 59 amostras não persistentes. Além disto, analisou-se ADN provenientes de nove amostras provenientes de biópsias intestinais Italianas, amavelmente cedidas por M. Rossi, Universidade 45 de Nápoles, nove amostras de ADN Alemão, amavelmente cedidas por M. Lentze, Universidade de Bona e vinte e duas amostras da Coreia do Sul, amavelmente cedidas por J.K. Seo, Universidade Nacional de Seul, (Na tabela: 23 Coreanas, 9 Italianas e 7 Alemãs (Um dos casos Alemães tinha origem na Coreia do Sul). 0 diagnóstico baseou-se na medição das actividades de dissacaridase. Por último, para se determinar a frequência da variante C/T-13910 na população Finlandesa, analisaram-se os ADN de 938 doadores de sangue anónimos Finlandeses de pequenas paróquias da Finlândia leste e Oeste, bem como o ADNA de 109 progenitores pertencendo a familias CEPH19. Além disto, analisou-se o ADN genómico de um babuino (Papio hemedryas ussinus), isolado de uma biópsia hepática utilizando protocolos padrão48. O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética do Hospital da Universidade de Helsínquia e pelo Serviço de Transfusões de Sangue da Cruz Vermelha Finlandesa.

Exemplo 2: Análise estendida do haplotipo

No primeiro estádio analisaram-se dez micro-satélites marcadores fortemente polimórficos flanqueando o gene LPH em 2q21, tal como se descreveu noutro local40'55. Em suma, analisaram-se os dez micro-satélites marcadores fortemente polimórficos em 2q na vizinhança do gene da lactase provenientes do The Généthon Resource Center55 com distâncias genéticas, como se segue: cen - D2S114 - lcM -D2S1334 - OcM - D2S2196 - OcM - D2S442 - 2cM - D2S314 - 2cM - D2S2385 - lcM - D2S2288 - lcM - D2S397 - lcM - D2S150- 46 lcM - D2S132. A ordem dos marcadores foi sobretudo obtida a partir do mapa YAC contig do cromossoma 2 (Chumakov et al. 199556), suplementado pelo mapa Généthon. Levou-se a cabo uma PCR num volume total de 15 μΐ, contendo 12 ng do ADN matriz, 5 pmol de iniciadores, 0,2 mM em cada nucleótido, 20 mM em Tris.HCl (pH 8,8), 15 mM em (NH4)2S04, 1,5 mM em MgCl2, com 0,1 % de Tween 20, 0,01 % de gelatina e com 0,25 U de Taq polimerase (Dynazyme, Finnzymes). Marcou-se radiologicamente um dos iniciadores no terminal 5' com 32P-γΑΤΡ. Levaram-se a cabo as reacções numa placa de microtitulação com diversos poços ao longo de 35 ciclos, com desnaturação a 94°C durante 30 s, recozimento a diversas temperaturas consoante os iniciadores durante 30 s e extensão a 72°C durante 30 s; ajustou-se a desnaturação a 3 minutos e a extensão final a 5 minutos. Separaram-se os fragmentos amplificados sobre um gel de poliacrilamida a 6 %, e obteve-se uma auto-radiografia.

No segundo estádio, identificaram-se nove micro-satélites marcadores adicionais no contig construído sobre o gene LPH a partir da sequência genómica publicada dos BAC (NH034L23, NH0318L13, NH0218L22, e RP11-32911), utilizando o programa Repeat Masker (hftp://ftp.genome.Washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker). Sintetizaram-se os iniciadores flanqueando as repetições. As condições da PCR forma descritas noutro local40. Separaram-se os fragmentos amplificados sobre um gel de poliacrilamida a 6 %, e obteve-se uma auto-radiografia. 47

Calcularam-se as classificações lod emparelhadas utilizando a opção MLINK do pacote de programas LINKAGE49. Assumiu-se uma herança recessiva autossomal para a hipolactasia do tipo da dos adultos, com penetração completa, sem diferença sexual nas fracções de recombinação, e uma frequência do alelo da doença de 0,4. Só se incluiram no estudo individuos com mais do que 20 anos de idade uma vez que o estado se manifesta por essa altura na população Finlandesa5"6. O estado de afectação para os individuos não confirmados por LTTE foi considerado desconhecido. Estimaram-se as frequências dos alelos e ad heterozigoticidades para os marcadores a partir do material familiar, utilizando o programa Downfreq para o objectivo da análise dos parâmetros de ligação49. Além disto, levaram-se a cabo análises de ligação de pseudo-marcadores e de desequilíbrio de ligação, assumindo um modo de herança recessivo autossomal16. Levou-se a cabo um teste da LD condicionada pela ligação detectada, tratando as frequências dos alelos e a fracção de recombinação como parâmetros de ruído16,49. Listam-se os valores de p destas análises na Tabela 1. Construíram-se manualmente os haplotipos para os micro-satélites marcadores pela ordem seguinte: LPH1-LPH2-LPH13-AC7-AC3-AC4-AC5 (Fig. 3). Estavam disponíveis no material familiar, um total de 54 cromossomas não persistentes e de 33 cromossomas persistentes, para análise de haplotipo.

Confirmou-se a ordem dos marcadores ligados de perto montando quatro clones BAC, NH0034L23, NH0218L22, 48 NH0318L13 e 329110, na região crítica para se obter um segmento não interrompido de sequência. Este contig estendia-se do marcador AC8 ao exão 10 do gene da aspartil-tARN sintetase (DARS), cobrindo no total 222,5 kb (Fig. 2). Com base neste mapa físico da região ligada, construíram-se haplotipos estendidos com sete marcadores cobrindo um intervalo de 150 kb (cen-LPH13-LPH2-LPHl-AC7-AC3-AC4-AC5-tel) (Fig. 3). Um halotipo principal estava presente em 20 alelos de persistência (60 %) e apenas em 3 dos alelos de não persistência (5 %) , enquanto uma grande variedade de haplotipos foi observada nos alelos de não persistência, os restantes 40 % dos haplotipos nos alelos de persistência diferiam do haplotipo ancestral de um modo consistente com uma quebra do haplotipo por eventos de recombinação históricos. Com base na análise do haplotipo conservado, foi possível restringir o local para a persistência da lactase a um intervalo de 47 kb entre os marcadores LPH1 e AC3 (Fig.3)

Exemplo 3: Análise da sequência do local da hipolactasia do tipo da dos adultos

Amplificou-se a região de 47 kb entre os marcadores LPH1 e AC3 em fragmentos com sobreposição, por PCR, a partir do ADN genómico de diversos elementos das nove famílias com hipolactasia, e sequenciou-se. A região contém o gene de manutenção minicromossomal (MCM6)18, que ocupa 36 kb da região crítica com 47 kb (Fig. 2) . Não se detectaram variações na região codificante do gene MCM6 mas 49 identificaram-se no total 52 variantes; 43 SNP e 9 polimorfismo de eliminação/inserção, na região critica de 47 kb (Tabela 2) . Só duas das variantes (C/T-13910, G/A-22018) foram associadas com a caracteristica da persistência/não persistência da lactase nas famílias Finlandesas (Tabelas 2 e 3) . A primeira variante associada, C/T_i39io, reside no intrão 13 no gene MCM6, na posição a -13910 pb do primeiro códon ATG do gene LPH. A segunda variante associada, G/A22018, está localizada no intrão 9 do gene MCM6, na posição - 22018 a partir do primeiro códon ATG do gene LPH (Fig.2) . Estas duas variantes, a 8 kb de distância uma da outra, co-segregaram-se por completo com a hipolactasia do tipo da dos adultos em 9 famílias estendidas Finlandesas. Todos os membros das famílias hipolactásicos (não persistentes) eram homozigóticos tanto para C-13910 como para G-22018 (Tabela 3) . De uma forma interessante, ambas estas variantes residem em elementos de repetição, a C/T-13910 num elemento derivado de L2 e a G/A-22018 num elemento Alu.

