PT1392822E - Linha de células duplamente transfectada útil para a identificação de inibidores de transporte - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "LINHA DE CÉLULAS DUPLAMENTE TRANSFECTADA ÚTIL PARA A IDENTIFICAÇÃO DE INIBIDORES DE TRANSPORTE"

Descrição A presente invenção relaciona-se com uma linha de células duplamente transfectada contendo (a) uma sequência de ADN que codifica um transportador de absorção para aniões orgânicos, preferencialmente 0ATP8, operativamente ligada a um promotor e (b) uma sequência de ADN que codifica uma bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos, preferencialmente a proteína 2 de multirresistência a fármacos (MRP2), operativamente ligada a um promotor. A presente invenção relaciona-se também com vários usos da referida linha de células, preferencialmente para a identificação de inibidores de transporte, por exemplo fármacos candidatos. 0 transporte vetorial é uma função importante de todas as células polarizadas contribuindo para a destoxificação e para a prevenção da entrada de toxinas nos órgãos. Isto é exemplificado pelo epitélio dos túbulos proximais renais, pelas células da barreira hematoencefálica, pelo epitélio intestinal, e, por último, mas não menos importante, pelos hepatócitos. Uma das principais funções hepatocelulares é a remoção de substâncias endógenas e exógenas da circulação sanguínea e a sua secreção para a bílis. Dois processos de transporte desempenham um papel decisivo neste transporte vetorial pelos hepatócitos: a absorção sinusoidal (basolateral) a partir de sangue e a secreção canalicular (apical) para a bílis. Nos hepatócitos humanos, a absorção independente de sódio de aniões orgânicos anfifílicos é mediada por pelo menos três proteínas de transporte, 2 nomeadamente pelos transportadores de aniões orgânicos humanos 0ATP2 (também conhecidos como OATP-C ou LST1, simbolo SLC21A6) (Abe et al. 1999; Hsiang et al. 1999; Kõnig et al. 2000a; Cui et al. 2001), OATP8 humano (SLC21A8) (Kõnig et al. 2000b; Cui et al. 2001), e OATP-B humano (SLC21A9) (Kullak-Ublick et al. 2001). Os três transportadores pertencem ao subgrupo 21A da superfamilia de transportador de soluto (SLC). Ao passo que OATP-B é expresso também em vários outros tecidos, OATP2 e OATP8 são expressos exclusivamente nos hepatócitos humanos. O espectro de substratos dos OATPs inclui sais biliares, conjugados de hormonas esteroides, hormonas tiroideias, e muitos outros aniões orgânicos anfifilicos (Abe et al. 1999; Kõnig et al. 2000a, b; Cui et al. 2001; Kullak-Ublick et al. 2000, 2001). Ao contrário destes transportadores de absorção basolaterais que se pensa serem do tipo permutador (Li et al. 1998), os transportadores de exportação apicais identificados nos hepatócitos humanos até agora são membros da superfamilia de cassetes ligadas a ATP (ABC) (Keppler and Arias 1997; Jansen 2000). A exportação de aniões orgânicos é mediada predominantemente pela bomba de exportação de sais biliares BSEP (ABCB11) pertencente ao subgrupo MDR (ABCB) da superfamilia ABC (Strautnieks et al. 1998; Gerloff et al. 1998; Wang et al. 2001) e pela proteina 2 de multirresistência a fármacos (MRP2, ABCC2) pertencente ao subgrupo MRP (ABCC) da superfamilia ABC (Buchler et al. 1996; Suzuki and Sugiyama 1998; Kõnig et al. 1999; Borst et al. 2000) . Enquanto que os principais substratos de BSEP são sais biliares como coliltaurina e colato (Gerloff et al. 1998), os aniões orgânicos transportados por MRP2 são principalmente conjugados de substâncias lipofílicas com glutationa, glucuronato, ou sulfato (Evers et al. 1998; Cui et al. 1999, Kõnig et al. 1999). 3 0 transporte trans-hepático de aniões orgânicos anfifílicos tem sido frequentemente estudado com uso de compostos modelo como sulfobromoftaleina (BSP) e indocianina verde (ICG) (Scharschmidt et al. 1975). A caracterização funcional dos três OATPs humanos identificados na membrana basolateral do hepatócito demonstrou que os três são capazes de mediar a absorção de BSP, com a maior afinidade para 0ATP2 (Km = 140 nM) e com a menor afinidade (Km =3,4 mM) para OATP8 (Kõnig et al. 2000b; Kullak-Ublick et al. 2001; Cui et al. 2001). No hepatócito BSP está predominantemente conjugado com glutationa para produzir BSP glutationa S-conjugado (BSP-SG) (Whelan et al. 1970; Snel et al. 1995). Estudos com ratazanas mutantes deficientes no transporte (Jansen et al. 1987) que não possuem a bomba de exportação canalicular Mrp2 (Paulusma et al. 1996; Buchler et al. 1996; Ito et al. 1997) sugeriram que esta bomba de exportação medeia a secreção de BSP-SG para a bilis. No entanto, não foi estabelecido que o próprio BSP é um substrato para MRP2 humano. Até agora, as proteínas de transporte como OATPs e MRPs foram estudadas principalmente com o uso de células de mamífero transf ectadas ou com o uso de sistemas de oócitos de Xenopus expressando somente uma proteína de transporte exógena recombinante (Madon et al. 1997; Ito etal. 1998; Evers et al. 1998; Cui et al. 1999, 2001; Abe et al. 1999; Hsiang et al. 1999; Kõnig et al. 2000a, b; Kullak-Ublick et al. 2001) .

Ao desenvolver ou conceber novos produtos farmacêuticos uma das questões críticas é para determinar se os compostos candidatos têm efeitos secundários indesejáveis como interferência com o transporte de substâncias que são produzidas ou ocorrem naturalmente no organismo, por 4 exemplo, interferência com o transporte hepático ou renal de aniões orgânicos, como exemplificado pela interferência da rifampicina, rifamicina SV, ou CDNB com o transporte transcelular de BSP. Para redução de custos, é desejável detetar esses efeitos secundários dos candidatos a fármacos numa fase inicial de desenvolvimento. Até agora, para o estudo de potenciais efeitos secundários dos fármacos candidatos foram usados animais ou culturas de células. No entanto, estas abordagens apresentam várias desvantagens, por exemplo são demoradas e dispendiosas, não permitem rastrear em grande volume os candidatos a fármacos etc.

Por esta razão, é objetivo da presente invenção fornecer um meio para a análise eficiente da interferência de um fármaco candidato com o transporte de substâncias que são produzidas ou ocorrem naturalmente no organismo, particularmente a interferência com o transporte hepático ou renal de aniões orgânicos o que ultrapassa as desvantagens dos sistemas presentemente usados.

