PT1399551E - Processo para a purificação de células bacterianas e componentes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Processo para a purificação de células bacterianas e componentes celulares" 0 presente invento refere-se a um processo para a purificação selectiva de células bacterianas e/ou componentes celulares, em que a purificação é realizada por meio de um suporte sólido. 0 ponto de partida de quase qualquer processamento, análise ou isolamento de componentes celulares é o enriquecimento das células, a "recolha das células". Esta é usualmente realizada através de centrifugação. Esta operação de centrifugação representa o problema principal na automatização completa de processos como, por exemplo, a purificação de plasmideos, uma vez que além do elevado investimento técnico para a integração de uma centrífuga num respectivo robô de processamento, é necessária uma precisão extremamente elevada na posição de arranque e de paragem do processo de centrifugação. Os processos automáticos de processamento, análise ou isolamento de componentes celulares começam por isso, geralmente com células já enriquecidas, centrifugadas ou sedimentadas fora do robô de processamento. Assim por exemplo, para uma análise rápida de genomas e proteomas completos, mas também para o esclarecimento rápido da estrutura e função em processos de alto débito, é essencial uma automatização tão completa quanto possível dos processos implicados relevantes. Neste âmbito, a automatização realizada p. ex. na análise genómica já está muito avançada: não apenas a cultura das bactérias como também o isolamento de plasmideos podem ser realizados de forma automatizada. No entanto, não se conseguiu realizar até à data uma automatização completa do processo que incluísse a recolha das células. Especialmente não é possível obter uma recolha selectiva de células, isto é, o enriquecimento específico em determinadas células, a partir de uma mistura celular, com os processos de recolha actualmente em uso.

Habitualmente, a recolha de células é realizada pelos processos seguintes: 0 processo padrão da recolha de células é a centrifugação não específica das culturas bacterianas. Para 2 ΕΡ 1 399 551 /PT este efeito é necessária uma centrífuga de placas de microtitulação, especialmente em processos previstos para um débito mais elevado. No entanto, a centrifugação como tal não é apropriada para automatização. É certo que é possível a filtração das células cultivadas através de membranas filtrantes adequadas possibilitando no entanto também esta apenas um enriquecimento não específico das células. Além disso, o processo está também fortemente sujeito a perturbações em relação a obstruções quando se trata de suspensões celulares de elevada concentração e de elevada viscosidade das soluções que isto implica. A separação de células através de activação por fluorescência é um processo em que se utiliza um fio de líquido muito fino que torna possível a separação e o enriquecimento de células individuais marcadas por fluorescência, através de um laser. É verdade que a utilização de marcadores fluorescentes adequadas torna possível uma certa especificidade do enriquecimento, mas devido ao fino fio de líquido, o processo fica limitado a volumes pequenos e, por conseguinte, a um débito reduzido. Desta maneira poderiam ser acumuladas apenas pequenas quantidades de células, o que não é suficiente para o processamento posterior ou a análise de componentes celulares. Além disso, os elevados custos em relação ao equipamento impedem uma divulgação extensa desta técnica e travam a paralelização que é necessária para uma recolha de células de elevado débito.

Na separação magnética de células, as células são ligadas directamente a partículas magnéticas através de interacções iónicas e concentradas localmente através da aplicação de um campo magnético. Processos deste género para a concentração não específica de bactérias são comercializados desde há pouco tempo pela Chemagen (ΕΡ 1 118 676), Genpoint (WO 01/53525, WO 98/51693), Merck (WO 00/29562), assim como pela Promega (US 6,284,470) ou Amersham (WO 91/12079), para a automatização completa do processamento de ADN plasmídico ou genómico, incluindo a recolha das células. No entanto, por um lado estas partículas magnéticas têm o inconveniente, de se ligarem às bactérias de forma não específica e, por outro lado, de não se ligarem igualmente bem a qualquer espécie bacteriana. Devido à 3

ΕΡ 1 399 551 /PT não especificidade da ligação, observam-se até mesmo diferentes eficácias de ligação em estirpes diferentes de uma espécie (Merck, WO 00/29562).

Sun e outros (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 25; 2000, páginas 273-275) revelam partículas magnéticas revestidas com estreptavidina, em cuja superfície estão aplicados bacteriófagos completos biotinilados. Este sistema representa um biossorvente com base em bacteriófagos, o qual pode ser utilizado directamente para o enriquecimento de bactérias da espécie S. enteritidis. Um inconveniente deste processo é a utilização de bacteriófagos completos que, eventualmente, ainda poderiam lisar as células bacterianas a purificar.

Por esta razão, o invento propõe-se resolver o problema de disponibilizar um processo com o qual células bacterianas e componentes celulares possam ser enriquecidos de forma selectiva e completamente automática e que possa ser integrado num processo de análise ou isolamento automatizado, assim como o de disponibilizar suportes sólidos para o enriquecimento selectivo de células bacterianas ou componentes celulares.

Este problema é resolvido através do objecto definido nas reivindicações.

As figuras que se seguem pormenorizam o invento. A figura 1 mostra, num gráfico, a dependência temporal da ligação dependente de pl2 de E.coli a pérolas magnéticas. Os valores indicam a actividade de β-galactosidase de células imobilizadas, em unidades relativas. VIK (losangos) significa: processo de 2 passos (pré-incubação de células e pl2, ligação subsequente a pérolas magnéticas). VC (quadrados) significa: processo de 1 passo (pré-revestimento de pl2 em pérolas magnéticas, imobilização subsequente de células). -pl2 (triângulos) significa: fundo (ligação não específica de células a pérolas sem pl2). A figura 2 mostra, num gráfico, a ligação de E.coli a pérolas magnéticas através do bacteriófago T4. Os valores indicam a actividade de β-galactosidase de células 4 ΕΡ 1 399 551 /PT imobilizadas, em unidades relativas. VIK significa: processo de 2 passos (pré-incubação de células e T4, ligação subseguente a pérolas magnéticas). VC significa: processo de 1 passo (pré-revestimento de T4 em pérolas magnéticas, imobilização subseguente de células). K significa: fundo (ligação não especifica de células a pérolas sem T4). A figura 3 mostra, numa comparação gráfica, os rendimentos de células de E.coli a partir de meios diferentes. -pl2 assinala os resultados sem N-Strep-pl2. +pl2 assinala os resultados com N-Strep-pl2. As barras sombreadas mostram os resultados obtidos com a estirpe E.coli LE392, as barras a cheio assinalam os resultados obtidos com a estirpe E.coli JM83, e LB, SOB, SOC, TB e YT-2x designam os respectivos meios nos quais o ensaio foi realizado. Os valores estão indicados sob a forma de rendimentos em % das células utilizadas, calculados através da dispersão do sobrenadante a 600 nm a seguir à peletização das células ligadas por meio de um iman. A figura 4 mostra graficamente o resultado do isolamento plasmidico a seguir à recolha de E.coli com pl2 de acordo com o processo de 2 passos. Estirpe DHIOb com o plasmídeo pUC19. 1: células centrifugadas, isolamento do ADN através de extracção em fase sólida; 2: células recolhidas com o processo de 2 passos de acordo com o invento, isolamento do ADN através de extracção em fase sólida; 3: células centrifugadas, isolamento do ADN através de pérolas magnéticas; 4: células recolhidas com o processo de 2 passos de acordo com o invento, isolamento do ADN através de pérolas magnéticas; 5: padrão. A figura 5 mostra numa representação gráfica o enriquecimento de células de E.coli a partir de 10 ml de meio de cultura, partindo de suspensões celulares de diferente densidade celular (ΙΟ9—107 CFU/ml). Gráfico A: as barras a cheio indicam a actividade de β-galactosidase das células ligadas através de N-Strep-pl2, as barras sombreadas indicam o fundo, sem pl2. Gráfico B: as barras a cheio indicam a actividade de β-galactosidase das células ligadas através de T4-bio, as barras sombreadas indicam o fundo, sem T4. A figura 6 mostra esquematicamente a recolha de células de E.coli vivas através de pl2 biotinilada e pérolas de 5

ΕΡ 1 399 551 /PT estreptavidina. As barras a cheio indicam a dispersão a 600 nm ao fim de um crescimento de 2 h. As barras sombreadas marcam a actividade de β-galactosidase das células. As abreviaturas significam: P12: determinações das células imobilizadas nas pérolas; P12-EDTA: determinações das células removidas das pérolas após a ligação (sobrenadante após o tratamento com EDTA); EDTA-pl2: a imobilização das células nas pérolas foi impedida pela presença de EDTA; determinações das células não específicas ligadas às pérolas; K: ensaio de controlo sem pl2; determinações nas pérolas. A figura 7 mostra, sob a forma de tabela, a ligação selectiva de pl2 a células bacterianas. A tabela A apresenta uma listagem da ligação dependente de pl2 de diferentes estirpes de E.coli; a tabela B indica a especificidade da ligação dependente de pl2. A abreviatura "n.d." significa "não determinado", "+" significa ligação de pl2 às bactérias indicadas, significa que não houve ligação de pl2 às células. A figura 8 mostra, numa representação gráfica, a especificidade da ligação dependente de pl2. Os valores indicam o rendimento de células imobilizadas, calculado através da dispersão do sobrenadante a 600 nm. As barras sombreadas indicam os valores referentes à ligação celular através de N-Strep-pl2 (= ligação específica). As barras a cheio escuras mostram o controlo sem pl2 (= adsorção não específica). As barras a cheio claras indicam os valores referentes à ligação celular com pl2, no entanto em presença de EDTA 10 mM (= adsorção não específica). A figura 9 mostra fotografias obtidas com um microscópio óptico e com um microscópio de fluorescência, da ligação selectiva de E.coli a pérolas magnéticas através de T4-bio numa cultura mista de E.coli e Serratia marrescens. As células de E.coli foram marcadas por fluorescência com T4-pl2 marcada com FITC. As imagens à esquerda mostram fotografias obtidas com um microscópio óptico, as imagens à direita mostram fotografias obtidas com um microscópio de fluorescência. As imagens superiores mostram fotografias de um ensaio sem T4-bio, as imagens inferiores mostram fotografias de um ensaio com T4-bio. 6