Experimentalmente, três indivíduos não persistentes, 2 com persistência homozigótica e 2 com persistência heterozigótica que partilhavam um haplotipo semelhantes ao longo da região crítica a partir do nosso material familiar, foram utilizados para a sequenciação. No primeiro estádio (Fig. 1), utilizando um rascunho da sequência genómica dos BAC: NH0034L23, NH0218L22 NH0318L23, e RP-329110 que recobriam a região crítica da hipolactasia do tipo da dos adultos, foram montados a um contig utilizando o programa Sequencher 4 (Gene Codes 50

Corporation). Conceberam-se iniciadores oligonucleotidicos cobrindo a região critica entre os marcadores LPH1 e AC3 (está adiante uma lista dos iniciadores oligonucleotidicos descritos neste documento). Levaram-se a acabo amplificações por PCR num volume de 50 yL com ADN genómico (100 ng), iniciadores (20 ng de cada), dNTP (200 μΜ) , 0,5 U de Taq polimerase (Dynazyme, Finnzymes) num tampão padrão. A maior parte das PCR foi amplificada utilizando as seguintes condições de ciclos PCR: uma desnaturação inicial a 94°C durante 3 minutos, depois 35 ciclos a 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, e 72°C durante 1,25 minutos e uma extensão final a 72 °C lactase 10 minutos, excepto nos casos em que as dimensões dos produtos de PCR eram maiores dos que 1 kb utilizou-se o estojo de extensão Dynazyme (descrevem-se as condições adiante neste documento). Sequenciaram-se os produtos de PCR purificados (15-40 ng) em ciclos, utilizando a quimica do terminador BigDye (PE Biosystems). Analisaram-se os dados utilizando o ABI Sequencing Analysis 3.3 (PE Biosystems) e o Sequencher 4.1 (Gene Codes).

Detecção das variantes de Lactase por Sequenciação:

As amplificações por PCR forma levadas a cabo em volumes de 50 yL com ADN genómico (100 ng), iniciadores (20 ng de cada), dNTP (200 μΜ) , 0,5 U de Taq polimerase (Dynazyme, Finnzymes) num tampão padrão. Ambas as PCR foram amplificadas utilizando as seguintes condições de ciclos de 51 PCR: um ciclo de desnaturação inicial a 94 °C durante 3 minutos, depois 35 ciclos a 94°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, e 72°C durante 1,25 minutos e uma extensão a final a 72°C durante 10 minutos. Purificaram-se os produtos de PCR por reacção anzimática. Sequenciaram-se em ciclos os produtos de PCR purificados (15-40 ng) utilizando química de terminador BigDye (PE Biosystems). Analisaram-se os dados utilizando o ABI Sequencing Analysis 3.3 (PE Biosystems) e o Sequencher 4.1 (Gene Codes).

Despiste das variantes de lactase por mini-sequenciação em fase sólida:

Amplificou-se o fragmento de ADN cobrindo a variante C/T-13910 utilizando um iniciador biotinilado (5' — Bio-CCTCGTTAATACCCACTGACCTA-3') e um iniciador não biotinilado (5'-GTCACTTTGATATGATGAGAGCA-3'). Para a G/A_ 22018, utilizaram-se os iniciadores (5'-Bio-TGCTCAGGACATGCTGATCAA-3') biotinilado e (5'-CTACCCTATCAGTAAAGGCCTA-3') não biotinilado nas condições descritas acima. Capturaram-se 10 pL do produto de PCR num poço de microtitulação revestido com estreptavidina (Lab Systems, Finlândia). Lavaram-se os poços, e desnaturou-se o ADN ligado tal como descrito por Syvãnen et al. (Am. J. Hum. Genet. (1993), 52, 46-59) e por Syvãnen e Landegren (Hum. Mutat. (1994), 3, 172-9). Em 50 pL da mistura reaccional de mini-sequenciação existiam 10 pmoles dos iniciadores de mini-sequenciação para C/T-13915 (5'-GGCAATACAGATAAGATAATGTAG-3' ) , para G/A-22018 (5'- 52 AAAAACAGCATTCTCAGCTGGGC-3'), e 0,1 pL de quer H-dCTP, H-dGTP correspondendo ao alelo de lactase não persistente (a 115 Ci/mmol; Ammersham, UK), quer H-dTTP, H-sATP correspondendo ao alelo de persistência de lactase e adicionou-se a cada poço 0,05 unidades de uma ADN polimerase (Dynazyme II, Finnzymes) no seu tampão.

Incubaram-se as placas de microtitulação durante 20 minutos a 50°C, e lavaram-se os poços. Eluiu-se a detecção, e mediu-se a radioactividade eluida num contador de cintilação liquida (Rackbeta 1209, Wallac, Finlândia). Levaram-se a cabo para cada produto de PCR duas reacções de mini-sequenciação em paralelo.

Iniciadores de PCR e iniciador de detecção para a variante C/T_i39i0:

Iniciador de |GT CAC T T T GATAT GAT GAGAGCA |Tm lSEQ PCR de sentido| Í58 ||ID directo: 1 | InO: \\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\^^^ de [iniciador [detecção:

Tm |SEQ 58 |ID |no : lio

Iniciador jReverso:

Bio- |Bio- |Tm fcCTCGTTAATACCCACTGACCTA Í62

SOU

[Bio- ^TAGGTCAGTGGGTATTAACGAGGT

SEQ ID INO: 9 (SEQ

|ID 53

Exemplo 4: Monitorização das variantes de ADN numa amostra de um estudo caso/controlo

Analisou-se a frequência das variantes C/T-13910 e G/A -22018 em amostras de ADN isoladas de um total de 196 amostras de espécimenes de biopsias intestinais que haviam sido analisadas quanto à sua actividade de dissacaridase, a título de teste para diagnóstico da hipolactasia. No total 59 amostras denotavam deficiência primária em lactase. Seis dos 59 casos (Tabela 3) eram heterozigóticos GA para a variante G/A-22018/ sendo as 53 restantes homozigóticas para o alelo G. Todas as 59 amostras eram homozigóticas para o alelo C da variante C/T-13910· Entre os 137 casos denotando 54 persistência da lactase, 74 mostraram ser homozigóticos para os alelos T e A, sendo 63 heterozigóticos CT e GA e nenhum sendo homozigótico para os alelos C e G, respectivamente nas C/T-13910 e G/A -22018, (Tabela 3) .

Para analisar estas variantes noutras populações, sequenciaram-se amostras de ADN isoladas de espécimenes de biópsias intestinais de 40 casos não Finlandeses com uma deficiência de dissacaridase estabelecida: 23 casos provinham da Coreia do Sul, 9 de Itália e 8 da Alemanha. Um caso Italiano era heterozigótico GA para a G/A_22oi3 enquanto todos os outros 39 casos remanescentes eram homozigóticos CC e GG, respectivamente para a C/T-13910 e para a G/A-22018 (Tabela 3) . Um estudo pormenorizado proporcionou os dados constantes da Tabela 7 representando dados acerca da associação completa da variante C/T-13910 com a hipolactasia bioquimicamente confirmada (não persistência da lactase) em 400 indivíduos de 6 populações diferentes. A variante G/A-22018 foi associada com a não persistência da lactase em 400 de 401 casos.

Exemplo 5: Epidemiologia molecular da variante de persistência de lactase C/T-13910

Para monitorizar a prevalência da variante associada com a hipolactasia na população Finlandesa, utilizou-se um método de mini-sequenciação em fase sólida19,20 para despistar amostras de ADN de 938 doadores de sangue Finlandeses anónimos provenientes quer da região 55

Oeste com povoamento mais antigo, quer da região Leste de povoamento da Finlândia (Tabela 4). Experimentalmente, amplificou-se o fragmento de ADN cobrindo a variante C/T.i39io utilizando um iniciador biotinilado (5 * — CCTCGTTAATACCCCTGACCTA-3') e um iniciador não biotinilado (5'-GTCACTTTGATATGATGAGAGCA-3' ) . Para a variante G/A_22oi8 utilizou-se um iniciador biotinilado (5'— AGTCTGTGGCATGTGTCTTCATG-3') e um iniciador não biotinilado ('5-TGCTCAGGACATGCTGATCAACT-3'), nas condições que se descreveram acima. Capturaram-se 10 pL do produto de PCR num poço de microtitulação revestido com estreptavidina (Lab system, Finlândia). lavaram-se os poços, e desnaturou-se o ADN ligado tal como se descreveu anteriormente19,20. Em 50 pL da mistura reaccional de mini-sequenciação estão 10 pmoles dos iniciadores de mini-sequenciação para G/A-22005 (5 '-GACAAAGGTGTGAGCCACCG-3 ' ) , para G/A-13915 (5 ' -GGCAATACAGATAAGATAATGTAG-3') e adicionou-se a cada poço 0,1 pL quer de H-dCTP correspondente ao alelo de não persistência da lactase (115 Ci/mmol; Amersham, UK), quer H-dTTP correspondente ao alelo da persistência da lactase e 0,05 unidades de ADN polimerase (Dynazyme II, Finnzymes), no seu tampão. Incubaram-se as placas de microtitulação durante 20 minutos a 50°C, e lavaram-se os poços. Eluiu-se o iniciador de detecção, e mediu-se a radioactividade eluida num contador de cintilação liquida (Rackbeta 1209,

