PT1276867E

PT1276867E - Utilização do receptor humano acoplado à proteína g tipo latrofilina em métodos de rastreio

Info

Publication number: PT1276867E
Application number: PT01938027T
Authority: PT
Inventors: Shyam Ramakrishnan
Original assignee: Bayer Healthcare Ag
Priority date: 2000-03-22
Filing date: 2001-03-21
Publication date: 2006-12-29
Also published as: DE60122488D1; DE60122488T2; CY1105656T1; WO2001070969A3; US20040175698A1; WO2001070969A2; ES2271020T3; ATE337398T1; EP1276867B1; AU2001263796A1; EP1276867A2; DK1276867T3

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DO RECEPTOR HUMANO ACOPLADO À PROTEÍNA G TIPO LATROFILINA EM MÉTODOS DE RASTREIO"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A invenção relaciona-se acoplados à proteína G. Mais relaciona-se com os receptores G tipo latrofilina e a sua fármacos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO com a área dos receptores particularmente, a invenção humanos acoplados à proteína utilização no rastreio de

Receptores acoplados à proteína G

Muitos processos biológicos com relevância no campo da medicina são mediados através de vias de trans-dução de sinal que envolvem as proteínas G (Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991). A família dos receptores aco plados à proteína G (GPCR, do Inglês "G-protein coupled receptors") inclui receptores de hormonas, neurotransmis-sores, factores de crescimento e vírus. Como exemplos específicos de GPCRs incluem-se os receptores de agentes tão diversos como as dopaminas, a calcitonina, hormonas adrenégicas, a endotelina, o AMPc, a adenosina, a acetil-colina, a serotonina, a histamina, a trombina, o cinina, a 2 ΡΕ1276867 hormona estimuladora do folículo, as opsinas, o gene-1 de diferenciação endotelial, as rodopsinas, substâncias odoríferas, os citomegalovírus, as próprias proteínas G, proteínas efectoras, tais como a fosfolípase C, a adenil-ciclase e a fosfodiesterase e proteínas de acção, tais como a proteína cínase A e a proteína cínase C.

Os GPCRs possuem sete domínios transmembranares conservados que ligam, pelo menos, oito ansas hidrofílicas divergentes. Os GPCRs (também conhecidos como receptores 7TM) foram caracterizadas como contendo estas sete porções hidrofóbicas conservadas com cerca de 20 a 30 aminoácidos a ligar, pelo menos, oito ansas hidrofílicas divergentes. A maior parte dos GPCRs têm um único resíduo conservado de cisteína em cada uma das duas primeiras ansas extrace-lulares, que formam ligações dissulfureto, que se pensa estabilizarem a estrutura da proteína funcional. As sete regiões transmembranares são designadas por TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6 e TM7. A TM3 tem sido implicada na transdução de sinal. A fosforilação e a adição de lípidos (palmiti-lação ou farnesilação) aos resíduos de cisteína podem influenciar a transdução de sinal de certos GPCRs. A maior parte dos GPCRs contêm potenciais locais de fosforilação na terceira ansa citoplasmática e/ou no terminal carboxi. Para vários GPCRs, tais como o receptor β-adrenégico, a fosforilação pela proteína cínase A e/ou por cínases específicas do receptor, intervêm na dessensibilização do receptor. 3 ΡΕ1276867

Pensa-se que, para determinados receptores, os locais de ligação do ligando nos GPCRs compreendem locais de encaixe hidrofílicos formados por diversos domínios transmembranares dos GPCR. Os locais de encaixe hidrofílicos estão rodeados pelos resíduos hidrofóbicos dos GPCRs. 0 lado hidrofílico de cada espiral transmembranar dos GPCRs está postulado estar voltado para dentro e formar um local de ligação ao ligando polar. Em vários GPCRs tem-se associado a TM3 como contendo um local de ligação ao ligando, como por exemplo o resíduo de aspartato da TM3. Também estão implicadas na ligação do ligando as serinas da TM5, a asparagina da TM6 e as fenilalaninas ou tirosinas da TM6 ou da TM7.

Através de proteínas G heterotriméricas os GPCRs estão acoplados dentro da célula a várias enzimas intracelulares, canais de iões e transportadores (ver em Johnson e tal., Endoc. Rev. 10, 317-331, 1989). Diferentes subuni-dades alfa das proteínas G estimulam preferencialmente certos efectores de modo a modular diversas funções biológicas dentro da célula. A fosforilação dos resíduos citoplasmá-ticos dos GPCRs é um mecanismo importante para a regulação de certos GPCRs. Por exemplo, numa das formas de transdução de sinal, o efeito da ligação da hormona é a activação, no interior da célula, de uma enzima, a adenilciclase. A activação enzimática através de hormonas está dependente da presença do nucleótido GTP. 0 GTP também influencia a ligação da hormona. Uma proteína G conecta o receptor da hormona e a adenilciclase. A proteína G troca GTP pelo GDP 4 ΡΕ1276867 ligado quando activada por um receptor da hormona. A forma que carrega o GTP liga-se então à adenilciclase activada. A hidrólise do GTP a GDP, catalisada pela própria proteína G, devolve a proteína G à sua forma basal inactiva. Assim sendo, a proteína G contém uma dupla função, como o intermediário que transmite o sinal do receptor ao efector e como um relógio que controla a duração do sinal.

Durante os últimos 15 anos foram sendo introduzidos no mercado com sucesso praticamente 150 agentes terapêuticos que têm como alvo os receptores GPCRs. Isto indica que estes receptores estão estabelecidos como alvos terapêuticos, como o comprova a história. Tem havido claramente uma necessidade de identificação e de caracterização de mais GPCRs que possam ter uma função na prevenção, atenuação e correcção de disfunções ou doenças que incluam, mas que não estejam limitadas a, infecções, tais como as bacterianas, as fúngicas, por protozoários e infecções virais, particularmente aquelas provocadas por vírus HIV, dores, cancros, anorexia, bulimia, asma, a doença de Par-kinson, insuficiência cardíaca aguda, hipotensão, hipertensão, retenção urinária, osteoporose, angina de peito, enfarte do miocárdio, úlceras, asma, alergias, hipertrofia prostática benigna e disfunções psicóticas e neurológicas, incluindo a ansiedade, a esquizofrenia, a depressão maníaca, o delírio, a demência, vários tipos de atraso mental e discinésias, tais como a Doença de Huntington e o síndroma de Tourett. 5 ΡΕ1276867

Latrofilina (Receptor da alfa-latrotoxina) A alfa-latrotoxina (ALX, do Inglês "alfa- latrotoxin Receptor"), uma proteína neurotóxica existente no veneno da aranha viúva negra, estimula uma libertação robusta de neurotransmissores e a subsequente degeneração dos terminais nervosos afectados. Este efeito é mediado pela ligação da ALX a um receptor acoplado à proteína G denominado por latrofilina (Ichtchenko et al., J. Biol. Chem. 274, 5491-98, 1999; Rahman et al., Philos. Trans. R.

Soc. Lond. B Biol. Sei. 28, 39-86, 1999). Devido ao efeito dramático da ALX na exoeitose, existe na especialidade uma necessidade de se identificarem membros adicionais da família de receptores latrofilina, cuja actividade pode ser regulada de modo a fornecer efeitos terapêuticos. A sequência EST identificada pelo número de acesso AL03J715 [XP002198805] (DATABASE EM_EST [em rede], [ID:HSM004191) foi clonada a partir de testículos de adulto e revela a sequência descrita pela SEQ ID N°:l.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É um objectivo desta invenção o fornecimento de reagentes e métodos para a regulação do receptor humano acoplado à proteína G tipo latrofilina (LT-GPCR). Este e outros objectivos desta invenção são fornecidos numa ou mais das formas de realização descritas mais abaixo. É revelado um polipéptido do LT-GPCR compreen- 6 ΡΕ1276867 dendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° : 2 .

Uma forma de realização desta invenção é um método de rastreio de agentes que diminuam a actividade do LT-GPCR. 0 composto a testar é posto em contacto com o polipéptido do LT-GPCR contendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:2. É detectada a ligação entre o composto em teste e o polipéptido do LT-GPCR. 0 composto em teste que ligue ao polipéptido do LT-GPCR é então identificado como um potencial agente capaz de diminuir a actividade do LT-GPCR.

Uma outra forma de realização desta invenção é um método de rastreio de agentes que diminuam a actividade do LT-GPCR. 0 composto a testar é posto em contacto com um polinucleótido que codifica o polipéptido LT-GPCR, em que o polinucleótido compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada dentro do grupo que é constituído por: a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N°:l ou um polinucleótido cuja sequência diverge da sequência definida pela SEQ ID N°:l como consequência da degeneração do código genético. E detectada a ligação entre o composto em teste e o polinucleótido. 0 composto em teste que ligue ao polinucleótido do LT-GPCR é então identificado como um potencial agente capaz de diminuir a actividade do LT-GPCR. 0 agente pode funcionar por diminuição da quantidade do LT-GPCR através da interacção com o ARNm do LT-GPCR. 7 ΡΕ1276867

Uma outra forma de realização desta invenção é um método de rastreio de agentes que regulem a actividade do LT-GPCR. 0 composto a testar é posto em contacto com um polipéptido do LT-GPCR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:2. É detectada uma actividade do LT-GPCR do polipéptido. Um composto em teste que aumente a actividade do LT-GPCR do polipéptido relativamente à actividade do LT-GPCR na ausência do composto em teste é então identificada como um potencial agente capaz de aumentar a actividade do LT-GPCR. Um composto em teste que diminua a actividade do LT-GPCR do polipéptido relativamente à actividade do LT-GPCR na ausência do composto em teste é então identificada como um potencial agente capaz de diminuir a actividade do LT-GPCR.

Ainda uma outra forma de realização desta invenção é um método de rastreio de agentes que diminuam a actividade do LT-GPCR. 0 composto a testar é posto em contacto com o produto do polipéptido do LT-GPCR que compreende a sequência de nucleótidos seleccionada dentro do grupo que é constituído por: a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N°:l ou um polinucleótido cuja sequência diverge da sequência definida pela SEQ ID N°:l como consequência da degeneração do código genético. É detectada a ligação entre o composto em teste e o produto do LT-GPCR. Um composto em teste que ligue ao ΡΕ1276867 produto do LT-GPCR é então identificado como um potencial agente capaz de diminuir a actividade do LT-GPCR.

Ainda mais uma outra forma de realização desta invenção é um método de redução da actividade do LT-GPCR. Uma célula é posta em contacto com um reagente que liga especificamente a um polinucleótido que codifica o polipéptido do LT-GPCR ou o produto codificado pelo polinucleótido, em que o polinucleótido compreende uma sequência de nucleótidos seleccionada dentro do grupo que é constituído por: a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N°:l ou um polinucleótido cuja sequência diverge da sequência definida pela SEQ ID N°:l como consequência da degeneração do código genético. Deste modo é diminuída a actividade do LT-GPCR na célula.

Assim sendo, esta invenção fornece um receptor humano acoplado à proteína G tipo latrofilina que pode ser utilizado para se identificarem compostos em teste que possam actuar como agonistas ou antagonistas no local do receptor. 0 receptor humano acoplado à proteína G tipo latrofilina e fragmentos dele derivados também são úteis na produção de anticorpos específicos que possam bloquear o receptor e impedir eficazmente a ligação do ligando.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig.l apresenta a sequência de ADN que codifica o polipéptido do LT-GPCR. 9 ΡΕ1276867 A Fig.2 apresenta a sequência de aminoácidos deduzida a partir da sequência de ADN da Fig.l.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à utilização de um poli-nucleótido isolado que codifica o polipéptido LT-GPCR e que é seleccionado dentro do grupo que é constituído por: a) um polinucleótido que codifica o polipéptido LT-GPCR que compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N° : 2; b) um polinucleótido que compreende a sequência SEQ ID N° : 1; c) um polinucleótido cuja sequência diverge da sequência de polinucleótidos especificada em (a) e (b) como consequência da degeneração do código genético no rastreio de fármacos.

Ainda mais, foi descoberto pelo presente requerente que a proteína receptor humano acoplado à proteína G tipo latrofilina (LT-GPCR), particularmente a proteína humana LT-GPCR, pode ser utilizada em métodos terapêuticos para o tratamento de distúrbios que envolvam disfunções neurais ou endócrinas resultantes de exocitoses aberrantes. 0 LT-GPCR humano também pode ser utilizado em rastreios de agonistas e antagonistas do LT-GPCR. 10 ΡΕ1276867

Polipéptidos LT-GPCR

Os polipéptidos LT-GPCR de acordo com a presente invenção compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:2, uma porção de uma dessas sequências ou uma variante biologicamente activa delas derivada, como definido mais abaixo. Um polipéptido LT-GPCR da invenção pode, consequentemente, ser uma porção da proteína LT-GPCR, a totalidade da proteína LT-GPCR ou uma proteína de fusão compreendendo toda ou uma porção da proteína LT-GPCR. A sequência codificante da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:2 é apresentada na SEQ ID N°:l.

Variantes Biologicamente Activas

As variantes do polipéptido LT-GPCR que são biologicamente activas, isto é, que retêm a capacidade de ligar o ligando de modo a produzir um efeito biológico, tais como a formação do AMP cíclico, a mobilização de cálcio intracelularmente ou o metabolismo do fosfo-inositídeo, também são polipéptidos LT-GPCR. A percentagem de identidade entre uma putativa variante do polipéptido LT-GPCR e uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:2 é determinada utilizando-se o programa de alinhamentos Blast2 .

