PT1337336T - Placa de reação - Google Patents

Description

EP1337336B1

DESCRIÇÃO PLACA DE REAÇÃO A presente divulgação refere-se a uma placa de reação, a um método para o seu fabrico e a um aparelho de processamento automatizado da placa de reação.

Existem muitas situações que implicam a realização em série de várias reações, como as aplicações de genotipagem, por exemplo as aplicações TaqMan™ (Applied Biosystems). As amplificações de ADN por reação em cadeia da polimerase (PCR) ou extensão de iniciadores envolvem um método utilizado de forma rotineira em genotipagem, como a análise SNP (poliformismo de nucleótido único) . Os alvos específicos de SNP são observados através de uma placa de reação da sua parte superior ou inferior (depois de uma fase de amplificação PCR, extensão de iniciador ou hibridização), após uma amostra ou reagente ter sido removido e interpretado por espetroscopia, espetroscopia de massa, sequenciação ou hibridização. Estas reações em série podem ser realizadas em placas de reação. Estas placas de reação, em diversas aplicações como estas, são referidas frequentemente como placas de microtitulação. De uma forma geral, estas placas têm sido disponibilizadas como placas de reação maciças, moldadas por injeção, que possuem vários poços formados na mesma sob a forma de tubos de ensaio em miniatura. A tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta de investigação importante em toda a biologia molecular, tanto para a academia, como para a indústria farmacêutica. Tradicionalmente, as limitações no uso destas reações têm sido os custos elevados que resultam do custo dos reagentes (em particular, a enzima) e os relativamente elevados volumes de reagente necessários para utilizar nas placas de microtitulação moldadas por injeção; EP1337336B1 os volumes comuns do poço nos dispositivos da técnica anterior podem chegar aos 200 μΐ. No entanto, é possível obter resultados eficazes em placas com volumes de poço tão reduzidos como 2 μΐ e menores. No entanto, até ao momento ainda não foram obtidas placas de reação eficazes com um volume de poço desta dimensão.

Outro problema do volume relativamente elevado nos dispositivos da técnica anterior reside no facto de a camada de ar excessiva nos poços das placas de reação causar problemas de evaporação e condensação que podem reduzir a eficácia das reações. Por vezes, e utilizado oleo mineral no topo da reação para prevenir/eliminar os problemas de evaporação/condensação (vedação de óleo). No entanto, isto pode originar problemas de remoção do óleo depois de a reação terminar. Deste modo, seria desejável minimizar a dimensão da camada de ar excessiva nas placas de reação multipoços para minimizar a evaporação ou evitar a vedação de óleo. A técnica anterior usou placas de reação moldadas por injeção de uma ou duas peças com tamanhos de poço inferiores, algumas tendo até 1536 poços. Estas têm sido feitas com poliestireno. No entanto, um dos problemas destas placas de reação está no facto de a placa de reação exigir estabilidade mecânica para uma PCR correta; o poliestireno fica deformado e distorcido com as elevadas temperaturas normalmente necessárias na PCR (aproximadamente 94 °C ou 95 °C) . Outro problema está na complexidade da base na técnica anterior (placa de polipropileno em V Genetix 1536). Isto dificulta a montagem da base numa placa de transferência térmica. Portanto, cada poço não vai transferir de forma eficiente o calor aplicado externamente aos poços da placa de reação, tornando assim as reações que dependem do calor menos fiáveis. Pode haver variações no calor transferido para os vários poços na placa de reação. Deste modo, seria desejável disponibilizar uma placa de reação que permita uma transferência sem problemas do calor para o interior do poço e que essa mesma transferência seja uniforme. A utilização de moldagem por injeção aparentemente não permitiria a formação de bases suficientemente finas para a ocorrência da transferência descrita.

As placas de reação com vários poços devem possuir uma densidade de poços elevada. As placas de reação convencionais da técnica anterior providenciam matrizes de, por exemplo, oito por 12 poços e 16 por 24 poços. Isto limita cada placa de reação a 96 e 384 reações em simultâneo, respetivamente. Portanto, seria desejável aumentar o número de poços com um volume de reagente muito reduzido de forma a possibilitar um volume acrescido de reações a um custo inferior.

Um problema adicional das placas de reação multipoços anteriores é a utilização generalizada de químicos externos sob a forma de cola, adesivo solvente ou similares, aplicados com pressão para unir uma folha de cobertura aos poços de forma a selá-los, por exemplo, para reduzir a perda de reagente/amostra por evaporação. As colas, como adesivos solventes, podem causar uma reação incorreta no interior do poço. A técnica anterior também descreve a soldadura térmica de uma folha numa placa de reação para vedar os poços. 0 calor derrete a cola térmica, bem como o plástico (tipicamente polipropileno) da placa de microtitulação, criando assim uma vedação soldada termicamente. No entanto, as técnicas atuais de soldadura térmica não são adequadas para vedar as placas de microtitulação de baixo volume e densidade muito elevada, úteis para a implementação da presente invenção, devido ao calor da fonte de calor dissipado nos reagentes da amostra.

Uma nova forma de placa de reação, especialmente uma isenta de qualquer agente aglutinante que possa afetar a reação, seria assim desejável para cumprir os protocolos de conformidade FDA.

Uma aplicação adicional destas placas de reação está na genotipagem. A genotipagem é um amplo setor comercial. A maioria dos métodos de genotipagem envolve um processo de amplificação do ADN. É também aqui que ocorre a maior parte dos custos do processo. Ao trabalhar de forma rotineira e fiável com volumes de reagentes baixos e com produtividade elevada, o custo por reação pode ser reduzido consideravelmente. No entanto, os dispositivos da técnica anterior não conseguiram este objetivo de forma fiável. Por esta razão, incorre-se frequentemente em custos de aproximadamente 0,5 USD por reação. No entanto, este valor pode ser reduzido para 0,1 USD por reação ao reduzir o volume do poço ou da reação de 10 μΐ para um volume de 1 μΐ ou 2 μΐ por reação. A presente invenção possibilita obter este objetivo. Para compreender este ganho, a escala necessária de genotipagem apenas numa companhia farmacêutica pode chegar facilmente a 100 milhões de reações por ano, o que custa aproximadamente 50 000 000 USD. Ao reduzir o volume para apenas 2 μΐ, este custo poderia potencialmente ser reduzido para 10 000 000 USD. (ligações e estudos de associação).