De acordo com a invenção, isto pode ser conseguido com as matérias definidas nas reivindicações. Um sistema celular com transportadores humanos definidos de absorção e exportação foi estabelecido, isto é, uma linha de células MDCK duplamente transfectada expressando permanentemente um transportador de absorção recombinante para aniões orgânicos na membrana basolateral e uma bomba de exportação dependente de ATP para conjugados aniónicos na membrana apical. A absorção basolateral foi mediada pelo transportador de aniões orgânicos 0ATP8 humano (símbolo SLC21A8) e a subsequente exportação apical pela proteína 2 de multirresistência a fármacos (MRP2; símbolo ABCC2). Sob condições fisiológicas, ambas as proteínas de transporte são fortemente expressadas nos hepatócitos e contribuem para a eliminação hepatobiliar de aniões orgânicos. A 5 expressão e localização de 0ATP8 e MRP2 nas células MDCK a crescer em insertos de membrana Transwell foi demonstrada por imunoblotting e microscopia confocal de varredura a laser. Sulfobromoftaleina marcada com 3H (BSP) foi um substrato para ambas as proteínas de transporte e foi transferida do compartimento basolateral para o apical a uma taxa pelo menos 6 vezes mais rápida de células MD-CK-MRP2/OATP8 duplamente transfectadas do que células MD-CK-0ATP8 ou MDCK-MRP2 transfectadas uma vez. 0 transporte vetorial a uma taxa muito mais elevada de células duplamente transfectadas do que de células transfectadas uma vez foi também observado para os substratos marcados com 3H leucotrieno C4, 17b-glucuronosil estradiol, e sulfato de desidroepiandrosterona, para o substrato aniónico fluorescente fluo-3, e para o antibiótico rifampicina. Estudos de inibição indicaram que a formação intracelular de S-(2,4-dinitrofenil)-glutationa a partir de 2,4-clorodinitrobenzeno inibe seletivamente o transporte transcelular de [3H]BSP no sitio de exportação mediado por MRP2 . A identificação dos novos substratos para MRP2 e 0ATP8 demonstra que a linha celular duplamente transfectada é útil para a caracterização destes transportadores. Em comparação com células MDCK transfectadas separadamente com 0ATP8 ou MRP2, as duplamente transfectadas têm várias vantagens. Até agora, tem sido difícil estudar a função de MRP2 em células inteiras porque a maior parte dos substratos para MRP2 são carregados negativamente sob condições fisiológicas e portanto não conseguem penetrar a membrana plasmática sem um transportador de absorção. Por esta razão, MRP2 tem sido sobretudo estudado usando vesículas de membrana reviradas de dentro para fora preparadas a partir de células expressando MRP2. Com as células MDCK duplamente transfectadas expressando 0ATP8 e 6 MRP2 e com compostos tipo [3H]BSP e Fluo-3, que são substratos para ambos os transportadores, podemos agora rastrear mais facilmente em relação a inibidores MRP2 de com células intactas. Um inibidor apenas para MRP2 vai inibir o transporte transcelular e melhorar a acumulação intracelular de [3H]BSP. Um inibidor para ambos MRP2 e 0ATP8 vai reduzir o transporte transcelular mais fortemente do que a acumulação intracelular de [3H]BSP. Dado o manuseamento mais fácil das células duplamente transfectadas crescidas em insertos de membrana Transwell em comparação com a preparação e manuseamento de vesículas membranares, é possível desenvolver sistemas de rastreio de elevada capacidade para inibidores de MRP2 com o uso de células duplamente transfectadas. 0 uso do penta-anião fluorescente Fluo-3 como substrato para ambos 0ATP8 e MRP2 pode facilitar ainda mais o rastreio.

Para concluir, as células duplamente transfectadas da presente invenção fornecem um sistema útil para a identificação de substratos de transporte e inibidores de transporte incluindo candidatos a fármacos. Usando a linha celular duplamente transfectada da presente invenção, o efeito inibidor dos candidatos a fármacos em proteínas de transporte definidas que estão presentes, por exemplo, no fígado, rim, intestino ou barreira hematoencefálica pode ser investigado.

Do mesmo modo, a presente invenção fornece uma linha celular duplamente transfectada, sendo uma linha celular estável contendo (a) uma sequência de ADN que codifica um transportador de absorção para aniões orgânicos operativamente ligada a um promotor e (b) uma sequência de ADN que codifica uma bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos operativamente ligada a um promotor. Um transportador de absorção para aniões 7 orgânicos é expresso na membrana celular basolateral e a bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos é expressa na membrana celular apical.

Preferencialmente, para transfectar as células as sequências de ADN estão presentes num vetor ou vetor de expressão. Um especialista na técnica está familiarizado com exemplos destes. As sequências de ADN podem também estar contidas num virus recombinante contendo cassetes de expressão apropriadas. Virus adequados que podem ser usados na presente invenção incluem baculovirus, vaccinia, virus sindbis, SV40, virus Sendai, adenovírus, um virus AAV ou um parvovirus, tal como MVM ou H-l. 0 vetor pode também ser um retrovirus, tal como MoMULV, MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV ou GaLV. Para expressão em mamíferos, um promotor adequado preferido é o "promotor precoce imediato" de citomegalovírus humano (pCMV).

Para gerar as sequências de ADN descritas acima e para construir vetores de expressão que contêm as referidas sequências de ADN, é possível usar métodos gerais conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de recombinação in vitro, métodos sintéticos e métodos de recombinação in vivo como descrito em Sambrook et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, por exemplo. Métodos de transfectar as células, de selecionar transfectantes fenotipicamente e de expressar ADN de acordo com a invenção usando os vetores descritos acima são conhecidos na técnica.

Preferencialmente, a linha celular é uma linha celular humana. As células são células polarizadas, por exemplo hepatócitos, células de rim, por exemplo, MDCKII ou HepG2.

Numa outra forma de realização preferida da linha celular duplamente transfectada da presente invenção o transportador de absorção para aniões orgânicos é um membro do subgrupo 21A da superfamília de transportadores de solutos (SLC). Particularmente preferidos são 0AT1 (SLC22A6) (Hosoyamada et al. 1999), 0ATP2, 0ATP8 ou OATP-B.

Numa forma de realização mais preferida da linha celular duplamente transfectada da presente invenção, a bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos é um membro do subgrupo MDR (ABCB) ou do subgrupo MRP (AB-CC) da superfamilia ABC. Particularmente preferidos são a bomba de exportação de sais biliares BSEP (ABCB11) ou a proteina 2 multirresistente a fármacos (MRP2). Uma combinação de 0AT1 com MRP2, ambos expressados nas células tubulares proximais de rim humano (Tojo et al. 1999; Schaub et al. 1999), pode servir para estudar a depuração renal de aniões orgânicos.

Numa forma de realização ainda mais preferida da linha celular duplamente transfectada da presente invenção, a sequência de ADN que codifica um transportador de absorção para aniões orgânicos e/ou a sequência de ADN que codifica uma bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos estão operativamente ligadas a um promotor que permite uma expressão elevada.

Em alguns casos para investigar o efeito do metabolismo intracelular do fármaco no transporte, pode ser desejável transfectar as células da invenção com uma sequência de ADN que codifica um terceiro composto cuja natureza pode variar de acordo com o fármaco a ser estudado.