Variações na percentagem de identidade podem-se dever, por exemplo, a substituições de aminoácidos, a inserções ou a eliminações. As substituições de aminoácidos são definidas como sendo substituições de um aminoácido por 11 ΡΕ1276867 um outro aminoácido. Na natureza elas são conservadas quando o aminoácido que substitui tem propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes. Como exemplos de substituições conservadas existem as substituições de uma leucina por uma isoleucina ou valina, um aspartato por um glutamato ou uma trionina por uma serina.

As inserções ou eliminações de aminoácidos são alterações por ou dentro de uma sequência de aminoácidos. Tipicamente, estas caem normalmente no intervalo de cerca de 1 a 5 aminoácidos. Uma orientação acerca da determinação de qual resíduo de aminoácido pode ser substituído, inserido ou eliminado, sem se eliminar uma actividade biológica ou imunológica de um polipéptido LT-GPCR, pode ser encontrada utilizando-se programas computacionais bem conhecidos na especialidade, como por exemplo o software ADNSTAR. Pode-se determinar imediatamente se uma alteração de um aminoácido resulta num polipéptido LT-GPCR biologicamente activo através de um ensaio de ligação a um ligando ou conduzindo-se um ensaio funcional, tal como descrito, por exemplo, nos Exemplos específicos, mais a baixo.

Proteínas de Fusão

As proteínas de fusão podem compreender, pelo menos, 5, 6, 8, 10, 25 ou 50 ou mais aminoácidos seguidos da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:2. As proteínas de fusão são úteis para a produção de anticorpos 12 ΡΕ1276867 contra as sequências de aminoácidos do polipéptido LT-GPCR e para serem utilizadas em diversos sistemas de ensaio. Por exemplo, as proteinas de fusão podem ser utilizadas na identificação de proteinas que interagem com porções de um polipéptido LT-GPCR. Cromatografia de afinidade para proteinas ou ensaios de interacção proteína-proteína baseados em bibliotecas, tais como o sistema de dois-híbridos em levedura ou o sistema de "phage display", podem ser utilizados para este fim. Estes métodos são bem conhecidos no estado da especialidade e também podem ser utilizados em rastreios fármacos.

Uma proteína de fusão do polipéptido LT-GPCR é constituída por dois segmentos de polipéptido fundidos entre si através de uma ligação peptídica. 0 primeiro segmento polipeptídico compreende, pelo menos, 5, 6, 8, 10, 25 ou 50 ou mais aminoácidos seguidos da sequência SEQ ID N°:2 ou uma variante biologicamente activa, como por exemplo as descritas mais acima. O primeiro segmento polipeptídico também pode compreender uma proteína LT-GPCR completa. O segundo segmento polipeptídico pode ser uma proteína completa ou um fragmento de proteína. As proteínas normalmente utilizadas na construção de proteínas de fusão incluem a β-galactosidase, a β-glucoronidase, a proteína fluorescente verde (GFP, do inglês "green fluorescent protein"), proteínas autofluorescentes, incluindo a proteína fluorescente azul (BFP, do inglês "blue fluorescent 13 ΡΕ1276867 protein"), a glutationa-S-transferase (GST, do Inglês "glu-tathione-S-transferase"), a luciferase, a peroxidase de rábano (HRP, do Inglês "horseradish peroxidase") e a acetiltransferase do cloranfenicol (CAT, do Inglês "chloramphenicol acetyltransferase"). Adicionalmente, são utilizados nas construções das proteínas de fusão alvos para epítopos, incluindo alvos de histidina (His), alvos FLAG, alvos da hemaglutinina (HÁ) influenza, alvos Myc, alvos VSV-G e alvos tioredoxina (Trx). Outras construções de fusão podem incluir a proteína de ligação à maltose (MBP, do Inglês "maltose binding protein"), alvo-S, fusões do domínio de ligação ao ADN Lex a (DBD, do Inglês "ADN binding domain"), fusões do domínio de ligação ao ADN GAL4 e proteínas de fusão do vírus herpes simplex (HSV, do Inglês "herpes simplex vírus") BP16. Uma proteína de fusão também pode ser manipulada de modo a conter um local de clivagem localizado entre a sequência codificante do poli-péptido LT-GPCR e a sequência da proteína heteróloga, de modo a que o polipéptido LT-GPCR possa ser clivado e purificado isoladamente da metade heteróloga.

Uma proteína de fusão pode ser sintetizada quimicamente, como é de conhecimento na especialidade. Preferencialmente, uma proteína de fusão é produzida através da ligação covalente entre dois segmentos de polipéptidos ou através de métodos padrão da especialidade da biologia molecular. Os métodos do ADN recombinante podem ser utilizados para preparar as proteínas de fusão, por exemplo, através da construção de um ADN que contenha as 14 ΡΕ1276867 sequências codificantes seleccionadas da SEQ ID N°:l na mesma grelha de leitura de nucleótidos que codificam o segundo segmento de polipéptido, e da expressão dessa construção de ADN numa célula hospedeira, tal como é de conhecimento na especialidade. Estão à disposição vários Kits de construção de proteínas de fusão de companhias como a Promega Corporation (Madison, WI), a Stratagene (La

Jolla, CA), a CLONTECH (Mountain View, CA) , a Santa Cruz Biotechnoligy (Santa Cruz, CA) , a MBL InteARNtional Corporation (MIC; Watertown, MA) e a Quantum Biotechnoligies (Montreal, Canada; 1-888- -ADN-KITS).

Identificação de Espécies Homólogas

Espécies homólogas do polipéptido do LT-GPCR humano podem ser obtidas utilizando-se os polinucleótidos do polipéptido do LT-GPCR (descritos mais à frente) com o objectivo de se produzirem sondas adequadas ou sequências iniciadoras para serem utilizadas no rastreio de bibliotecas de expressão de ADNc de outras espécies, tais como do ratinho, do macaco, a levedura, identificando-se os ADNc que codificam polipéptidos homólogos do LT-GPCR, sendo a expressão do ADNc realizada segundo os métodos conhecidos na especialidade.

Polinucleótidos do LT-GPCR

Um polinucleótido do LT-GPCR pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla e compreende uma sequência codificante ou o complementar de uma sequência codificante 15 ΡΕ1276867 de um polipéptido do LT-GPCR. Uma sequência codificante para o polipéptido do LT-GPCR humano mostrado na SEQ ID N°:2, é o mostrado na SEQ ID N°:l. A percentagem de identidade de sequência entre as sequências de dois polinucleótidos é determinada utilizando-se programas de computador, tais como o ALIGN, que emprega algoritmo FASTA, utilizando um na relação um intervalo de busca com um limite de intervalo de abertura de -12 e um limite de intervalo de extensão de -2. As moléculas de ADN complementar (ADNc), espécies homólogas e variantes dos polinucleótidos do LT-GPCR que codificam polipéptidos do LT-GPCR biologicamente activos também são polinucleótidos do LT-GPCR.

Identificação dos Variantes e dos Homólogos dos Polinucleótidos do LT-GPCR

Os variantes e os homólogos dos polinucleótidos do LT-GPCR acima descritos também são polinucleótidos do LT-GPCR. Tipicamente, as sequências de polinucleótidos homólogas ao LT-GPCR podem ser identificadas por hibridação dos polinucleótidos candidatos com os polinucleótidos conhecidos do LT-GPCR, sob condições de adstringência, tal como é conhecido na especialidade. Por exemplo, utilizando as seguintes condições de lavagem - 2x SSC (0,3M NaCl, 0,03M citrato sódio, pH 7,0), 0,1% SDS, à temperatura ambiente, duas vezes, durante 30 minutos cada; a seguir, 2x SSC, 0,1% SDS, 50°C, uma vez, durante 30 minutos; e a seguir, 2x SSC, à temperatura ambiente, duas vezes, durante 16 ΡΕ1276867 10 minutos cada - as sequências homólogas podem ser identificadas como contendo no máximo cerca de 25-30% de pares de bases não emparelhadas. Mais preferivelmente, as cadeias homólogas de ácidos nucleicos contêm 15-25% de pares de bases não emparelhadas, ainda de maior preferência, 5-15% de pares de bases não emparelhadas.

As espécies homólogas aos polinucleótidos do LT-GPCR reveladas neste documento também pode ser identificadas através da produção de sondas ou de sequências iniciadoras adequadas e através do rastreio de bibliotecas de expressão de ADNc de outras espécies, tais como do ratinho, do macaco ou da levedura. Os variantes humanos dos polinucleótidos do LT-GPCR podem ser identificados, por exemplo, através do rastreio de bibliotecas de expressão de ADNc humano. É do conhecimento geral que a Tm de uma cadeia dupla de ADN diminui cerca de 1-1,5°C com cada 1% de diminuição em homologia (Bonner et al., J. Mol.Biol. 81, 123 (1973)). Os variantes humanos dos polinucleótidos do LT-GPCR ou os polinucleótidos do LT-GPCR de outras espécies podem por conseguinte ser identificados através da hibridação de um putativo polinucleótido homólogo do LT-GPCR com um polinucleótido contendo a sequência de nucleótidos da SEQ ID N°:l ou a complementar dela derivada, para se formar um híbrido de teste. A temperatura de fusão do híbrido de teste é comparada com a temperatura de fusão de um híbrido constituído por polinucleótidos do LT-GPCR contendo uma complementaridade perfeita com as sequências de nucleótidos, calculando-se assim o número ou percentagem 17 ΡΕ1276867 de pares de bases nao emparelhadas dentro do híbrido de teste.

As sequência de nucleótidos que hibridam com os polinucleótidos do LT-GPCR ou com os seus complementares após uma hibridação e/ou condições de lavagem adstringentes também são polinucleótidos do LT-GPCR. As condições de lavagem adstringentes são bem conhecidas e bem compreendidas na especialidade e estão reveladas, por exemplo, em Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, nas páginas 9.50-9.51.

Tipicamente, para as condições de lavagem adstringentes deve ser escolhida uma combinação de temperatura e de concentração de sais que seja de aproximadamente de 12-20°C abaixo da Tm calculada para o híbrido em estudo. A Tm de um híbrido entre um polinucleótido do LT-GPCR contendo a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N°:l, ou a complementar dela derivada e uma sequência de nucleótidos que é pelo menos 50, preferencialmente de cerca de 75, 90, 96 ou 98% idêntica a uma dessas sequências de nucleótidos, pode ser calculada, por exemplo, utilizando a equação de Bolton andMcCarthy, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 48, 1390 (1962):

Tm=81,5°C-16,6 (log10 [Na+] ) +0, 41 (%G+C) -0,63 (%forma-mida)-600/1) , onde l=tamanho do híbrido em pares de bases. As condições de lavagem adstringentes incluem, por exemplo, 4x SSC a 65°C ou 50% de formamida, 4x SSC, a 42°C ou 0,5x 18 ΡΕ1276867 SSC, 0,1%SD, a 65°C. As condiçoes de lavagem altamente adstringentes incluem, por exemplo, 0,2x SSC, a 65°C.

Preparação dos Polinucleótidos do LT-GPCR

Um polinucleótido do LT-GPCR de origem natural pode ser isolado, livre de outros componentes celulares, tais como componentes de membrana, proteínas e lípidos. Os polinucleótidos podem ser formados por uma célula e serem isolados utilizando-se técnicas padrão de purificação de ácidos nucleicos ou ser sintetizados utilizando-se técnicas de amplificação, como por exemplo a "polimerase chain reaction" (PCR) ou utilizando-se um sintetizador automático. Os métodos para o isolamento de polinucleótidos são métodos de rotina e são bem conhecidos na especialidade. Qualquer uma dessas técnicas utilizadas para a obtenção de um polinucleótido também pode ser utilizada para se obterem polinucleótidos do LT-GPCR isolados. Por exemplo, as enzimas de restrição e as sondas podem ser utilizadas para o isolamento de fragmentos de polinucleótidos que compreendam as sequências de nucleótidos do LT-GPCR. Os polinucleótidos isolados encontram-se em preparações que são livres ou pelo menos 70, 80 ou90% livres de outras moléculas.

As moléculas de ADNc do LT-GPCR podem ser sintetizadas através de técnicas padrão de biologia molecular, utilizando-se como molde o ARNm do LT-GPCR. Depois disso, as moléculas de ADNc do LT-GPCR podem ser replicadas, usando-se para tal técnicas de biologia molecular bem 19 ΡΕ1276867 conhecidas na especialidade e reveladas em manuais, tais como Sambrook et al. (1989). Uma técnica de amplificação, como por exemplo o PCR, pode ser utilizada para se obterem cópias extra dos polinucleótidos da invenção, utilizando-se tanto ADN genómico humano, como o ADNc como moldes.

Alternativamente, podem ser utilizadas técnicas de sintese química para a síntese dos polinucleótidos do LT-GPCR. A degenerescência do código genético permite que sejam sintetizadas sequências de nucleótidos alternativas, que irão codificar um polipéptido do LT-GPCR com, por exemplo, uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:2 ou uma variante biologicamente activa dela derivada.

Ampliação dos Polinucleótidos do LT-GPCR A sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID N°:l, ou a sua complementar, podem ser utilizadas para a identificação do gene completo da qual derivaram. Por exemplo, sequências de nucleótidos adjacentes seleccionadas da sequência complementar da SEQ ID N°:l podem ser traduzidas pelo método da tradução com uso de "nicks", ou marcadas num dos seus terminais utilizando-se o 32P, com a utilização da cínase de polinucleótidos, utilizando-se os métodos de marcação conhecidos por aqueles com perícia na especialidade (BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., eds., Elsevier Press, N.Y., 1986). Por exemplo, uma biblioteca lambda preparada a partir de tecido humano pode ser rastreada directamente com as sequências de interesse 20 ΡΕ1276867 marcadas ou a biblioteca pode ser convertida congregando-se em pBluescript (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Calif. 92037), de modo a se facilitar o rastreio das colónias bacterianas (ver em Sambrook et al., 1989, pg. 1.20) .