Os bem conhecidos sistemas de biotipagem TaqMan™ (Applied Biosystems) são sistemas com aprovação governamental para GMO (organismos modificados geneticamente) e testes NBC militares nos EUA, bem como nos marcadores de diagnóstico clínico SNP. 0 sistema TaqMan 7700™ existente utiliza uma tecnologia de placa de reação com oito por 12 (96) poços. Cada poço possui, pelo menos, aproximadamente 200 μΐ em volume. Ao usar as placas de reação da presente invenção, este pode ser reduzido para 2 μΐ e menos. A placa TaqMan 7700™ de 96 poços não funciona com estes volumes menores de amostra/reagente devido aos problemas do volume interno elevado. A presente invenção também pode proporcionar eventualmente um aumento de 16 vezes na produtividade, dado o número superior de poços por placa de reação a um custo acessível. A tecnologia 7700™ atual não poderia realizar a genotipagem de elevada produtividade farmacêutica requerida, devido ao custo elevado do equipamento e aos custos elevados do reagente.

Os atuais progressos nos mapas SNP (associados a, por exemplo, Alzheimer, cancro, doença cardíaca, etc.) estão a criar um mercado para a deteção massiva de distúrbios específicos. Isto pode implicar a realização de mapas de SNP quantificados específicos em grandes grupos ou populações ou indivíduos, durante a admissão hospitalar ou ao nível clínico. Estes mapas de SNP podem observar distúrbios singulares em grandes populações ou então mais ao nível individual com números elevados de alvos de SNP em estudo. Apenas ao aumentar a produtividade e reduzir os custos será possível realizar esta análise de forma extensiva. É desejável conseguir 106 análises com amostra num dia.

Como aconteceu nas indústrias da eletrónica e informática, as tendências na instrumentação analítica, química e bioquímica têm avançado no sentido da miniaturização. Em análises químicas e bioquímicas, esta miniaturização, como aquela obtida, por exemplo, em placas de microtitulação de elevada densidade com 1536 poços, proporciona vantagens enormes. Estas incluem uma necessidade de reagente consideravelmente menor, uma produtividade mais rápida, processos facilmente automatizáveis e, em muitos casos, melhores dados/resultados.

Por exemplo, as patentes norte-americanas n.° 5,498,392 e 5,587,128 descrevem o rendimento das reações de amplificação em dispositivos microfabricados que incluem sistemas de fluxo e/ou câmaras de reação de microescala. Ditos sistemas reduzem consideravelmente os requisitos de reagentes dispendiosos utilizados nas reações de amplificação.

Apesar das numerosas vantagens obteníveis com estas duas patentes norte-americanas, a obtenção das vantagens é frequentemente complexa, devido aos problemas no manuseamento de utilizador e nas interfaces do sistema.

Portanto, seria desejável miniaturizar um número de reações na área ocupada da placa de microtitulação comum com volumes de reação muito baixos. Em particular, é desejável miniaturizar o processo de amplificação em PCR e aumentar o formato da placa de microtitulação com a mais elevada densidade possível da atual placa de microtitulação de 384 poços. É preferencial e típico que uma placa de reação adequada para PCR seja composta por polipropileno. Adicionalmente, para a miniaturizaçâo do volume de reação, por exemplo, numa placa de 1536 poços, a vedação dos poços na placa deve ser extremamente boa. Isto permite evitar qualquer contaminação cruzada entre os poços e impedir que quaisquer reagentes se escapem durante o processo de PCR. Uma vedação rigorosa também é desejável para minimizar a evaporação do volume da reação com as elevadas temperaturas envolvidas.

Deve ser tido em conta que, apesar destes incentivos, ainda não foi inventado até agora um dispositivo de placa de reação adequado. As possibilidades de placas de reação com uma densidade de poço elevada e com um volume de poço baixo da presente invenção permitem expandir consideravelmente o campo de genotipagem, utilizando técnicas de ensaio químico aprovadas e sólidas já consolidadas entre a comunidade científica. A patente WO 94/12405 divulga um meio de oclusão, contentores e métodos de oclusão, por exemplo em relação aos dispositivos de contenção de reagente (RCD). 0 meio de oclusão pode compreender uma película multicamadas e pode ser aplicado por meio de calor e/ou pressão. A patente WO 00/64747 descreve métodos para fazer uma embalagem blister, que pode compreender o contacto de uma folha de base que possui uma bolsa de blister com uma folha de cobertura e aplicar energia de laser para formar uma junta entre a folha de cobertura e a bolsa de blister da folha de base. A WO 99/42608 está relacionada com plataformas de ensaio de baixa fluorescência e métodos similares para a descoberta de fármacos como, por exemplo, uma plataforma multipoços para medições de fluorescência, que compreende uma pluralidade de poços numa estrutura, em que a plataforma multipoços possui um fundo de baixa fluorescência. A presente invenção aborda as insuficiências da técnica atual ao permitir a utilização de uma tecnologia de placa com 1536 poços (e potencialmente uma densidade superior) em qualquer reação que requeira uma fase de vedação ou oclusão do poço. Esta invenção é de particular importância na miniaturização da Reação em Cadeia da Polimerase e na sua utilização em aplicações de Genotipagem. A presente invenção proporciona um método para formar uma vedação em redor de uma pluralidade de poços de uma placa de reação conforme exposto nas reivindicações. A presente divulgação proporciona uma placa de reação que compreende um laminado planar de plástico soldados que consiste numa placa perfurada e numa película, com a placa perfurada a ter pelo menos uma superfície planar e uma pluralidade de aberturas na superfície planar da dita placa perfurada e com a película a ser fixada na superfície planar da placa perfurada em redor da ou de cada abertura por soldadura.

De preferência, cada abertura, em conjunto com a película, define um contentor.