Finalmente, a presente invenção relaciona-se com vários usos da linha celular duplamente transfectada. Um uso 9 preferido é a identificação de um substrato de transporte ou de um inibidor do transporte, particularmente um candidato a fármaco. Formatos de ensaios adequados são conhecidos do especialista e, por exemplo, descritos nos exemplos, a seguir. Um formato de ensaio preferido é o rastreio de elevada capacidade.

Breve descrição dos desenhos

Fig. 1. Análise de imunoblot de MRP2 e 0ATP8 em células MDCK transfectadas. Frações de membrana brutas das células MD-CK transfectadas permanentemente com o vetor de controlo (MDCK-Co) , com cDNA de MRP2 humano (MDCK-MRP2) , com OATP8 humano (MDCK-0ATP8), ou com ambos MRP2 e OATP8 (MDCK-MRP2/OATP8) foram separadas por SDS-PAGE. A, MRP2 humano foi detetado pelo anticorpo policlonal EAG5 (Keppler and Kartenbeck 1996; Schaub et al. 1999). B, 0ATP8 humano foi detetado pelo anticorpo policlonal SKT (Kõnig et al. 2000b). No caso de OATP8, apenas a forma totalmente glicosilada é indicada pela ponta de uma seta, ao passo que a banda a cerca de 90 kDa representa uma forma sub-glicosilada da proteína (Kõnig et al. 2000b).

Fig. 2. Imunolocalização de MRP2 e OATP8 recombinantes em células MDCK. Células MDCK expressando apenas OATP8 (A, D) ou ambos MRP2 e OATP8 (B, C, E, e F) foram crescidas em insertos de membrana Transwell e examinadas por microscopia confocal de varredura a laser. OATP8 (fluorescência verde) e MRP2 (fluorescência vermelha) foram corados usando o anticorpo policlonal SKT (Kõnig et al. 2000b) e o anticorpo monoclonal M2III6 (Evers et al. 1998), respetivamente. A e B são imagens opostas focadas no centro da monocamada de células, C é uma imagem oposta focada na parte superior da monocamada de células. D, E, e F são secções verticais nas 10 posições indicadas pelas linhas brancas em A, B, e C. Para além da localização lateral do OATP8, pode ver-se alguma coloração intracelular desta proteína nas secções verticais. Apenas o MRP2 está localizado na membrana apical (E, F). Bar, 10/mm.

Fig. 3. Esquema de transfectantes de MDCK a crescer em insertos de membrana Transwell como uma monocamada polarizada. A membrana apical virada para o meio de cultura está separada da membrana basolateral virada para a estrutura membranar por junções apertadas. A bomba de exportação MRP2 está localizada na membrana apical, ao passo que o transportador de absorção OATP8 está localizado na membrana basolateral.

Fig. 4. Transporte transcelular de [3H]BSP. Células MDCK-Co (ê), MDCK-MRP2 (s), MDCK-OATP8 (c) , e MDCK-MRP2/OATP8 (g) foram crescidas em insertos de membrana Transwell. [3H] BSP (1 μΜ) foi dado aos compartimentos basolaterais. Nos mesmos pontos de tempo indicados, a radioatividade nos compartimentos apicais (transporte transcelular de [3H]BSP) e dentro das células (Acumulação intracelular de [3H]BSP) foi determinada. A absorção total de [3H]BSP foi calculada como a soma da radioatividade intracelular e apical. Os dados representam média ± SD (n = 4) . Para a maior parte das medições, o desvio padrão encontrou-se dentro do tamanho dos símbolos.

Fig. 5. Transporte vetorial e efluxo de [3H]BSP. Células MDCK-OATP8 e MDCK-MRP2/OATP8 foram crescidas em insertos de membrana Transwell. A, Transporte vetorial de [3H]BSP. [3H]BSP (1 μΜ) foi administrado aos compartimentos basolaterais (B ® A) ou aos compartimentos apicais (A® B). Após 15 min a 37°C, a radioatividade nos compartimentos opostos foi medida. B, Efluxo de [3H]BSP. As células MDCK- 11

0ΑΤΡ8 e MDCK-MRP2/0ATP8 foram incubadas com [3H]BSP (1 μΜ) nos compartimentos basolaterais a 37°C durante 30 min. As células foram depois lavadas com tampão frio e incubadas com tampão sem [3H]BSP a 37 °C durante 30 min. A radioatividade subsequentemente libertada para os compartimentos basolateral e apical e dentro das células foi medida. Os dados representam médias ± SD (n = 4) .

Fig. 6. Análises de HPLC de [3H]BSP. Células MDCK-

MRP2/OATP8 crescidas em insertos de membrana Transwell foram incubadas com 1 μΜ de [3H]BSP no compartimento basolateral a 37°C durante 30 min. O meio no compartimento apical e o lisado celular foram analisados por radio-HPLC como descrito em "Materiais e Métodos". A, [3H]BSP autêntico (Cui et al. 2001); B, radioatividade recolhida no compartimento apical; C, radioatividade acumulada nas células. [3H]BSP (ponta da seta) e glutationa S-conjugado de [3H]BSP ([3H]BSP-SG, seta) estão indicados. Acivicina, um inibidor da degradação da porção de glutationa de [3H]BSP-SG, foi adicionado à incubação a uma concentração de 5 mM.

Fig. 7. Transporte dependente de ATP de [3H]BSP por MRP2 humano. A, Vesículas de membrana reviradas de dentro para fora de células HEK293 transfectadas com MRP2 humano (HEK-MRP2) foram incubadas com 1 μΜ de [3H]BSP na presença de ATP (g) ou 5'-AMP (c) . B, o valor liquido de transporte dependente de ATP de [3H]BSP para as vesículas das células HEK-MRP2 (g) ou células HEK-Co (c) foi calculado subtraindo os valores determinados na presença de 5'-AMP dos valores na presença de ATP. C, O valor Km de MRP2 humano para BSP foi determinado em concentrações de BSP entre 1 e 10 μΜ. Os dados representam médias ± SD (n = 4) . 12

Fig. 8. Transporte transcelular de aniões orgânicos. Células MDCK-Co, MDCK-0ATP8, e MDCK-MRP2/0ATP8 crescidas em insertos de membrana Transwell foram incubadas com [3H]BSP (1 μΜ) , [3H]LTC4 (0,5 μΜ) , [3H]E217bG (5 μΜ) , [3H]DHEAS (5 mM) , Fluo-3 (2 μΜ) ou [3H]colil taurina (5 μΜ) nos compartimentos basolaterais a 37°C. A radioatividade (substratos marcados) ou fluorescência (Fluo-3) nos compartimentos apicais foi então medida após 30 min. Os dados representam médias ± SD (n = 4).