Ambos os métodos são bem conhecidos na especialidade. Resumidamente, filtros com as colónias de bactérias contendo a biblioteca em pBluescript ou crescimento confluente com placas de lambda são desnaturados e o ADN é fixado aos filtros. Os filtros são hibridizados com a sonda marcada, utilizando-se as condições de hibridação descritas por Davis et al., 1986. As sequências parciais, clonadas em lambda ou em pBluescript, podem ser utilizadas como controlos positivos para se estimar a ligação de fundo e para se ajustar as adstringências de hibridação e de lavagem necessárias para uma identificação precisa dos clones. Os autoradiogramas resultantes são comparados com os duplicados das placas de colónias ou das placas; cada ponto corresponde a uma colónia ou placa positiva. As colónias ou placas são seleccionadas e expandidas e o ADN é isolado das colónias para uma posterior análise e sequenciação.

Os clones positivos de ADNc são analisados para se determinar a quantidade adicional de sequência que contêm, fazendo-se um PCR utilizando-se numa das sequências iniciadoras a sequência parcial e na outra sequência iniciadora o vector. Os clones que contenham um produto de 21 ΡΕ1276867 PCR vector-inserção maior que a sequência parcial original são analisados por restrição enzimática e por sequenciação de ADN, para se determinar se estas contêm uma inserção do mesmo tamanho ou de tamanho similar ao tamanho do ARNm determinado através de uma análise por Northern blot.

Uma vez que um ou mais dos clones de ADNc que se sobrepõe são identificados, pode ser determinada a sequência completa dos clones, por exemplo, após digestão com a exonuclease III (McCombie et al., Methods 3, 33-40, 1991). São originados uma série de clones de eliminação, sendo cada um deles sequenciado. As sequências sobrepostas resultantes são montadas numa só sequência contígua de elevada redundância (normalmente de três a cinco sequências sobrepostas em cada posição de nucleótido), resultando numa sequência final bastante exacta. a região conhecida.

Podem ser utilizados vários métodos baseados na PCR para a extensão das sequências de ácidos nucleicos que codificam as porções reveladas do LT-GPCR humano para a detecção de sequências que estejam a montante, como por exemplo de promotores e de elementos reguladores. Por exemplo, a PCR de locais de restrição utiliza sequências iniciadoras universais para se procurarem sequências desconhecidas adjacentes a locais conhecidos (Sarkar, PCR Methods Applic. 2, 318-322, 1993). Primeiro o ADN genómico é amplificado na presença de uma sequência iniciadora para uma sequência de ligação e de uma sequência iniciadora específica para a região conhecida. As sequências 22 ΡΕ1276867 amplificadas são então sujeitas a um segundo ciclo de PCR, utilizando-se a mesma sequência iniciadora da ligação e uma outra seguência iniciadora especifica, interno relativamente à primeira. Os produtos de cada ciclo de PCR são transcritos com uma polimerase de ARN adequada e sequen-ciados, utilizando-se a transcriptase reversa. A PCR inversa pode ser utilizada para amplificar ou aumentar seguências utilizando-se seguências iniciadoras divergentes, com base numa região conhecida (Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16, 8186, 1988). As seguências iniciadoras podem ser desenhadas utilizando-se os softwares comercialmente disponíveis, como por exemplo o software OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), sendo estes de 22- -30 nucleótidos em comprimento, tendo um conteúdo em GC de 50% ou mais e emparelhando com a sequência alvo a temperaturas de cerca de 68-72°C. 0 método utiliza várias enzimas de restrição na produção de um fragmento adequado de uma região conhecida de um gene. 0 fragmento é então circularizado através de ligações intramoleculares e utilizado como molde na PCR.

Um outro método que também pode ser utilizado é a PCR de Captura, que envolve a amplificação por PCR de fragmentos de ADN adjacentes a uma sequência conhecida em cromossomas artificiais de humanos ou de levedura (La-gerstrom et al. PCR Methods Applic., 1, 111-119, 1991). Neste método, também podem ser utilizadas múltiplas digestões com enzimas de restrição e ligações para se colocar 23 ΡΕ1276867 uma sequência manipulada de cadeia dupla de ADN num fragmento desconhecido da molécula de ADN antes de se executar a PCR.

Um outro método que também pode ser utilizado para se procurarem sequências desconhecidas é o de Parker et al., Nucleic Acids Res. 19, 3055-3060, 1991. Adicio nalmente, a PCR, as sequências iniciadoras de tipo "nested" e bibliotecas PROMOTERFINDER (CLONTECH, Paio Alto, Calif.) podem ser utilizadas para se "percorrer" o ADN genómico (CLONTECH, Paio Alto, Calif.). Este processo evita a necessidade de fazer o rastreio de bibliotecas e é útil na procura de junções intrão/exão.

Quando se está a fazer o rastreio para ADNc de cadeia completa, é preferível que se utilizem bibliotecas que tenham sido seleccionadas pelo seu tamanho para incluírem ADNc maiores. São preferíveis as bibliotecas que foram construídas com sequências iniciadoras aleatórias, dado que estas irão incluir mais sequências contendo as regiões 5' dos genes. A utilização de uma biblioteca que foi construída com sequências iniciadoras aleatórias pode ser especialmente preferível para situações nas quais uma biblioteca de oligos d(T) não origine ADNc de cadeia completa. As bibliotecas genómicas podem ser úteis para a amplificação de sequências das regiões reguladoras não transcritas a 5'.

Para a análise do tamanho ou para a confirmação 24 ΡΕ1276867 da sequência de nucleótidos da PCR ou dos produtos da sequenciação podem ser utilizados os sistemas de electro-forese por capilaridade comercialmente disponíveis. Por exemplo, a sequenciação capilar pode utilizar polímeros capazes de permitir o fluxo para a separação electroforé-tica, quatro corantes fluorescentes diferentes (um para cada nucleótido) que são activados por laser e a detecção dos comprimentos de onda emitidos ser feita através de uma câmara com um dispositivo associado à carga. A produção/in-tensidade de luz pode ser convertida em sinais eléctricos com a utilização do software apropriado (por exemplo, GENOTYPER e o Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer) e, todo o processo, desde o carregar das amostras, até à análise por computador e a apresentação da informação electrónica, pode ser controlada através do computador. A electroforese por capilaridade é especialmente preferível para a sequenciação de pequenos pedaços de ADN que podem estar presentes em quantidades limitadas numa amostra em particular.

Obtenção dos Polipéptidos do LT-GPCR

Os polipéptidos do LT-GPCR podem ser obtidos, por exemplo, por purificação de células humanas, por expressão dos polinucleótidos do LT-GPCR ou através de síntese química directa.

Purificação das Proteínas

Os polipéptidos do LT-GPCR podem ser purificados a partir de um qualquer tipo de célula humana que expresse 25 ΡΕ1276867 o receptor, incluindo células hospedeiras que tenham sido transfectadas com os polinucleótidos do LT-GPCR. Os testículos de adulto são uma fonte particularmente útil dos polipéptidos do LT-GPCR. Um polipéptido do LT-GPCR purificado é separado dos outros compostos que normalmente se associam com o polipéptido do LT-GPCR na célula, como por exemplo determinadas proteínas, hidratos de carbono e lípidos, utilizando-se métodos bem conhecidos na especialidade. Tais métodos incluem, mas não se limitam a, cromatografia de exclusão molecular, fraccionamento com sulfato de amónio, cromatografia de troca iónica, cromatograf ia de afinidade e géis preparativos de electroforese. 0 polipéptido do LT-GPCR pode ser convenientemente isolado na forma de um complexo com a sua proteína G associada, tal como descrito mais abaixo nos exemplos específicos. Uma preparação dos polipéptidos do LT-GPCR purificados é, pelo menos, 80% pura; preferencialmente, as preparações são 90%, 95% ou 99% puras. A pureza das preparações pode ser determinada por um qualquer método conhecido na especialidade, como por exemplo a electro-forese em géis de SDS-poliacrilamida.

Expressão dos Polinucleótidos do LT-GPCR

Para expressar um polipéptido do LT-GPCR, pode-se inserir o polinucleótido do LT-GPCR num vector de expressão que contenha os elementos necessários para a transcrição e a tradução da sequência codificante introduzida. Podem ser 26 ΡΕ1276867 utilizados os métodos bem conhecidos para aqueles com perícia na especialidade para a construção dos vectores de expressão contendo as sequências codificantes dos poli-péptidos do LT-GPCR e os elementos de controlo apropriados para a transcrição e a tradução. Estes métodos incluem técnicas do ADN recombinante in vitro, técnicas de síntese e recombinação genética in vivo. Tais técnicas estão descritas em, por exemplo, Sambrook et al. (1989) e em Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1989.

Podem ser utilizados uma variedade de sistemas de vector de expressão/hospedeiro para conter e expressar as sequências que codificam o polipéptido do LT-GPCR. Estes incluem, mas não se limitam a, microorganismos, tais como bactérias transformadas com bacteriófagos recombinantes, plasmídeos, vectores de expressão de ADN cosmídico; leveduras transformadas com vectores de expressão de levedura, sistemas de células de insectos infectadas com vectores de expressão de vírus (por exemplo, o baculovírus), sistemas de células vegetais transformadas com vectores de expressão de vírus [por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV (do Inglês, "cauliflower mosaic vírus"); o vírus do mosaico do tabaco, TMV (do Inglês, "tobacco mosaic vírus")} ou com vectores de expressão bacterianos (por exemplo, Ti ou os plasmídeos pBR322) ou sistemas de células humanas.

Os elementos de controlo ou as sequências reguladoras são aquelas regiões não-traduziveís do vector - se- 27 ΡΕ1276867 quências potenciadoras, promotores, regiões não-traduziveís a 5'e a 3'- que interagem com as proteinas do hospedeiro, de modo a levarem a cabo a transcrição e a tradução. Tais elementos podem variar na sua potência e na sua especificidade. Dependendo do sistema de vector e de hospedeiro utilizado, pode ser utilizado um número qualquer adequado de elementos de transcrição e de tradução, incluindo promotores constitutivos e indutiveis. Por exemplo, quando clonados em sistema bacterianos, podem ser utilizados os promotores indutiveis, tais como o promotor híbrido LacZ do fagemídeo BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) ou o plasmídeo pSPORTl (Life Technologies) e seus semelhantes. 0 promotor da poliedrina do baculovírus pode ser utilizado em células de insectos. Os promotores e as sequências potenciadoras derivados dos genomas de células vegetais (por exemplo, choque térmico, RUBISCO e genes de proteínas de armazenamento) ou de vírus de plantas (promotores virais ou sequências "leader") podem ser clonados no vector. Em sistemas celulares de mamífero, os promotores dos genes de mamífero ou dos vírus dos mamíferos são os preferíveis. Se for necessário criar uma linha celular que contenha cópias múltiplas de uma sequência de nucleótidos que codifique o polipéptido do LT-GPCR, podem ser utilizados os vectores baseados no SV40 ou no EBV com um marcador de selecção apropriado.

Sistemas de Expressão Bacterianos e de Levedura

Nos sistemas bacterianos, podem ser seleccionados 28 ΡΕ1276867 uma variedade de vectores de expressão, dependendo do tipo de utilização pretendida para o polipéptido do LT-GPCR. Por exemplo, quando é necessária uma grande quantidade de polipéptido do LT-GPCR para a indução de anticorpos, podem ser utilizados os vectores que dirigem a expressão de elevados níveis da proteína de fusão, que serão facilmente purificadas. Tais vectores incluem, mas não estão limitados a, vectores de clonagem e de expressão multifuncionais em E. coli, como por exemplo o BLUESCRIPT (Stratagene) . Num vector BLUESCRIPT, uma sequência que codifique o polipéptido do LT-GPCR pode ser ligada no vector, na mesma grelha de leitura das sequências da Met do terminal amino e os 7 resíduos subsequentes da β-galactosidase, de modo a que seja produzida uma proteína híbrida. Os vectores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264, 5503-5509, 1989) ou os vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) também podem ser utilizados para expressar polipéptidos externos, na forma de proteínas de fusão com a glutationa-S-transferase (GST, do Inglês "Glutathione-S-transferase). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir dos lisados celulares por adsorção a esferas de agarose com glutationa, seguido De uma eluição na presença de glutationa livre. As proteínas produzidas através de tais sistemas podem ser desenhadas de modo a conterem locais de clivagem para a heparina, trombina ou a protease do factor Xa, de modo que o polipéptido clonado de interesse possa ser libertado da metade GST quando se desejar. 29 ΡΕ1276867

Na levedura Saccharomyces cerevisiae, podem ser utilizados diversos vectores contendo promotores constitutivos ou indutiveis tais como, o factor alfa, a álcool oxidase e a PGH. Para revisão, ver Ausubel et ai. (1989) e Grant et al., Methods Enzymol. 153, 516-544, 1987.