De preferência a película cobre todas as aberturas, adicional e preferencialmente estendendo-se sobre toda a superfície planar da placa perfurada.

De preferência, a placa de reação compreende o laminado planar de plásticos soldados quando a placa estiver no seu estado de não utilização.

Embora as aberturas possam estar dispostas apenas parcialmente pela placa perfurada, de preferência a ou cada abertura está disposta desde uma primeira superfície planar da placa perfurada até uma segunda superfície planar oposta. Uma segunda película pode ser soldada na segunda superfície, por exemplo para vedar ou ocluir o(s) contentor(es) formados pela(s) abertura(s) e pela primeira película.

De preferência, a pluralidade de aberturas está disposta numa matriz. De preferência, o espaçamento centro-a-centro das aberturas é 2,25 mm.

Nas placas perfuradas podem ser providenciados canais ou ranhuras, em particular micropistas ou ranhuras superficiais, pelo que os métodos desta divulgação podem ser utilizados para vedar um ou mais microcanais, séries de canais ou reservatórios através da soldadura de uma película numa superfície planar lisa que contenha as ditas estruturas, de preferência por soldadura a laser. Os ditos canais ou ranhuras vão permitir, por exemplo, a comunicação fluidal entre aberturas adjacentes. Deve ser tido em conta que a soldadura a laser simplifica a criação e a vedação de micropistas, em comparação com a micromaquinagem e fotolitografia.

De preferência, o lado contrário da placa de reação é liso. No entanto, a placa de reação pode assumir a forma de uma matriz de minitubos de ensaio, conforme proporcionado pela técnica anterior (ver, por exemplo, a Figura 7) . De preferência, os ditos tubos de ensaio devem ter todos o mesmo tamanho e comprimento.

Preferencialmente, a soldadura da presente divulgação é obtida mediante soldadura por transmissão como, por exemplo, a soldadura a laser.

Na soldadura a laser ê possível utilizar um laser capaz de aquecimento localizado na superfície da placa até uma temperatura que derrete o material de plásticos da placa e da película. 0 laser deve ter a potência suficiente e ser controlado com uma precisão suficiente, de forma a não danificar quaisquer reagentes ou amostras que possam ter sido depositados nos poços de reação. As reivindicações requerem a soldadura seja a laser díodo de infravermelho próximo. A soldadura pode compreender a soldadura por termocolagem (p. ex. , uma união ativada termicamente), em que a cola é derretida com, por exemplo, um laser, de forma a ficar pegajosa para unir a película à placa.

Estas e outras formas de soldadura por transmissão permitem ocluir aberturas mais pequenas do que com as técnicas de termossoldadura convencional, visto que o calor é concentrado com precisão na superfície perfurada e não é absorvido pelo reagente/amostra. Os contentores ou poços menores obteníveis com estes processos de soldadura precisos podem permitir uma redução dos volumes de poço, em comparação com os dispositivos da técnica anterior. Isto possibilita que o volume do fluido fique numa proporção superior em relação ao volume de contenção do poço, sem um volume excessivo de reagente, isto é, sem desperdício de compostos e reagentes dispendiosos, como seria necessário nos dispositivos da técnica anterior para obter o mesmo efeito; uma grande camada de ar permite uma evaporação excessiva do reagente, o que não é desejável.

Preferencialmente, para um volume líquido de 2 μΐ, o volume de contenção da abertura é apenas 4 μΐ. Os dispositivos da técnica anterior usavam eventualmente uma amostra de 3 μΐ para um volume de contenção de 100 μΐ. Adicionalmente, reduzir os volumes de reagente tem a vantagem de reduzir também os custos. No entanto, permite aumentar o número de aberturas numa placa de reação de determinado tamanho, o que possibilita obter uma produtividade acrescida das análises com volumes de reagente baixos. Isto também aumenta o número de análises obteníveis quando estiver disponível apenas uma amostra original limitada, por exemplo de ADN ou ARN, para trabalhar.

De preferência, a placa de reação é formada apenas por materiais quimicamente estáveis como, por exemplo, polímeros como polipropileno ou policarbonato. 0 polipropileno é particularmente adequado, visto ser moldável por injeção, inerte aos reagentes, estável ao calor nas temperaturas de reação, por exemplo de 0 °C a 95 °C, e bom na condução de calor, de forma que o calor possa ser transferido para a abertura. Também está disponível como oticamente transparente, pelo que se revela útil para análise fluorescente da põs-deteção da amostra/reagente.

Outra vantagem reside no facto de o polipropileno poder ser soldado, e de, após a soldadura, apresentar uma interferência mínima dos poços de reação adjacentes, devido ao efeito de vedação da solda em redor de cada poço de reação. A técnica anterior apenas obtém uma base transparente com a união de uma base transparente mais espessa quer na fase de moldagem por injeção ou posteriormente, pelo que não está soldada e possibilitar interferência.

Adicionalmente, o polipropileno permite um fluxo térmico elevado e pode ser fornecido em películas com uma espessura desejável como, por exemplo, entre 1 μπι e 500 μιη, de preferência entre 10 μηι e 120 μηι e mais preferencialmente cerca de 2 pm. Também pode ser congelado para efeitos de armazenagem com, p. ex,, arrefecido até temperaturas de -20 °C a -70 °C. A soldadura também possibilita a reticulação de polímeros como, por exemplo, pela fusão das superfícies de revestimento da placa e da película, de forma a fundirem-se, em particular, se os dois componentes unidos forem formados pelo mesmo material plástico, embora seja possível soldar materiais diferentes, A reticulação proporciona uma resistência da soldadura muito eficiente. No entanto, pode ser suficiente simplesmente fundir uma camada de cola entre a película e a placa com o soldador de forma que a cola solde (una) a película e a placa. A camada de cola pode ser aplicada tanto na película como na placa, mas preferencialmente na película.