ΕΡ 1 399 551 /PT A figura 10 mostra, numa representação gráfica, o resultado da recolha de células de acordo com o processo de 2 passos com N-Strep-pl2, a partir de soluções com um número de células diferente. "S/N-ratio" designa a relação de sinal-ruído (sinal com N-Strep-pl2 dividido pelo sinal sem N-Strep-pl2) da reacção de β-galactosidase das células de E.coli ligadas, CFU/ml indica as células utilizadas (cell forming units) por ml. Os quadrados assinalam os resultados da medição da actividade de β-galactosidase com um substrato luminescente. Os losangos assinalam os resultados da medição da actividade de β-galactosidase com um substrato fluorescente. A figura 11 mostra, numa representação gráfica, o resultado da recolha de células de E.coli de acordo com o processo de 1 passo com T4pl2 ligada de forma covalente a pérolas magnéticas EM2-100/49 (Merck Eurolab). +pl2 designa os resultados obtidos com pérolas com T4pl2, -pl2 designa os resultados obtidos com pérolas sem T4pl2, DSMZ 613 designa os resultados obtidos com a estirpe E.coli DSMZ 613, DSMZ 13127 os resultados obtidos com a estirpe E.coli DSMZ 13127. A figura 12 mostra uma representação gráfica do resultado da recolha de células de E.coli de acordo com o processo de 1 passo com T4pl2 adsorvida em pérolas de PVA magnéticas. Os losangos assinalam os resultados obtidos com as pérolas PVA-011 (Chemagen). Os quadrados assinalam os resultados obtidos com as pérolas PVA-012. As linhas contínuas designam os resultados obtidos com as pérolas nas quais foi adsorvida T4pl2 e as linhas tracejadas, pérolas sem T4pl2. Os valores de D0600 indicam as percentagens de células recolhidas em % da dispersão do sobrenadante a seguir à peletização das células ligadas por meio de um íman. A expressão "proteínas de fago" ou "proteínas de bacteriófago" aqui utilizada designa todas as proteínas de bacteriófago que participam no reconhecimento e na ligação das células bacterianas ou dos componentes celulares. Estas proteínas podem estar localizadas conforme a natureza morfológica dos fagos, p. ex., directamente no invólucro dos fagos ou em estruturas de reconhecimento especiais, as fibras de cauda. Em consequência disso, a expressão "proteínas de 7

ΕΡ 1 399 551 /PT cauda de bacteriófago" designa as proteínas de fago que formam a cauda do bacteriófago ou fazem parte da cauda do bacteriófago. A expressão "especificidade" aqui utilizada significa que os bacteriófagos ou as proteínas de fago não só reconhecem e se ligam a apenas um género ou uma espécie, ou também subespécie, de células bacterianas ou componentes celulares, como também que alguns bacteriófagos ou proteínas de fago reconhecem e se ligam a determinados grupos de bactérias

As expressões "purificação" ou "enriquecimento" aqui utilizadas significam a separação específica de células bacterianas ou componentes celulares da solução aquosa, p. ex. do meio de cultura, na qual as células bacterianas ou componentes celulares se encontram. Neste âmbito, a purificação ou o enriquecimento são realizados por meio de suportes sólidos, p. ex. partículas magnéticas, partículas de vidro, partículas de agarose, recipientes de reacção ou placas de microtitulação.

Um aspecto do presente invento consiste na disponibilização de um processo para a purificação selectiva de células bacterianas ou componentes celulares, o qual compreende as operações seguintes: (processo de dois passos) a) contacto de uma amostra contendo células bacterianas ou componentes celulares, com proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago, de preferência com uma incubação de cerca de três a cinco minutos, b) incubação subsequente da amostra contendo as células bacterianas ou componentes celulares e as proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago, com um suporte sólido, de preferência durante cerca de três a 30 min, c) separação do suporte sólido com as células bacterianas ou componentes celulares ligados ao mesmo através das proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago, da amostra. 8

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Com o processo de acordo com o invento torna-se possível enriquecer células bacterianas ou componentes celulares de forma selectiva, por exemplo, a partir de culturas mistas de espécies diferentes ou de uma cultura de uma só espécie. Os componentes celulares a enriquecer podem ser, p. ex., endotoxinas, proteínas, ácidos nucleicos ou sacáridos. A selectividade do processo é tornada possível através da escolha de proteínas de bacteriófago adequadas. As proteínas de bacteriófago são as substâncias mais apropriadas para um enriquecimento selectivo das bactérias ou dos componentes celulares no processo de acordo com o invento, uma vez que os sistemas de fago-bactéria se evolvem na natureza ao longo de períodos de tempo prolongados, pelo que os fagos reconhecem as suas bactérias hospedeiras com elevada especificidade e alta afinidade de ligação. Para o processo de acordo com o invento utilizam-se de preferência proteínas de bacteriófago que são específicas para as bactérias que se procura detectar. Não só os bacteriófagos como também as proteínas de bacteriófago evoluíram sob condições ambientais adversas, sendo, assim, resistentes a influências como, por exemplo, temperatura, variações do pH (Burda e outros, Biological Chemistry 2000, 381, 255-258) e semelhantes, podendo por isso ser utilizados nos tampões de purificação mais diversos. A escolha das proteínas de bacteriófago utilizadas depende das espécies bacterianas que se pretende purificar. Para uma purificação subsequente dos plasmídeos preferem-se proteínas de bacteriófago capazes de se ligar selectivamente a bactérias de E.coli, uma vez que estas bactérias são as que são presentemente usadas para a produção de plasmídeos. Actualmente já se conhece um grande número de bacteriófagos disponíveis para grande parte das bactérias até à data descritas que pode ser utilizado para o enriquecimento selectivo de bactérias. A tabela que se segue dá um resumo de bactérias e dos bacteriófagos específicos para as mesmas, sem que se pretenda completa. Os fagos e as respectivas bactérias hospedeiras podem ser obtidos nas seguintes colecções de estirpes, entre outras: ATCC (Estados Unidos), DSMZ (Alemanha), UKNCC (Grã-Bretanha), NCCB (Países Baixos) e MAFF (Japão). Além disso, se for necessário, é possível, por exemplo, isolar bacteriófagos dirigidos contra as respectivas bactérias a partir de amostras ambientais, simplesmente de acordo com processos padrão (Seeley, N.D. & Primrose, S.B., 1982, J. Appl. Bacteriol. 53, 1-17).

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Bactérias: Acholeplasma

Fagos Oclr, lOtur, L2, L51, Ml, MVG51, MV-L1, 01,

SpVl, VI, VI, V2, V4, V5_ Actinomycetes: 108/016, 119, 29, 37, 43, 51, 59.1, Al-Dat, Aeh2, Bir, Ml, MSP8, 0115-A, 015OA, 031C, P-a-1, PhiC, Rl, R2, SK1, SV2, VP5_ Actinoplanes/ Ap3, Ap4, Mml, Mm3, Mm4, Mm5, phiUW 51

Micromonospora: Aeromonas: Aeromonas hydrophila Agrobacterium: Alcaligenes: Alteromonas: Amycolatopsis: Bacillus:

Bacillus subtilis: Bdellovibrio: Brucella: Caulobacter:

Cellulomonas: Chlamydia: Chlamydia psittaci: Clostridium: Coryneforme:

Cyanobacteria: E.coli. (0157) : E.coli: 43, 44RR2.8t, 65, Aehl PM1 PIIBNV6, PS8, psi, PT11 8764, A5/A6, A6 PM2 Wll, W2, W4, W7 IA, alpha, AP50, BLE, F, G, GA-1, II, IPy-1, morl MP13, MP15, 0105, 029 (phi 29), 0NS11, PBP1 PBS1 SP10, SP15, SP3, SP8, SPP1, SPB, SPy-2, SST, type 168, W23, SP50, W23, SP01 MAC-1, MAC-2, MAC-4, MAC-5, MAC-7 Tb ' 0Cbl2r, 0Cb2, 0Cb23r, 0Cb4, 0Cb5, 0Cb8r, 0Cb9 0CPI8, 0CP2, 0Cr14, 0Cr28 011, 013, 02, 03, 05, 06, 08 Ί .phi.CPGl CeB, Fl, HM2, HM3, HM7 7/26, A, A19, AN25S-1, Arp, AS-1, BL3, CONX, MT, NI 0A8OIO, S-6(L), β A- 4(L), AC-1, LPP-1, S-2L, S-4L, SM-1 Pl, Tl, Tuia, Tulb, TulI 103 , 107, 109, 2D/13, Ae2, alphalO, alpha3, BE/1 E.coli Rl: E.coli 08: E.coli (K12): Enterobacter: BF23, dA, deitai, deltaô, d03, d04, d05, Ec9, eta8, fl, fd, G13, G14, G4, G6, HK022, HK97, HR, lambda, M13, M13mpl8, M20, MM, MS2, Mu, 01, 08O, 0A, 0R, 0X174, PA-2, Pl, P1D, P2, P22, QB, R17, S13, St-1, Tl, T2, T3, T4, T5, T6, T7, WA/1, WF/1, WW/1, zeta3, ZG/2, ZJ/2 C21 omega8 U3 chi, FC3-9, p2, Õ37 11F, 121, 1412, 3^ 3T+, 507 5845, 66F, 7480b, 8893, 9, 9266, al, alphal5, b4, B6, B7, Beccles, BZ13, C-l, C16, C2, C-2, DdVI, Esc-7-11, f 2, fcan, Fl, Folac, fr, GA, H, H-19J, 12-2, Ialpha, ID2, Ifl, If2, Ike, JP34, JP501, K19, KU1, Μ, Ml1, Ml2, MS2, NL95, 092, 0l, 0ii, Omega8, pilHalpha, PR64FS, PRD1, PST, PTB, R, R17, R23, R34, sd, SF, SMB, SMP2, SP, B, ST, tau, tf-1, TH1, TW18, TW2 8, Vill, VK, W31, X, Y, ZG/1, ZIK/1, ZJ/1, ZL/3, ZS/3 10