Wallac, Finlândia). Conduziram-se duas reacções de mini- sequenciação em paralelo para cada produto de PCR . A prevalência global do genótipo putativamente de hipolactasia CC-13910 (170 casos) foi de 18,1 %, com uma 56 maior prevalência (16,8% em relação a 18,9 %) na amostra do oeste do que na do leste (Tabela 4). Estes valores concordam bem com o estudo epidemiológico descrevendo uma prevalência de 17 % entre os Finlandeses que falam Finlandês, com um gradiente crescente do Oeste para o Leste2, também se genotipou o mesmo conjunto de amostras quanto ao seu polimorfismo G/A-22018, e monitorizou-se a LD entre estas duas SNP utilizando a estatística D' Verificou-se que estavam numa LD quase completa (D' = 0,98, p = 7,62 x 10-11, Tabela 5).

Sabe-se que a prevalência da hipolactasia em populações diferentes varia muito, desde menos do que 5 % até quase 100 %3,6. Para se determinar se estas alterações da prevalência da hipolactasia se correlacionaria com a distribuição do genótipo CC-13910, analisou-se o ADN dos progenitores das famílias CEPH22. As famílias CEPH provêm sobretudo de França, com uma prevalência descrita de hipolactasia de cerca de 37 %23, e do Utah, originando as populações do Utah da Europa Norte, com uma prevalência de hipolactasia inferior a 5 %24. Genotipando os progenitores das famílias CEPH revelou-se que 41,2 % (7 de 17 amostras) de famílias Francesas possuíam o genótipo CC, enquanto apenas 7,6 % (7 de 92 amostras) das famílias do Utah possuíam o gene CC (Tabela 4) . mais uma vez, apesar do pequeno número de amostras analisadas, estes números concordam com os valores obtidos nos estudos epidemiológicos da hipolactasia nestas populações ' . 57 A Tabela 8 demonstra que a prevalência observada das variantes concorda bem com a as frequências de intolerância à lactose descritas para as populações.

Exemplo 6: A genealogia da variante de persistência da lactase C/T_i39io A análise do haplotipo nas famílias Finlandesas sugeria que a maior parte se não a totalidade dos alelos de persistência da lactase na Finlândia descenderam de um antepassado comum. Utilizou-se o desequilíbrio da ligação para se estimar o momento da introdução do alelo de persistência na população Finlandesa25. Assumindo 20 anos por geração, esta estimativa indicaria que a mutação fundadora havia sido introduzida na população Finlandesa há 9.000-11.400 anos (Tabela 6). Isto concorda bem com os sinais mais antigos da presença de habitantes na parte Finlandesa do continente, há alguns 8.000-9.000 anos26, e coincidiria razoavelmente bem com o início das práticas leiteiras em 8.000-10.000 AC27. De uma forma mais importante, a presença da mesma variante de ADN nos alelos de persistência em populações diferentes sugeriria que esta variante é ainda mais antiga e que a mutação havia ocorrido antes da diferenciação das populações analisadas.

Para se obter uma certa perspectiva em relação à origem filogenética do alelo da lactase, sequenciaram-se o intrão 9 e parte do intrão 13 do gene MCM6 de um babuíno (Papio Hamadryas). O genótipo GG e o CC estava presente no 58 ADN de babuínos tanto na G/A_22oi8 como na C/T_13910. isto poderia sugerir que os alelos G e C, respectivamente, reflectem o aparecimento do alelo ancestral, apresentando o tipo da não persistência, e que uma mutação havia transformado este alelo para criar o alelo da persistência. Esta assunção é suportada pela identificação das LD e do halotipo partilhado nos alelos de persistência, em relação a uma elevada diversidade encontrada nos alelos de não persistência.

Exemplo 7: LD emparelhadas das variantes C/T e G/A.

As LD emparelhadas entre C/T-13910 e G/A-22018 foi estimada utilizando a estatística D'21. Estimaram-se as frequências dos haplotipos por verosimilhança máxima, utilizando o programa EH50. Calcula-se D' como o máximo de (D/Dmax, D/Dmin) : em que a medida do desequilíbrio D = hpq—p q, em que hpq é a frequência do haplotipo com o alelo raro em cada local, p e q são as frequências dos alelos raros nos locais 1 e 2, e Dmax = min p (1-p), q (1-q) no caso de D>0, e Dmin = -min pq, (1-p) (1-q) quando D<0. A significância do desvio de D' em relação a 0 foi determinada utilizando a estatística D2 f * \p(\-p)qQ.-q) que se distribui tal como χ2 com 1 df21. 59 Números de acessão de genes. Para os BAC NH0218L22, N0034L34, NH0318L13, e RP11-329110, eles são, respectivamente, AC012551, AC011893, AC011999 e AC016516. os números de acessão para polimorfismos humanos são GenBank AF395607-AF395615.

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Tabela 1. Análises de Ligação e de Desequilíbrio de Ligação nas famílias com hipolactasia do tipo da de adultos (marcadores de mapeamento pormenorizado ilustrados em negrito)

Marcador Classificação lod(Z) a Θ valor de 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 D2S114 — co 2,44 1, 92 1,13 0, 41 0,87195 P6112 2,76 2,20 1,45 0,75 0,22 0,66207 69

Marcador Classificação lod(Z) a Θ valor de p D2S1334 3, 15 2,45 1, 61 0,84 0,25 0,91039 AC 8 2,26 1, 99 1,36 0,71 0,21 0,53670 LPH13 3, 67 2, 94 1, 96 1,03 0,31 4xl0~6 LPH2 4,09 3, 07 2,00 1,00 0,26 5, 7xl0~7 LPH1 5, 91 4,52 2, 96 1,53 0,46 5xl0~6 AC7 3, 63 2, 60 1, 66 0,83 0,23 0,03471 AC3 6, 63 4,88 3,16 1, 61 0,44 32xl0“8 AC4 3, 07 2,22 1,42 0,71 0,19 4xl0~5 AC5 5, 33 4,10 2,72 1,39 0,39 0,02166 AC10 6, 60 4, 99 3,25 1, 65 0,46 lxl0~5 D2S2196 7, 67 5, 62 3, 62 1,85 0,54 0,00010 D2S442 3, 81 3, 08 2, 08 1,03 0,27 0,2805 D2S314 4,22 3, 61 2,50 1,37 0,45 0,27535 D2S2385 — oo 2,79 1, 92 1,01 0,28 0,46457 a: valores de p produzidos utilizando o teste de desequilíbrio da ligação dada a ligação10. 49

Tabela 2. Variações identificadas adentro do local da hipolactasia do tipo da dos adultos em famílias Finlandesas ^sssssssssssssssssssssssssssssssssssv.