Fig. 9. Inibição do transporte transcelular de [3H]BSP. Células MDCK-OATP8 (A, C, E, G) , e MDCK-MRP2/OATP8 (B, D, F, H) crescidas em insertos de membrana Transwell foram incubadas com [3H]BSP (1 μΜ) nos compartimentos basolaterais na presença de diferentes concentrações de albumina do soro humano (HSA, C, D), rifampicina (E, F), ou rifamicina SV (G, H) . Para 2,4-cloro-dinitrobenzeno (CDNB) (A, B) , as células foram pré-incubadas com CDNB à temperatura ambiente durante 20 min, o transporte de [3H]BSP foi iniciado substituindo o tampão nos compartimentos basolaterais por tampão fresco contendo [3H]BSP e CDNB. Após incubação durante 30 min a 37°C, a radioatividade nos compartimentos apicais e dentro das células foi medida. Os dados representam médias ± SD (n = 4) .

Fig.10. Transporte transcelular de rifampicina. Células MDCK-Co, MDCK-MRP2, MDCK-OATP8, e MDCK-MRP2/OATP8 crescidas em insertos de membrana Transwell foram incubadas com 50 μΜ de rifampicina nos compartimentos basolaterais a 37°C durante 30 min. A concentração de rifampicina nos compartimentos apicais foi determinada pela absorção especifica de rifampicina a 475 nm. Os dados representam médias ± SD (n = 4). 13

Fig. 11. Imunolocalização das proteínas de transporte recombinantes em linhas celulares duplamente transfectadas. Células MDCKII transfectadas com 0AT1 e MRP2 (A,C) ou com 0ATP2 e MRP2 (B,D) foram crescidas em insertos de membrana Transwell. MRP2 recombinante foi corado com o antissoro EAG5 (verde em A,C) ou com o anticorpo comercial M2III6 (vermelho em B, D) . 0AT1 recombinante foi corado com um anticorpo monoclonal comercial contra um epitopo na terminação carboxilo de 0AT1 (vermelho em A, C) . 0ATP2 recombinante foi corado com o antissoro policlonal ESL (verde em B, D) . Em ambas as linhas celulares duplamente transfectadas, MRP2 foi localizado na membrana apical das células MDCKII polarizadas. 0AT1 e 0ATP2 foram detetados apenas na membrana basolateral das respetivas linhas celulares.

Fig. 12. Transporte transcelular de para-aminohipurato (PAH) por células MDCK-0AT1/MRP2. Células MDCKII transfectadas com o vetor de controlo (MD-CK-Co), com 0AT1 (MDCK-0AT1), ou com ambos 0AT1 e MRP2 (MD-CK-0AT1/MRP2) foram crescidas em insertos de membrana Transwell e incubadas com 10 μΜ de [3H]PAH adicionado ao compartimento basolateral a 37°C. A radioatividade acumulada no compartimento apical foi medida após 30 min.

Fig. 13. Transporte transcelular de BSP por células MDCK-OATP2/MRP2. Células MDCKII transfectadas com o vetor de controlo (MDCK-Co), com OATP2 (MDCK-OATP2) , ou com ambos OATP2 e MRP2 (MDCK-OATP2/MRP2) foram crescidas em insertos de membrana Transwell e incubadas com 1 μΜ de [3H]BSP adicionado ao compartimento basolateral a 37°C. A radioatividade acumulada no compartimento apical foi medida após 30 min. 14

Abreviaturas: ABC, superfamília de cassete de ligação a ATP; BSEP, bomba de exportação de sais biliares; BSP, sulfobromoftaleina; CDNB, l-cloro-2,4-nitrobenzeno, DHEAS, 3-sulfato de desidroepiandrosterona; DiOC6(3), iodeto de 3,3'-dihexiloxacarbocianina; E217bG, 17b-glucuronosil estradiol; Fluo-3, sal penta-amónio do ácido 1-[2-amino-5-(2,7-dicloro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)]-2-(2'-amino-5'-metil-fenoxil)-etano-N,N,Ν',N'-tetraacético; HEK293, células embrionárias de rim humano; HPLC, cromatografia liquida de alta performance; HSA, albumina de soro humano; Km, constante de Michaelis-Menten; LTC4, leucotrieno C4; MDCKII, células de rim canino Madin-Darby, estirpe II; MRP2, proteina 2 multirresistente a fármacos; 0AT1, transportador de aniões orgânicos 1; OATP, polipéptido transportador de aniões orgânicos humano; 0CT1, transportador de catiões orgânicos 1; SLC, superfamilia de transportadores de solutos; TC, taurocolato ou colil taurina; SDS, dodecil sulfato de sódio A presente invenção é explicada pelos exemplos.

Exemplo 1: Materiais e Métodos (A) Químicos. [3H]BSP (0,5 TBq/mmol) foi obtido de Hartmann Analytic (Kõln, Alemanha) por síntese habitual (Cui et al. 2001). [14, 15, 19, 20-3H] LTC4, sulfato de [1,2,6,7- foi Alemanha).

Calbiochem (Bad Soden, 3H]desidroepiandrosterona (0,6 TBq/mmol), [3H]colil taurina (73 GBq/mmol), e 17b-D-glucuronosil [ 6,7—3H]estradiol (1,6 TBq/mmol) foram comprados a Perkin-Elmer Life Science Products (Boston, MA). Ácido carboxílico [14C]inulina (82 MBq/g) foi obtido de Biotrend Chemicals (Kõln, Alemanha). Fluo-3 sal penta-amónio do ácido (1-[2-amino-5-(2,7-dicloro-6-hidroxi-3-oxo-3H-xanten-9-il)]-2-(2'-amino-5'-metil-fenoxil)-etano-N,N,N',N'-tetraacético) proveniente de 15