Sistemas de Expressão de Plantas e de Insectos

Se forem utilizados vectores de expressão de plantas, a expressão das sequências que codificam os poli-péptidos do LT-GPCR pode ser levada a cabo por qualquer um de entre muitos promotores. Por exemplo, promotores virais, tais como os promotores 35S e o 19S do CaMV podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com a sequência "leader" ómega do TMV (Takamatsu, EMBO J. 6, 307-311, 1987). Alternativamente, podem ser utilizados promotores de plantas, como por exemplo a pequena subunidade da RUBISCO ou promotores de choque térmico (Coruzzi et al., EMBO J. 3, 1671-1680, 1984; Broglie et al., Science 224, 838-843, 1984; Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105, 1991) . Estas construções podem ser introduzidas nas células das plantas através da transformação directa de ADN ou através de transfecção mediada por agentes patogénicos. Tais técnicas estão descritas num número de publicações geralmente disponíveis (por exemplo, Hobbs and Murray, em MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, MacGraw Hill, New York, N.Y., pp. 191-196, 1992). Também pode ser utilizado um sistema de insecto para a expressão de um polipéptido do LT-GPCR. Por exemplo, num desses sistemas, o 30 ΡΕ1276867 vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV, do Inglês "Autographa californica nuclear polyhedrosis vírus") é utilizado como vector para expressar genes externos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. As sequências que codificam os poli-péptidos do LT-GPCR podem ser clonadas numa região não essencial do vírus, como por exemplo o gene da poliedrina, e ser colocadas sob o controlo do promotor da poliedrina» Uma inserção bem sucedida dos polipéptidos do LT-GPCR irá inactivar o gene da poliedrina e irá produzir um vírus recombinante sem a proteína do envelope. Os vírus re-combinantes podem então ser utilizados para infectar células de S. frugiperda ou de larvas de Trichoplusia nas quais os polipéptidos do LT-GPCR podem ser expressos (Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sei. 91, 3224-3221, 1994) .

Sistemas de Expressão de Mamíferos

Podem ser utilizados em células hospedeiras de mamíferos, para a expressão dos polipéptidos do LT-GPCR, uma variedade de sistemas de expressão baseados nos sistemas virais. Por exemplo, se é utilizado um adenovírus como um vector de expressão, as sequências que codificam os polipéptidos do LT-GPCR podem ser ligadas a um complexo de transcrição/tradução do adenovírus contendo o promotor do adenovírus e a sequência "leader" tripartida. A inserção numa região EI ou E3 não essencial do genoma do vírus pode ser utilizada para se obter um vírus viável que é capaz de 31 ΡΕ1276867 expressar um polipéptido do LT-GPCR em células hospedeiras infectadas (Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. 81, 3655-3659, 1984) . Se for desejável, podem ser utilizadas sequências potenciadoras da transcrição, tais como a sequência potenciadora do vírus do sarcoma de Rous (RSV, do Inglês "Rous sarcoma vírus"), para se aumentar a expressão nas células hospedeiras de mamífero.

Os cromossomas artificiais humanos (HACs, do Inglês "human artificial chromosomes") também podem ser utilizados para o fornecimento de fragmentos de ADN maiores do que aqueles que podem ser contidos e expressos pelos plasmídeos. Os HACs de 6M a 10M são construídos e postos em células através dos métodos convencionais de libertação controlada (por exemplo, lipossomas, polímeros policatió-nicos amino ou vesículas).

Também podem ser utilizados sinais específicos de iniciação para se obter uma translação das sequências que codificam os polipéptidos do LT-GPCR mais eficiente. Tais sinais incluem o codão de iniciação ATG e as sequências adjacentes. Nos casos em que as sequências que codificam o polipéptido do LT-GPCR, o seu codão de iniciação, e as sequências a montante são inseridos num vector de expressão apropriado, não serão necessários sinais adicionais de controlo da transcrição e da tradução. Contudo, nos casos em que só é inserida a sequência codificante ou um fragmento dela derivado, devem ser fornecidos sinais exógenos de controlo da tradução (incluindo o codão de iniciação 32 ΡΕ1276867 ATG). 0 codão de iniciação deve estar na grelha de leitura correcta de modo a garantir a tradução da inserção na sua totalidade. Os elementos de tradução exógenos e os codões de iniciação podem ser de diversas origens, tanto naturais como sintéticas. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de sequências potenciadoras que são as adequadas para um determinado sistema celular que esteja a ser utilizado (ver em Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20, 125-162, 1994). Células Hospedeiras

Uma estirpe de células hospedeiras pode ser escolhida pela sua capacidade de modular a expressão das sequências inseridas ou de processar do modo desejado o polipéptido do LT-GPCR que foi expresso. Tais modificações do polipéptido incluem, mas não se limitam a, acetilações, carboxilações, glicosilações, fosforilações, lipidações e acilações. 0 processamento pós-tradução que cliva uma forma "prepro" do polipéptido também pode ser utilizado para facilitar a inserção correcta, o enrolamento e/ou a função. Diversas células hospedeiras que contêm uma maquinaria celular especifica e mecanismos caracteristicos para as actividades pós-tradução (por exemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 e WI38), estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) podem ser escolhidas para assegurarem a correcta modificação e o processamento da proteína estranha. 33 ΡΕ1276867 A expressão estável é a preferível para a produção de proteínas recombinantes a níveis elevados e a longo prazo. Por exemplo, as linhas celulares que expressam estavelmente os polipéptidos do LT-GPCR podem ser transformadas utilizando-se vectores de expressão que possam conter origens de replicação virais e/ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador de selecção no mesmo vector ou num vector separado. Após a introdução do vector, as células são deixadas a crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido antes de serem mudadas para um meio selectivo. 0 objectivo do marcador de selecção é o de conferir resistência a um tipo de selecção e a sua presença permite o crescimento e a recuperação das células que expressam com sucesso as sequências do LT-GPCR introduzidas. Os clones resistentes das células transformadas estavelmente podem ser proliferados utilizando-se técnicas de cultura de tecidos apropriadas para aquele tipo de célula. Ver, por exemplo em, ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney, ed., 1986.

Pode ser utilizado um número diverso de sistemas de selecção para a recuperação das linhas celulares transformadas.

Estes incluem, mas não se limitam a, os genes da cínase da timidina do vírus do herpes simplex (Wigler et ai., Cell 11, 223-32, 1977) e da fosforribosiltransferase da adenina (Lowy et al., Cell 22, 817-23, 1980) que podem ser utilizados em células tk~ ou aprt~, respectivamente. Como base para a selecção também podem ser utilizadas as 34 ΡΕ1276867 resistências a antimetabolitos, a antibióticos ou a herbicidas. Por exemplo, o dhfr confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sei 77, 3567-70, 1980), o npt confere resistência aos aminoglicosídeos, à neomicina e ao G-418 (Colbere-Garapin ai., J. Mol. Biol. 150, 1-14, 1981) e o ais e o pat conferem resistência ao "clhorsulfuron" e à fosfinotricina acetiltransferase, respectivamente (Murray, 1992, supra). Já foram descritos outros genes de selecção. Por exemplo, o trpB permite que as células utilizem o índole em vez do triptofano ou o hisD que permite que as células utilizem o histinol em vez da histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei 85, 8047-51, 1988). Marcadores de visibilidade, tais como as antocianinas, a β-glucoronidase e o seu substrato, a GUS e a luciferase e o seu substrato, a luciferina podem ser utilizados para a identificação dos transformantes e para a quantificação da quantidade de expressão de proteína transiente ou estável atribuída a um sistema específico de vector (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995) .

Detecção da Expressão dos Polipéptidos do LT-GPCR

Apesar da presença da expressão do gene marcador sugerir que o polinucleótido do LT-GPCR também está presente, a sua presença e expressão poderá ter de ser confirmada. Por exemplo, se uma sequência que codifica um polipéptido do LT-GPCR é inserida dentro da sequência de um gene marcador, as células transformadas que contêm as 35 ΡΕ1276867 sequências que codificam um polipéptido do LT-GPCR podem ser identificadas pela ausência da função do gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser colocado junto com uma sequência que codifica um polipéptido do LT-GPCR sob o controlo de um único promotor. A expressão do gene marcador em resposta à indução ou à selecção, normalmente indica a expressão do polinucleótido do LT-GPCR.

Alternativamente, uma célula hospedeira que contenha um polinucleótido do LT-GPCR e que expresse um polipéptido do LT-GPCR pode ser identificada através de uma série de procedimentos conhecidos por aqueles com perícia na especialidade. Estes procedimentos incluem, mas não se limitam a, hibridações ADN-ADN e ADN-ARN e bioensaios de proteínas ou técnicas de imunoensaios, que incluem tecnologias baseadas em membranas, soluções ou "chips" para a detecção e/ou quantificação do ácido nucleico ou da proteína. Por exemplo, a presença de uma sequência de um polinucleótido que codifique um polipéptido do LT-GPCR pode ser detectada através de hibridações ADN-ADN ou ADN-ARN ou da amplificação utilizando-se sondas ou fragmentos ou fragmentos de polinucleótidos que codifiquem um polipéptido do LT-GPCR. Ensaios baseados na amplificação de ácidos nucleicos envolvem a utilização de oligonucleótidos seleccionados das sequências que codificam um polipéptido do LT-GPCR para a detecção dos transformantes que contenham um polinucleótido do LT-GPCR.

Sao conhecidos na especialidade uma variedade de 36 ΡΕ1276867 protocolos para a detecção e a medição da expressão de um polipéptido do LT-GPCR, utilizando-se anticorpos específicos para o polipéptido, tanto monoclonais como poli-clonais. Como exemplos incluem-se o ensaio imunoadsorvente associado a enzimas (ELISA, do Inglês "enzyme-linked immunosorbent assay"), o radioimunoensaio (RIA, do Inglês "radioimmunoassay") e a separação celular activada por fluorescência (FACS, do Inglês "fluorescence activated cell sorting"). Pode ser utilizado um imunoensaio duplo com base monoclonal, utilizando-se anticorpos monoclonais reactivos para dois epítopos, não interferindo estes entre si, dum polipéptido do LT-GPCR ou pode ser empregue um ensaio de ligação competitiva. Estes e outros ensaios estão descritos em Hampton et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990) e em Maddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1216, 1983).

Uma grande variedade de marcadores e técnicas de conjugação são conhecidos por aqueles com perícia na especialidade e podem ser utilizados em diversos ensaios com ácidos nucleicos e com aminoácidos. Os meios para a produção de sondas marcadas para hibridação ou para PCR para a detecção de sequências relacionadas com os polinucleótidos que codificam os polipéptidos do LT-GPCR incluem a marcação de oligonucleótidos, a tradução utilizando-se "nicks", a marcação terminal ou a amplificação através de PCR utilizando-se um nucleótido marcado. Alternativamente, as sequências que codificam um polipéptido do LT-GPCR podem ser clonadas num vector para se produzir uma sonda de ARNm. 37 ΡΕ1276867

Esses vectores são conhecidos na especialidade, estão disponíveis comercialmente e podem ser utilizados para a síntese in vitro de sondas de ARN através da adição de nucleótidos marcados e uma polimerase de ARN apropriada, como por exemplo a T7, a T3 ou a SP6. Estes procedimentos podem ser levados a cabo utilizando-se uma variedade de kits disponíveis comercialmente (Amersham Pharmacia Biotech, Promega e US Biochemical). Moléculas repórter ou marcadores adequados que podem ser utilizados para facilitarem a detecção incluem os radionucleótidos, as enzimas e agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromo-génicos, também como substratos, cofactores, inibidores, partículas magnéticas e seus semelhantes.

Expressão e Purificação dos Polipéptidos do LT-GPCR Células hospedeiras transformadas com sequências de nucleótidos que codificam um polipéptido do LT-GPCR podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão e a recuperação do polipéptido a partir da cultura de células. 0 polipéptido produzido por uma célula transformada pode ser secretado ou pode ficar contido intracelularmente, dependendo da sequência e/ou do vector utilizado. Aqueles com perícia na especialidade irão perceber que, os vectores de expressão contendo os polinucleótidos que codificam polipéptidos do LT-GPCR podem ser desenhados de modo a conterem sequências sinal que direccionam a secreção de polipéptidos solúveis do LT-GPCR através de membranas celulares procariotas ou eucariotas ou 38 ΡΕ1276867 que direccionam a inserção na membrana de um polipéptido do LT-GPCR ligado à membrana.

Tal como discutido anteriormente, podem ser utilizadas outras construções para ligarem uma sequência que codifica um polipéptido do LT-GPCR a uma sequência de nucleótidos que codifica um dominio do polipéptido que irá facilitar a purificação das proteínas solúveis. Tais domínios que facilitam a purificação incluem, mas não estão limitados a, péptidos que quelatam metais, tais como os módulos de histidina-triptofano, que permitem a purificação utilizando-se metais imobilizados, domínios da proteína A, que permitem a purificação utilizando-se imunoglobulinas imobilizadas e os domínios utilizados nos sistemas de purificação de extenção/afinidade com FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). A inclusão de sequências de ligação cliváveis, tais como aquelas específicas para o factor Xa ou a enterocinase (Invitrogen, San Diego, CA), entre o domínio de purificação e o polipéptido do LT-GPCR também podem ser utilizadas com a finalidade de facilitarem a purificação. Um desses vectores de expressão proporciona a expressão de uma proteína de fusão contendo um polipéptido do LT-GPCR e 6 resíduos de histidina antecedendo um local de clivagem para a tioredoxina ou uma enterocinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação por IMAC ("immobilized metal ion affinity chromatography", tal como descrito em Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992), enquanto que o local de clivagem para a enterocinase fornece um meio de purificação do polipéptido do LT-GPCR a 39 ΡΕ1276867 partir da proteína de fusão. Os vectores que contêm as proteínas de fusão estão revelados em Kroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993. Síntese Química

As sequências que codificam um polipéptido do LT-GPCR podem ser sintetizadas, no seu todo ou em parte, utilizando-se métodos químicos bem conhecidos na especialidade (ver em Caruthers et al., Nucl. Acids Res Symp. Ser. 215-223, 1980; Horn et al., Nucl. Acids Res

Symp. Ser. 225-232, 1980). Alternativamente, um polipéptido do LT-GPCR pode ele mesmo ser produzido utilizando-se métodos químicos para a síntese da sua sequência de aminoácidos, por exemplo através da síntese directa do péptido utilizando-se técnicas de fase-sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Roberge et al., Science 269, 202-204, 1995). A síntese de proteínas pode ser executada utilizando-se técnicas manuais ou através da automação. A síntese automatizada pode ser conseguida, por exemplo, utilizando-se um Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Opcionalmente, os fragmentos dos polipéptidos do LT-GPCR podem ser sintetizados separadamente e depois combinados utilizando-se métodos químicos para a produção da molécula completa.