De preferência, a placa perfurada é feita numa secção sólida, além das aberturas. No entanto, se for formada com uma matriz de minitubos de ensaio, por exemplo, montada no interior de uma estrutura, os tubos devem estar interconectados por uma rede para formar a placa perfurada. No entanto, pelo menos um lado da placa perfurada deve possuir uma superfície planar para receber a película; em utilização, a placa de reação será aquecia geralmente numa placa aquecedora com uma superfície planar mediante a qual seja possível transferir o calor, através da película, para uma amostra contida nos contentores ou poços definidos pelas aberturas. Para conseguir isto, a placa de reação deve primeiro ser invertida de forma que a amostra repouse contra a película por gravidade e seguidamente a película repouse na placa aquecedora. 0 calor de processamento pode alternativamente ser transferido para a placa perfurada por imersão total em banhos-maria para obter a reação pretendida. Para tal, as placas de reação serão mantidas num suporte adequado.

De preferência, a película é formada de um material de plástico transparente. A película é preferencialmente transparente em termos óticos com distorção ou interferência muito baixa. Isto permite a inspeção tanto manual (isto, é, por ser humano) como automatizada (isto é, por máquina) de, por exemplo, cada PCR. No entanto, nos sensores que funcionam com deteção UV ou IR, por exemplo, isto é, fora da gama visível, a película apenas precisa de ser transparente para o comprimento de onda EM apropriado utilizado. A utilização da soldadura a laser para unir a película também aumenta (melhora) a relação de ruído para sinal em obtenção de imagens fluorescente, devido aos parâmetros óticos superiores obtidos com a película unida, em comparação com a soldadura térmica, por causa das propriedades óticas simplificadas da placa de reação planar. A película é preferencialmente um laminado. Por exemplo, pode possuir um topo de poliéster, um centro de polipropileno e um fundo de cola termofundível para união à placa.

De preferência, a placa perfurada é substancialmente rígida e opaca e feita de um material de plástico.

De preferência, a placa perfurada é de um material absorvente de infravermelho (IR) adequado (p. ex. , negro) para facilitar a soldadura por transmissão. A placa perfurada pode ser feita de material absorvente de infravermelho (IR) não adequado, com o material da película a ser um absorvente de infravermelho adequado para facilitar a soldadura por transmissão. Isto permite que a soldadura da película na placa seja realizada por laser através da placa perfurada planar. A placa perfurada pode ser feita de material absorvente de infravermelho (IR) não adequado que iniba a soldadura de transmissão, mas pode ser revestido com coloração absorvente para facilitar a soldadura por transmissão. A coloração pode ser uma tinta aplicada, por exemplo, com um marcador ou similar, para definir os pontos em que a soldadura será necessária.

De preferência, a placa perfurada é negra. Isto previne a interferência cruzada num aparelho de inspeção automatizada de, por exemplo, PCR em poços adjacentes. A placa perfurada pode ser, sob alguma outra forma, absorvente da luz para a frequência relevante da radiação EM usada no equipamento de inspeção automatizada. A absorvência também evita que as reflexões internas no interior da abertura, p. ex. , das suas paredes, interfiram na inspeção automática.

Em utilização, um ou mais reagentes e uma ou mais amostras (multiplexado) vão ser retidos no interior na ou em cada abertura pela película ou pelas películas. De preferência, a película é perfurável para permitir que o reagente e a amostra, por exemplo na forma fluida, sejam removidos do interior da abertura, se tal for necessário.

Preferencialmente, a solda em redor da abertura é contínua para vedar a película na placa perfurada em redor da periferia do orifício na extremidade correspondente. No entanto, quando são proporcionados canais ou ranhuras, a solda deve então preferencialmente ser contínua ao longo da periferia dos canais ou ranhuras e das aberturas conectadas na mesma.

De preferência, a placa perfurada tem menos de 4 mm de espessura. Por exemplo, a placa perfurada pode ter aproximadamente 0,2 mm de espessura, aproximadamente 0,5 mm de espessura, aproximadamente 1,3 mm de espessura, aproximadamente 2 mm de espessura ou aproximadamente 3 mm de espessura. Tais placas perfuradas tão finas podem ser formadas ou cortadas de redes contínuas como, por exemplo, de um rolo de material perfurado. Isto pode proporcionar propriedades de manuseamento vantajosas do aparelho de processamento e fabrico automatizado, sendo possível obter produtividades superiores.

As aberturas podem ter uma secção circular e um comprimento correspondente à espessura da placa perfurada (isto é, dispostas perpendicularmente às superfícies da mesma). De preferência, as aberturas possuem um diâmetro de 1,8 mm. Portanto, cada abertura possui um volume interno de aproximadamente 3,36 μΐ com 1,32 mm de comprimento. A Figura 8 mostra uma construção deste tipo.

Cada abertura pode ser substancialmente troncocónica, isto é, tendo um diâmetro de 1,8 mm numa superfície planar (p. ex., no topo) e 0,2 mm na superfície oposta (p. ex., na base). Em alternativa, as aberturas podem ter uma secção quadrada. Um exemplo, ter aberturas quadrangulares que possuem 1,8 mm, define aberturas que possuem individualmente um volume interno de 4,27 μΐ com 1,32 mm de comprimento.

As aberturas podem ser cónicas, p. ex., com fundo em V, prolongando-se parcialmente através da placa, conforme mostrado na Figura 9.

De preferência, a placa possui 3 mm de espessura, tendo poços com 2,5 mm de profundidade, que podem, por exemplo, ser cónicos, troncocõnicos, quadrados ou tubulares, e tendo cada uma parede inferior com 0,5 mm de espessura. A placa é preferencialmente moldada por injeção, possuindo espaços de 2,25 mm de centro-a-centro da abertura. Os poços têm 1,8 mm de largura. 0 comprimento das aberturas, isto é, usualmente a espessura da placa perfurada, pode ser utilizado para variar o volume das aberturas, bem como o diâmetro das aberturas. Um volume de abertura desejável seria 4 μΐ ou menos.

De acordo com um segundo aspeto da presente divulgação, é proporcionado um método para formar uma placa de reação de acordo com o aspeto preferido da presente divulgação que compreende proporcionar uma placa perfurada e uma película e soldar a placa perfurada para formar o laminado planar de plástico soldado.