Rifampicina, rifamicina SV, acivicina, e CDNB foram comprados a Sigma (Deisenhofen, Alemanha). Sulfato de G418 (geneticina) foi proveniente de Life Technologies (Gaithersburg, MD) . Higromicina foi proveniente de Invitrogen (Groningen, Holanda). Os químicos não radioativos adicionais de pureza analítica foram obtidos de Sigma. (B) Cultura de Células e Transfecção. Células HEK293 (rim embrionário humano) e MDCKII (estirpe II de rim canino Madin-Darby) foram cultivadas em meio essencial mínimo suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 100 U/mL de penicilina, e 100 yg/mL de estreptomicina a 37°C, 95% de humidade, e 5% de C02. HEK-MRP2 e HEK-Co são células HEK293 transfectadas com cDNA de MRP2 humano e vetor de controlo, respetivamente; MDCK-MRP2 e MDCK-Co são células MDCKII transfectadas com cDNA de MRP2 humano e vetor de controlo, respetivamente, como descrito (Cui et ai. 1999). O cDNA de OATP8 humano (Kõnig et al. 2000b) foi subclonado no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.1/Hygro(+) (Invitrogen) e transfectado em células MDCKII usando o método de polibreno (Kõnig et al. 2000b). Transfectantes expressando OATP8 recombinante foram selecionados com higromicina (950 μΜ). O clone com a expressão mais elevada de OATP8 (MDCK-OATP8) foi ainda transfectado com o elemento de construção de vetor pcDNA3.1-MRP2 com o cDNA de comprimento total de MRP2 humano (Cui et ai. 1999) . Após seleção com 950 μΜ de higromicina e 800 μΜ de dissulfato de G418 durante três semanas, os transfectantes foram rastreados em relação à expressão de MRP2 e OATP8 por análises de imunoblot. Um clone com a expressão mais elevada de MRP2 e um nível de expressão semelhante de OATP8 como as células MDCK-OATP8 foi designado como MDCK-MRP2/OATP8 e escolhido para estudos posteriores. 16 (C) Análise de Imunoblot. Frações de membrana brutas foram preparadas a partir de células MDCKII cultivadas como descrito anteriormente (Cui et ai. 1999). As proteínas foram separadas por SDS-PAGE (7,5% de géis). 0ATP8 foi detetado pelo anticorpo policlonal SKT (Kõnig et ai. 2000b) numa diluição de 1:5000 em TBS-T (20 mM de Tris, 145 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,6) . MRP2 foi detetado pelo anticorpo policlonal EAG5 (Buchler et ai., 1996; Keppler and Kartenbeck, 1996) numa diluição de 1:10000 em TBS-T. (D) Microscopia Confocal de Imunofluorescência com Varredura de Laser. Células MDCKII foram crescidas em insertos de membrana Transwell (6,5 mm de diâmetro, 0,4 ym de tamanho de poro, Corning Costar, Bodenheim, Alemanha) durante 3 dias em confluência e induzidas com 10 mM de butirato de sódio durante 24 h (Cui et ai. 1999). As células foram fixadas com 2,5% de paraformaldeído em PBS (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KC1, 8,0 mM de Na2HP04, 1,5 mM de KH2P04, pH 7,4) durante 20 min, permeabilizadas com 1% de Triton X-100 em PBS durante 20 min, e incubadas durante 1,5 h com anticorpos primários à temperatura ambiente. O anticorpo policlonal SKT (Kõnig et ai. 2000b), a uma diluição de 1:25 em PBS, e o anticorpo de rato monoclonal M2III-6 (Alexis Biochemicals, Gríinberg, Alemanha) numa diluição de 1:20 em PBS, foram usados para corar OATP8 e MRP2, respetivamente. As células foram depois lavadas três vezes com PBS e incubadas com anticorpos secundários. Ambas as IgG de cabra anti-coelho conjugada com Cy2 e IgG de cabra anti-rato conjugada com Cy3 foram obtidas de Jackson Laboratories (West Grove, PA) e usadas numa diluição de 1:200 em PBS. As membranas Transwell foram depois cortadas dos insertos de membrana e montadas usando glicerol 50% em PBS nas lâminas. Microscopia confocal de varredura a laser 17 foi realizada com um aparelho LSM 510 da Zeiss (Oberkochen, Alemanha).

(E) Ensaios de Transporte. Para os ensaios de transporte as células MDCKII foram crescidas em insertos de membrana Transwell (24 mm de diâmetro, 0,4 μΜ de tamanho de poro, Corning Costar) em confluência durante 3 dias e induzidas com 10 mM de butirato de sódio durante 24 h. As células foram primeiro lavadas com tampão de transporte (142 mM de NaCl, 5 mM de KC1, 1 mM de KH2P04, 1,2 mM de MgS04, 1,5 mM de CaCl2, 5 mM de glucose, e 12,5 mM de HEPES, pH 7,3), subsequentemente, substratos marcados com 3H foram adicionados em tampão de transporte aos compartimentos apicais (1 mL) ou aos compartimentos basolaterais (1,5 mL). Após os periodos de tempo indicados, a radioatividade nos compartimentos opostos foi medida. A acumulação intracelular da radioatividade foi determinada por lise das células com 2 mL de SDS 0,2% em água e medindo a radioatividade nos lisados celulares.

Para estudar o transporte transcelular de Fluo-3, as células foram incubadas com 2 μΜ de Fluo-3 nos compartimentos basolaterais a 37°C durante 30 min. A fluorescência de Fluo-3 no compartimento apical foi medida com um espetrómetro de fluorescência RF-510 (Shimadzu, Duisburg, Alemanha) a um comprimento de onda de excitação de 506 nm (5 nm de largura de banda) e um comprimento de onda de emissão de 52 6 nm (10 nm de largura de banda) na presença de 1,5 mM de Ca2+ (Nies et al. 1998) .

Para estudar o transporte transcelular da rifampicina, as células foram incubadas com 50 μΜ de rifampicina nos compartimentos basolaterais a 37 °C durante 30 min. Para determinar a concentração de rifampicina nos compartimentos apicais a sua absorção a 475 nm foi medida com um 18 espetrofotómetro (Ultrospec III, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemanha). Uma curva de calibração para o cálculo das concentrações de rifampicina foi determinada na gama de concentração entre 1 e 50 μΜ.

Para estudos de inibição, os inibidores foram adicionados simultaneamente com [3H]BSP aos compartimentos basolaterais, com a exceção do l-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB). Neste caso, as células MDCKII crescidas nos insertos de membrana Transwell foram pré-incubadas com CDNB em tampão de transporte em ambos os compartimentos apical e basolateral durante 20 min à temperatura ambiente. O transporte transcelular foi depois iniciado substituindo o tampão nos compartimentos basolaterais por tampão fresco contendo CDNB e [3H]BSP. A fuga transcelular foi determinada incubando as células com 50 μΜ de ácido carboxilico de [14C]inulina nos compartimentos basolaterais durante 30 min e medindo a radioatividade nos compartimentos apicais. Para as quatro linhas de células MDCKII usadas neste trabalho a fuga transcelular foi inferior a 1%.

Análise de HPLC de [3H]BSP. Células MD-CK-MRP2/OATP8 crescidas em insertos de membrana Transwell foram incubadas com 1 μΜ de [3H]BSP no compartimento basolateral durante 30 min a 37 °C após pré-incubação com 5 mM de acivicina, um inibidor da g-glutamiltransferase (Allen et al. 1980), em ambos os compartimentos durante 30 min a 37°C. A radioatividade no compartimento apical e no lisado celular foi analisada por HPLC. Análises de HPLC de fase reversa numa coluna Hypersil Ci8 (partículas de 5 mm; Shandon, Runcorn, Reino Unido) foram realizadas como descrito (Cui et al. 2001) usando uma eluição de gradiente linear do tampão A 100% (45% metanol/55% água contendo 2 mM de 19

hidróxido de tetrabutilamónio a pH 6,0) para tampão B 100% (90% metanol/10% água contendo 2 mM de hidróxido de tetrabutilamónio a pH 6,0) a uma taxa de fluxo de 1 mL/min. [3H]BSP-SG foi sintetizado para as análises de HPLC incubando 1 mM de GSH, 0,4 mM [3H] BSP (1 pCi) , e 5 mM de acivicina com 350 pL de citosol de figado de rato num volume final de 500 pL durante 1 h a 37 °C. Após desproteinização com 3 volumes de metanol 200 pL de sobrenadante foram analisados por HPLC como descrito acima.