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Klebsiella pneumoniae: Ap3, C3: Lactobacillus: lb6, 223, fri, hv, hw222a, 0FSW, PL-1, y5 Lactococcus lactis: 1, 643, c2, kh, ml3, P008, P127, 1358, 1483, 936, 949, BK5-T, c2, KSY1, P001, P008, P107, P335, P034, P087 Leuconostoc: pro-2 Listeria: 4211 Methanothermobacter: psi M2 (ΨΜ2) Mi crococcus: Nl, N5 Mollicutes: Brl, C3, L3 Mycobacterium: 13, lacticola, Leo, 017, Rl-Myb Nocardia/Rhodococcus/ Gordona: N13, N18, N24, N26, N36, N4, N5 Nocardioides: XI, ΧΙΟ, X24, X3, X5, X6, D3, D4 Pasteurella: 22, 32, AU, C-2 Promicromonospora: Pl, P2, P3, P4 Pseudomonas aeruginosa: Phi CT, phi CTX, PB-1 Pseudomonas: 12S, 7s, D3, F116, gh-1, gh-1, Kfl, M6, 0l, 0KZ, 0W-14, Pfl, Pseudonocardia: W3 Rhizobium: 2, 16-2-12, 2, 317, 5, 7-7-7, CM1, CT4, m, NM1, NT2, 02037/1, 02042, 0gal-l-R, WT1 Saccharomonospora: Mpl, MP2 Saccharothrix: W1 Salmonella: epsilonl5, Felix 01, 16-19, 7-11, H-19J, Jersey, N4, SasLl, Vil, ZG/3A, San21 Salmonella typhimurium: A3, A4, P22 Spiroplasma: 4, C1/TS2 Sporichthya: Spl Staphylococcus: 107, 187, 2848A, 3A, 44AHJD, 6, 77, B11-M15, Twort Streptococcus: 182, 2BV, A25, A25-24, A25-omega8, A25-PE1, A25-VD13, CP-1, Cvir, H39 Streptomyces: P23, P26, phi A.streptomycini III, phi8238, phiC31, Sl, S2, S3, S4, S6, S7, SH10 Terrabacter: Tbl, Tb2 Tsukamurella: Tsl Vibrio: 06N-22P, 06N-58P, 06N-58P, 4996, alpha3alpha, I, II, III, IV, kappa, nt-1, OXN-100P, OXN-52P, v6, Vfl2, Vf33, VP1, VP11, VP3, VP5, X29 Xanthomonas: Cf, Cflt, RR66, Yersinia: 8/C239, phiYe03-12, YerA41

No caso de se utilizarem proteínas de fago individuais, estas oferecem a vantagem de neste caso se poder tirar proveito das propriedades de uma proteína individual, em vez de um complexo de proteínas e ácidos nucleicos. As proteínas 11 ΕΡ 1 399 551 /PT de fago são muitos estáveis (Burda e outros, Biological Chemistry 2000, 381, 255-258); a estabilidade de uma proteína individual é muito mais fácil de controlar do que a de um complexo proteico. É importante também a capacidade de modificação (genética, mas também química) mais fácil, ao contrário dos fagos completos, p. ex. a inserção de "Tags". Além disso, a utilização de proteínas de fago oferece vantagens em determinados processos subsequentes, como p. ex. o isolamento de ácidos nucleicos (ADN plasmídico, ARN, ADN genómico) , uma vez que ao contrário da utilização de fagos completos não é possível que haja uma poluição de ácidos nucleicos.

Preferem-se proteínas de cauda de fago da família dos Myoviridae, dos Podoviridae e Siphoviridae, em especial proteínas de cauda de fago curtas, especialmente as proteínas de cauda de fago curtas dos "fagos T de número par", p. ex. de T4, T2 ou K3, especialmente a proteína de cauda de bacteriófago pl2 de T4, pl2 de T2 (GenBank Accession Number X56555), pl2 de K3 (compare-se Burda e outros, 2000, Biol. Chem., vol. 381, pp. 255 - 258) ou as proteínas de cauda de bacteriófago dos fagos Felix 01, PI ou PB1. Nestes casos, as proteínas de cauda de bacteriófago curtas dos fagos T4 (pl2) e de Pl, por exemplo, ligam-se a coliformes, a proteína de cauda de fago curta Felix 01 a salmonelas e a proteína de cauda de fago curta PB1, a pseudomonas.

As proteínas de cauda de fago como, por exemplo, pl2 ou a proteína tailspike P22 apresentam uma elevada estabilidade em relação a proteases, detergentes, agentes caotrópicos como, p. ex., ureia ou cloridrato de guanidínio ou a um aumento da temperatura (Goldenberg, D. e King, J.; Temperature-sensitive mutants blocked in the folding or subunit assembly of the bacteriophage P22 tailspike protein. II. Active mutant proteins matured at 30°C, 1981, J. Mol. Biol. 145, 633-651.

Miller, S., Schuler, B. e Seckler, R.; Phage P22 tailspike protein: Removal of headbinding domain unmasks effects of folding mutations on native-state thermal stability, 1998, Prot. Sei. 7, 2223-2232.; Miller, S., Schuler, B. e Seckler, R.; A reversibly unfolding fragment of P22 tailspike protein with native structure: The isolated β-helix domain, 1998, Biochemistry 37, 9160-9168.; Burda e outros, 2000, Biol. 12

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Chem., Vol. 381, pp. 255 - 258). A remoção da região de ligação da cabeça do fago ou da região de ligação da placa basal destas proteínas pode reduzir uma sensibilidade de agregação eventualmente existente. É interessante que os domínios individuais ou subunidades destas proteínas são nitidamente menos estáveis do que os trímeros intactos ou apenas insignificantemente encurtados (Miller e outros, Prot. Sei. 1998; 7: 2223-2232. Phage P22 tailspike protein: Removal of headbinding domain unmasks effects of folding mutations on native-state thermal stability.; Miller-S, e outros, Biochemistry 1998; 37: 9160-9168. A reversibly unfolding fragment of P22 tailspike protein with native structure: The isolated β-helix domain), ou, devido à sua estrutura tridimensional, supostamente pouco estável e funcionalmente expressável: além disso, trabalhos cristalográficos tinham mostrado que as proteínas de cauda de fago e proteínas receptoras de vírus existem frequentemente sob a forma de trímeros fortemente torcidos, podendo-se dobrar o terminal C, um mecanismo que assegura possivelmente uma protecção adicional contra as proteases (Mitraki A, Miller S, van Raaij MJ. Review: conformation and folding of novel Beta-structural elements in virai fiber proteins: the triple Beta-spiral and triple Beta-helix. J Struct Biol. 2002 137(1-2): 236-247).

Além disso, estas proteínas existem em estado nativo sob a forma de homotrímeros. Com três locais de ligação, os trímeros contribuem para uma ligação mais firme de bactérias através de um aumento da avidez. A maneira como as proteínas de cauda de bacteriófago se ligam às bactérias individuais, será aqui ilustrada a título de exemplo, por meio dos "fagos T de número par" (p. ex. T4, T2, K3). Neste grupo existem do lado do hospedeiro dois componentes que são reconhecidos pelos fagos: em primeiro lugar uma proteína de superfície que é específica para fagos individuais, em segundo lugar o lipopolissacárido (LPS), que todas as bactérias Gram-negativas possuem sob uma forma modificada no seu lado exterior, exposto ao seu ambiente. As fibras de cauda compridas dos "fagos T de número par" desempenham um papel no reconhecimento específico das bactérias hospedeiras, enquanto que o LPS serve como receptor para as fibras de cauda curtas. Do fago T4 de E.coli sabe-se que a interaeção específica com a bactéria hospedeira, mediada 13

ΕΡ 1 399 551 /PT pelas fibras de cauda compridas, se torna irreversível logo que as fibras de cauda curtas se tenham também ligado à superfície bacteriana. A fibra de cauda curta não é responsável pela especificidade exacta dentro do grupo de bactérias hospedeiras e pode, por isso, ser permutada entre os diferentes "fagos T de número par".