Também é proporcionado um método de ocluir uma abertura de uma placa de reação que compreende a soldadura por transmissão de uma película numa placa perfurada que possui uma superfície planar lisa e, pelo menos, uma abertura que se prolonga desde a superfície planar lisa na direção oposta da placa de reação, com a película a ocluir a abertura na sua extremidade da superfície planar lisa.

De preferência, a placa de reação compreende quaisquer propriedades descritas acima.

Para aberturas que se prolongam completamente através da placa perfurada, a película pode ocluir qualquer extremidade da mesma. De preferência, uma primeira película oclui a primeira extremidade e uma segunda película oclui a segunda extremidade. Preferencialmente, ambas as películas são soldadas por transmissão na placa perfurada.

De preferência, a soldadura é uma soldadura por transmissão por laser díodo.

Uma placa de reação com dois lados que tenha sido selada por transmissão numa primeira superfície (uma placa de reação selada por transmissão única) pode ser selada na segunda superfície com uma fita compatível com PCR adequada que é fixada na superfície planar da placa durante o processamento com temperatura.

De preferência, a abertura é, pelo menos, parcialmente enchida com uma quantidade de um ou mais reagentes e amostras, com a película ou películas a vedar a abertura ocluída com o reagente e amostra contidos na mesma. A abertura selada deste modo que contém o reagente e/ou a amostra pode ser usada para a armazenagem massiva de reagente/amostra (isto é, para bibliotecas de livrarias, amostras de ADN da população e sondas de SNP em massa).

De preferência, as placas com aberturas parcialmente cheias com reagentes / amostras de ADN / sondas SNP podem ser armazenadas num estado seco ou húmido para acesso e reconstituição posterior, com vista à sua distribuição ou utilização. A soldadura de laser (com díodo, ND YAG ou infravermelho próximo) da(s) película(s) na placa perfurada permite uma passagem de quantidades mínimas de energia/calor para a mistura de reagente e amostra, por exemplo, amostra de composto/fluido, durante a fase de soldadura por transmissão, É improvável que isto seria obtido com a soldadura térmica convencional; a fusão de uma folha revestida com cola para a sua fixação numa superfície planar requer o isolamento térmico da camada de ar entre a película e a mistura de amostra e reagente. Com a utilização de soldadura térmica convencional, a superfície soldada, que inclui a oclusão da abertura, geralmente torna-se quente ao toque após a soldadura. Isto constitui uma desvantagem. Portanto, a presente invenção simplifica o processo de soldadura e diminui a possibilidade de qualquer degradação prematura não intencional dos reagentes ou da amostra causada pelo processo de soldadura, ou pelo seu calor residual, visto que localiza o aquecimento. A presente divulgação proporciona adicionalmente um método para formar uma vedação em redor do poço da placa de reação ou microtitulação que compreende uma fase de soldadura a laser de uma película de plástico sobre o poço para formar a referida vedação. A soldadura térmica pode causar a fusão da película em redor do poço ou, com cola térmica entre a película e a placa, a união em redor do poço, A película está revestida preferencialmente com uma cola com estas propriedades no seu lado virado para a placa.

De acordo com este e outros aspetos da presente invenção e divulgação, de preferência toda a placa é soldada utilizando a soldadura a laser e a película de plástico, A película pode ser revestida com um reagente de afinidade que é preferencialmente estrepavidina.

De preferência, a película está revestida com um produto químico utilizado numa reação que utiliza a placa de microtitulação. As paredes dos poços podem ser revestidas similarmente. A presente divulgação proporciona também um aparelho de processamento da placa de reação automatizado para o processamento automatizado de uma placa de reação, integrando o referido aparelho os meios para realizar o ou cada método descrito acima. 0 aparelho pode servir simplesmente para aplicar uma película numa placa perfurada. A placa perfurada pode já possuir uma primeira película aplicada na mesma e reagentes e/ou amostras nas aberturas. No entanto, o aparelho pode servir para soldar uma primeira película numa placa perfurada. 0 aparelho pode compreender meios para encher a ou cada abertura, pelo menos parcialmente, com um reagente e uma amostra, como meios de enchimento conhecidos na técnica anterior, por exemplo, injetores de seringa robóticos, dispensadores piezoelétricos, pino de dispensa, bombas peristálticas, dispensadores de deslocamento positivo ou dispensadores capilares. 0 aparelho pode compreender meios para segurar a ou cada placa perfurada no momento da soldadura como, p. ex., utilizando um leito de vácuo, para permitir uma soldadura por transmissão precisa.

De preferência, o aparelho enche aberturas de uma placa perfurada que possui uma primeira película soldada na mesma com amostra e/ou reagente. Preferencialmente, o aparelho depois sela as aberturas mediante a soldadura de uma segunda película numa superfície planar oposta da placa de reação na superfície em que a primeira película está soldada.

De preferência, o aparelho compreende uma ou mais unidade(s) de soldadura por laser díodo para soldar a(s) películas(s) na placa perfurada. 0 aparelho pode também compreender uma unidade de moldagem por injeção para formar as placas perfuradas. Em alternativa, as placas perfuradas podem ser providas com espaços em branco. 0 aparelho pode então formar a ou cada abertura em ou através dos espaços em branco, p. ex., por perfuração, corte laser, decapagem ou fresagem. De preferência, no entanto, as placas perfuradas são fornecidas ao aparelho preparadas para a soldadura da película ou película na mesma. Estas placas perfuradas podem ser fundidas ou moldadas, por exemplo.

As películas podem ser desenroladas de um rolo de material de película ou podem ser cortadas previamente com a dimensão adequada.