Estudos do Transporte de Vesículas. O transporte de [3H]BSP para as vesículas membranares foi medido pelo método de filtração rápida (Keppler et ai. 1998). Em resumo, as vesículas membranares (30 pg de proteína) foram incubadas na presença de 4 mM de ATP, 10 mM de creatina fosfato, 100 pg/mL de creatina quinase, e [3H]BSP num tampão de incubação (250 mM de sacarose, 10 mM de Tris/HCl, pH 7,4) num volume final de 55 pL a 37°C. Alíquotas (15 pL) foram retiradas nos pontos de tempo indicados, diluídas em 1 mL de tampão de incubação gelado, e imediatamente filtradas através de membrana de nitrocelulose previamente ensopada (0,2 pm de tamanho de poro, Schleicher & Schull, Dassel, Alemanha) . Os filtros foram passados por água duas vezes com 5 mL de tampão de incubação, dissolvidos em fluido de cintilação líquido, e contados em relação a radioatividade. Em experiências de controlo, o ATP foi substituído por uma concentração igual de 5'-AMP. O transporte dependente de ATP foi calculado subtraindo os valores obtidos na presença de 5'-AMP daqueles obtidos na presença de ATP.

Exemplo 2: Expressão e Localização de ΟΆΤΡ8 e MRP2 Humanos Recombinantes em células MDCKII A expressão de 0ATP8 e MRP2 humanos nas células MDCKII transfectadas foi primeiro analisada por imunoblotting 20 (Fig. 1). Como mostrado na Fig. IA, a expressão de MRP2 foi detetada pelo anticorpo EAG5 em células MDCKII transfectadas apenas com cDNA de MRP2 (MDCK-MRP2) ou com cDNA de ambos OATP8 e MRP2 (MDCK-MRP2/OATP8) . A expressão de OATP8 foi detetada pelo anticorpo SKT em células MDCKII transfectadas apenas com cDNA de OATP8 (MDCK-OATP8) e em células MDCK-MRP2/OATP8 (Fig. 1B). Consistente com o nosso relatório anterior (Kõnig et al. 2000b), a forma totalmente gi icosilada de OATP8 humano tem um peso molecular aparente de cerca de 120 kDa, as bandas com peso molecular aparente mais baixo detetadas pelo anticorpo SKT resultaram das formas sub-glicosiladas de OATP8. Nas células MDCKII transfectadas com o vetor de controlo (MDCK-Co) não conseguiu ser detetada a expressão de OATP8 nem de MRP2 humanos (Fig. 1). A localização celular dos transportadores recombinantes nos transfectados foi estudada por meio de imunofluorescência e microscopia confocal de varredura a laser. Em células MDCK-OATP8, OATP8 pode ser corado com o anticorpo SKT na membrana basolateral (Fig. 2A e D) . Nestas células, foi também observada alguma coloração intracelular de OATP8. Experiências com dupla marcação usando o anticorpo SKT e DiOC6(3) que cora especificamente o reticulo endoplasmático (Terasaki et al. 1984) indicaram que a fração de 0ATP8 intracelular foi localizada no RE (não mostrado). A localização parcial no RE de OATP8 corresponde à sua biogénese e é consistente com a existência de 0ATP8 sub-glicosilado observado em análises de imunoblot (Fig. 1B) . Em células MDCK-MRP2/OATP8, MRP2 foi localizado na membrana apical, para além do aparecimento lateral de 0ATP8 (Fig. 2B, C, E, e F). A Fig. 2B mostra uma imagem focada no plano dos núcleos onde apenas OATP8 era visivel neste plano. A Fig. 2C mostra uma imagem focada na parte de cima das células, onde a coloração de MRP2 pode ser vista. Em 21 secções verticais ambos 0ATP8 e MRP2 foram visíveis (Fig. 2E e 2F). A Fig. 3 mostra esquematicamente o papel de ambos os transportadores recombinantes no transporte vetorial pela respetiva linha celular transfectada.

Exemplo 3: Transporte transcelular de [3H]BSP Mediado por OATP8 e MRP2 A função de 0ATP8 e MRP2 humanos nas células duplamente transfectadas foi estudada através da medição do transporte transcelular do anião orgânico [3H]BSP, um substrato de 0ATP8 humano (Kõnig et al. 2000b, Cui et al., 2001). Deste modo, células MDCKII polarizadas crescidas em insertos de membrana Transwell foram incubadas com [3H]BSP numa concentração de 1 μΜ nos compartimentos basolaterais. Em diferentes pontos de tempo, a radioatividade acumulada no compartimento apical e nas células foi medida. Como mostrado na Fig. 4A, a acumulação intracelular de [3H]BSP foi significativamente mais elevada em células MDCKII transfectadas apenas com cDNA de OATP8 (MDCK-OATP8) ou com cDNA de ambos OATP8 e MRP2 (MDCK-MRP2/OATP8) do que nas células transfectadas de controlo (MDCK-Co) e nas células transfectadas com MRP2 (MDCK-MRP2), demonstrando que OATP8 é necessário para a acumulação intracelular de [3H]BSP. No entanto, quando a radioatividade no compartimento apical foi medida, não foi observada transferência significativa de [3H]BSP dos compartimentos basolaterais para os compartimentos apicais para as células MDCK-Co, MDCK-MRP2, e MDCK-OATP8 (Fig. 4B), ao passo que um transporte transcelular acentuado de [3H]BSP pode ser observado com as células MDCK-MRP2/OATP8 (Fig. 4B). A Fig. 4C demonstra uma absorção total mais elevada de [3H]BSP (acumulação intracelular mais transporte transcelular) pelas células MDCK-MRP2/OATP8 do que pelas células MDCK-OATP8. 22 0 transporte transcelular de [3H]BSP pelas células MDCK-MRP2/OATP8 foi um processo vetorial, como mostrado na Fig. 5A. Foi apenas observado transporte basolateral para apical de [3H]BSP, ao passo que o transporte apical para basolateral foi negligenciável. Isto era esperado devido à localização celular de 0ATP8 e MRP2 nos transfectados duplamente e devido à unidirecionalidade do transporte mediado por MRP2 (Fig. 3) . 0 efluxo de [3H]BSP foi determinado após incubação das células MDCK-0ATP8 e MDCK-MRP2 / 0ATP8 com 1 μΜ de [3H]BSP durante 30 min no compartimento basolateral. Como mostrado na Fig. 5B, [3H]BSP foi libertado das células MDCK-OATP8 principalmente através da membrana basolateral, ao passo que foi exportado das células MDCK-MRP2/OATP8 principalmente através da membrana apical. Quando a radioatividade remanescente nas células após as experiências de efluxo de 30 minutos foi comparada, as células MDCK-MRP2/OATP8 mostraram um nivel de [3H]BSP intracelular significativamente mais baixo do que as células MDCK-OATP8, indicando a exportação eficaz por via de MRP2 na membrana apical.