Proteínas de cauda de bacteriófago podem facilmente ser produzidas em grandes quantidades através da tecnologia recombinante e ser purificadas utilizando tags adequados ou através de métodos simples de separação cromatográficos normalizados. Não só os fagos como também as estirpes hospedeiras são na maioria dos casos obteníveis comercialmente através de colecções de estirpes, ou então podem ser isolados com recursos simples. No entanto, para o processo de acordo com o invento podem ser utilizadas não apenas as proteínas de cauda de bacteriófago naturais, como também as suas variantes. "Variantes" no sentido do presente invento significa que estas proteínas de cauda de bacteriófago apresentam uma sequência de aminoácidos modificada. Estas proteínas podem ser obtidas através de screening das variantes que ocorrem naturalmente, ou através de mutagénese aleatória ou dirigida, mas também através de uma modificação química. A especificidade para o hospedeiro ou as características de ligação das proteínas de cauda de bacteriófago utilizadas para o processo de acordo com o invento podem ser adaptadas às estruturas portadoras através de uma mutagénese dirigida ou aleatória. Através da mutagénese são introduzidas mutações, as quais podem ser adições, deleções, substituições de aminoácidos ou modificações químicas. Estas mutações provocam uma alteração da sequência de aminoácidos na região de ligação dos fagos ou das proteínas de fago, com o objectivo de adaptar a especificidade e a afinidade de ligação às necessidades de um teste, p. ex. para aumentar a ligação das bactérias às proteínas de fago isoladas ou a tornar irreversível, com o objectivo de melhorar as possibilidades de lavagem. Além disso pode ser realizada uma modificação genética ou bioquímica das proteínas de fago, com o objectivo de "desligar" a actividade enzimática eventualmente existente, para melhorar assim a ligação, ou a tornar irreversível. 14

ΕΡ 1 399 551 /PT

Para ligar as bactérias e/ou componentes celulares a purificar às proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago, no processo de dois passos, a amostra, p. ex. uma cultura de uma noite (overnight), é colocada em contacto com as proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago e, de preferência, incubada. A incubação é realizada a uma temperatura no intervalo de 4o a 90°C, de preferência a uma temperatura no intervalo de 4o a 45°C, com particular preferência a uma temperatura no intervalo de 15° a 37°C, preferindo-se particularmente a uma temperatura no intervalo de 20° a 37°C, especialmente à TA, no máximo durante 6 horas, de preferência no máximo 4 horas, com particular preferência 2 horas, especialmente 1 hora, preferindo-se particularmente 1 a 20 minutos, com especial preferência de 3 a 5 minutos. A incubação pode ser realizada, por exemplo, durante 2 a 120 min a uma temperatura de 4o a 37°C, de preferência durante 20 a 30 min a 25°C ou 37°C, com particular preferência durante 3 a 5 min a 37°C. A seguir, a amostra é colocada em contacto com suportes sólidos e incubada. Os suportes sólidos podem ser, p. ex., partículas magnéticas (paramagnéticas ou ferromagnéticas), partículas de vidro, partículas de agarose, partículas de Luminex, recipientes de reacção ou placas de microtitulação.

No caso de se utilizarem partículas magnéticas, estas são adicionadas à amostra a seguir. As partículas magnéticas ligam-se ao complexo de proteína de bacteriófago- bactéria/componente celular, o qual pode então ser separado da amostra de maneira simples por meio de um dispositivo magnético, e ser purificado. Neste âmbito, o dispositivo magnético pode estar posicionado do lado exterior do recipiente, sendo ligado para o enriquecimento de forma a que as partículas magnéticas se acumulem na parede do recipiente, ou então mover-se ao longo do lado exterior do recipiente, acumulando-se, assim, as partículas magnéticas, p. ex., no fundo do recipiente. Prefere-se o enriquecimento por meio de um íman permanente. É também possível que o dispositivo magnético se encontre imerso no recipiente e na amostra, depositando-se, assim, as partículas magnéticas no dispositivo magnético (o dispositivo magnético pode estar coberto, neste 15

ΕΡ 1 399 551 /PT caso, por uma ponta de pipeta ou por um dispositivo "disposable" comparável). Ao contrário das técnicas de centrifugação ou filtração, as bactérias estão apenas sujeitas a forças de corte mínimas, podendo, assim, ser enriquecidas com elevado rendimento também sob a forma activa/vivas, se necessário. 0 fácil manuseamento facilita mudanças rápidas e simples de tampões/soluções, podendo não apenas ser facilmente realizado em grande escala, como também ser automatizado.

As partículas magnéticas têm um diâmetro que permite a ligação de uma quantidade suficiente de células ou componentes celulares por partícula. De preferência, as partículas magnéticas têm um diâmetro no intervalo de cerca de 0,5 a cerca de 4 pm, especialmente no intervalo de cerca de 0,5 a cerca de 2 pm, com particular preferência no intervalo de cerca de 0,8 a cerca de 1,8 pm, sendo o mais preferido de cerca de 1 pm. A ligação do complexo de proteína de bacteriófago-bactéria/componente celular aos suportes sólidos, p. ex. a partículas magnéticas, é realizada de preferência através de grupos de acoplamento adequados, especialmente polipéptidos e/ou substâncias de baixo peso molecular. No entanto, estes polipéptidos podem também ser anticorpos, lectinas, receptores ou anticalinas específicos das proteínas de bacteriófago. Além disso, as proteínas de bacteriófago podem estar ligadas a substâncias de baixo peso molecular, p. ex. biotina, para se ligarem através destas substâncias de baixo peso molecular a polipéptidos, p. ex. estreptavidina, as quais, por sua vez, foram imobilizadas no suporte. Em vez de biotina pode ser utilizado além disso, o denominado strep-tag (Skerra, A. & Schmidt, T.G.M. Biomolecular Engineering 16 (1999), 79-86), que é uma sequência curta de aminoácidos que se liga a estreptavidina. Além disso pode ser utilizado o His-tag, capaz de se ligar a um material de suporte através de iões bivalentes (zinco ou níquel) ou através de um anticorpo específico (Qiagen GmbH, Hilden). Não só o strep-tag como também o His-tag são ligados de preferência através da tecnologia de ADN recombinante às proteínas de bacteriófago produzidas utilizando a tecnologia recombinante. Este acoplamento pode ser realizado de uma forma orientada, p. ex. no terminal N ou C. Uma vez que para um enriquecimento 16 ΕΡ 1 399 551 /PT eficiente, especialmente no processo de dois passos, é essencial uma elevada constante de ligação, prefere-se particularmente a combinação de acoplamento de biotina/ estreptavidina, com uma kD de ~1CT15 M (Gonzales e outros J. Biol. Chem., 1997, 272 (17), pp. 11288-11294). Verificou-se que esta combinação de ligação não covalente é melhor que os anticorpos, anticalinas, receptores e lectinas disponíveis.

Para a ligação do complexo, as partículas magnéticas são colocadas em contacto com o complexo de proteína de bacteriófago-bactéria/componente celular e, de preferência, incubadas. A incubação é realizada a uma temperatura no intervalo de 4o a 90°C, de preferência a uma temperatura no intervalo de 4o a 45°C, com particular preferência a uma temperatura no intervalo de 15° a 37°C, preferindo-se particularmente uma temperatura no intervalo de 20° a 37°C, especialmente à TA, no máximo durante 6 horas, de preferência no máximo 4 horas, com particular preferência 2 horas, especialmente 1 hora, preferindo-se particularmente 1 a 20 minutos, com especial preferência de 3 a 5 minutos. A incubação pode ser realizada, por exemplo, durante 2 a 120 min a uma temperatura de 4o a 37°C, de preferência durante 20 a 30 min a 25°C ou 37°C, com particular preferência durante 3 a 5 min a 37°C. O processo de acordo com o invento é realizado de maneira análoga com outros suportes sólidos que podem ser adicionados à amostra. As condições de incubação e operações de separação individuais devem ser adaptadas adequadamente aos diferentes suportes sólidos. Esta adaptação pode ser realizada de maneira simples através de uma série de ensaios e não necessita de nenhuma explicação adicional para uma pessoa competente na matéria.

Alternativamente, o processo de dois passos pode também ser realizado em suportes sólidos adequadamente revestidos que não são adicionados à amostra, mas onde a amostra é colocada em cima ou dentro do suporte sólido, p. ex. uma placa de microtitulação ou um recipiente de reacção. Neste caso, a amostra é colocada p. ex., a seguir ao passo a), nas respectivas cavidades da placa de microtitulação, onde é incubada, de preferência durante cerca de 20 a 30 minutos sob 17

ΕΡ 1 399 551 /PT as condições restantes iguais ao que acabou de ser descrito. As cavidades de uma placa de microtitulação ou as paredes internas de um recipiente de reacção podem apresentar os mesmos revestimentos descritos anteriormente para as partículas magnéticas.

Os processos de acordo com o invento (processos de dois passos) podem ser utilizados, por exemplo, para substituírem uma centrifugação, tornando possível, assim, pela primeira vez, a purificação automática de células bacterianas. Desta maneira é pela primeira vez possível uma automatização completa, por exemplo da análise genómica, isto é, desde a inoculação das culturas bacterianas até a determinação da sequência. Além disso, os processos de acordo com o invento podem ser utilizados, por exemplo, para isolar componentes celulares, especialmente lipopolissacáridos, endotoxinas ou exopolissacáridos. A exposição dada a seguir em relação ao acoplamento ou à imobilização de proteínas de bacteriófago às partículas magnéticas é correspondentemente também válida para o acoplamento ou a imobilização de proteínas de bacteriófago ou polipéptidos aos suportes sólidos (processos de dois passos). 0 revestimento dos suportes sólidos com os polipéptidos ou as proteínas de bacteriófago anteriormente descritos pode ser realizado de maneira diferente.

As proteínas de bacteriófago podem ser fixadas aos suportes sólidos através de um acoplamento covalente. A ligação muito firme ao suporte que este acoplamento facilita, torna possível a utilização de condições de lavagem rigorosas para a lavagem das células eventualmente necessária para o processamento posterior das células acumuladas. 0 acoplamento das proteínas de bacteriófago através de adsorção é um processo muito simples e pouco dispendioso. 0 acoplamento das proteínas de bacteriófago através de biotina/estreptavidina ou através de sistemas de ligando/receptor comparáveis, torna possível o processo de dois passos. A estreptavidina, utilizada nesta abordagem, pode ser fixada não só através de adsorção como também através de um acoplamento químico. 0 que importa no revestimento é uma imobilização funcional, ou seja, que as proteínas de bacteriófago dispunham de estruturas 18

ΕΡ 1 399 551 /PT acessíveis para as bactérias, apesar da fixação aos suportes sólidos.