Os péptidos sintetizados de novo podem ser purificados substancialmente através de uma cromatografia líquida de alta pressão (por exemplo, Creighton, PROTEINS: 40 ΡΕ1276867 STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co. , New York, N.Y., 1983). A composição de um polipéptido do LT-GPCR sintético pode ser confirmada através da análise aos seus aminoácidos ou através de uma sequenciação (por exemplo, utilizando-se o procedimento de degradação de Edman; ver em Creighton, supra). Adicionalmente, qualquer porção da sequência de aminoácidos do polipéptido do LT-GPCR pode ser alterada durante a síntese directa e/ou combinada utilizando-se métodos químicos com sequências de outras proteínas para a produção de um polipéptido diferente ou uma proteína de fusão.

Produção de Polipéptidos do LT-GPCR Alterados

Aqueles com perícia na especialidade irão perceber que pode ser vantajosa a produção de sequências de nucleótidos que codificam um polipéptido do LT-GPCR que contenham codões que não têm ocorrência natural. Por exemplo, podem ser seleccionados os codões de preferência de um hospedeiro procariota ou eucariota em particular de modo a se aumentar a taxa de expressão da proteína ou de se produzir um transcrito de ARN contendo propriedades desejáveis, tais como um tempo de semi-vida que seja superior àquele do transcrito produzido a partir da sequência de ocorrência natural.

As sequências de nucleótidos reveladas nesta patente podem ser modificadas utilizando-se métodos conhecidos na especialidade de uma maneira geral com o 41 ΡΕ1276867 objectivo de se alterarem as sequências que codificam um polipéptido do LT-GPCR por uma variedade de razões, incluindo, mas não se limitando a, alterações que modifiquem a clonagem, o processamento e/ou a expressão do polipéptido ou do produto do ARNm. A troca do ADN através da fragmentação ao acaso e a montagem de novo, por PCR, dos fragmentos dos genes e dos oligonucleótidos sintéticos pode ser utilizada para se modificarem as sequências de nucleótidos. Por exemplo, a mutagénese dirigida pode ser utilizada para a inserção de novos locais de restrição, para a alteração dos padrões de glicosilação, para a modificação da preferência de codões, para a produção de variantes de "splicing", para a introdução de mutações e assim por adiante.

Anticorpos

Pode ser produzido para se ligar especificamente a um epitopo de um polipéptido do LT-GPCR um qualquer tipo de anticorpo do conhecimento da especialidade. 0 "anticorpo" tal como aqui utilizado inclui moléculas de imunoglobulinas intactas, também como fragmentos delas derivados, tais como, Fab, F(ab')2 e Fv, com a capacidade de ligar um epitopo de um polipéptido do LT-GPCR. Tipicamente, são necessários, pelo menos, 6, 8, 10 ou 12 aminoácidos contíguos para formar um epitopo. Contudo, epitopos que envolvam aminoácidos não-contiguos podem requerer um número maior de pelo menos, por exemplo, 15, 25 ou 50 aminoácidos. 42 ΡΕ1276867

Um anticorpo que se liga especif icamente a um epitopo de um polipéptido do LT-GPCR pode ser utilizado terapeuticamente, como também em ensaios de imunoquimica, tais como "western blots", ELISAs, radioimunoensaios, ensaios de imunohistoquimica, imunoprecipitações ou outros ensaios de imunoquimica do conhecimento da especialidade. Podem ser utilizados diversos imunoensaios para a identificação de anticorpos que contenham a especificidade desejada. São bem conhecidos na especialidade numerosos protocolos para ensaios de ligação competitiva ou ensaios imunoradiométricos. Tipicamente, esses imunoensaios envolvem a medição da formação de complexos entre um imunogénio e um anticorpo que se liga especificamente ao imunogénio.

Tipicamente, um anticorpo que se liga especi-ficamente a um polipéptido do LT-GPCR fornece um sinal de detecção pelo menos 5-, 10- ou 20-vezes maior que um sinal de detecção fornecido com outras proteínas quando utilizado num ensaio de imunoquimica. Preferencialmente, os anticorpos que se ligam especificamente a polipéptidos do LT-GPCR não detectam outras proteínas em ensaios de imunoquimica e podem imunoprecipitar um polipéptido do LT-GPCR a partir de uma solução.

Os polipéptidos do LT-GPCR podem ser utilizados para a imunização de um mamífero, como por exemplo, um ratinho, uma ratazana, um coelho, um porquinho-da-índia, um macaco ou um humano, para se produzirem anticorpos policlonais. Se for desejável, um polipéptido do LT-GPCR 43 ΡΕ1276867 pode ser conjugado com uma proteína transportadora, como por exemplo a albumina sérica bovina, a tiroglobulina ou a hemocianina do caranguejo-ferradura. Dependendo da espécie hospedeira, podem ser utilizados diversos adjuvantes com a finalidade de se aumentar a resposta imunológica. Tais adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, o adjuvante de Freund, geles minerais (por exemplo, o hidróxido de alumínio) e substâncias de superfície activas (por exemplo, a lisolecitina, polialcoóis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões de óleos, hemocianina da caranguejo-ferradura e o dinitrofenol). Dentro dos adjuvantes utilizados em humanos, são especialmente úteis o BCG (bacilli Calmette-Guerin) e a Corynebacterium parvum.

Os anticorpos monoclonais que se ligam especi-ficamente a um polipéptido do LT-GPCR podem ser preparados utilizando-se uma qualquer técnica que forneça a produção de moléculas de anticorpo através de linhas celulares contínuas em cultura. Estas técnicas incluem, mas não estão limitadas a, à técnica do hibridoma, à técnica do hibridoma das células B humanas e à técnica do hibridoma-EBV (Kohler et ai., Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor et al., J Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 80, 2026-2030, 1983 ; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120, 1984). A acrescentar, podem ser utilizadas as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos", a união de genes de anticorpos de ratinho com genes de 44 ΡΕ1276867 anticorpos de humanos para se obter uma molécula com a especificidade de antigénio e a actividade biológica apropriadas (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985). Os anticorpos monoclonais e outros anticorpos podem também ser "humanizados" de modo a se prevenir que um paciente monte uma resposta imune contra o anticorpo quando este é utilizado com fins terapêuticos. Tais anticorpos podem ser suficientemente similares na sua sequência aos anticorpos humanos para serem utilizados directamente na terapia ou podem necessitar de alterações em alguns dos resíduos chave. As diferenças nas sequências entre os anticorpos dos roedores e as sequências humanas podem ser minimizadas através da substituição dos resíduos que difiram daqueles das sequências humanas utilizando-se a mutagénese local dirigida dos resíduos individuais ou através da "raspagem" da totalidade das regiões determinantes da complementaridade. Alternativamente, os anticorpos humanizados podem ser produzidos utilizando-se métodos de recombinação, tal como os descritos em GB2188638B. Os anticorpos que se ligam especificamente a um polipéptido do LT-GPCR podem conter locais de ligação ao antigénio que são tanto parcialmente como totalmente humanizados, tal como revelado em U.S. 5,565,332.

Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples podem ser adaptadas utilizando-se os métodos conhecidos na especialidade 45 ΡΕ1276867 para se produzirem anticorpos de cadeia simples que especificamente se liguem a polipéptidos do LT-GPCR. Os anticorpos com o mesmo tipo de especificidade, mas com uma composição idiotípica distinta, podem ser gerados através da mistura das cadeias de bibliotecas de imunoglobulinas combinadas aleatoriamente (Burton, Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 11120-23, 1991).

Os anticorpos de cadeia simples também podem ser construídos utilizando-se um método de amplificação do ADN, tal como a PCR, usando como molde o ADNc do hibridoma (Thirion et al., 1996, Eur. J. Câncer Prev. 5, 507-11). Os anticorpos de cadeia simples podem ser mono- ou biespe-cíficos e podem ser bivalentes ou tetravalentes. A construção de anticorpos de cadeia simples, biespecíficos e tetravalentes é descrita, por exemplo, em Coloma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63. A construção de anticorpos de cadeia simples, biespecíficos e bivalentes é descrita em Mallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206 .

Uma sequência de nucleótidos que codifique um anticorpo de cadeia simples pode ser construída através de uma síntese de nucleótidos manual ou automatizada, clonada numa construção de expressão utilizando-se métodos do ADN recombinante estandardizados e introduzida numa célula para esta expressar a sequência codificante, tal como descrito mais abaixo. Alternativamente, os anticorpos de cadeia simples podem ser produzidos directamente utilizando-se, 46 ΡΕ1276867 por exemplo, a tecnologia do fago filamentoso (Verhaar et al., 1995, Int. J. Câncer 61, 497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91).

Os anticorpos que se ligam especificamente a polipéptidos do LT-GPCR também podem ser produzidos através da indução da sua produção in vivo na população de linfócitos ou através do rastreio de bibliotecas de imunoglobulinas ou de painéis de reagentes de ligação altamente específicos, tal como vem revelado na literatura (Orlandi, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 86, 3833-3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293-299, 1991).

Podem ser construídos outros tipos de anticorpos e estes serem utilizados com fins terapêuticos em métodos desta invenção. Por exemplo, anticorpos quiméricos podem ser construídos tal como revelado em WO 93/03151. Também podem ser preparadas proteínas de ligação que derivaram a partir de imunoglobulinas e que são multivalentes e multi-específicas, tais como os "diabodies" descritos em WO 94/13804.

Os anticorpos que estão de acordo com a invenção podem ser purificados utilizando-se métodos bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, os anticorpos podem ser purificados utilizando-se métodos de afinidade através da passagem por uma coluna à qual o polipéptido do LT-GPCR está ligado. Os anticorpos ligados podem depois ser eluídos da coluna utilizando-se um tampão com uma elevada concentração salina. 47 ΡΕ1276867

Oligonucleótidos "antisense

Os oligonucleótidos "antisense" são sequências de nucleótidos que são complementares a uma sequência específica de ADN ou de ARN. Uma vez introduzidos numa célula, os nucleótidos complementares combinam-se com as sequências naturais produzidas pela própria célula de forma a formarem complexos e bloquearem tanto a transcrição como a tradução. Preferencialmente, um oligonucleótido "antisense" tem de comprimento pelo menos 11, mas pode ter pelo menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 ou mais nucleótidos de comprimento. Também podem ser utilizadas sequências mais longas. As moléculas dos oligonucleótidos "antisense" podem ser fornecidas numa construção de ADN e ser introduzidas numa célula tal como descrito mais acima, de forma a diminuírem o nível dos produtos dos genes do LT-GPCR na célula.

Os oligonucleótidos "antisense" podem ser deso-xirribonucleótidos, ribonucleótidos ou uma combinação de ambos. Os oligonucleótidos podem ser sintetizados manualmente ou utilizando-se um sintetizador automático através da ligação covalente do terminal 5' de um nucleótido com o terminal 3' de um outro nucleótido através de ligações não-fosfodiéster entre os nucleótidos tais como, alquilfos-fonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfono-tioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, carbamatos, acetamidato, carboximetil ésteres, carbonatos e triésteres de fosfato. Ver em Brown, Meth. Mol. 48 ΡΕ1276867

Biol. 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-583, 1990.

As modificações da expressão do gene do LT-GPCR podem ser obtidas através do desenho de oligonucleótidos "antisense" que formem dupletos com o controlo, 5' ou regiões reguladoras do gene do LT-GPCR. Os oligonucleótidos que derivam do local de iniciação da transcrição, por exemplo, entre as posições -10 e +10 a partir do local de iniciação são os preferíveis. Similarmente, a inibição pode ser adquirida utilizando-se a metodologia de emparelhamento de bases em espiral tripla. O emparelhamento em espiral tripla é útil porque provoca uma inibição na capacidade das espirais duplas de abrirem o suficiente para a ligação das polimerases, dos factores de transcrição ou das chapero-ninas. Os avanços terapêuticos com a utilização do ADN triplo estão descritos na literatura (por exemplo, Gee et al., em Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994). Um oligonucleótido "antisense" também pode ser projectado para bloquear a tradução do ARNm por evitar que o transcrito forme a ligação aos ribossomas. Não é necessário existir uma complementaridade exacta para a formação de um complexo com sucesso entre um oligonucleótido "antisense" e a sequência complementar de um polinucleótido do LT-GPCR. Os oligonucleótidos "antisense" que compreendam, por exemplo, 2, 3, 4 ou 5 ou mais extensões de nucleótidos contíguos que são precisamente 49 ΡΕ1276867 complementares a um polinucleótido do LT-GPCR, cada um separado por uma extensão de nucleótidos contíguos que não são complementares aos nucleótidos do LT-GPCR adjacentes, podem fornecer uma especificidade de alvo suficiente para o ARNm do LT-GPCR. De preferência cada extensão de nucleótidos contíguos complementares deve ter 4, 5, 6, 7 ou 8 ou mais nucleótidos de comprimento. As sequências não-comple-mentares que estão de permeio têm preferencialmente 1, 2, 3 ou 4 ou mais nucleótidos de comprimento. Alguém com perícia na especialidade pode facilmente utilizar o ponto de fusão calculado para um par "antisense-sense" para determinar o grau de ligações inadequadas que serão toleradas entre um oligonucleótido "antisense" em particular e uma sequência em particular do polinucleótido do LT-GPCR.