Exemplo 4: O próprio BSP e não o seu S-Conjugado de

Glutationa é Transportado por MRP2 nas células MDCK duplamente transfectadas

Estudos em figados de ratazana mostraram que BSP é secretado para a bilis principalmente como conjugado de glutationa (Combs 1965; Klaassen and Plaa 1967). Para investigar se isto também é verdade para os duplamente transfectados, verificámos a radioatividade no compartimento apical das células MDCK-MRP2/OATP8 por radio-HPLC após incubação das células com 1 μΜ de [3H]BSP no compartimento basolateral durante 30 min. A maioria da 23 radioatividade (> 98%) que foi acumulada no compartimento apical (Fig.6B) e nas células (Fig. 6C) mostrou o mesmo tempo de retenção (17 min) que o [3H]BSP não conjugado (Fig. 6A) . Foi apenas observado um pequeno pico de [3H]BSP-SG (tempo de retenção de 15 min) no compartimento apical (Fig. 6B) . Estes resultados sugerem que o BSP é absorvido por 0ATP8 humano e ele próprio é, em vez do seu S-conjugado de glutationa, um substrato para MRP2 durante o transporte transcelular. Para confirmar esta hipótese investigámos o transporte de [3H]BSP para vesículas membranares reviradas de dentro para fora preparadas a partir de células HEK-MRP2 (células HEK293 transfectadas com MRP2 humano, Cui et al. 1999). Como mostrado na Fig. 7A, [3H]BSP foi transportado dependendo de ATP para as vesículas membranares das células HEK-MRP2. A acumulação de [3H]BSP nas vesículas membranares das células HEK-MRP2 foi significativamente mais elevada do que nas vesículas membranares das células HEK-Co transfectadas de controlo (Fig. 7B) demonstrando que [3H]BSP é um substrato para MRP2 humano. Um valor de Km de 12 μΜ para BSP foi determinado para MRP2 (Fig. 7C).

Exemplo 5: Transporte transcelular de Outros Aniões Orgânicos 0 transporte transcelular de outros aniões orgânicos que são substratos para ambos 0ATP8 e MRP2 foi também estudado. [3H]Leucotrieno C4 (LTC4) , 17b-glucuronosilo [3H]estradiol (E217bG), e sulfato de [3H]desidroepiandrosterona (DHEAS) já foram identificados como substratos de 0ATP8 (Kõnig et al. 2000b; Kullak-Ublick et al. 2001; Cui et al. 2001). Verificou-se que [3H]LTC4 e [3H]E217bG são substratos de alta afinidade para MRP2 (Cui et al. 1999). Os nossos estudos também identificaram [3H] DHEAS como um substrato de MRP2 (Gologan, Leier, and 24

Keppler, dados não publicados, 2001). À semelhança de [3H]BSP (Fig. 8A) , os três compostos foram transportados a velocidades mais elevadas através das células MDCK-MRP2/OATP8 do que através das células MDCK-OATP8 ou MDCK-Co (Fig. 8B, C, D) . Fluo-3 é um composto fluorescente (Minta et al. 1989) e um bom substrato para MRP2 (Nies et al. 1998) . Tal como os outros compostos mencionados acima, Fluo-3 foi transportado através da monocamada de células MDCK-MRP2/OATP8 com uma taxa de transporte maior em comparação com a monocamada de células MDCK-OATP8 (Fig. 8E), sugerindo que Fluo-3 é também um substrato para OATP8 humano.

Na Fig. 8F o transporte transcelular de [3H]colil taurina (TC) , que não é um substrato para OATP8 humano (Kõnig et al. 2000b, Cui et al. 2001) nem para MRP2 (Madon et al. 1997), foi estudado. Ao contrário dos outros compostos testados, [3H]colil taurina foi transportada através das três linhas celulares de MDCKII a uma velocidade bastante elevada, mas não foi observada diferença nas taxas de transporte entre as células MDCK-Co, MDCK-OATP8, e MDCK-MRP2/OATP8. A elevada taxa de transporte de [3H]colil taurina pelas células MDCK é provavelmente resultado da expressão de sistemas de transporte endógenos para os sais de bílis.

Exemplo 6: Inibição do Transporte Transcelular de [3H]BSP O composto hidrofóbico CDNB que se pensa que entra nas células por via de difusão é conjugado com glutationa dentro da célula e depois bombeado por via de MRP2 (Evers et al. 1998). Estas propriedades do CDNB permitiram-nos diferenciar entre a absorção mediada por OATP8 e a exportação mediada por MRP2. As células MDCK transfectadas foram pré-incubadas com concentrações diferentes de CDNB à 25 temperatura ambiente durante 20 min antes da medição do transporte transcelular de [3H]BSP. Como mostrado na Fig. 9A, a acumulação intracelular e o transporte transcelular de [3H]BSP nas células MDCK-OATP8 não foram inibidos por CDNB até uma concentração de 50 μΜ. No entanto, o CDNB exerceu um efeito completamente diferente nas células MDCK-MRP2/OATP8. A acumulação intracelular de [3H]BSP foi melhorada, ao passo que o transporte transcelular de [3H]BSP foi acentuadamente inibido pela pré-incubação com CDNB (Fig. 9B). Estes resultados indicam que CDNB não afeta a absorção mediada por OATP8, mas inibe a exportação mediada por MRP2 de [3H]BSP após formação de dinitrofenilglutationa dentro das células.

Registámos recentemente que albumina de soro humano (HSA) inibe potentemente a absorção de [3H]BSP mediada por OATP8, provavelmente ligando-se a [3H]BSP com elevada afinidade (Cui et al. 2001) . Deste modo, estudámos aqui o efeito de HSA no transporte transcelular de [3H]BSP ao longo dos transfectantes MDCKII. Na presença de 5 μΜ de HSA a acumulação mediada por OATP8 de [3H]BSP em células MDCK-OATP8 foi suprimida quase completamente (Fig. 9C) . Também nas células MDCK-MRP2/OATP8, a acumulação de [3H]BSP foi fortemente inibida por HSA (Fig. 9D) . Consequentemente, o transporte transcelular de [3H]BSP foi também diminuído nas células MDCK-MRP2/OATP8 (Fig. 9D) . A absorção de [3H]E217bG mediada por OATP8 para células HEK293 transfectadas com OATP8 pode ser inibida pelos antibióticos rifampicina e rifamicina SV (Cui et al. 2001) . A Fig. 9E-H demonstra que ambos os antibióticos interferem fortemente com ambos OATP8 e MRP2. Consistente com os nossos estudos anteriores (Cui et al. 2001), ambos os antibióticos inibiram a acumulação intracelular de [3H]BSP nas células MDCK-OATP8 (Fig. 9E e G) . No entanto, nas 26 células MDCK-MRP2/OATP8, a acumulação intracelular de [3H]BSP foi apenas suprimida até cerca de 50% do controlo, ao passo que o transporte transcelular de [3H]BSP foi inibido mais fortemente por rifampicina e rifamicina SV (Fig. 9G e H) . Estes resultados sugerem que ambos os compostos inibem a exportação mediada por MRP2 adicionalmente. Isto é confirmado por estudos de transporte usando vesiculas membranares das células HEK-MRP2. Rifampicina a uma concentração de 50 μΜ inibiu o transporte de [3H]LTC4 para as vesiculas membranares de HEK-MRP2 até 50% do controlo, e 50 μΜ de rifamicina SV inibiram o transporte de LTC4 para as vesiculas membranares de HEK-MRP2 até 38% do controlo.