No acoplamento covalente, as proteínas de bacteriófago podem ser acopladas, p. ex., através de grupos amino primários ou grupos carboxilo, a materiais de suporte já activados pelo fabricante, p. ex. partículas magnéticas da Merck, Estapor, etc. através de condições padrão, p. ex. -NH2 através de cloreto de cianurilo (Russian Chemical Rev., 1964, 33_: 92- 103), ou -COO através de EDC (l-etil-3'-[3'-dimetilaminopropil]carbodiimida) (Anal. Biochem. 1990 185: 131-135). Além disso, os suportes sólidos podem ser activados directamente por meio de processos adequados. Além disso, o acoplamento pode ser realizado de forma orientada através de espaçadores de maleimida ou iodoacetilo, p. ex. a uma cisteína introduzida de forma N-terminal. A imobilização das proteínas de bacteriófago ao material de suporte por meio de adsorção, pode ser realizada através de incubação de uma solução de proteína de bacteriófago num tampão aquoso, p. ex. Tris 100 mM, pH 7,3, ou fosfato de sódio 100 mM, pH 7,5, PBS (fosfato de sódio 10 mM, pH 7,4, cloreto de sódio 150 mM) , durante várias horas ou durante a noite a uma temperatura de 4°C a 45°C, de preferência de 15°C a 37°C, com particular preferência de 20°C a 37°C, preferindo-se particularmente a 37°C ou à TA, sendo particularmente preferido de 30-65°C durante 2-4 h. A seguir à adsorção, a solução de revestimento é removida e a estrutura de suporte é armazenada numa solução aquosa, eventualmente tamponada.

Um outro aspecto do invento é um suporte sólido, especialmente uma partícula magnética ou uma placa de microtitulação, revestida com proteínas de bacteriófago ou com polipéptidos dirigidos contra proteínas de bacteriófago. Estes polipéptidos podem ser anticorpos, lectinas, receptores ou anticalinas específicos para as proteínas de bacteriófago. Além disso, os suportes sólidos podem estar revestidos com estreptavidina.

Um outro aspecto do invento são proteínas de bacteriófago com strep-tag que apresenta uma cisteína exposta na superfície, para a biotinilação específica dirigida, p. ex. os 19

ΕΡ 1 399 551 /PT tags de acordo com a SEQ ID NO: 5, 6 e 7. Um exemplo de uma pl2 com um tag é a sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO: 8. Prefere-se uma pl2 com um tag, especialmente com um tag tendo uma cisteina exposta na superfície, especialmente uma pl2 com o tag de acordo com a SEQ ID NO: 6 e 7. Esta biotinilação dirigida pode ser mediada adicionalmente através de um espaçador ou linker adequado. Um outro aspecto do invento é a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de bacteriófago juntamente com strep-tag. 0 presente invento refere-se além disso aos aminoácidos com uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 5, 6 e 7. Além disso, o presente invento refere-se aos ácidos nucleicos que codificam a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5, 6 e 7.

Um outro aspecto do invento refere-se a um kit para o enriquecimento de células bacterianas e/ou componentes celulares, compreendendo os suportes sólidos de acordo com o invento, p. ex. as partículas magnéticas, partículas de vidro, partículas de agarose, recipientes de reacção ou placas de microtitulação, assim como as soluções necessárias para o enriquecimento das bactérias e/ou dos componentes celulares, com os reagentes de teste. O kit para o enriquecimento por meio de partículas magnéticas contém, de preferência, uma solução estabilizada de uma variante de pl2 com um resíduo de cisteina introduzido de forma N-terminal, para a biotinilação orientada, ou NS-T4pl2 (ou T4pl2-bio) 1 mg/ml em Tris-HCl 100 mM, pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tween 20 a 0,05% suplementado com uma mistura de inibidor de protease (Sigma), como solução (armazenada de preferência a 4°C) ou como liofilizado. Além disso uma solução de partículas que consiste em partículas magnéticas revestidas com estreptavidina ou estreptactina numa solução estabilizante (PBST com azida de sódio a 0,005%). O kit para um enriquecimento por meio de placas de microtitulação contém, de preferência, uma solução estabilizada de uma variante de pl2 com um resíduo de cisteina introduzido de forma N-terminal, para a biotinilação orientada, ou NS-T4pl2 (ou T4pl2-bio) 1 mg/ml em Tris-HCl 100 mM, pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tween 20 a 0,05% suplementado com uma mistura de inibidor de protease (Sigma), 20 ΕΡ 1 399 551 /PT como solução (armazenada de preferência a 4°C) ou como liofilizado. Além disso contém uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina ou estreptactina.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento e não devem ser entendidos como sendo restritivos. Se não for indicado algo diferente, foram utilizados métodos padrão da biologia molecular, como p. ex. os que foram descritos por Sambrook e outros, 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 1. A purificação de pl2 de T4 do tipo selvagem foi realizada de acordo com as instruções descritas por Burda, M.R. & Miller, S. Eur J Biochem. 1999 265(2), 771-778. 2. Construção de pl2 com strep-tag N-terminal (N-Strep-pl2):

Por meio de PCR, foi introduzida no terminal 5' do gene de T4pl2, a sequência nucleotidica para strep-tag (patente US 5,506,121). Para este efeito foi construído, para o terminal 5' do gene de pl2, um iniciador (5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ ID NO: 1), o qual contém a sequência nucleotidica do strep-tag no seu terminal 5' (na sequência indicada em itálico) e um local de restrição (NdeI, na sequência sublinhada) , de modo a que o gene possa ser inserido no plasmídeo de expressão respeitando a grelha de leitura correcta. Para o terminal 3' do gene de pl2 foi construído um iniciador que introduz a jusante do gene de pl2 um local de restrição BamEI (na sequência indicado em itálico)

(5' -ACG CGC AAA GCT TGT CGA CGG ATC CTA TCA TTC TTT TAC CTT AAT TAT GTA GTT-3'), (SEQ ID NO: 2). A PCR foi realizada com 40 ciclos (1 min a 95°C, 1 min a 45°C e 1 min a 72°C) . A preparação da PCR foi cindida com as endonucleases de restrição Nde I e BamHI e o fragmento procurado foi inserido após um fraccionamento dimensional através de um gel de agarose e eluição do gel, no local de Nde I e BamHI do plasmídeo de expressão pET21a (Novagen, Merck Eurolab,

Darmstadt). Através de sequenciação do ADN foi verificado se a sequência do gene de N-Strep-pl2 está correcta. Os passos subsequentes que conduzem ao plasmídeo pNS-T4pl2p57, foram realizados como descrito por Burda, M.R. & Miller, S. (Eur J 21

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Biochem. 1999 265 (2), 771-778) para T4pl2p57. A seguir, o plasmídeo pNS-T4pl2p57 foi transformado na estirpe de expressão BL21 (DE3) (Novagen, Merck Eurolab, Darmstadt). 3. Inserção de um resíduo de cisteína N-terminal em N-Strep-pl2 (N-Strep-S3C-pl2 e N-Strep-S14C-pl2): A inserção de um resíduo de cisteína N-terminal (marcado a negrito) foi realizada como descrito em 2., sendo para este efeito construídos dois novos iniciadores para o terminal 5'. Para o N-Strep-S3C-pl2 foi utilizado o iniciador 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC CCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ ID NO: 3), para o N-Strep-S14C-pl2, o iniciador 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ ID NO: 4). 4. Purificação da proteína N-Strep-pl2: A estirpe E.coli BL21(DE3) com o plasmídeo pNS-T4pl2p57 foi cultivada em culturas de agitação de 2 1 (meio LB com ampicilina 100 pg/ml) até se obter uma D0600 de 0,5-0,7 a 37°C e a expressão da proteína N-Strep-pl2 foi induzida através de adição de IPTG (isopropil-P-tio-galactopiranósido) 1 mM. A seguir a uma incubação durante 4 h a 37°C, as células foram recolhidas. As células recolhidas de 10 1 de cultura foram retomadas em 50 ml de fosfato de sódio 20 mM do pH 7,2, MgS04 2 mM e NaCl 0,1 M, lisadas através de um tratamento de três vezes com uma French-Press (20000 psi) e, a seguir, centrifugadas durante 30 min a 15000 rpm (SS34). A seguir a duas lavagens no mesmo tampão, a proteína N-Strep-pl2 foi extraída da pelete através de agitação durante 30 min em Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, e EDTA 10 mM, a preparação foi centrifugada durante 30 min a 15000 rpm (SS34) e a NS-pl2 removida foi armazenada no sobrenadante a 4°C. A extracção foi repetida duas vezes e os sobrenadantes reunidos foram colocados numa coluna de afinidade para estreptactina (15 ml), equilibrada com tampão "W" (Tris-HCl 100 mM do pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM) , (IBA GmbH, Gõttingen) . A seguir à lavagem com 5 volumes de coluna de tampão "W", eluíu-se com 3 volumes de tampão "W" com destiobiotina 2,5 mM no tampão "W". Após uma diálise repetida contra tampão "W" e concentração, verificou-se a concentração e a pureza da N-Strep-T4pl2 através de SDS-PAGE e espectroscopia UV (Burda e outros 1999) . A partir de 10 litros 22 ΕΡ 1 399 551 /PT de cultura foram purificados, desta maneira, cerca de 100 mg de N-Strep-T4pl2.