De preferência a ou cada película é feita de polipropileno e pode ser polipropileno revestido de cola térmica. 0 aparelho pode compreender também meios para realizar as reações utilizando as placas de reação como, p. ex., manuseadores de placa de reação e meios de aquecimento para aplicar calor no reagente e amostra no interior das aberturas por meio de condução e/ou radiação através da película. Os manuseadores podem ser necessários para rodar as placas de reação para posicionar o seu lado apropriado (com a película) em contacto com os meios de aquecimento. Os manuseadores de placa de reação e os meios de aquecimento adequados já são conhecidos na técnica anterior, por exemplo manuseadores robõticos, placas aquecedoras e banhos-maria. 0 aparelho também pode compreender meios sensores para inspecionar o conteúdo das aberturas durante ou depois de a reação ter sido efetuada, como meios que usam fluorescência, refletância ou similares. Os meios sensores podem ver o interior das aberturas, por exemplo em PCR, através da película. A aplicação do estado atual da tecnologia a um volume de reação de 1536 poços (ou mais) miniaturizados, com menos de 1 μΐ (ou inferior), não é adequada devido a uma combinação de conceção do poço e intolerância da amostra. Para criar um volume ótimo para a relação da camada de ar, a placa miniaturizada requer um perfil pouco profundo, conforme mostrado na Fig. 10b. Isto é contrário à tecnologia atual de placa adequada para PCR (mostrada na Figura 10a) . A utilização deste perfil de placa inferior faz com que a utilização de técnicas de termosvedação convencionais seja inadequada, devido à proximidade da amostra ao elemento de aquecimento, o que levaria à evaporação da amostra. Isto poderia originar vedações inadequadas e anomalias na reação devido a evaporação da amostra ou dano na amostra. A utilização de soldadura a laser evita este problema, visto que o efeito de aquecimento é localizado com precisão. A presente invenção será agora descrita como exemplo com referência aos desenhos acompanhantes, nos quais:

As Figuras 1 e 2 são vistas em planta de duas placas de reação de acordo com a presente divulgação. A Figura 3 é uma vista em planta de uma formação de abertura variável de acordo com a presente divulgação; A Figura 4 é uma secção A-A da Figura 3. A Figura 5 é uma vista esquemática de uma soldadura a laser díodo de uma película numa placa perfurada de acordo com a presente invenção; A Figure 6 é uma secção esquemática de uma placa de reação cheia e selada da presente invenção; A Figura 7 mostra uma placa de reação da técnica anterior que pode ser usada no aparelho da presente divulgação; A Figura 8 mostra uma secção parcial através de uma placa perfurada que possui poços cilíndricos; A Figura 9 mostra uma secção parcial através de uma placa perfurada que possui poços cónicos; e A Figura 10 mostra uma comparação entre os respetivos rãcios volume de poço-para-amostra num poço da técnica anterior e um poço de placa de reação soldada a laser.

As Figuras 1 e 2 mostram duas placas de reação diferentes 10 de acordo com a presente divulgação.

As placas de reação 10 compreendem uma placa perfurada 12 de forma substancialmente retangular que tem as dimensões típicas de aproximadamente 85 mm por 125 mm, com uma espessura de aproximadamente 2 mm. Disposta pela placa perfurada 12 é providenciada uma matriz de aberturas 14 que formam contentores ou poços para a placa de reação 10. Cada abertura 14 é cilíndrica, tendo um diâmetro ou aproximadamente 1,8 mm. A matriz tem uma disposição de 32 por 48. As aberturas podem ser, em alternativa, quadradas ou retangulares, por exemplo. No entanto, algumas das aberturas são mostradas para ser omitidas ou como espaços em branco, conforme explicado abaixo. Em vez disso, são substituídas por pontos de moldagem por injeção. No entanto, deve ser possível moldar a placa perfurada com uma seleção completa de aberturas ou formar uma matriz completa em espaços em branco por perfuração ou outros métodos de processamento.

Um código de barras ou meio de identificação única (não mostrado) pode ser posicionado na placa perfurada em qualquer altura durante o fabrico ou utilização.

Na Figura 1, as aberturas omitidas 16 estão escurecidas. Na Figura 2, são mostradas como espaços em branco.

Uma esquina da placa de reação 10 está chanfrada para proporcionar um meio de indexação para o aparelho de processamento automatizado da placa de reação da presente divulgação.

As Figuras 3 e 4 mostram uma representação esquemática de uma forma alternativa da placa de reação 10. São providenciadas duas aberturas 14 na placa de abertura 12. É providenciada uma ranhura 20 que se prolonga para a extremidade de cada abertura 14. As ranhuras 20 (ou canais) permitem que aberturas selecionadas 14 estejam em comunicação fluidal entre si. Ter as aberturas em comunicação fluidal permite que os fluidos (reagentes, por exemplo) sejam transferidos (seta 21) para aberturas que, de outra forma, estariam ocluídas.

Em utilização, a ranhura 20 vai estar ocluída, bem como as aberturas 14. Uma película 22 é fixada na placa perfurada 12 sobre a ranhura 20 conforme mostrado pela seta 24 na Figura 4. A película 22 será usualmente contínua (ver Figuras 5 e 6), sendo disposta sobre toda a placa perfurada 12, ocluindo todas as aberturas 14 e quaisquer ranhuras 20. A ranhura pode ter sido moldada na placa perfurada 12 ou pode ter sido cortada na placa perfurada 12. A Figura 5 mostra uma representação esquemática de um dispositivo para unir uma película 22 a uma placa perfurada 12. 0 dispositivo compreende um aparelho de soldadura a laser díodo 26 que possui uma unidade geradora de laser 28 e um meio de focagem do feixe 30. As unidades de soldadura a laser conhecidas na técnica seriam adequadas para esta aplicação, isto é, um laser díodo Herfuth Laser Technology TL250. Estas unidades de soldadura da técnica anterior realizam aquilo que é conhecido genericamente como "soldadura por transmissão".

Uma placa perfurada 12 e uma película associada 22 estão dispostas de forma que a película 22 oclua as aberturas 14 necessárias. Neste exemplo são todas as aberturas 14. Um laser 32 é depois direcionado para a película 22, de forma a soldar por pontos a película 22 a placa perfurada 12 (no ponto mostrado pela seta 34 na Figura 5). A película 22 e a placa perfurada 12, e o laser 32, são depois movidos entre si de forma permitir a conclusão da soldadura. De preferência, a solda é efetuada sobre todas as secções da película 22 que estão sobrepostas nas porções não perfuradas da placa perfurada 12 .