Posição

Variante

Persistência Persistência de lactase de lactase Não pe de rsistência lactase (Homozigótica) (Heterozigótica)

-694 A->G BIV4 AA AIV3 AA -1640/50 113 — 112 T13/13 T13/13 -2131 C^T CC CC -3058/72 T15—*T 15 T15/15 T15/15 -3075 G^T GG GG -4480 T->A TT TT -5440 C^T CC CC -5926 A->T AA AA -8540 G->A GG GG

BIV8 CIV3 BIV9 DIV4 EIII2- AG AA GG N° AA T13/13 T13/13 T13/13 T12/12 T12/12 CT CC TT CT* TT T15/15 T15/15 Tl5/15 T16/16 T16/16 GG GG GG GG TT TA TT AA TT TT CT CC TT CC CC AA AA AA TA TT GA GA AA AG AA 70

Posição Variante Persistência de lactase (Homo z i gó t i ca) Persistência de lactase (Heterozigótica) Não persistência de lactase BIV4 AIV3 BIV8 CIV3 BIV9 DIV4 EIII2b -8630 CTG CC CC CG CG GG GC GG -13495 mc TT TT TC TT CC CT CC -13910 1UC TT TT TC TC CC CC CC -15239 G^A GG GG GA GG AA AG AA -15862 1UC CC CC CT CC TT TC TT -16568/79 T11-T12 T11/11 T11/11 T11/12 T11/11 T12/12 T11/11 T12/12 -16888 A->G AA AA GA AA GG GA GG -17300 C^T CC CC CC CC CC CT TT -19044 mc TT TT TC TT CC CT CC -19519 mc TT TT TC TT CC TT TT -20077 C^G CC CC CG CC GG GC GG -20486 G^A GG GG GA GG AA GG GG -21721/28 A7—>Ag A7/7 A7/7 A7/7 A7/7 A7/7 A7/A6 A7/7 -21731 A-^C AA AA AA AA AA CC AA -21736/43 Ag—>Ag A9/9 A9/9 Ag/ Ag A9/9 > CO co > co co > CO CO -22018 G^A AA AA AG AG GG GG GG -22741 C^T CC CC CC CC CC N TT -22788 A-^G AA AA AG AA GG N GG -23069 A-^G AA AA AG AA GG N GG -23442 A-^G AA AA AA AA AA N GG -23771 T^C TT TT TT TT TT N CC -25093/23 Δ30 pb ΔΔ ΔΔ ΔΔ ΔΔ ΔΔ N II -27310 A-^G AA AA AG AA GG GA GG -27480 G^A GG GG GA GG AA AG AA -27807 A-^C AA AA AA AA AA AC GC -30183 A-^G AA AA AG AA GG AA AA -31268 A-^G AA AA AG AA GG AA AA -31342 T^C TT TT TT TT TT CT CC -33645 C^T CC CC CT CC TT CC CC -35176 T^C TT TT TC TT CC CT CC -36254 C^T CC CC CT CC TT TC TT -36296 G^T TT TT TG TT GG TG N -36501 A-^T AA AA AT AA TT AT N -36506/14 Δ 9 pb ΔΔ ΔΔ ΔΙ ΔΔ II ΔΙ N -36671/77 T7-T6 T7/7 T7/7 T7/6 T7/7 T 6/ 6 T7/7 T7/7 -37565 T^G TT TT TG TT GG GG TG -38276 G^C GG GG GC GG CC GG GG -39036 G^C GG N GC N CC N N -40608 G^C GG GG GG GG GG GC CC -41590 mc TT TT TC TT CC CT CC -42081/82 AAG AG AG AG/ Δ AG AG AG ΔΔ -42618 T^C TT TT TC TT CC TT TT -42893 G^A GG GG GA GG AA GG GG a: O Número é da iniciação do códon da tradução (ATG) do 71 71 AXWXW\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\XWXWXW\\\\VXWXWXWXXWX\\\\\\\\\V Posição Variante

Persistência de lactase (Homozigótica)

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX\XX\XX\XX\XXXXXV

Persistência Não persistência de lactase de lactase (Heterozigótica) BIV4 AIV3 BIV8 CIV3 BIV9 DIV4 EIII2b gene LPH utilizando a sequência genómica compilada dos BAC NH034L23, NH0218L22, NH0318L13 e de RP11-329I10, b: os indivíduos sequenciados das famílias Finlandesas estudadas, ilustradas pela seta na fFg.l, c: não determinado xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxto XXXXXXXXXXXXXXXXWXWXWXWXWXWXWXXXXXXXXXXXWXWX^XXXXXXXXXV»

Tabela 3. Distribuição de genótipos de C/T_13910 & de G/A_22oi8 em alelos de lactase persistente/não persistente

Genótipo C/T-13910 CC CT TT G/A-22018 GG GA AA Total Membros da Não persistência 45 0 0 45 0 0 45 família da lactase Persistência da 0 32 13 0 32 13 45 lactase Amostras de controlo de caso Finlandesa Não persistência 59 0 0 53 6 0 59 da lactase Persistência da 0 63 74 0 63 74 137 lactase Não Não persistência 40 0 0 39 10 40 Finlandesa3 da lactase Persistência da 0 5 0 0 5 0 5 lactase Total Não persistência 0 144 da lactase Persistência da 187 lactase a: As amostras não Finlandesas são i constituídas por 23 indivíduos Sul Coreanos, 9 Italianos e 7 Alemães

Tabela 4. Prevalência da variante C/T-13910 em amostras da população 72

Amostras de Genótipo ADN analisadas I. População Finlandesa: CC CT TT 1. Regiões Leste 108 287 176 2. Regiões Oeste 62 159 146 Total II. Progenitores CEPH: 170 446 322 1. Famílias do Utah 7 33 52 2. Famílias Francesas 7 9 1

Total Frequência de alelos (%) C T % do genótipi (CC) 571 0,440 0,560 18, 9% 367 0,385 0, 615 16, 8% 938 0,418 0,582 18,1% 92 0255 0,745 7, 6% 17 0, 676 0,324 41,2%

No total 938 amostras de ADN de doadores de sangue anónimos Finlandeses provenientes de pequenas paróquias das partes Leste e Oeste da Finlândia, e 109 amostras de ADN de progenitores CEPH, A prevalência da hipolactasia nas populações é reflectida pelas frequências do genótipo com alelos CC,_

Tabela 5. LD entre variantes C/T-13910 e G/A-220018 em amostras Finlandesas aleatórias

Genótipo Total ϊν ("Ϊ valor de no C/T_ dt) p 13910_

CC CT TT

Genótipo no G/A- 220018 GG 162 2 1 165 GA 6 440 3 449 AA 2 4 318 324 Total 170 446 322 938 0, 984 42,41 7,62x10-11

Calcularam-se as LD utilizando a estatística D' , o valor de p é a significância de D' a partir de 0, tal como se descreve nos métodos18. 73 73 C/T-13910 na DISLAMB.

Tabela 6. Estimativa da introdução da variante população Finlandesa utilizando o programa

Marcador AC 3 LPH2 Alelo Persistência Não Persistência Não da lactase persistência da da lactase persistência da lactase lactase 1 0 1 0 1 2 31 10 0 20 3 0 1 0 14 4 2 9 32 15 5 0 31 0 2 Xa 0, 838 0, 999 0b 0,00031 (0, 000038-0,00099) 0,0000(0,00000-0,00052) nc 570 450 a: λ é a proporção do aumento de um determinado alelo nos cromossomas da doença (alelo da persistência da lactase) em relação à sua frequência na população (0,60) . b: Θ é a fracção de recombinação, reflectida pela distância entre a mutação e o marcador mais próximo, assumindo que 1 cM = 1 Mb. C: n é o número de gerações desde a introdução da mutação fundadora numa população Aplicando a fórmula λ,= oc (1 —Θ) n d: Alelo hipotético utilizado nos cálculos, sendo Θ zero e oc um.

Tabela 7 Prevalência das variantes de intolerância à lactose em amostras verificadas bioquimicamente C1T13910 G/A22018 Número 1. Finlandesa 2. Italiana cc CT TT GG GA AA Persistência da lactase 182 0 95 87 0 95 87 Não persistência da lactase 116 116 0 0 110 6 0 Persistência da lactase 7 0 7 0 0 7 0 Não persistência da lactase 23 23 0 0 22 1 0 Persistência da 0 0 0 0 0 0 0

População 3. Alemã - 74 - - 74 - População Número CC C1T13910 CT TT GG G/A22018 GA AA lactase Não persistência da lactase 8 8 0 0 8 0 0 4. Somali Persistência da lactase 0 0 0 0 0 0 0 Não persistência da lactase 42 42 0 0 42 0 0 6. Sul Coreana Persistência da lactase 0 0 0 0 0 0 0 Não persistência da lactase 23 23 0 0 23 0 0 Total 401 212 102 87 205 109 87

Tabela 8 Prevalência das variantes de intolerância à lactose em amostras de diversas populações