Os oligonucleótidos "antisense" podem ser modificados sem se afectar a sua capacidade de hibridarem com um polinucleótido do LT-GPCR. Estas modificações podem ser internas ou num ou em ambos os terminais da molécula "antisense". Por exemplo, as ligações fosfato entre os nucleósidos podem ser modificadas pela adição de metades colesteril ou diamina com um número variável de resíduos de carbono entre os grupos amino e a ribose terminal. Bases ou açúcares modificados tais como, uma arabinose em vez de uma ribose ou um oligonucleótido substituído a 3'ou 5', nos quais o grupo hidroxilo a 3' ou o grupo fosfato a 5' estão substituídos, também podem ser empregues num oligonucleótido "antisense" modificado. Estes oligonucleótidos modificados podem ser preparados por métodos bem conhecidos na 50 ΡΕ1276867 especialidade. Ver, por exemplo, Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann et ai., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann et al., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542, 1987.

Ribozimas

As ribozimas são moléculas de ARN com actividade catalítica. Ver, por exemplo, Cech, Science 236, 1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568; 1990, Cech, Curr. Opin. Struct. Biol. 2, 605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12, 510-515, 1996. As ribozimas podem ser utilizadas para inibir a função de um gene ao clivarem a sequência de ARN, tal como é do conhecimento na especialidade (por exemplo, Haseloff et ai., U.S. Patent 5,641,673). O mecanismo de acção das ribozimas envolve uma hibridação sequência-específica da molécula de ribozima ao ARN alvo complementar, seguindo-se a clivagem endonucleo-lítica. Os exemplos incluem moléculas modificadas de ribozima com o motivo de cabeça de martelo que possam catalisar especificamente e eficientemente a clivagem endonucleolítica de sequências específicas de nucleótidos. A sequência codificante de um polinucleótido do LT-GPCR, tal como a sequência do nucleótido apresentado na SEQ ID NO:l, pode ser utilizada para produzir ribozimas que irão ligar-se especificamente ao ARNm transcrito a partir do polinucleótido do LT-GPCR. Os métodos de desenho e construção de ribozimas que possam clivar outras moléculas 51 ΡΕ1276867 de ARN em trans de um modo altamente sequência-específico foram desenvolvidos e descritos na especialidade (ver Haseloff et al. Nature 334, 585-591, 1988). Por exemplo, a actividade de clivagem das ribozimas pode ser dirigida para ARNs específicos através da criação de uma pequena região de "hibridação" na ribozima. A região de hibridação contém uma sequência complementar ao ARN alvo e assim híbrida especificamente com o alvo (ver, por exemplo, Gerlach et al., EP 321,201).

Os locais de clivagem específicos das ribozimas dentro de um ARN do LT-GPCR alvo podem ser identificados através do rastreio da molécula alvo para locais de clivagem da ribozima que incluem as seguintes sequências: GUA, GUU e GUC. Uma vez identificadas, as pequenas sequências de ARN contendo entre 15 a 20 ribonucleótidos correspondentes à região do ARN alvo contendo o local de clivagem podem ser avaliadas nas características estruturais secundárias que possam tornar o alvo inoperacional. A adequação dos alvos de ARN do LT-GPCR candidato também pode ser avaliada através do teste da acessibilidade para a hibridação com oligonucleótidos complementares utilizando-se ensaios de protecção à ribonuclease. A sequência do nucleótido apresentado na SEQ ID N0:1 e a sua complementar fornecem uma fonte de sequências adequadas com região de hibridação. Podem ser utilizadas sequências complementares maiores para se aumentar a afinidade da sequência de hibridação para o alvo. As regiões de hibridação e de clivagem da ribozima podem estar integralmente relacionadas de modo 52 ΡΕ1276867 que após a hibridação ao ARN alvo através das regiões complementares, a região catalítica da ribozima possa clivar o alvo.

As ribozimas podem ser introduzidas nas células como parte de uma construção de ADN. Os métodos mecânicos, tais como a microinjecção, a transfecção mediada por liposomas, a electroporação ou a precipitação com fosfato de cálcio, podem ser utilizados para se introduzir a construção de ADN que contém a ribozima nas células em que se deseja uma diminuição da expressão do LT-GPCR. Alternativamente, se é desejável que as células retenham estavel-mente a construção, a construção pode ser fornecida num plasmídeo e ser mantida como um elemento à parte ou ser integrado no genoma das células, como é do conhecimento na especialidade. Uma construção de ADN que codifique uma ribozima pode incluir elementos reguladores da transcrição, tais como um elemento promotor, um potenciador ou um elemento UAS e um sinal de terminação da transcrição, para o controlo da transcrição das ribozimas nas células.

Tal como referido em Haseloff et al., U.S. Patent 5,641,673, as ribozimas podem ser modificadas de modo que a expressão da ribozima ocorra como resposta a factores que induzem a expressão de um gene alvo. As ribozimas também podem ser modificadas para fornecerem um nível adicional de regulação, de modo que a destruição do ARNm ocorra apenas quando tanto a ribozima como o gene alvo são induzidos nas células. 53 ΡΕ1276867 Métodos de Rastreio A invenção fornece ensaios para o rastreio dos compostos em teste que se ligam a, ou modulam, a actividade de um polipéptido do LT-GPCR ou de um polinucleótido do LT-GPCR. Um composto em teste liga-se preferencialmente a um polipéptido ou a um polinucleótido do LT-GPCR. Ainda mais preferencialmente, um composto em teste diminui ou aumenta o efeito biológico mediado através do LT-GPCR humano por, pelo menos, 10, preferencialmente cerca de 50, ainda mais preferencialmente cerca de 75, 90 ou 100% relativamente à ausência do composto em teste.

Compostos em Teste

Os compostos em teste podem ser agentes farmacológicos já conhecidos na especialidade ou podem ser compostos anteriormente desconhecidos de conterem qualquer actividade farmacológica. Os compostos podem ser de ocorrência natural ou podem ser concebidos em laboratório. Eles podem ser isolados a partir de microorganismos, de animais ou de plantas e podem ser produzidos através de recombinação ou ser sintetizados utilizando-se métodos químicos do conhecimento da especialidade. Se for desejável, os compostos em teste podem ser obtidos utilizando-se qualquer um dos numerosos métodos de bibliotecas combinatórias do conhecimento da especialidade, incluindo-se, mas não se limitando a, bibliotecas biológicas, bibliotecas de fase sólida ou de fase líquida espacialmente aplicáveis, 54 ΡΕ1276867 métodos de bibliotecas sintéticas que requerem descon-volução, o método da biblioteca "one-bead one-compound" e os métodos de bibliotecas sintéticas que utilizam a selecção através de cromatografia de afinidade. A abordagem do método da biblioteca biológica está limitada a bibliotecas de polipéptidos, enquanto que as outras quatro abordagens são aplicáveis a polipéptidos, a oligómeros não-péptidos ou a bibliotecas de pequenas moléculas dos compostos. Ver em Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997.

Os métodos para a síntese de bibliotecas moleculares são bem conhecidos na especialidade (ver, por exemplo, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew.

Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994). As bibliotecas dos compostos podem ser apresentadas em solução (ver, por exemplo, Houghten, Bio-techniques 13, 412-421, 1992) ou em esferas (Lam, Nature 354, 82-84, 1991), em microplacas (Fodor, Nature 364, 555- 556, 1993), em bactérias ou esporos (Ladner, U.S. Patent 5,223,409), em plasmídeos (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992) ou em fagos (Scott & Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; e Ladner, U.S. Patent 5,223,409). 55 ΡΕ1276867

Rastreio de Elevada Produtividade Operacional

Os compostos em teste podem ser rastreados para a sua capacidade de se ligarem aos polipéptidos ou aos polinucleótidos do LT-GPCR ou afectarem a actividade do LT-GPCR ou a expressão do gene do LT-GPCR utilizando-se um rastreio de elevada produtividade operacional. Utilizando-se o rastreio de elevada produtividade operacional, muitos compostos discretos podem ser testados em paralelo de modo que grandes números de compostos em teste podem ser rapidamente rastreados. As técnicas que estão mais estabelecidas utilizam microplacas com 96 poços. Os poços das microplacas necessitam tipicamente de volumes de ensaio dentro do intervalo de 50 a 500 ?1. A acrescentar ás placas, muitos instrumentos, materiais, pipetas, robótica, lavadores de placas e leitores de placas estão disponíveis comercialmente e estão de acordo com o formato das placas com 96 poços.

Alternativamente, podem ser utilizados "ensaios de formato livre" ou ensaios que não contêm uma barreira física entre as amostras. Por exemplo, um ensaio que utiliza células de pigmentos (melanócitos) num ensaio homogéneo único para bibliotecas combinatórias de péptidos está descrito por Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 19, 1614-18, (1994). As células são colocadas sobre placas de Petri revestidas com agarose, depois esferas que carregam os compostos combinatórios são colocadas na superfície da agarose. Os compostos combinatórios são 56 ΡΕ1276867 libertados parcialmente das esferas. Os compostos activos podem ser visualizados na forma de áreas de pigmentação escura porque, á medida que os compostos se difundem localmente para a matriz do gel, os compostos activos provocam uma alteração de cor nas células.

Um outro exemplo de ensaio de formato livre é descrito por Chelsky, "Strategies for Screening Combi-natorial Libraries: Novel and Traditional Approaches", apresentado na First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 7-10, 1995). Chelsky colocou um ensaio enzimático homogéneo simples para a anidrase carbónica dentro de um gel de agarose de modo que a enzima no gel provoque uma alteração de cor através do gel. Após isso, são colocadas dentro de gel esferas que transportam, via fotoligadores, os compostos combinatórios, sendo os compostos parcialmente libertados através de luz ultra-violeta. Os compostos que inibem a enzima são observados como zonas localizadas de inibição com menor alteração de cor.

Contudo um outro exemplo é descrito por Salmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). Neste exemplo, as bibliotecas combinatórias foram rastreadas para os compostos que continham efeitos citotóxicos em células cancerosas que cresciam no agar.

Um outro método de rastreio de elevada produtividade está descrito em Beutel et al., U.S. Patent 57 ΡΕ1276867 5,976,813. Neste método, as amostras a testar são colocadas numa matriz porosa. Um ou mais componentes do ensaio são então colocados dentro, por cima de, ou no fundo de uma matriz, como por exemplo um gel, uma folha de plástico, um filtro ou uma outra forma de suporte sólido facilmente manipulável. Quando as amostras são introduzidas na matriz porosa elas difundem suficientemente devagar de modo que os ensaios podem ser executados sem que as amostras a testar "corram" juntas.

Ensaios de Ligação

Para os ensaios de ligação, o composto a testar é preferencialmente uma molécula pequena que se liga ao polipéptido do LT-GPCR e que ocupa o local activo do polipéptido do LT-GPCR, tornando assim o local de ligação ao ligando inacessível ao substrato de modo que fica impedida a actividade biológica normal. Os exemplos de tais moléculas pequenas incluem, mas não estão limitados a, pequenos péptidos ou moléculas tipo-péptidos. Os potenciais ligandos que se ligam a um polipéptido da invenção incluem, mas não estão limitados a, os ligandos naturais dos LT-GPCRs conhecidos e seus análogos ou derivados daqueles. Os ligandos naturais dos LT-GPCRs incluem a adrenomedulina, a amilina, a proteína de gene associado à calcitonina (CGRP, do Inglês "calcitonin gene related protein"), a calcitonina, a anandamina, a serotonina, a histamina, a adrenalina, a noradrenalina, o factor activador das plaquetas, a trombina, o C5a, a bradiquinina e as quimiocinas. 58 ΡΕ1276867

Nos ensaios de ligação, tanto o composto a testar como o polipéptido do LT-GPCR podem conter um marcador detectável, como por exemplo, um marcador fluorescente, radioisotópico, quimioluminescente ou enzimático, tal como, a peroxidase de rábano, a fosfatase alcalina ou a luci-ferase. A detecção de um composto em teste que se encontre ligado ao polipéptido do LT-GPCR pode ser então conseguida, por exemplo, através da contagem directa da radioemissão, através da contagem das cintilações ou através da determinação da conversão de um substrato apropriado num produto detectável.

Alternativamente, a ligação de um composto em teste a um polipéptido do LT-GPCR pode ser determinada sem se fazer uma marcação em ambos os interactuantes. Por exemplo, pode ser utilizado um microfisiómetro para se detectar a ligação de um composto em teste a um polipéptido do LT-GPCR. Um microfisiómetro (por exemplo, o Cytosensor™) é um instrumento analítico que mede a taxa a que uma célula acidifica o seu meio ambiente, utilizando para isso um sensor potenciométrico associado à luz (LAPS, do Inglês "light-adressable potentiometric sensor")· As alterações nesta taxa de acidificação podem ser utilizadas como um indicador da interacção entre o composto em teste e um polipéptido do LT-GPCR (McConnell et al., Science 257, 1906-1912, 1992). A determinação da capacidade de um composto em teste se ligar a um polipéptido do LT-GPCR também pode ser 59 ΡΕ1276867 conseguida utilizando-se tecnologias tais como a Análise da Interacção Biomolecular (BIA, do Inglês "Biomolecular Interaction Analisys) em tempo real (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345, 1991 e Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705, 1995). A BIA é uma tecnologia utilizada para se estudarem interacções bioes-pecificas em tempo real sem se fazer a marcação de qualquer um dos intervenientes (por exemplo, BIAcore™) . As alterações do fenómeno óptico "surface plasmon ressonance" (SPR) podem ser utilizadas como um indicação das reacções entre biomoléculas em tempo real.