Nome Sequência do tag Nstrep-pl2 MASWSHPQFEKGAS SEQ ID NO 5 Nstrep-pl2-S3C MACWSHPQFEKGAS SEQ ID NO 6 Nstrep-pl2-S14C MASWSHPQFEKGAC SEQ ID NO 7 5. Purificação alternativa de pl2: Para este efeito, a pelete celular (proveniente de 10 1 de cultura, BL21 (DE3) transformada com o plasmídeo pNS-T4pl2p57 ou pT4pl2p57) foi retomada no tampão 1, (fosfato de sódio 10 mM, pH 9, NaCl 500 mM, MgCl2 4 mM) e lisado por meio de uma French-Press (como descrito em 3). A seguir, o material foi centrifugado durante 45 minutos a 20000 rpm (SS-34) e a pelete foi ressuspensa (= lavada) em cerca de 25 ml de tampão 1. Esta operação de lavagem foi repetida duas vezes e a pelete foi extraída com 25 ml de tampão 2: (NaPi 50 mM, pH 5, NaCl 100 mM, EDTA 25 mM) . Para este efeito, a pelete ressuspensa foi agitada para a extracção durante 60 minutos à temperatura ambiente e, a seguir, separada por centrifugação (20000 rpm (SS-34) durante 45 minutos). Quando necessário, esta extracção era repetida 2 vezes. A seguir, os sobrenadantes da extracção foram unidos e colocados directamente numa coluna de permuta aniónica (Resources, Pharmacia). Como tampão de eluição foi utilizado hidrogenofosfato de Na 15 mM, formato de Na 15 mM, acetato de Na 30 mM, pH 5,0, NaCl 50 mM. A eluição foi realizada através de um gradiente salino linear de NaCl 50 mM a NaCl 600 mM no tampão de eluição. A seguir, a pl2 purificada foi dialisada para armazenamento, contra Tris 50 mM, pH 8,5, NaCl 150 mM, EDTA ou PBS 5 mM, congelada em alíquotas em N2 e armazenada a -20°C. 6. Biotinilação de pl2: Para a biotinilação da proteína pl2

TM foram utilizadas EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotm ou EZ- TM _

Lmk TFP-PEO-Biotm da Pierce, Estados Unidos, e a formulação de biotinilação realizada de acordo com as instruções indicadas pelo fabricante, utilizando para a biotinilação cerca de 30 moléculas de biotina por trímero de pl2. A seguir, o acoplamento da biotina foi verificado e quantificado por meio do ensaio HABA (Savage MD, Mattson G, Desai S, 23

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Nielander GW, Morgensen S e Conklin EJ, 1992, Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook, Pierce, Illinois). Em média foram ligadas, finalmente, 5-10 moléculas de biotina por trimero de pl2 . 7. Para a biotinilação da cisteina inserida de forma

, TM N-terminal utilizou-se EZ-Link PEO-Maleiimid-Biotin e EZ-

TM

Link PEO-Iodoacetil-Biotin da Pierce, Estados Unidos, de acordo com as instruções do fabricante. A reacção foi verificada como descrito em 5. 8. Biotinilação do bacteriófago T4: O bacteriófago foi purificado de acordo com Bachrach U e Friedmann A (1971)

Practical procedures for the purification of bacterial viruses, Appl Microbiol 22: 706-715. O fago purificado foi

TM dralrsado contra PBS e marcado com EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-

TM

Biotin ou EZ-Link TFP-PEO-Brotin da Pierce, Estados Unidos, de acordo com as instruções do fabricante, numa proporção de 100-100000 moléculas de biotina por fago. 9. Recolha dependente de pl2 de E.coli, de acordo com o processo de 1 passo e o processo de 2 passos (fig. 1) : Na ligação de acordo com o processo de 1 passo (VC), a proteína N-Strep-pl2 foi incubada com as pérolas magnéticas de estreptavidina (10 yg de proteína/50 μΐ de pérolas a 1%) e, a seguir, as pérolas foram lavadas 3x com PBST. Para a ligação das células misturaram-se em cada um dos casos 200 μΐ de uma cultura de uma noite (overnight) de E.coli diluída de 1 para 10 em LB (cerca de 1 x 108 células/ml) por cavidade de uma placa de microtitulação, com 10 μΐ de pérolas revestidas com N-Strep-pl2 e incubou-se durante períodos de tempo diferentes (fig. 1) à TA. A seguir, as pérolas com as células ligadas foram concentradas na parede das cavidades por meio de um separador magnético (Bilatec AG, Mannheim) durante 3-5 min. As pérolas foram lavadas 3x com PBST e a seguir foi verificada a actividade de β-galactosidase (Apte SC e outros, 1995, Water res. 29, 1803-06) das células que permaneceram ligadas às pérolas. Na ligação de acordo com o processo de 2 passos foi incubada uma diluição 1:10 de uma cultura de uma noite (overnight) de E.coli (cerca de 1 x 108 células/ml) durante lh (em outros ensaios durante 1 min, 3 min, 10 min, 30 min) com a proteína N-Strep-pl2 (10 yg de proteína/ml de suspensão 24 ΕΡ 1 399 551 /PT celular), à TA. A seguir foram adicionados 200 μΐ da mistura de proteina/células, a 10 μΐ de pérolas de estreptavidina magnéticas a 1% e incubou-se durante os tempos indicados na fig. 1 à TA. Para verificar as células ligadas procedeu-se, a seguir, como no processo de 1 passo. 10. Ligação de E.coli, dependente de T4, de acordo com o processo de 1 passo (VC) e de acordo com o processo de 2 passos (VIK) (fig. 2). Na ligação de acordo com o processo de 1 passo (VC) , o fago T4 biotinilado (100 moléculas de biotina/fago) foi ligado no período de lh a pérolas de estreptavidina a 1% (1010 PFU/ml de pérolas a 1%) e as pérolas foram lavadas a seguir 3x com PBST. Após a ligação das células (25 μΐ de pérolas de fago/ml de suspensão celular) no espaço de 2 h, as pérolas foram lavadas e as células de E.coli ligadas foram detectadas através da actividade de β-galactosidase (indicações em unidades relativas). Na ligação de acordo com o processo de 2 passos (VIK) , as células foram incubadas durante 1 h com o fago biotinilado (2,5 108 PFU/ml de suspensão celular) e a mistura foi incubada a seguir durante 2 h com as pérolas de estreptavidina (25 μΐ de pérolas a 1%/ml de suspensão celular). O procedimento subsequente foi o mesmo que no processo de 1 passo. Enquanto durava a incubação de fago e bactérias foram adicionados ao meio os antibióticos rifampicina (25 pg/ml), cloranfenicol (25 pg/ml) e tetraciclina (2 pg/ml). 11. Colheita de células E. coli de acordo com o processo de 2 passos, a partir de meios de cultura diferentes (fig. 3): As estirpes LE392 e JM83 de E.coli foram cultivadas durante a noite no respectivo meio. A 200 μΐ de suspensão celular foi adicionada N-Strep-pl2 (10 pg/ml de suspensão celular). Ao cabo de uma incubação de 5 min à TA foram adicionados 10 μΐ de pérolas de estreptavidina a 1%, misturados aspirando 3 vezes com a pipeta e incubou-se mais uma vez durante 5 min à TA. A seguir, os complexos de bactérias-pérolas foram separados no espaço de 3-5 min por meio do separador magnético acima indicado e as células remanescentes no sobrenadante foram determinadas através da dispersão do sobrenadante aos 600 nm. 12. Isolamento de plasmídeos a partir de E.coli a seguir à colheita de células através do processo de 2 passos (fig. 4). 25