População % de Prevalência do alelo da persistência da lactase

Genótipo C/T13910 G/A22018 Número

CC CT TT GG GA AA

Sul Coreanos 23 23 0 0 23 0 0 0 ★ Franceses 17 7 9 1 6 10 1 59 * Bascos 85 7 44 34 13 35 37 92 * Italianos do 100 89 11 0 88 12 0 11 * Sul Somalis 79 74 5 0 78 1 0 6 Do Utah 92 7 33 52 7 30 55 92 * Americano- 96 76 15 5 78 12 5 21 * Africanos Marroquinos 90 62 25 3 65 22 3 31 * Sarawhi 57 29 26 2 28 26 3 49 * (Africanos) Saami 30 20 10 0 21 9 0 33 * Tibetanos 23 23 0 0 23 0 0 0 Finlandeses 571 108 287 176 107 288 176 81 * do Leste Finlandeses 367 62 159 146 58 161 148 83 * do Oeste Tribos Finn-ugrianas 75 75 População % de Prevalência do alelo da persistência da lactase

Genótipo C/T13910 G/A22018 Número CC CT TT GG GA AA Xan 20 19 1 0 19 1 0 5 Xm 20 19 1 0 19 1 0 5 Mansi 22 20 2 0 20 2 0 9 Lkomi 10 7 3 0 7 3 0 30 Erza 30 17 10 3 19 9 2 43 Moksa 30 13 17 0 14 16 0 57 * Udmort Tribos 30 12 16 2 11 15 4 60 * Paquistanesas Kalash 30 30 0 0 28 2 0 0 Burusho 30 29 1 0 27 3 0 3 Hazara 14 13 1 0 11 3 0 7 Kashmiri 20 15 5 0 14 6 0 25 Makrani 29 19 10 0 19 8 1 34 Baluch Brahui 30 17 10 3 16 11 3 43 Makrani 29 16 10 3 16 10 3 45 (Negróide) Pathan 29 12 16 1 13 14 2 59 * Indianos 29 11 13 5 10 12 5 62 *

Total 2032 • A prevalência do alelo de persistência da lactase está muito bem correlacionada com as prevalências descritas para o alelo da prevalência da lactase (Simoons Fj ., The geographic hypothesis and lactose malabsorption, Am. J. Dig. Dis. 1978 23 (11) : 963-80)

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> National Public Health Institute PELTONEN, Leena ENATTAH, Nabil JÀRVELÀ, Irma SAHI, Timo SAVILAHTI, Erkki 76 TERWILLIGER, Joseph <120> Identificação de uma variante de ADN associada à hipolactasia do tipo da dos adultos

<130> F 2034 PCT <150> EP 01 11 9377.8 <151> 2001-08-10 <150> EP 01 11 9528.6 <151> 2001-08-14 <150> US 60/315.955 <151> 2001-08-31 <160> 14 <170> Patente na versão 3.1 <210> 1 <211> 180 <212> ADNA <213> Homo sapiens <400> 1 acctttcatt caggaaaaat gtacttagac cctacaatgt actagtaggc ctctgcgctg 60 gcaatacaga taagataatg tagcccctgg cctcaaagga actctcctcc ttaggttgca 120 180 tttgtataat gtttgatttt tagattgtto tttgagccct gcattccacg aggataggtc 77

<210> 2 <211> 180 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 2 60 120 180 taagaacatt ttacactctt cagtataaag aagtcagaat acccctaccc tatcagtaaa ggcctataag ttaccattaa aaagatgtcc ttaaaaacag cattctcagc tgggcgcggt ggctcacacc tttgtcccag tactttggga agccgaggtg ggtggatcac ctgaggtcag

<210> 3 <211> 3213 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 7 atcagagtca ctttgatatg atgagagcag agataaacag atttgttgca tgtttttaat 60 ctttggtatg ggacatacta gaattcactg caaatacatt tttatgtaac tgttgaatgc 120 fccatacgacc atggaattct tccctttaaa gagcfctggta agcatttgag tgtagttgtt 180 agacggagac gatcacgtca tagtttatag agtgcataaa gacgtaagtt accatttaat 240 acctttcatt caggaaaaat gtacttagac cctacaatgt actagtaggc ctctgcgctg 300 gcaatacaga taagataatg tagtccctgg cctcaaagga actctcctcc ttaggttgca 360 tttgtataat gtttgatttt tagattgttc tttgagccct gcattccacg aggataggtc 420 agtgggtatt aacgaggtaa aaggggagta gtacgaaagg gcattcaagc gtcccatctt 480 cgcttcaacc aaagcagccc tgcgttttcc tagttttatt aatagçftttg atgtaaggtc 540 gtctttgaaa agggggtttg gctttttttt acagtgtgac tgaggtataa tttataaaaa 600 gggaaatgfca tggcatggtg agttttttca catacatcct tgtgaatacc cagctcaaga 660 tccaaaacat ttecataatt tcagaaagtt ccaaacccct gcctcttttc agtcttagcc 720 ctcttcccct gaagtaacca ctgttccgac ttcaatcact acttttatcc cacaggttaa 780 ttttttggct tttttocact aaattttcaa attctttgat atggtacttt actattgacg 840 aagtactttc acactaggtt atttaatatt ctttgattca cccaatattt agggaacacc 900 tgtaggggac aaaaaatgaa tgagagcccc tgccttccat tgctgctaat ctggtgggaa 960 cgagacatgt atttaattaa gcatgtaaaa aatagagtgg gtgatgaaat aatctatata 1020 ctaaatcccc atgacacaca gtttaeetat gtaacaaacc tgcatgtgta cccccgaacc 1080 taaaatataa gttggaaatt aaaaaaaaac gagagggaga atagagcatc acaaccagag 1140 tgctgagatg aattacttta ttaccaaaga aggaggagga ctcagggagg tgccgacgtt 1200 taaacccagt cactgaaggg tgtgcagaat ttggataggc aagataccct gggacaaggt 1260 cattctaaaa ccatgctaac atttgtaott tttttttcat tgtgatagtt cctgaaatga 1320 gttgcataaa actggrtacat gtcttagggc agtctctaat tgatttttat tttgttctat 1380 ttttaaaaat tagtcttcaa atagcagatt cacatgatat taaaatatat gcacataaat 1440 tatatacaca aatatatttt ctgaatgaaa tttagtatct goatatattt aagagctatt 1500 tctgtctcat atgttcataa tcttcatcca ttaaaaaaac ttttgttagg cctttctcac 1560 tctaagatta taaaaaattc tcccattatt tacctagcta gttttctagt tgttccaaaa 1620 ccatttattg aacaatccat ctttttgaca ctggtttggc atgccttaat tatatattct 1680 tgtgtgtgtt aggatctcct tttggacttt ccattctgtt cattgagtct tatcagctcc 1740 tcttacattg gtaccatgat gttttaatct atggggcttt gtagtttaaa tgtagggcta 1800 79 gttccagcgc attgttctct atcagctgtt aggaacttag aaatcagctt getctgtttt 1860 aaagaaaaac ctggtatttt tttatcagta taacattcta tttatattaa cttgaagaat 1920 tgaaaacatc tatgattttt cctattcaçft aacgtatcac ttagaatagg ttaggttgta 1980 ctactataaa atctcagctg cataaaacaa tttttttttg cttgtgctac acatccatta 2040 ggtcatcaag ggactcacct tgtcaagtta ctcagagatt caggctgata taaaggtttg 2100 atcttgacat acgctttcat gatgacagaa agcagggaag agaaggtggt gagccatgtg 2160 ctttctcccc cttctatcca gaaatgacac atactcacat ttcattcgcc agagaaatta 2220 acatggcccc tcctaagttc aaatggatag agaaatgcct tcctaccagg tgcccagaat 2280 tagaagagca aacatttgtg aacagttctg agtaccacaa ataccgttat ctttccactt 2340 aagtcttctg tttcactcag tagtgcttta aacttttctt catatgtttt tcagtgtttc 2400 ttgttgaatt tcttgatatt ttatcatgtt tgttcgtact gggagtagcc tttttttcca 2460 tttcattttc tggctggttt eattgctggt tgrtttttttg ttttgttttg tttttgagat 2520 ggagtctcac tctgtcgccc aggctggagt gcagtgtcac aatctcggct cactgcaacc 2580 tctgcctecc aggttcaagc gattcttctt tctcagcctc ctgagtagct gggattacag 2640 gcatgtgcca ccatgcccag ctaatttttt atatttttag tagagatggg gtttctccat 2700 gttggtcagg ctggtctcaa actcccaatc tcaggtgatc cgcctgcctc tgccttccaa 2760 agtgctggga ttatagacat gagccaccgt gcctggccta gttcttatgg gatgtatatg 2820 tctttggatt catatgatat gtatatatgt ttatatttct acaagtacat acctaggagt 2880 ggaattgttg ggtcataggt taatgcatgt ttttctgcca aacagttgtg tcaatttctg 2940 ttttcaccgc tgtgaatgag agttgttcta ccttcttgac aacacttgat attgtcagtc 3000 attttagcca ttctggtgaa tttatagtgc tatttctgtg tgtgtaagag agagaatgag 3060 agagggtgtt tgtgagaaaa ccaaagcaac actgtgagag tgtgtgtgtt tgtgagaaaa 3120 ccaaaataca tactactgtg atttcattgg gagaaaatct gtttggtata tcaaaaaaag 3180 tagcttaatt acttcatcat tattggttta ggt 3213