Este método de fabrico proporciona uma placa de reação multipoços lisa com orifícios que estão cobertos (ocluídos) numa extremidade com uma película fina, por exemplo polipropileno, com a película a ser soldado por laser na mesma para criar uma camada de base. A amostra ou material 3 6 (ver Figura 6) pode então ser introduzido nos poços através das extremidades abertas dos poços e selado no interior unindo uma folha superior na mesma para ocluir as extremidades abertas dos poços. A amostra ou material 36 é usualmente uma amostra e um ou mais reagentes.

Uma vedação formada pelo processo de soldadura 0. -i- cí O vai ser mais eficiente quando existir um bom contacto entre as duas superfícies a soldar. De preferência, a película e a placa a soldar serão mantidas unidas pela aplicação de pressão utilizando materiais não absorventes do laser, permitindo que a soldadura a laser ocorra através dos materiais. Os ditos materiais são de preferência vidro, Perspex (RTM) ou mais preferencialmente uma combinação de borracha de silicone e./ou vidro. Em alternativa, pode ser aplicada pressão de ar de um ponto sobre ou pressão de vácuo de um ponto sob a placa. 0 aparelho descrito anteriormente proporciona placas de reação que possuem uma matriz de poços ou contentores de elevada densidade, sendo cada um de pequena dimensão e tendo seladas no seu interior amostras tratáveis individualmente, para permitir assim PCR com baixos volumes de líquidos de amostras, por exemplo, e com um elevado número de análises na mesma. Adicionalmente, a soldadura a laser é extremamente precisa e o calor é contido localmente no objeto-alvo. Deste modo, é possível soldar películas muito finas. Como é utilizada uma película, o aquecimento da amostra pode ser controlado com precisão quando o dito aquecimento ocorrer pela transferência de calor através da película. A título de exemplo, a película 22 vai ter geralmente a mesma espessura de 12 pm ou menos. De preferência a película tem 62 pm de espessura.

Numa forma de realização preferida, o laser díodo é utilizado para fundir adesivo de películas revestidas com adesivo para unir essas películas na placa perfurada 12. 0 laser díodo também pode ser utilizado para voltar a fundir 0 adesivo para remover a película de forma a aceder ao material 36 (ver Figura 6) que tinha sido selado no interior dos poços. Isto proporciona reciclabilidade. No entanto, o adesivo teria de ser selecionado de forma que não contaminasse o material 36 no interior do poço.

Embora a presente descrição ilustre matrizes multipoços específicas (1440 poços e 1152 poços nas Figuras 1 e 2 respetivamente), a presente invenção pode ser utilizada para criar recipientes de armazenagem de líquidos para formatos existentes, com, por exemplo, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 96 ou 384 poços ou mesmo com 1536, 3456 ou 6144 poços ou quaisquer outras variantes pretendidas. As matrizes podem ser proporcionadas com outras disposições de aberturas em espaços em branco também.

Um exemplo de uma matriz de uma abertura seria para a micromatrizes de processamento de ADN / Oligonucleótidos em lamelas de plástico ou vidro, uma estrutura fina com 1 mm de espessura poderia ser soldada na lamela, uma película seria depois soldada na estrutura para cobrir toda a superfície. Os orifícios de entrada e saída de fluidos podem ser proporcionados de forma a permitir que o fluido passe sobre a lamela ou amostra de uma forma controlada.

As placas perfuradas preferidas são moldadas por injeção completas com as aberturas. No entanto, devido à natureza fina da dimensão de abertura preferida, pode ser necessário usar vários pontos de injeção para a fase de moldagem por injeção. Com o uso de vários pontos de injeção, não existe dificuldade em assegurar que o material injetado, isto é, o plástico, flui completamente para o interior do molde. Na placa da Figura 2, a distância máxima do fluxo de injeção no interior do molde pode ser tão reduzida como 2 mm ou 3 mm (cada abertura de espaço em branco corresponde a um ponto de moldagem por injeção). Ao posicioná-las regularmente sobre a placa perfurada, é possível obter uma injeção uniforme. No entanto, deve ser possível moldar por injeção a placa perfurada com menos pontos de moldagem por injeção. Para a placa perfurada da Figura 1, foram usados 96 pontos de moldagem por injeção. Na placa perfurada da Figura 2 havia 384 pontos de moldagem por injeção.

Este método de fabricar placas de reação 10 e as próprias placas de reação tem diversas aplicações. Estas incluem: 1. A soldadura de uma película de polímero translúcida numa placa de reação multipoços de plástico cria uma vedação estanque ao líquido. Se a outra extremidade dos poços também estiver ocluída, isto forma uma contenção estanque ao líquido ou até estanque ao fluido. Esta contenção também pode ser obtida soldando uma película de topo e de base nas extremidades de um tubo cilíndrico ou quadrado ou de uma conduta; por exemplo, é possível criar matrizes do tipo placa múltipla bidimensional e uma estrutura de lamela de vidro/plástico unidimensional ou faixas de recipientes e formar matrizes mais altas. 2. Fabrico de micropoços para realizar amplificação de ADN (reação em cadeia da polimerase) para levar a cabo em volume reduzidos (inferior a 4 μΐ). 3. No fabrico de vedações estanques ao líquido sobre microcanais para transferir ou adicionar líquidos de cada poço, criando assim um ®laboratõrio numa placa/chip®. 4. A soldadura a laser de películas de polipropileno, tratadas, pré-revestidas (estrepavidina, ADN, oligonucleótidos, colorações, etc.) em placas perfuradas para criar placas de reação em formato de microtitulação com superfícies internas pré-revestidas. 5. A utilização de placas de reação soldadas a laser para obtenção de imagens fluorescente uni e multiplexada como, p. ex. , para aplicações de genotipagem e tipicamente aplicações de TaqMan® da Applied Biosystems. 6. A utilização de placas de reação soldadas a laser para obtenção de imagens fluorescente uni e multiplexada como, p. ex., para aplicações de genotipagem e tipicamente aplicações de Transferência Ressonante de Energia por Fluorescência (FRET) de TaqMan® da Applied Biosystems. 7. Para aplicações de genotipagem com a deteção de alvo específico (uni e multiplexado) com sinal positivo SNP (nucleótido polimõrfico único) no da análise é observada na placa de reação a partir do topo ou da base ou com a remoção de reagente/amostra através de espetroscopia, espetroscopia de massa, sequenciação com base de gel (em placa e de forma capilar), radiação, fluorescência, quimioluminescência ou hibridização. 8. Para a deteção de ADN, proteínas, anticorpos, fluidos biológicos, soros, urina por etiquetas. 9. Para utilização na genotipagem de doente/população, monitorização ambiental, ensaios de equipamentos militares "NBC" (nuclear-biolõgico-químico), controlo de qualidade com o formato de placa inovador com marcadores/sondas predefinidas num formato de kit. 10. A união de um material/película condutivo numa superfície planar de forma simples ou dupla que possua propriedades de "deteção" (condução/reação) ou facilite o movimento (isto é, fluxo osmótico) ou controle os reagentes/fluidos internos na mesma. 11. Para a criação de amostras ou sondas de ADN ou Oligonucleótidos secas para distribuição.