ΕΡ 1 399 551 /PT

Por cada 300 μΐ de uma cultura de uma noite (overnight) de E.coli contendo o plasmídeo pUC19, foi feita a colheita de acordo com o processo de 2 passos, como descrito em 9. Após a separação das células por meio do separador magnético acima indicado, o plasmídeo foi isolado das células, uma vez através de um processo de extracção em fase sólida (QIAprep, Qiagen, Hilden) e também através de um processo com pérolas magnéticas (Bilatec, Mannheim), de acordo com as instruções dos fabricantes. 13. Enriquecimento de células de E.coli a partir de um volume de cultura de 10 ml através de N-Strep-pl2 e através do bacteriófago biotinilado T4-bio, de acordo com o processo de 2 passos (fig. 5): Para o enriquecimento com N-Strep-pl2 foram adicionados a 10 ml de culturas de E.coli com 109, 108 e 107 células por ml, respectivamente, 30 pg ou 6 pg de proteína e as misturas foram rodadas durante lha 37°C. Para o enriquecimento com T4-bio foram adicionados a 10 ml de culturas, com ΙΟ9, 108 e 107 células por ml, em cada um dos casos 1010 fagos T4-bio e 10 pg de rifampicina/ml e 2 pg de tetraciclina/ml e as misturas foram rodadas durante lha 37°C. A seguir foram adicionados às preparações 100 pl de pérolas magnéticas de estreptavidina a 1% e as misturas foram rodadas durante mais uma hora. As células ligadas às pérolas magnéticas foram separadas por meio de um íman (ABgene, Hamburgo), lavadas 3x com PBST e detectadas através da sua actividade de β-galactosidase. 14. Colheita de células de E.coli vivas através do processo de 2 passos com pl2 biotinilada (fig. 6): células de E. coli (200 pl de uma cultura) foram recolhidas de acordo com o processo de 2 passos como no exemplo 9 (10 pg de pl2 biotinilada/ml de cultura celular e 10 pl de pérolas de estreptavidina a 1%/ml de cultura celular) e as pérolas foram lavadas 2x com PBST. A seguir foi verificada a actividade de β-galactosidase e foi verificado o crescimento das células ao fim de 2 h através da dispersão a 600 nm, no fotómetro. 15. Selectividade da colheita dependente de N-Strep-pl2 (fig. 7 e 8) : Foram colhidos em cada um dos casos 200 pl de uma cultura de uma noite (overnight) de diferentes estirpes de E.coli (fig. 7) assim como de diferentes estirpes bacterianas 26 ΕΡ 1 399 551 /PT (fig. 8) de acordo com o processo de 2 passos (como descrito no exemplo 9). A seguir à concentração das pérolas no separador magnético, a quantidade de células colhidas foi determinada através da dispersão do sobrenadante a 600 nm. 16. Ligação selectiva de E.coli a pérolas magnéticas de estreptavidina através de T4-bio e detecção de E.coli através de pl2 marcada com FITC (fig. 9) . A proteína pl2 foi marcada com FITC (Molecular Probes, Leiden) de acordo com as instruções do fabricante e dialisada contra PBS. A uma cultura mista (cerca de 108~9 células/ml) de E. coli e Serratia marcescens foi adicionada pl2 marcada com FITC (5 pg/ml). Após uma incubação de 5 min à TA, no escuro, foram adicionados 109 fagos T4-bio e rifampicina (10 pg/ml), cloranfenicol (25 yg/ml) e tetraciclina (2 pg/ml). Como controlo utilizou-se um fago T4 não biotinilado. A seguir a uma incubação de 10 min foram adicionadas pérolas de estreptavidina a 1% (10 μΐ/ml) e as preparações foram observadas no microscópio (fig. 9). 17. Determinação do limite de detecção para o isolamento dependente de N-Strep-pl2 de células de E.coli de acordo com o processo de 2 passos (fig. 10) : Em cada um dos casos foram incubados, durante lh, 300 μΐ de diluições de uma cultura de uma noite (overnight) de E.coli ( 102-105 células/ml) em placas de microtitulação com N-Strep-pl2 (10 pg de proteína/ml). A seguir foram adicionadas pérolas magnéticas de estreptavidina (100 μΐ de pérolas a 1%/ml), misturou-se e as células ligadas foram peletizadas por meio de um íman (Bilatek, Mannheim). As pérolas foram lavadas 3x com PBST. A detecção das células de E.coli foi realizada através de substratos fluorescentes e luminescentes para a β-galactosidase. 18. Acoplamento químico de T4pl2 a pérolas magnéticas (fig. 11): 150 μΐ de pérolas magnéticas a 1% (EM2-100/40, Merck Eurolab, França) foram lavados 3x com tampão de fosfato de sódio 10 mM, pH 6, e colocados em 40 μΐ de tampão. A seguir à adição de 120 μΐ de uma solução de EDC (1-et il-3' - [ 3' -dimetilaminopropil]carbodiimida) (30 mg/ml) e incubação durante 5 min à TA, foram adicionados com uma pipeta 160 μΐ de solução de T4pl2 (0,7 mg de proteína/ml de tampão de fosfato de sódio 10 mM, pH 6), misturou-se e a preparação foi incubada durante 2 h à TA. Através da adição de 1 volume de Tris-HCl 27

ΕΡ 1 399 551 /PT 0,2 Μ, ρΗ 7, e Tween 20 a 0,05%, a reacção overnight foi parada a 4°C. A seguir, as pérolas foram lavadas 4x com PBST e, com PBST, ajustadas a um teor de 1%. O acoplamento de pl2 às pérolas foi testado por meio de um anti-soro especifico para pl2. A actividade de ligação de pl2-pérolas foi verificada através da ligação de células de E.coli de acordo com o processo de 1 passo. Para este efeito foram incubados durante 5 min, 3 μΐ de pl2-pérolas a 1% com 200 μΐ de uma cultura overnight de E.coli de uma diluição de cem vezes (cerca de 1 x 107 células/ml), lavou-se 3x com PBST e as células ligadas foram detectadas através da sua actividade de β-galactosidase (fig. 11). 19. Adsorção de pl2 a diferentes pérolas magnéticas de poli(álcool vinilico) (PVA) (fig. 12): 200 μΐ de pérolas de PVA a 2% (Chemagen AG, Baesweiler) foram incubados durante a noite com quantidades diferentes de T4pl2 (0-5 pg de proteina/mg de pérolas) em Tris-HCl 100 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 200 mM, a 37°C. A seguir, as pérolas foram lavadas 2x com PBST e retomadas em PBS até se atingir 2%. A ligação funcional de T4pl2 às pérolas foi verificada através da ligação de células de E.coli. Para este efeito foram misturados 200 μΐ de uma cultura overnight de E.coli com 10 μΐ de pl2-pérolas e incubou-se durante 5 min à TA. A seguir à separação das células ligadas mediu-se a dispersão do sobrenadante a 600 nm e comparou-se com a dispersão da cultura de E.coli antes da adição das pérolas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> PROFOS AG <120> Processo para a purificação de células bacterianas e componentes celulares

<130> PRO-00 4 PCT <150>DE 101 29 815 <151>2001 -06-24 <160>8 <170>Patentln versão 3.1 28

ΕΡ 1 399 551 /PT

<210> 1 <211> 78 <212> ADN <213> sequência artificial <400> 1 gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgccagtaat 60 aatacatatc aacacgtt 78

<210>2 <211> 54 <212> ADN <213> sequência artificial <400> 2 acgcgcaaag cttgtcgacg gatcctatca ttcttttacc ttaattatgt agtt 54

<210>3 <211> 78 <212> ADN <213> sequência artificial <400> 3 gaaggaacta gtcatatggc ttgttggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgccagtaat 60 aatacatatc aacacgtt 78

<210> 4 <211> 78 <212> ADN <213> sequência artificial gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgcctgtaat 60

aatacatatc aacacgtt 7B

<210 > 5 <211>19 <212> PRT <213> sequência artificial <400>5

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn 15 10 15

Thr Tyr Gin

<210>6 <211> 19 <212> PRT <213> sequência artificial 29

ΕΡ 1 399 551 /PT <4 Ο Ο > 6

Met Ala Cys Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn 1 5 10 15

Thr Tyr Gin

<210>7 <211> 19 <212> PRT <213> sequência artificial <400>7

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Gly Ala Cys Asn Asn 15 io 15

Thr Tyr Gin Λ O \—1 CM V 8 Λ \—1 \—1 CM V 539 <212> PRT <213> sequência artificial <400> 8

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gin Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn 15 io 15

Thr Tyr Gin His Vai Ser Asn Glu Ser Arg Tyr Vai Lys Phe Asp Pro 20 25 30

Thr Asp Thr Asn Phe Pro Pro Glu Ile Thr Asp Vai Gin Ala Ala Ile 35 40 45

Ala Ala Ile Ser Pro Ala Gly Vai Asn Gly Vai Pro Asp Ala Ser Ser 50 55 60

Thr Thr Lys Gly Ile Leu Phe Leu Ala Thr Glu Gin Glu Vai Ile Asp 65 70 75 80

Gly Thr Asn Asn Thr Lys Ala Vai Thr Pro Ala Thr Leu Ala Thr Arg 85 90 95

Leu Ser Tyr Pro Asn Ala Thr Glu Ala Vai Tyr Gly Leu Thr Arg Tyr 100 105 110

Ser Thr Asp Asp Glu Ala Ile Ala Gly Vai Asn Asn Glu Ser Ser Ile 115 120 125 30

ΕΡ 1 399 551 /PT

Thr Pro Ala Lys Phe Thr Vai Ala Leu Αεη Asn Vai Phe Glu Thr Arg 130 135 140

Vai Ser Thr Glu Ser Ser Asn Gly Vai Ile Lys Ile Ser Ser Leu Pro 145 ISO 155 160

Gin Ala Leu Ala Gly Ala Asp Asp Thr Thr Ala Met Thr Pro Leu Lys 165 170 175

Thr Gin Gin Leu Ala Vai Lys Leu Ile Ala Gin Ile Ala Pro Ser Lys 180 185 190

Asn Ala Ala Thr Glu Ser Glu Gin Gly Vai Ile Gin Leu Ala Thr Vai 195 200 205

Ala Gin Ala Arg Gin Gly Thr Leu Arg Glu Gly Tyr Ala Ile Ser Pro 210 215 220

Tyr Thr Phe Met Asn ser Thr Ala Thr Glu Glu Tyr Lys Gly Vai Ile 225 230 235 240

Lys Leu Gly Thr Gin Ser Glu Vai Asn Ser Asn Asn Ala Ser Vai Ala 245 250 255

Vai Thr Gly Ala Thr Leu Asn Gly Arg Gly Ser Thr Thr Ser Met Arg 260 265 270

Gly Vai Vai Lys Leu Thr Thr Thr Ala Gly Ser Gin Ser Gly Gly Asp 275 280 285

Ala Ser Ser Ala Leu Ala Trp Asn Ala Asp Vai Ile His Gin Arg Gly 290 295 300

Gly Gin Thr Ile Asn Gly Thr Leu Arg Ile Asn Asn Thr Leu Thr Ile 305 310 315 320

Ala Ser Gly Gly Ala Asn Ile Thr Gly Thr Vai Asn Met Thr Gly Gly 325 330 335

Tyr ile Gin Gly Lys Arg Vai vai Thr Gin Asn Glu ile Asp Arg Thr 340 345 350 31

ΕΡ 1 399 551 /PT

Ile Pro Vai Gly Ala-Ile Met Met Trp Ala Ala Asp Ser Leu Pro Ser 355 360 365

Asp Ala Trp Arg Phe Cys His Gly Gly Thr Vai Ser Ala Ser Asp Cys 370 375 380

Pro Leu Tyr Ala Ser Arg Ile Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ser Ser Ser 385 390 395 400