<210> 4 <211> 1296 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 4 80 taagaacatt ttacactctt cagtataaag aagtcagaat acccctaccc tatcagtaaa 60 ggcctataag ttaccattaa aaagatgtcc ttaaaaacag cattctcagc tgggcacggt 120 ggctcacacc tttgtcccag tactttggga agccgaggtg ggtggatcac ctgaggtcag 180 gagttcgaga ccagcctggc caacatggcg aaaacccatt ttctctacta aaaatacaaa 240 aattagccgg gcatggtggc gggtgcttgt ggtcccagct actcaagagg ctgaggtggg 300 aggatcactg agcccaggag gtggaggctg cattgagcca agattgtgcc actgcactcc 360 agcctgggtg acagagcgag actctgtcto aaaaaaacca aaacaaaaaa aacccagcat 420 tctttagtaa ataattcata gttttcttca tctagaattt aaaattgtga tagttgatca 480 gcatgtcctg agcacgtgtg tttgctgtta ctagtttaga tcggtagatg tgtatataag 540 ttataggtat aaaatcaatc ctgagttgao acaaggtttt gatgttgagt acaagtacag 600 taagtgtata tttttagtta tgctcttagt tttaagtoaa ttgtgtggtt ctttctagct 660 ttaggatctg ttgaattatc ttccttagaa aagggagtta agaatcttca cttacctatc 720 ttctacttgt ttggagaata gaagagtccc tgtggtagca gactttgtga gtttacttgt 780 aattttccat ctgaaagact gttcttgttt ttcgtgatga agtcttgctc tgtcgcccag 840 gctggagtgc agtggtgcaa ccttggctca ctgcaacctc tgcctcccgg gttcaagcaa 900 ttctoctgco tcagcctccc gagtatctgg gattacaggt gcacaccacc acacctggct 960 aatttttgta ttttcagtag agacggggtt tcaccatgtt ggccaggctg gtctcgaact 1020 cttgacctca tgatcagccc acctcagcct tccaaagtgc tgggattaca ggtgtgagcc 1080 cccacactcg gccgttgttg ttttttaaga gacagggtct cactctgtca cctaacctgg 1140 agtacagtgg caatcatggc tcactgtaac ctcaaatgcc cggccttagt gaagcgttct 1200 tcctgccttg gcctcccaaa gtgctgggat tacaagtgtg agccatgcat ccagcttgaa 1260 agacagcttc ttaggcttga tttgtttggt tacagg 1296

<210> 5 <211> 3213 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atcagagtca ctttgatatg atgagagcag agataaacag atttgttgca tgtttttaat 60 ctttggtatg ggacatacta gaattcactg caaatacatt tttatgtaac tgttgaatge 120 tcatacgacc atggaattct tccctttaaa gagcttggta agcatttgag tgtagttgtt 180 agacggagac gatcacgtca tagtttatag agtgcataaa gacgtaagtt accatttaat 240 acctttcatt caggaaaaat gtacttagac cctacaatgt actagtaggc ctctgcgctg 300 gcaatacaga taagataatg tagcccctgg cctcaaagga actctcctcc ttaggttgca 360 81 tttgtataat gtttgatttt tagattgttc tttgagccct gcattccacg aggataggtc 420 agtgggtatt aacgaggtaa aaggggagta gtacgaaagg gcattcaagc gtcccatctt 480 cgcttoaacc aaagcagccc tgcgttttcc tagttttatt aataggtttg atgtaaggtc 540 gtctttgaaa agggggtttg gctttttttt acagtgtgac tgaggtataa tttataaaaa 600 gggaaatgta tggcatggtg agttttttca catacatcct tgtgaatacc cagctcaaga 660 tccaaaacat ttccataatt tcagaaagtt ccaaacccct gcctcttttc agtcttagcc 720 ctcttcccct gaagtaacca ctgttccgac ttcaatcact acttttatcc cacagçfttaa 780 ttttttggct tttttccact aaattttcaa attctttgat atggtacttt actattgacg 840 aagtactttc acactaggtt atttaatatt ctttgattca cccaatattt agggaacacc 900 tgtaggggac aaaaaatgaa tgagagcccc tgccttccat tgctgctaat ctggtgggaa 960 cgagacatgt atttaattaa gcatgtaaaa aatagagtgg gtgatgaaat aatctatata 1020 ctaaatcccc atgacacaca gtttacctat gtaacaaacc tgcatgtgta cccccgaacc 1080 taaaatataa gttggaaatt aaaaaaaaac gagagggaga atagagcatc acaaccagag 1140 tgctgagatg aattacttta ttaccaaaga aggaggagga ctcagggagg tgccgacgtt 1200 taaacccagt cactgaaggg tgtgcagaat ttggataggc aagataccct gggacaaggt 1260 cattctaaaa ccatgctaac atttgtactt tttttttcat tgtgatagtt cctgaaatga 1320 gttgcataaa actggtacat gtcttagggc agtctctaat tgatttttat tttgttctat 1380 ttttaaaaat tagtcttoaa atagcagatt cacatgatat taaaatatat gcacataaat 1440 tatatacaca aatatatttt ctgaatgaaa tttagtatct gcatatattt aagagctatt 1500 tctgtctcat atgttcataa tcttcatcca ttaaaaaaac ttttgttagg cctttctcac 1560 tctaagatta taaaaaattc tcccattatt tacctagcta gttttctagt tgttccaaaa 1620 ccatttattg aacaatccab ctttttgaca ctggtttggc atgccttaat tatatattct 1680 tgtgtgtgtt aggatctcct tttggacttt ccattctgtt cattgagtct tatcagctcc 1740 tcttacattg gtaccatgat gttttaatct atggggcttt gtagtttaaa tgtagggcta 1800 gttccagcgc attgttctct atcagctgtt aggaacttag aaatcagctt gctctgtttt 1860 aaagaaaaac ctggtatttt tttatcagta taacattcta tttatattaa cttgaagaat 1920 tgaaaacatc tatgattttt cctattcagt aacgtatcac ttagaatagg ttaggttgta 1980 ctactataaa atctcagctg cataaaacaa tttttttttg cttgtgctac acatccatta 2040 ggtcatcaag ggactcacct tgtcaagtta ctcagagatt caggctgata taaaggtttg 2100 82 atcttgacat acgctttcat gatgacagaa agcagggaag agaaggtggt gagccatgtg 2160 ctttctcccc cttctatcca gaaatgacac atactcacat ttcattcgcc agagaaatta 2220 acatggcccc tcctaagttc aaatggatag agaaatgcct tcctaccagg tgcccagaat 2280 tagaagagca aacatttgtg aacagttctg agtaccacaa ataccgttat ctttccactt 2340 aagtcttctg tttcactcag tagtgcttta aacttttctt catatgtttt tcagtgtttc 2400 ttgttgaatt tcttgatatt ttatcatgtt tgttcgtact gggagtagcc tttttttcca 2460 tttcattttc tggctggttt cattgctggt tgtttttttg ttttgttttg tttttgagat 2520 ggagtctcac tctgtcgccc aggctggagt gcagtgtcac aatctcggct cactgcaacc 2580 tctgcctccc aggttcaagc gattcttctt tctcagcctc ctgagtagct gggattacag 2640 gcatgtgcca ccatgcccag ctaatttttt atatttttag tagagatggg gtttctccat 2700 gttggtcagg ctggtctcaa actcccaatc tcaggtgatc cgcctgcctc tgccttccaa 2760 agtgctggga ttatagacat gagccaccgt gcctggccta gttcttatgg gatgtatatg 2820 tctttggatt catatgatat gtatatatgt ttatatttct acaagtacat acctaggagt 2880 ggaattgttg ggtcataggt taatgcatgt ttttctgcca aacagttçrtg tcaatttctg 2940 ttttcaccgc tgtgaatgag agttgttcta ccttcttgac aacacttgat attgtcagtc 3000 attttagcca ttctggtgaa tttatagtgc tatttctgtg tgtgtaagag agagaatgag 3060 agagggtgtt tgtgagaaaa ccaaagcaac actgtgagag tgtgtgtgtt tgtgagaaaa 3120 ccaaaataca tactactgtg atttcattgg gagaaaatct gtttggtata teaaaaaaag 3180 tagcttaatt acttcatcat tattggttta ggt 3213 <210> 6 <211> 1296 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 taagaacatt ttacactctt cagtataaag aagtcagaat acccctaccc tatcagtaaa 60 ggcctataag ttaccattaa aaagatgtcc ttaaaaacag cattctcagc tgggcgcggt 120 ggctcaçacc tttgtcccag tactttggga agccgaggtg ggtggatcac ctgaggtcag 180 gagttcgaga ccagcctggc caacatggcg aaaacccatt ttctctacta aaaatacaaa 240 aattagccgg gcatggtggc gggtgcttgt ggtcccagct actcaagagg ctgaggtggg 300 aggatcactg agcccaggag gtggaggctg cattgagcca agattgtgcc actgcactcc 360 agcctgggtg acagagcgag actctgtcto aaaaaaacca aaacaaaaaa aacccagcat 420 83 tctttagtaa ataattcata gttttcttca tctagaattt aaaattgtga tagttgatca 480 gcatgtcctg agcacgtgtg tttgctgtta ctagtttaga tcggtagatg tgtatataag 540 ttataggtat aaaatcaatc ctgagttgac acaaggtttt gatgttgagt acaagtacag 600 taagtgtata tttttagtta tgctcttagt tttaagtcaa ttgtgtggtt ctttctagct 660 ttaggatctg ttgaattatc ttccttagaa aagggagtta agaatcttca cttacctatc 720 ttctacttgt ttggagaata gaagagtccc tgtggtagca gactttgtga gtttacttgt 780 aattttccat ctgaaagact gttcttgttt ttcgtgatga agtcttgctc tgtcgcccag 840 gctggagtgc agtggtgcaa ccttggctca ctgcaacctc tgcctecegg gttcaagcaa 900 ttctcctgcc tcagcctccc gagtatctgg gattacaggt gcacaccacc acacctggct 960 aatttttgta ttttcagtag agacggggtt tcaccatgtt ggccaggctg gtctcgaact 1020 ettgacctca tgatcagccc acctcagcct tccaaagtgc tgggattaca ggtgtgagcc 1080 cccacactcg gccgttgttg ttttttaaga gacagggtct cactctgtca cctaacctgg 1140 agtacagtgg caatcatggc tcactgtaac ctcaaatgco cggccttagt gaagcgttct 1200 tcctgccttg gcctcccaaa gtgctgggat tacaagtgtg agccatgcat ccagcttgaa 1260 agacagcttc ttaggcttga tttgtttggt tacagg 1296