Ainda numa outra perspectiva da invenção, um polipéptido do LT-GPCR pode ser utilizado como uma "proteína bait" no ensaio dos dois híbridos ou no ensaio dos três híbridos (ver, por exemplo em, U.S. Patent 5, 283,317; Zervos et al., Cell 72, 223-232, 1993; Madura et al., J. Biol. Chem. 263, 12046-12054, 1993; Bartel et al., Biotechniques 14, 920-924, 1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696, 1993; e Brent W094/10300), de modo a se proceder à identificação de outras proteínas que se ligam ao polipéptido do LT-GPCR ou que interactuam com o polipéptido do LT-GPCR e que modulam a sua actividade. O sistema dos dois híbridos baseia-se na natureza de modulação da maior parte dos factores de transcrição e que consiste na existência de domínios de ligação ao ADN e de activação do ADN separados. Resumidamente, o ensaio utiliza duas construções de ADN diferentes. Por exemplo, 60 ΡΕ1276867 numa das construções o polinucleótido que codifica o polipéptido do LT-GPCR pode ser fundido a um polinucleótido que codifica o domínio de ligação ao ADN de um factor de transcrição conhecido (por exemplo, o GAL-4). Na outra construção, uma sequência de ADN que codifica uma proteína não identificada ("presa" ou "amostra") pode estar fundida com um polinucleótido que codifica para o domínio de activação do factor de transcrição conhecido. Se as proteínas "bait" e "presa" são capazes de interaqir in vivo, de modo a formar um complexo proteíno-dependente, os domínios de ligação ao ADN e de activação do ADN do factor de transcrição são levados a aproximar-se. Esta proximidade permite a transcrição de um gene repórter (por exemplo, o LacZ), que está operacionalmente ligado a um local regulador da transcrição e que responde ao factor de transcrição. A expressão do gene repórter pode ser detectada e as colónias de células que contêm o factor de transcrição funcional podem ser isoladas e utilizadas para se obter a sequência de ADN que codifica a proteína que interage com o polipéptido do LT-GPCR.

Poderá ser desejável imobilizar tanto o polipéptido do LT-GPCR (ou o polinucleótido) como o composto em teste, de modo a se facilitar a separação das formas ligadas das não ligadas, de um ou de ambos os intervenientes, também como se poder utilizar a automação no ensaio. Assim sendo, tanto o polipéptido do LT-GPCR (ou o polinucleótido) como o composto em teste podem estar ligados a um suporte sólido. Como suportes sólidos adequados 61 ΡΕ1276867 incluem-se, mas não estão limitados a, lâminas de vidro ou plástico, placas de cultura de tecidos, poços de micro-titulação, tubos, chips de silicone, ou partículas, tal como, esferas (incluindo, mas não se limitando a esferas de látex, poliestireno ou de vidro). Pode ser utilizado qualquer um dos métodos conhecidos na especialidade para se fixar o polipéptido do LT-GPCR (ou o polinucleótido) também como o composto em teste a um suporte sólido, incluindo-se a utilização de ligações covalentes ou não-covalentes, a absorção passiva ou pares de metades de ligação fixados respectivamente ao polipéptido (ou ao polinucleótido) ou ao composto em teste e ao suporte sólido. Os compostos em teste estão preferencialmente ligados ao suporte sólido num arranjo, de modo que a localização dos compostos em teste individuais possa ser facilmente determinada. A ligação de um composto em teste a um polipéptido do LT-GPCR (ou ao polinucleótido) pode ser conseguida num qualquer recipiente adequado para conter os reagentes. Como exemplos de tais recipientes incluem-se as microplacas, tubos de ensaio e tubos de microcentrífuga.

Numa forma de realização, o polipéptido do LT-GPCR é uma proteína de fusão contendo um domínio que permite que o polipéptido do LT-GPCR esteja ligado a um suporte sólido. Por exempolo, as proteínas de fusão com a glutationa-S-transferase podem ser adsorvidas a esferas de sefarose com glutationa (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo.) ou a microplacas derivatizadas com glutationa, que são depois combinadas com o composto em teste ou com o composto 62 ΡΕ1276867 em teste e o polipéptido do LT-GPCR não-adsorvido; a mistura é então incubada sob condições tais que conduzam à formação complexo (por exemplo, nas condições fisiológicas de salinidade e de pH). Após a incubação, as esferas ou os poços da microplaca são lavados para se removerem quaisquer componentes não ligados. A ligação dos interactuantes pode ser determinada tanto directa como indirectamente, tal como descrito mais acima. Alternativamente, os complexos podem ser dissociados do suporte sólido antes da ligação estar determinada.

Nos ensaios de rastreio desta invenção também podem ser utilizadas outras técnicas para a imobilização de proteínas ou de polinucleótidos num suporte sólido. Por exemplo, tanto o polipéptido do LT-GPCR (ou o polinu-cleótido) como o composto em teste podem ser imobilizados utilizando-se a conjugação da biotina e da estreptavidina. Os polipéptidos do LT-GPCR (ou o polinucleótido) ou o composto em teste biotinilados podem ser preparados a partir de biotina-NHS(N-hidroxisuccinimida) utilizando-se técnicas bem conhecidas na especialidade (por exemplo, kit de biotinilação, Pierce Chemicals, Rockford, 111.) e serem imobilizados nos poços de placas com 96 poços revestidas com estreptavidina. Alternativamente, anticorpos que ligam especificamente a um polipéptido do LT-GPCR, a um poli-nucleótido ou a um composto em teste, mas que não interferem com um local de ligação desejável, tal como o local activo do polipéptido do LT-GPCR, podem ser derivatizados aos poços da placa. As proteínas ou os alvos não ligados podem ser fixados aos poços por conjugação a um anticorpo. 63 ΡΕ1276867

Os métodos para a detecção de tais complexos, a acrescentar aqueles descritos mais acima para os complexos de GST imobilizados, incluem a imunodetecção dos complexos utilizando-se anticorpos que se ligam especificamente ao polipéptido do LT-GPCR ou ao composto em teste, ensaios de ligação a enzimas que se baseiam na detecção da actividade do polipéptido do LT-GPCR e electroforeses em geles de SDS sob condições não-redutoras. 0 rastreio dos compostos a testar que se ligam a um polipéptido do LT-GPCR também pode ser levado a cabo numa célula intacta. Qualquer célula que contenha um polipéptido do LT-GPCR ou um polinucleótido pode ser utilizada num sistema de ensaio com base na célula. Um polinucleótido do LT-GPCR pode ocorrer naturalmente na célula ou pode ser introduzido recorrendo-se para isso a técnicas tal como as já descritas anteriormente. A ligação do composto a testar a um polinucleótido ou a um polipéptido do LT-GPCR é determinada tal como descrito mais acima.

Ensaios Funcionais

Os compostos em teste podem ser testados para a sua capacidade de aumentar ou diminuir um efeito biológico de um polipéptido do LT-GPCR. Esses efeitos biológicos podem ser determinados utilizando-se os ensaios funcionais descritos mais abaixo nos exemplos específicos. Os ensaios funcionais podem ser levados a cabo após se colocar em 64 ΡΕ1276867 contacto tanto o polipéptido do LT-GPCR purificado, uma preparação de membrana celular ou uma célula intacta, com o composto a testar. Um composto em teste que aumenta a actividade funcional de um LT-GPCR de, pelo menos, cerca de 10, preferencialmente, de cerca de 50 e ainda mais preferencialmente, de cerca de 75, 90 ou 100% é identificado como um potencial agente capaz de aumentar a actividade do LT-GPCR.

Um dos procedimentos de rastreio envolve a utilização de melanóforos que são transf ectados de modo a expressarem um polipéptido do LT-GPCR. Esta técnica de rastreio está descrita na WO 92/01810, publicada em 6 de Fevereiro, 1992. Deste modo, e como exemplo, tal ensaio pode ser empregue no rastreio de um composto que iniba a activação do receptor do polipéptido, através do contacto das células melanóforas, que contêm o receptor com tanto o ligando do receptor como um composto a testar que irá ser rastreado.

Outras técnicas de rastreio incluem a utilização de células que expressam o polipéptido do LT-GPCR humano (por exemplo, células CHO transfectadas) num sistema que mede as alterações de pH extracelulares provocadas pela activação de receptor (ver, por exemplo em, Science 246, 181-296, 1989). Por exemplo, os compostas a testar podem ser postos em contacto com uma célula que expressa o polipéptido do LT-GPCR humano e uma resposta de um mensageiro secundário, por exemplo, uma transdução de sinal 65 ΡΕ1276867 ou uma alteração de pH, pode ser medida de modo a se determinar se o composto em teste activa ou inibe o receptor.

Uma outra técnica de rastreio envolve a introdução de ARN que codifica o polipéptido do LT-GPCR humano, em oócitos de Xenopus, de modo a que estes expressem transientemente o receptor. Os oócitos transfectados podem depois ser postos em contacto com o ligando do receptor e o composto a testar que irá ser rastreado, seguindo-se a detecção da inibição ou da activação de um sinal de cálcio, isto no caso de se estar a rastrear compostos em teste que se pensa inibirem a activação do receptor.

Ainda uma outra técnica de rastreio envolve a expressão do polipéptido do LT-GPCR humano em células nas quais o receptor está associado a uma fosfolipase C ou D. Essas células incluem as células endoteliais, células do músculo liso, células embrionárias de rim, entre outros. 0 rastreio pode ser realizado tal como descrito mais acima, através da quantificação do grau de activação do receptor tendo em conta as alterações na actividade da fosfolipase.

Os detalhes dos ensaios funcionais, tal como os descritos mais acima, são fornecidos nos exemplos específicos, mais abaixo.

Expressão do gene LT-GPCR

Numa outra forma de realizaçao, são identificados 66 ΡΕ1276867 os compostos em teste que aumentem ou diminuam a expressão do gene LT-GPCR. Um polinucleótido do LT-GPCR é posto em contacto com um composto em teste e é determinada a expressão de um ARN ou de um polipéptido, produto do polinu-cleótido do LT-GPCR. 0 nível da expressão de um ARNm apropriado ou de um polipéptido na presença de um composto em teste é comparada com o nível de expressão de um ARNm ou de um polipéptido na ausência do composto em teste. 0 composto em teste pode então ser identificado como um modu-lador da expressão, com base nesta comparação. Como exemplo, quando a expressão de um ARNm ou de um polipéptido é maior na presença do composto em teste do que na sua ausência, o composto em teste é identificado como um estimulador ou um potenciador da expressão do ARNm ou do polipéptido. Alternativamente, quando a expressão de um ARNm ou de um polipéptido é menor na presença do composto em teste do que na sua ausência, o composto em teste é identificado como um inibidor da expressão do ARNm ou do polipéptido. 0 nivel de expressão de um ARNm ou de um polipéptido do LT-GPCR nas células pode ser determinado através de métodos bem conhecidos na especialidade de detecção de ARNm ou de polipéptidos. Podem ser utilizados tanto métodos qualitativos, como métodos quantitativos. A presença de polipéptidos, produtos de um polinucleótido do LT-GPCR pode ser determinada, por exemplo, utilizando-se uma variedade de técnicas conhecidas na especialidade, incluindo métodos imunoquimicos, tais como, o radioimunoensaio, o "western blotting" e imunohistoquimica. Alternativamente, a síntese 67 ΡΕ1276867 de um polipéptido pode ser determinada in vivo, numa cultura de células ou num sistema de tradução in vitro, através da detecção da incorporação num polipéptido do LT-GPCR de aminoácidos marcados. 0 referido rastreio pode ser levados a cabo tanto num sistema de ensaio sem células (do Inglês, "cell-free") ou numa célula intacta. Qualquer célula que expresse um polinucleótido do LT-GPCR pode ser utilizada num sistema de ensaio com base celular (do Inglês, "cell-based"). 0 polinucleótido do LT-GPCR pode ocorrer naturalmente na célula ou pode ser introduzido utilizando-se técnicas tais como as descritas mais acima, podendo ser utilizadas tanto uma cultura primária, como uma linha celular estabelecida, tomando-se como exemplo as células CHO ou as células embrionárias humanas de rim 293.

Composições Farmacêuticas A invenção também fornece composições farmacêuticas que podem ser administradas a um paciente para se alcançar um efeito terapêutico. As composições farmacêuticas desta invenção podem compreender, por exemplo, um polipéptido do LT-GPCR, um polinucleótido do LT-GPCR, anticorpos que se ligam especificadamente a um polipéptido do LT-GPCR ou miméticos, agonistas, antagonistas ou inibidores da actividade de um polipéptido do LT-GPCR. As composições podem ser administradas isoladamente ou combinadas com pelo menos um outro agente, tal como compostos 68 ΡΕ1276867 estabilizadores, podendo ser administradas num qualquer veiculo farmacêutico, biocompativel e estéril, incluindo-se, mas não estando limitado a, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, dextrose e água. As composições podem ser administradas a um paciente isoladamente ou combinadas com outros agentes, fármacos ou hormonas. A acrescentar aos gradientes activos, estas composições farmacêuticas podem conter veículos farmaceuti-camente aceitáveis, adequados para o fim a que se destinam, compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o processamento dos compostos activos nas preparações que podem ser utilizadas com fins farmacêuticos. As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas através de um sem número de vias, incluindo, mas não se limitando às vias, oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, parentérica, tópica, sub-lingual ou rectal. As composições farmacêuticas a serem administradas oralmente podem ser formuladas utilizando-se veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos do estado da especialidade, em doses adequadas para uma administração oral. Os referidos veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas em comprimidos, comprimidos revestidos, drageias, cápsulas, líquidos, geles, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para serem ingeridas pelo paciente.