Exemplo 7: Transporte Transcelular de Rifampicina

Por a rifampicina inibir fortemente ambos OATP8 e MRP2 humanos, nós estávamos interessados se o próprio transporte transcelular de rifampicina pode ser medido usando os nossos transfectantes duplos. Tirámos vantagem da absorção intensa de rifampicina a 475 nm para determinar a sua concentração. A baixa concentração de rifampicina de 1 μΜ pode ser medida por este método. Como mostrado na Fig. 10, um transporte transcelular significativamente mais elevado de rifampicina pode ser observado com células MDCK-MRP2/OATP8 em comparação com as outras três linhas celulares transfectantes de MD-CKII. Uma concentração de rifampicina de cerca de 50 μΜ nestas experiências foi a mais baixa que pudemos usar para obter transporte de rifampicina para os compartimentos apicais numa quantidade detetável pelo método fotométrico.

Exemplo 8: Linhas Celulares Adicionais duplamente transfectadas 27

Para além da linha celular MDCK-MRP2/OATP8 duplamente transfectada descrita acima, duas outras linhas celulares duplamente transfectadas foram geradas do mesmo modo: MDCK-0AT1/MRP2 e MDCK-OATP2/MRP2. A combinação de transportador basolateral 0AT1 de aniões orgânicos (símbolo do gene: SLC22A6; Hosoyomada et al, 1999) e a bomba de exportação apical MRP2 representa um sistema modelo para estudos de processos de transporte renal. A combinação do transportador basolateral 0ATP2 de aniões orgânicos (Abe et al., 1999; Hsiang et al, 1999; Kõnig et al., 2000a) e da bomba de exportação apical MRP2 representa um sistema modelo para estudos de processos de transporte hepático. A localização correta das proteínas de transporte recombinantes nas linhas celulares duplamente transfectadas foi demonstrada por microscopia confocal de varredura d6e laser com imunofluorescência (Fig. 11) .

Exemplo 9: Transporte Transcelular de para-Amino- hipurato A atividade de transporte da linha celular MDCK-0AT1/MRP2 duplamente transfectada foi estudada com o uso do composto modelo extensamente usado para-aminohipurato (PAH). 0 PAH tem sido usado para estudos de secreção renal de aniões orgânicos. No epitélio do túbulo proximal renal, o PAH é absorvido do sangue na membrana basolateral por 0AT1 (Hosoyamada et al., 1999). Subsequentemente, PAH é secretado com dependência de ATP por MRP2 (Leier et al, 1999) para a urina. Como demonstrado na Fig. 12, a taxa de transporte transcelular de PAH é significativamente maior na linha celular MDCK-OAT1/MRP2 duplamente transfectada do que na linha celular MDCK-Co transfectada de controlo e na linha celular MDCK-OAT1 transfectada uma vez.

Exemplo 10: Transporte Transcelular de BSP 28 A atividade de transporte da linha celular MDCK-OATP2/MRP2 duplamente transfectada foi estudada com o uso do composto modelo BSP. Como demonstrado na Fig. 13 a taxa de transporte transcelular de BSP é significativamente maior na linha celular MDCK-OATP2/MRP2 duplamente transfectada do que na linha celular MDCK-Co transfectada de controlo e na linha celular MDCK-0ATP2 transfectada uma vez.

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Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Linha celular duplamente transfectada de mamífero estavelmente transfectada com (a) uma sequência de ADN que codifica um transportador de absorção para aniões orgânicos operativamente ligada a um promotor e (b) uma sequência de ADN codificando uma bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos operativamente ligada a um promotor, em que um transportador de absorção para aniões orgânicos é expressado na membrana basolateral e a bomba de exportação é expressada na membrana apical.

2. A linha celular da reivindicação 1, em que a linha celular é obtida por transfecção estável com (a) uma sequência de ADN que codifica um transportador de absorção para aniões orgânicos operativamente ligada a um promotor presente num vetor ou vírus recombinante e (b) uma sequência de ADN que codifica uma bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos operativamente ligada a um promotor presente num vetor ou vírus recombinante.

3. A linha celular de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 a qual é uma linha celular canina ou humana e as sequências de ADN de (a) e/ou (b) são humanas.

4. A linha celular de qualquer uma das reivindicações 1 até 3 a qual é uma linha de células de rim.

5. A linha celular de qualquer uma das reivindicações 1 até 4 em que o transportador de absorção para aniões 2 orgânicos é um membro do subgrupo 21A ou 22A da superfamilia de transportadores de solutos (SLC).

6. A linha celular da reivindicação 5, em que o transportador de absorção para aniões orgânicos é 0AT1 (SLC22A6), 0ATP2 (SLC21A6), 0ATP8 (SLC21A8) ou OATP-B (SLC21A9).

7. A linha celular de qualquer uma das reivindicações 1 até 6 em que a bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos é um membro do subgrupo MDR (ABCB) ou do subgrupo MRP (ABCC) da superfamilia ABC.

8. A linha celular da reivindicação 7, em que a bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos é a bomba de exportação de sais biliares BSEP (ABCB11) ou a proteína de multirresistência a fármacos 2 (MRP2; ABCC2).

9. A linha celular da reivindicação 1, em que a sequência de ADN que codifica um transportador de absorção para aniões orgânicos e/ou a sequência de ADN que codifica uma bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos são operativamente ligadas a um promotor precoce imediato de citomegalovírus (pCMV).

10. Processo para a produção de uma linha de células duplamente transfectadas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 9 que é estavelmente transfectada com (a) uma sequência de ADN que codifica um transportador de absorção para aniões orgânicos operativamente ligada a um promotor e (b) uma sequência de ADN que codifica uma bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos 3 operativamente ligada a um promotor, compreendendo os passos de: transfectar células com ambas as sequências de ADN de (a) e (b); e selecionar transfectantes expressando o referido transportador de absorção para aniões orgânicos e a referida bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos.

11. Uso de uma linha celular duplamente transfectada polarizada para analisar a interferência de um candidato a fármaco com o transporte de substâncias que são produzidas ou ocorrem naturalmente no organismo, em que a linha celular é estavelmente transfectada com (a) uma sequência de ADN que codifica um transportador de absorção para aniões orgânicos operativamente ligada a um promotor e (b) uma sequência de ADN que codifica uma bomba de exportação para aniões orgânicos ou conjugados aniónicos operativamente ligada a um promotor.

12. Uso da reivindicação 11, em que o transporte de substâncias é o transporte hepático ou renal de aniões orgânicos.

13. Uso da linha celular de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 9 ou o uso de acordo com a reivindicação 11 ou 12 para a identificação de um substrato de transporte ou um inibidor de transporte.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13 em que o inibidor de transporte é um candidato a fármaco.

15. Uso de acordo com a reivindicação 13 ou 14 em que a identificação de um substrato de transporte ou um 4 inibidor de transporte é realizada como rastreio de elevada capacidade.