<210> 7 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 7 taggtcagtg ggtattaacg aggt 24

<210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> sequência artificial 84 <22 0> <223> iniciador <400> 8 gtcactttga tatgatgaga gca 23 <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 9 cctcgttaat acccactgac cta <210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 10 ggcaatacag ataagataat gtag 24 <210> 11 85

<211> 21 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 11 ttgatcagca tgtcctgagc a 21 <210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 12 ctaccctatc agtaaaggcc ta 22 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> iniciador 86 <4 Ο 0> 13 tgctcaggac atgctgatca a 21

<210> 14 <211> 23 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> Iniciador <4 0 0> 14 aaaaacagca ttctcagctg ggc 23

Lisboa, 3 de Outubro de 2012.

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de ácido nucleico que inclua uma porção 5' de um gene de lactase-florisina hidrolase intestinal (LPH) contribuindo para, ou indicativo de, hipolactasia do tipo da dos adultos, em que a referida molécula de ácido nucleico seja seleccionada de entre o conjunto constituído por: (a) uma molécula de ácido nucleico contendo ou incluindo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, a sequência de SEQ ID NO: 1 também está representada na Fig. 4 e incluída na sequência que se representa na Fig. 8; e (b) uma molécula de ácido nucleico contendo ou incluindo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2, a sequência de SEQ ID NO: 2 também está representada na Fig. 5 e incluída na sequência que se representa na Fig. 9; em que a referida molécula de ácido nucleico se estenda, no máximo, por 30.000 nucleótidos, respectivamente até ao terminal 5' e/ou 3' da molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou 2.

2. Uma molécula de ácido nucleico constituída pela porção 5' de um gene de uma hidrolase de lactase- 2 florizina intestinal (LPH), que contribui para ou é indicativa de uma hipolactasia do tipo da dos adultos, em que a referida molécula de ácido nucleico seja seleccionada de entre o conjunto constituído por: (a) uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 20 nucleótidos cuja cadeia complementar hibridize sob condições restritivas com uma molécula de ácido nucleico apresentando ou contendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1, em que o polinucleótido referido possua numa posição que corresponda à posição -13910, a 5' do primeiro ATG do gene LPH, um residuo de citosina; e (b) uma molécula de ácido nucleico com pelo menos 20 nucleótidos cuja cadeia complementar hibridize sob condições restritivas com uma molécula de ácido nucleico apresentando ou contendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 2, em que o polinucleótido referido possua numa posição que corresponda à posição -22018 a 5' do primeiro ATG do gene LPH, um resíduo de guanina, em que a referida molécula de ácido nucleico se estenda, no máximo, por 30.000 nucleótidos, respectivamente até ao terminal 5' e/ou 3' da molécula de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou 2. 3

3. Uma molécula de ácido nucleico que inclua uma porção a 5' de um gene de uma hidrolase de lactase-florizina intestinal (LPH), em que a referida molécula de ácido nucleico seja seleccionada de entre o conjunto constituido por: (a) uma molécula de ácido nucleico possuindo ou contendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3, sequência esta da SEQ ID NO: 3 que também está ilustrada na Fig. 6; (b) uma molécula de ácido nucleico possuindo ou contendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4, sequência esta da SEQ ID NO: 4 que também está ilustrada na Fig. 7.

4. Uma molécula de ácido nucleico constituída por uma porção a 5' de um gene de uma hidrolase de lactase-florizina intestinal (LPH) , em que a referida molécula de ácido nucleico seja seleccionada de entre o conjunto constituído por: (a) uma molécula de ácido nucleico cuja cadeia complementar se hibridize sob condições restritivas com uma molécula de ácido nucleico possuindo ou contendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 3, em que a referida molécula de ácido nucleico possua numa posição 4 que corresponde à posição - 13910 do primeiro ATG do gene LPH, um residuo de timidina; e (b) uma molécula de ácido nucleico cuja cadeia complementar se hibridize sob condições restritivas com uma molécula de ácido nucleico possuindo ou contendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 4, em que a referida molécula de ácido nucleico possua numa posição que corresponde à posição - 22018 do primeiro ATG do gene LPH, um residuo de adenosina.

5. A molécula de ácido nucleico consoante qualquer uma das reivindicações 1 a 4, que seja ADN genómico.

6. A molécula de ácido nucleico da reivindicação 5, em que o referido ADN genómico seja parte de um gene.

7. Um fragmento da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, contendo pelo menos 14 nucleótidos, em que o fragmento referido inclua a posição nucleotidica - 13910 ou a posição nucleotidica -22018 do gene LPH.

8. Uma molécula de ácido nucleico que seja complementar da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 e 2 e 5 a 7. 5

9. Uma molécula de ácido nucleico que seja complementar da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 3 a 7.

10. Um vector incluindo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 e 5 a 7.

11. Um vector incluindo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicação 3 a 7.

12. Um iniciador ou um par de iniciadores, em que o iniciador ou par de iniciadores se hibridize em condições restritivas com a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 e 5 a 7, incluindo a posição nucleotidica -13910 do gene LPH, ou com a sua cadeia complementar, em que o iniciador seja exactamente complementar de uma sequência que contenha uma C na posição -13910 ou da sua cadeia complementar.