Uma unidade matricial de laser díodo pode ser utilizada para aumentar a velocidade da soldadura; em vez da soldadura de um ponto ou uma linha, também pode ser soldada uma faixa. A matriz de laser díodo pode, por exemplo, ser uma matriz de laser díodo unidimensional de configurações variáveis como, por exemplo, circular, quadrada, retangular ou linear. 0 laser díodo pode possuir uma focagem variável, possibilitando várias dimensões de "pontos" de soldadura. 0 laser ou unidade matricial de laser podem ser montados numa plataforma robótica para o seu controlo, de forma a ser possível cobrir a placa com uma folha de polipropileno para criar contenção ou contentores ou soldar cada poço individual para selá-los. Isto pode ser obtido, por exemplo, movendo o laser sobre o espaço intersticial entre as aberturas do poço, protegendo assim as amostras da exposição à fonte de laser.

Usar lasers díodo, por exemplo no formato de matriz, possibilitou soldar, por exemplo, uma película de polipropileno num substrato sólido absorvente de laser para criar uma placa de reação ou microtitulação rígida, termicamente eficiente e estável, capaz de realizar um número superior de PCR/reações de uma vez, e com volumes significativamente reduzidos, que as realizáveis anteriormente nas placas de reações multipoços moldadas convencionais ou na placa de reação selada com adesivo desvantajosa, enquanto a soldadura térmica convencional de uma película proporcionou resultados oticamente insuficientes devido à eficiência ótica reduzida do revestimento de cola. A matriz de laser díodo unidimensional solda correta, rápida e eficazmente no ponto de contacto dos dois materiais, isto é, o substrato absorvente de laser e o não absorvente de laser (isto é, folha/película apropriadamente transparente). 0 ADN e os reagentes comuns não são muito absorventes de energia IR (infravermelha) e portanto não são suscetíveis de danos por aquecimento no momento da soldadura. Adicionalmente o laser está desfocado sob a camada de soldadura, reduzindo significativamente qualquer energia de laser.

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente serve apenas para a conveniência do leitor. Não faz parte o documento de patente europeia. Embora tenha sido aplicado um cuidado extremo ao compilar as referências, não foi possível excluir erros ou omissões e ο IEP exime qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição • US 5498392 A [0014] • US 5587128 A [0014] • WO 9412405 A [0019] • WO 0064747 A [0020] • WO 9942608 A [0021]

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para formar vedações em redor de uma pluralidade de poços de uma placa de reação, com os poços a serem definidos por uma pluralidade de aberturas (14, 20) numa superfície planar da placa de reação perfurada (10,12) e contendo o reagente PCR, com o dito método a compreender a fase de unir uma película de plástico (22) na superfície planar da placa de reação perfurada para vedar o reagente no interior dos poços, utilizando a soldadura a laser díodo de infravermelho próximo para formar as vedações, em que a placa de reação perfurada é feita de um material plástico e possui pelo menos 1536 poços.

2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a película (22) cobre todas as aberturas (14,20), estendendo-se sobre toda a superfície planar da placa de reação perfurada (12).

3. 0 método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que cada abertura (14,20) se estende de uma primeira superfície planar da placa de reação perfurada para uma segunda superfície planar oposta, opcionalmente em que uma segunda película é soldada para formar a segunda superfície, opcionalmente em que ambas as películas são soldadas a laser díodo de infravermelho próximo na placa de reação perfurada.

4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os canais ou ranhuras (20), em particular ranhuras superficiais ou micropistas, são dispostas na placa de reação perfurada.

5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a película (22) é oticamente transparente com uma interferência mínima.

6. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a película (22) possui uma espessura entre 1 pm e 500 pm.

7. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores em que a placa possui menos de 4 mm de espessura, opcionalmente aproximadamente 0,2 mm de espessura, aproximadamente 0,5 mm de espessura, aproximadamente 1,3 mm de espessura, aproximadamente 2 mm de espessura ou aproximadamente 3 mm de espessura.

8. 0 método de acordo com a reivindicação 7 em que a placa de reação é formada ou cortada de uma rede ou rolo contínuo de material perfurado.

9. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 7, em que a placa de reação perfurada (12) é substancialmente rígida e opaca.

10. 0 método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a placa de reação perfurada (12) é absorvente de infravermelho próximo, em que opcionalmente a placa de reação perfurada (12) é negra.

11. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 em que a placa de reação perfurada (12) é absorvente de infravermelho próximo.

12. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a película (22) é absorvente de infravermelho próximo.

13. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a película (22) é facilmente perfurável.

14. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a película (22) é revestida com um reagente de afinidade, em que opcionalmente o reagente de afinidade é estrepavidina.

15. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a película (22) é revestida com um produto químico utilizado numa reação para a qual a placa de reação foi preparada.

16. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que as aberturas possuem um diâmetro de 1,8 mm, ou em que o espaço de centro-a-centro das aberturas é 2,25 mm.

17. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que os poços contêm um ou mais reagentes de PCR e uma ou mais amostras.