Asn Pro Gly Leu Pro Asp Met Arg Gly Leu Phe Vai Arg Gly Ser Gly 405 410. 415

Arg Gly Ser His Leu Thr Asn Pro Asn Vai Asn Gly Asn Asp Gin Phe 420 425 430

Gly Lys Pro Arg Leu Gly Vai Gly Cys Thr Gly Gly Tyr Vai Gly Glu 435 440 445

Vai Gin Lys Gin Gin Met Ser Tyr His Lys His Ala Gly Gly Phe Gly 450 455 460

Glu Tyr Asp Asp Ser Gly Ala Phe Gly Asn Thr Arg Arg Ser Asn Phe 465 470 475 480

Vai Gly Thr Arg Lys Gly Leu Asp Trp Asp Asn Arg Ser Tyr Phe Thr 485 490 495

Asn Asp Gly Tyr Glu Ile Asp Pro Ala Ser Gin Arg Asn Ser Arg Tyr 500 505 510

Thr Leu Asn Arg Pro Glu Leu Ile Gly Asn Glu Thr Arg Pro Trp Asn 515 520 525

Ile Ser Leu Asn Tyr Ile Ile Lys Vai Lys Glu 530 535

Lisboa

Claims (16)

1. ΕΡ 1 399 551 /PT 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a purificação selectiva de células bacterianas ou componentes celulares bacterianos, o qual compreende as operações seguintes: a) contacto de uma amostra contendo células bacterianas ou componentes celulares bacterianos, com proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago, b) incubação subsequente da amostra contendo as células bacterianas ou componentes celulares bacterianos e as proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago, com um suporte sólido, sendo que o suporte sólido apresenta um ou vários grupos de acoplamento diferentes na sua superfície que ligam as bactérias e/ou as proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago, c) separação do suporte sólido com as células bacterianas ou componentes celulares bacterianos a si ligados, através das proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago, da amostra.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo de acoplamento é uma lectina, um receptor ou anticalina.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o grupo de acoplamento é uma estreptavidina ou avidina e as proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago estão acopladas a biotina ou a um strep-tag.
4. 4. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, em que o suporte sólido é uma partícula magnética, uma partícula de agarose, uma partícula de vidro, uma partícula de Luminex, um recipiente de reacção ou uma placa de microtitulação.
5. 5. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, em que são adicionadas duas ou mais proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago diferentes. ΕΡ 1 399 551 /PT 2/4
6. 6. Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, em que o componente celular bacteriano a purificar de maneira selectiva é uma endotoxina.
7. 7. Partículas magnéticas revestidas com proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago isoladas.
8. 8. Partículas magnéticas de acordo com a reivindicação 7, em que as proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago são seleccionadas do grupo que consiste em Oclr, lOtur, L2, L51, Ml, MVG51, MV-L1, 01, SpVl, VI, VI, V2, V4, V5, 108/016, 119, 29, 37, 43, 51, 59.1, Al-Dat, Aeh2, Bir, Ml, MSP8, 0115—A, 015OA, 031C, P-a-1, PhiC, Rl, R2, SK1, SV2, VP5, Ap3, Ap4, Mml, Mm3, Mm4, Mm5, phiUW 51, 43, 44RR2.8t, 65, Aehl, PM1, PIIBNV6, PS8, psi, PT11, 8764, A5/A6, A6, PM2, Wll, W2, W4, W7, IA, alpha, AP50, BLE, F, G, GA-1, II, IPy-1, morl, MP13, MP15, 0105, 029 (phi 29), 0NS11, PBP1, PBS1, SP10, SP15, SP3, SP8, SPP1, SPB, SPy-2, SST, type, 168, W23, SP50, W23, SP01, MAC-1, MAC-2, MAC-4, MAC-5, MAC-7, Tb, 0Cbl2r, 0Cb2, 0Cb23r, 0Cb4, 0Cb5, 0Cb8r, 0Cb9, 0CPI8, 0CP2, 0Crl4, 0Cr28, 011, 013, 02, 03, 05, 06, 08, 1, .phi.CPGl, CeB>, Fl, HM2, HM3, HM7, 7/26, A, A19, AN25S-1, Arp, AS-1, BL3, CONX, MT, Nl, 0A8O1O, S-6(L), β, A-4(L), AC-1, LPP-1, S-2L, S-4L, SM-1, Pl, Tl, Tuia, Tulb, TulI, 103, 107, 109, 2D/13, Ae2, alphalO, alpha3, BE/1, BF23, dA, deitai, delta6, d03, d04, do5, Ec9, eta8, fl, fd, G13, G14, G4, G6, HK022, HK97, HR, lambda, M13, M13mpl8, M20, MM, MS2, Mu, 01, 08O, 0A, 0R, 0X174, PA-2, Pl, P1D, P2, P22, QB, R17, S13, St-1, Tl, T2, T3, T4, T5, T6, T7, WA/1, WF/1, WW/1, zeta3, ZG/2, ZJ/2, C21, omega8, U3, chi, FC3-9, μ2, 01, 11F, 121, 1412, 3, 3T+, 50, 5845, 66F, 7480b, 8893, 9, 9266, al, alphal5, b4, B6, B7, Beccles, BZ13, C-l, C16, C2, C-2, DdVI, Esc-7-11, f2, fcan, Fl, Folac, fr, GA, H, H-19J, 12-2, Ialpha, ID2, Ifl, If2, Ike, JP34, JP501, K19, KU1, M, Mil, M12, MS2, NL95, 092, 01, 0ii, Omega8, pilHalpha, PR64FS, PRD1, PST, PTB, R, R17, R23, R34, sd, SF, SMB, SMP2, SP, B, ST, tau, tf-1, TH1, TW18, TW28, Vill, VK, W31, X, Y, ZG/1, ZIK/1, ZJ/1, ZL/3, ZS/3, Ap3, C3: , lb6, 223, fri, hv, hw222a, 0FSW, PL-1, y5, 1, 643, c2, kh, ml3, P008, P127, 1358, 1483, 936, 949, BK5-T, c2, KSY1, P001, P008, P107, P335, P034, P08 7, pro-2, 4211, psi M2 (ΨΜ2), Nl, N5, Brl, C3, L3, 13, ΕΡ 1 399 551 /PT 3/4 lacticola, Leo, 017, Rl-Myb, N13, N18, N24, N26, N36, N4, N5, XI, ΧΙΟ, X24, X3, X5, X6, D3, D4, 22, 32, AU, C-2, Pl, P2, P3, P4, Phi CT, phi CTX, PB-1, 12S, 7s, D3, F116, gh-1, gh-1, Kfl, M6, 0l, 0KZ, 0W-14, Pfl, W3, 2, 16-2-12, 2, 317, 5, 7-7-7, CM1, CT 4, m, NM1, NT2, 02037/1, 02042, 0gal-l-R, WT1, Mpl, MP2, Wl, epsilonl5, Felix 01, 16-19, 7-11, H-19J, Jersey, N4, SasLl, Vil, ZG/3A, San21, A3, A4, P22, 4, C1/TS2, Spl, 107, 187, 2848A, 3A, 44AHJD, 6, 77, B11-M15, Twort, 182, 2BV, A25, A25-24, A25-omega8, A25-PE1, A25-VD13, CP-1, Cvir, H39, P23, P26, phi A.streptomycini III, phi8238, phiC31, Sl, S2, S3, S4, S6, S 7, SH10, Tbl, Tb2, Tsl, 06N-22P, 06N-58P, 06N-58P, 4996, alpha3alpha, I, II, III, IV, kappa, nt-1, OXN-lOOP, OXN-52P, v6, Vf 12, Vf 33, VP1, VP11, VP3, VP5, X29, Cf, Cflt, RR66, 8/C239, phiYe03-12, YerA41.
9. 9. Partículas magnéticas de acordo com a reivindicação 7 ou 8 com um diâmetro de cerca de 0,5 a cerca de 4 pm ou cerca de 0,8 a cerca de 1,8 pm.
10. 10. Proteína de invólucro de bacteriófago ou proteína de cauda de bacteriófago compreendendo um marcador (tag), sendo que o marcador (tag) apresenta uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 5, 6 ou 7.
11. 11. Proteína de cauda de bacteriófago de acordo com a reivindicação 10, sendo que a proteína de cauda de bacteriófago é a proteína pl2 do fago T4.
12. 12. Proteína de invólucro de bacteriófago ou proteína de cauda de bacteriófago de acordo com uma das reivindicações 10 a 11, sendo que a proteína de invólucro de bacteriófago ou a proteína de cauda de bacteriófago é produzida através da tecnologia de ADN recombinante.
13. 13. Ácido nucleico que codifica uma proteína de invólucro de bacteriófago ou uma proteína de cauda de bacteriófago de acordo com uma das reivindicações 10 a 12.
14. 14. Aminoácido com uma sequência de acordo com a SEQ ID NO: 6, 7 ou 8. ΕΡ 1 399 551 /PT 4/4
15. 15. Utilização das partículas magnéticas de acordo com uma das reivindicações 7 a 9 ou das proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou das proteínas de cauda de bacteriófago de acordo com uma das reivindicações 10 a 12, para o isolamento de ácidos nucleicos, especialmente para a preparação de plasmídeos, de componentes celulares bacterianos, especialmente de lipopolissacáridos, endotoxinas ou exopolissacáridos.
16. 16. Kit para a purificação de células bacterianas e/ou componentes celulares bacterianos, compreendendo as partículas magnéticas de acordo com uma das reivindicações 7 a 9 e/ou as proteínas de invólucro de bacteriófago e/ou proteínas de cauda de bacteriófago de acordo com uma das reivindicações 10 a 12. Lisboa,