13. Um iniciador ou um par de iniciadores, em que o iniciador ou par de iniciadores se hibridize em condições restritivas com a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 e 5 a 7, incluindo a posição nucleotidica -22018 do gene LPH, ou com a sua cadeia complementar, em que o iniciador seja exactamente complementar de uma sequência que contenha uma G na posição -22018 ou da sua cadeia complementar. 6

14. Um iniciador ou um par de iniciadores, em que o iniciador ou par de iniciadores se hibridize em condições restritivas com a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 3 a 7, incluindo a posição nucleotidica -13910 do gene LPH, ou com a sua cadeia complementar, em que o iniciador seja exactamente complementar de uma sequência que contenha uma T na posição -13910 ou da sua cadeia complementar.

15. Um iniciador ou um par de iniciadores, em que o iniciador ou par de iniciadores se hibridize em condições restritivas com a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 3 a 7, incluindo a posição nucleotidica -22018 do gene LPH, ou com a sua cadeia complementar, em que o iniciador seja exactamente complementar de uma sequência que contenha uma A na posição -22018 ou da sua cadeia complementar.

16. Um hospedeiro não humano transformado com o vector da reivindicação 10.

17. Um hospedeiro não humano transformado com o vector da reivindicação 11. 18. 0 hospedeiro não humano da reivindicação 16 ou da 17, que seja uma bactéria, uma célula de levedura, uma célula de insecto, uma célula de fungo, uma célula de mamifero, uma célula de planta, um animal transgénico ou uma planta transgénica. 7

19. Um anticorpo ou um aptâmero ou um fago que se liguem especificamente à molécula de ácido nucleico mutante de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 e 5 a 8 mas não à molécula de ácido nucleico correspondente, de tipo selvagem, em que a molécula de ácido nucleico correspondente de tipo selvagem contém na posição correspondente à posição -13910 do gene LPH uma timidina e/ou na posição correspondente à posição -22018 uma adenosina, e uma molécula de ácido nucleico mutante possua na posição correspondente à posição -13910 uma citosina e/ou na posição correspondente à posição -22018 uma guanina.

20. Um anticorpo ou um aptâmero ou um fago que se liguem especificamente à molécula de ácido nucleico de tipo selvagem de qualquer uma das reivindicações 3 a 7 e 9, mas não à correspondente sequência mutante que contribui para ou indica a hipolactasia do tipo das dos adultos, em que uma molécula de ácido nucleico de tipo selvagem possua na posição que corresponde à posição -13910 do gene LPH uma timidina e/ou na posição que corresponde à posição -22018 uma adenosina, enquanto uma molécula de ácido nucleico mutante contém na posição correspondente à posição -13910 uma citosina e/ou na posição correspondente à posição -22018 uma guanina.

21. Uma composição farmacêutica incluindo a molécula de ácido nucleico de tipo selvagem das reivindicações 3 a 6 ou o vector da reivindicação 11, em que uma molécula de ácido nucleico de tipo selvagem possua na posição que corresponde à posição -13910 do gene LPH uma timidina e/ou na posição que corresponde à posição -22018 uma adenosina.

22. Uma composição diagnóstica incluindo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, o vector da reivindicação 10 ou da 11, o iniciador ou o par de iniciadores das reivindicações 12 a 15, e/ou o anticorpo, aptâmero e/ou fago da reivindicação 19 ou da 20.

23. Um método para testar a presença ou a predisposição de hipolactasia do tipo da dos adultos, que inclua testar-se uma amostra obtida de um paciente prospectivo ou de uma pessoa que se suspeite ser portadora dessa predisposição ou da presença da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 e 5 a 8, num estado homozigótico ou heterozigótico.

24. Um método para testar a presença ou a predisposição da hipolactasia do tipo da dos adultos, que inclua testar-se uma amostra obtida de um paciente prospectivo ou de uma pessoa que se suspeite ser portadora dessa predisposição ou da presença da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 3 a 7 e 9 num estado homozigótico ou heterozigótico. 9 25. 0 método da reivindicação 23 ou 24, em que o teste referido inclua hibridizar-se a molécula de ácido nucleico complementar da reivindicação 8 que seja complementar da molécula de ácido nucleico que contribui para ou é indicativa da hipolactasia do tipo da dos adultos ou da molécula de ácido nucleico da reivindicação 9, que seja complementar da sequência de tipo selvagem a titulo de uma sonda, em condições restritivas para moléculas de ácido nucleico incluídas na referida amostra, e detectar-se a hibridização referida, em que uma molécula de ácido nucleico de tipo selvagem tenha na posição que corresponde à posição -13910 do gene LPH gene uma timidina e/ou na posição que corresponde à posição -22018 uma adenosina, e uma molécula de ácido nucleico mutante apresente na posição correspondente à posição -13910 uma citosina e/ou na posição correspondente à posição -22018 uma guanina.

26. O método de qualquer uma das reivindicações 23 a 24, incluindo também digerir-se o produto da hibridização referida com uma endonuclease de restrição, ou submeter-se o produto da hibridização referida a uma digestão com uma endonuclease de restrição, e analisar-se o produto da digestão referida. 27. 0 método da reivindicação 25, em que a sonda referida seja detectavelmente marcada.

28. O método da reivindicação 23 ou da 24, em que o teste referido inclua determinar-se a sequência de 10 ácido nucleico de pelo menos uma porção da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, incluindo a porção referida a posição nucleotidica -13910 e/ou a posição nucleotidica -22018 do gene LPH.

29. O método da reivindicação 28, no qual a determinação da sequência da molécula de ácido nucleico seja levada a cabo por mini-sequenciação em fase sólida. 30. 0 método da reivindicação 28 incluindo também, antes de se determinar a referida sequência de ácido nucleico, a amplificação de pelo menos a referida porção da referida molécula de ácido nucleico. 31. 0 método da reivindicação 23 ou da 24, em que o teste referido inclua levar-se a cabo uma reacção de amplificação na qual pelo menos um dos iniciadores empregues na reacção de amplificação referida seja o iniciador da reivindicação 12 ou da 13 ou pertença ao par de iniciadores da reivindicação 12 ou da 13, incluindo determinar-se um produto de amplificação.

32. O método da reivindicação 23 ou da 24, em que o teste referido inclua levar-se a cabo uma reacção de amplificação na qual pelo menos um dos iniciadores empregues na reacção de amplificação referida seja o iniciador da reivindicação 14 ou da 15 ou pertença ao par de iniciadores da reivindicação 14 ou da 15, incluindo determinar-se um produto de amplificação. 11 33. 0 método de qualquer uma das reivindicações 30 a 32, em que a amplificação referida seja levada a cabo por, ou a referida amplificação seja a reacção de polimerase em cadeia (PCR).

34. Um método para se testar a presença ou a predisposição para uma hipolactasia do tipo da dos adultos, que inclua determinar-se numa amostra obtida de um ser humano, uma ligação especifica ao anticorpo ou ao aptâmero ou ao fago da reivindicação 19.

35. Um método para se testar a presença ou a predisposição para uma hipolactasia do tipo da dos adultos, que inclua determinar-se numa amostra obtida de um ser humano, uma ligação especifica ao anticorpo ou ao aptâmero ou ao fago da reivindicação 20.

36. O método da reivindicação 34 ou da 35, no qual o referido anticorpo ou aptâmero ou fago seja detectavelmente marcado.

37. O método de qualquer uma das reivindicações 34 a 36, no qual o teste seja um imuno-ensaio.

38. O método de qualquer uma das reivindicações 23 a 37, no qual a amostra referida seja de sangue, soro, plasma, tecido fetal, saliva, urina, tecido das mucosas, 12 muco, tecido vaginal, tecido fetal obtido da vagina, pele, cabelo, foliculo de pelos ou outro tecido humano. 39. 0 método de qualquer uma das reivindicações 23 a 38, no qual a molécula de ácido nucleico referida da amostra referida seja fixada a um suporte sólido.

40. O método da reivindicação 39, no qual o referido suporte sólido seja uma apara, uma hóstia de silica, uma pérola ou uma placa de microtitulação.

41. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, para utilização na análise da presença ou da predisposição para a hipolactasia do tipo da dos adultos.

42. Um estojo incluindo a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, o iniciador ou o par de iniciadores das reivindicações 12 a 15, o vector da reivindicação 10 ou 11, e/ou o anticorpo, aptâmero e/ou fago da reivindicação 19 ou da 20, num ou em diversos contentores. Lisboa, 3 de Outubro de 2012.