As preparações farmacêuticas para serem utili- 69 ΡΕ1276867 zadas através da via oral podem ser obtidas pela combinação dos compostos activos com excipientes sólidos, opcionalmente triturando-se a mistura resultante e processando a mistura granulosa, após a adição de auxiliares adequados, se for desejável, para se obterem comprimidos ou núcleos para drageias. Os excipientes adequados são os agentes de enchimento de hidratos de carbono ou proteicos, tais como os açúcares, incluindo a lactose, a sacarose, o manitol ou o sorbitol; o amido de milho, trigo, arroz, batata ou de outras plantas; a celulose, tal como a metilcelulose, a hidroxipropilmetilcelulose ou a carboximetilcelulose; gomas, incluindo a arábica e a de tragacanta; e proteínas, tais como a gelatina e o colagéneo. Se for desejável, podem ser adicionados agentes desintegrantes ou solubilizadores, tais como a polivinilpirrolidona de ligações cruzadas, o agár, o ácido algínico ou um sal dele derivado, como por exemplo o alginato de sódio.

Os núcleos para drageias podem ser utilizados conjuntamente com revestimentos adequados, tais como as soluções concentradas de açúcar, que também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel corbopol, polietilenoglicol e/ou dióxido de titânio, soluções de lacagem e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Podem ser adicionadas substâncias corantes ou pigmentos aos comprimidos ou aos revestimentos das drageias para a identificação do produto ou para a caracterização da quantidade do composto activo, isto é, da dosagem. 70 ΡΕ1276867

As preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas através da via oral incluem as cápsulas do tipo "push-fit também como as cápsulas moles e seladas feitas de gelatina e de um revestimento, como por exemplo, o glicerol ou o sorbitol. As cápsulas do tipo "push-fit" podem conter ingredientes activos misturados com um agente de enchimento ou um ligante, tal como a lactose ou amidos, lubrificantes, tal como o talco ou o estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Nas cápsulas moles os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em liquidos adequados, como por exemplo, óleos gordos, liquido ou polietilenoglicol liquido, com ou sem estabilizantes.

As formulações farmacêuticas adequadas para uma administração parentérica podem ser formuladas em soluções aquosas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como a solução de Hanks, a solução de Ringer ou soro fisiológico tamponado. As suspensões aquosas dos injectáveis podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como por exemplo, a carboximetil-celulose de sódio, o sorbitol ou o dextrano. Adicionalmente, as suspensões dos compostos activos podem ser preparadas na forma de suspensões injectáveis oleosas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem os óleos gordos, tal como o óleo de sésamo ou ésteres sintéticos de ácidos gordos, tais como o oleato de etilo ou triglicerídeos ou lipossomas. Como veículos também podem ser utilizados polímeros policatiónicos aminados não-lipídicos. Opcionalmente, a suspensão também pode conter 71 ΡΕ1276867 estabilizadores adequados ou agentes que aumentem a solubilidade dos compostos, de modo a ajudarem a preparação de soluções altamente concentradas. Para a administração tópica ou nasal são utilizados na formulação agentes penetrantes apropriados para a barreira em questão de modo a esta se tornar permeável. Estes agentes penetrantes são geralmente conhecidos na especialidade.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser manufacturadas de um modo que é conhecido na especialidade, por exemplo, através de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, produção de dra-geias, moagem, emulsificação, encapsulação, englobamento ou liofilização. A composição farmacêutica pode ser fornecida na forma de um sal, podendo ser produzida com muitos ácidos, incluindo-se, mas não estando limitados a, clorídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, entre outros. Os sais têm a tendência de serem mais solúveis em solventes aquosos ou noutros solventes próticos do que as correspondentes formas de bases livres. Em outros casos, uma preparação preferencial pode ser um pó liofilizado que pode conter qualquer um ou todos dos seguintes: 1-50 mM histidina, 0,l%-2% sacarose e 2-7% manitol, a um pH dentro do intervalo de 4,5 a 5,5, que será combinado com um tampão antes da sua utilização.

Mais detalhes sobre as técnicas para as formulações e administração podem ser encontrados na última edição de REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Maack 72 ΡΕ1276867

Publishing Co., Easton, Pa.)· Depois de as composições farmacêuticas terem sido preparadas, estas podem ser colocadas num recipiente adequado e este ser rotulado para o tratamento de uma determinada condição. A referida rotu-lagem deverá incluir a quantidade, a frequência e o método de administração.

Indicações Terapêuticas e Métodos

Os GPCRs são ubíquos nos hospedeiros mamíferos e são responsáveis por muitas funções biológicas, incluindo muitas patologias. De acordo com o referido, é desejável encontrarem-se compostos e fármacos que por um lado estimulem o GPCR e que por outro lado possam inibir a função de um GPCR. Como exemplo, compostos que activem um GPCR podem ser empregues com finalidade terapêutica, como por exemplo para o tratamento da asma, da doença de Parkinson, da insuficiência cardíaca aguda, da retenção urinária e da osteoporose. Em particular, os compostos que activam os GPCRs são úteis no tratamento de diversas indisposições cardiovasculares, como por exemplo as causadas pela falta de fluxo de sangue nos pulmões ou pela hipertensão. A acrescentar, estes compostos também podem ser utilizados no tratamento de diversos distúrbios fisiológicos relacionados com um controlo anormal da homeostase dos fluidos e dos electrólitos e de doenças associadas com a secreção da aldoesterona induzida pela angiotensina. 73 ΡΕ1276867

Em geral, os compostos que inibem a activação de um GPCR podem ser utilizados numa série de fins terapêuticos, por exemplo, para o tratamento da hipotensão e/ou da hipertensão, da angina de peito, do enfarte do miocárdio, de úlceras, da asma, de alergias, da hipertrofia prostática benigna e de disfunções psicóticas e neurológicas, incluindo a esquizofrenia, a excitação maníaca, a depressão, o delírio, a demência ou o atraso mental severo, discinésias, tais como a doença de Huntington ou o síndroma de Tourett, dentro de outros. Os compostos que inibem os GPCRs também são úteis na reversão da anorexia endógena, no controlo da bolimia e no tratamento de várias indisposições cardiovasculares, tais como as causadas por um fluxo excessivo de sangue nos pulmões ou pela hipotensão. A regulação do LT-GPCR pode ser utilizada para regular a exocitose. Por exemplo, os antagonistas do LT-GPCR podem ser utilizados para diminuir a exocitose de hormonas, por exemplo, de tumores benignos das glândulas endócrinas, tal como o adenoma da pituitária da acro-megalia, do adenoma tóxico que produz o hipertiroidismo, do adenoma da paratiróide do hiperparatiroidismo, do adenoma pancreático das células das ilhotas que secretam a insulina, do feocromocitoma benigno e do adenoma adrenal cortical do síndroma de Cushing, de tumores malignos secretores de hormonas da pituitária anterior e da tiróide, de cancros da paratiróide, das células das ilhotas, da medula adrenérgico e do córtex adrenérgico. Também podem ser tratados outros estados hiperfuncionais, tais como a 74 ΡΕ1276867 doença de Graves, a papeira difusa tóxica, o Síndroma de Cushing não associado com o tumor adrenal, o Síndroma de Zollinger-Ellison, o hipertiroidismo associado com a superprodução de TSH pelos tumores da pituitária.

Os agonistas do LT-GPCR podem ser utilizados para tratar disfunções caracterizadas por uma função endócrina deficiente, como por exemplo o hipotiroidismo da tiroidite de Hashimoto, o hipoparatiroidismo, a doença de Addison, os diabetes mellitus, tumores que destroem ou diminuem a função de uma glândula endócrina, incluindo os cancros que produzem metástases, como por exemplo o cancro da mama e o linfoma, o adenoma cromófobo e a hipofisite.

Deficiências na neurotransmissão também podem ser tratadas através da regulação dos níveis de LT-GPCR nos sistemas nervosos central e periférico.

Esta invenção também diz respeito à utilização de novos agentes identificados através dos ensaios de rastreio referidos mais acima. De acordo com o referido, está dentro do âmbito desta invenção a utilização de um composto teste identificado tal como referido algures neste documento, num modelo animal apropriado. Por exemplo, um agente identificado tal como descrito algures neste documento (por exemplo, um agente modulador, uma molécula de ácido nucleico "antisense", um anticorpo específico, uma ribozima ou uma molécula que liga ao polipéptido do LT-GPCR) pode ser utilizado num modelo animal a fim de se determinar a 75 ΡΕ1276867 eficácia, a toxicidade ou os efeitos secundários do tratamento com o agente referido. Alternativamente, um agente identificado tal como descrito algures neste documento pode ser utilizado num modelo animal a fim de se determinar o mecanismo de acção do agente referido. Além disso, esta invenção concerne a utilização de novos agentes identificados através dos ensaios de rastreio referidos mais acima nos tratamentos descritos algures neste documento.

Um reagente que afecte a actividade do LT-GPCR pode ser administrado a uma célula humana, tanto in vitro como in vivo, de modo a se reduzir a actividade do LT-GPCR. 0 reagente liga-se preferencialmente a um produto da expressão de gene humano do LT-GPCR. Se o produto da expressão é uma proteína, o reagente é preferencialmente um anticorpo. Para o tratamento de células humanas ex vivo pode ser adicionado um anticorpo a uma preparação de células estaminais que foram removidas do corpo. As células podem então ser repostas no mesmo ou noutro corpo humano, com ou sem propagação do clone, tal como é do conhecimento da especialidade.

Numa forma de realização, o reagente é distribuído utilizando-se um lipossoma. Preferencialmente, o lipossoma é estável no animal no qual foi administrado durante, pelo menos, cerca de 30 minutos, mais preferencialmente, por pelo menos, cerca de 1 hora e ainda mais preferencialmente, por pelo menos, cerca de 24 horas. Um lipossoma compreende uma composição lipídica que é capaz de 76 ΡΕ1276867 direccionar um reagente, particularmente um polinucleótido, para um local em particular no animal, como por exemplo, o humano. Preferencialmente, a composição lipídica do lipossoma é capaz de direccionar para um órgão específico de um animal, como por exemplo os pulmões, o fígado, o baço, coração cérebro, os nódulos linfáticos e a pele.

Um lipossoma com utilidade na presente invenção compreende uma composição lipídica que é capaz de se fundir com a membrana plasmática da célula alvo para, digamos, entregar o seu conteúdo à célula. Preferencialmente, a eficiência de transfecção de um lipossoma é de cerca de 0,5μρ de ADN por lônmole de lipossoma, distribuídos a cerca de 106 células, mais preferencialmente, cerca de Ι,Ομρ de ADN por 16nmole de lipossoma, distribuídos a cerca de 106 células, e ainda mais preferencialmente, cerca de 2,0μς de ADN por 16nmole de lipossoma, distribuídos a cerca de 106 células. Preferencialmente, um lipossoma tem entre cerca de 100 a 500nm, mais preferencialmente, entre cerca de 150 a 450nm, e ainda mais preferencialmente, cerca de 200 a 400nm de diâmetro.

Os lipossomas adequados para serem utilizados na presente invenção incluem aqueles lipossomas utilizados normalmente, por exemplo, nos métodos de entrega de genes, conhecidos por aqueles com perícia na especialidade. Os lipossomas de maior preferência incluem os lipossomas contendo uma composição lipídica policatiónica e/ou lipossomas contendo um esqueleto de colesterol conjugado ao 77 ΡΕ1276867 polietilenoglicol. Opcionalmente, um lipossoma contém um composto com a capacidade de dirigir o lipossoma para uma célula tumoral, como por exemplo, um ligando de células tumorais exposto na superfície externa do lipossoma. A complexação de um lipossoma com um reagente, como por exemplo, um oligonucleótido "antisense" ou uma ribozima, pode ser conseguida utilizando-se métodos que estão padronizados na especialidade (ver, por exemplo, U.S. Patent 5,705,151). Preferencialmente, desde cerca de Ο,ΐμρ até cerca de 10 μρ de polinucleótido são combinados com cerca de 8nmol de lipossomas, mais preferencialmente, desde cerca de 0,5μρ até cerca de 5 μς de polinucleótido são combinados com cerca de 8nmol de lipossomas, e ainda mais preferencialmente, cerca de Ι,Ομρ de polinucleótido são combinados com cerca de 8nmol de lipossomas.

Numa outra forma de realização, os anticorpos podem ser entregues a tecidos específicos in vivo, utilizando-se uma entrega dirigida mediada através de um receptor. As técnicas de entrega de ADN mediadas através de um receptor estão descritas em, por exemplo, Findeis et al., Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiou et al., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu & Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wu et al., J. Biol. Chem. 269, 542-46 (1994); Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S. A. 87, 3655-59 (1990); Wu et al., J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991) . 78 ΡΕ1276867

Determinação de uma Dosagem Terapeuticamente Efectiva A determinação de uma dosagem terapeuticamente efectiva encontra-se perfeitamente dentro das capacidades daqueles com perícia na especialidade. Uma dosagem terapeuticamente efectiva refere-se a uma quantidade do ingrediente activo que aumenta ou diminui a actividade do LT-GPCR relativamente à actividade do LT-GPCR que acontece na ausência da dosagem terapeuticamente efectiva.

Para um qualquer composto, a dosagem terapeuticamente efectiva pode ser estimada inicialmente tanto em ensaios em culturas celulares, como em modelos animais, normalmente em murganhos, coelhos, cães ou porcos. 0 modelo animal pode também ser utilizado para se determinar o intervalo de concentrações apropriadas e a via de administração. A informação assim conseguida pode depois ser utilizada para se determinarem as dosagens úteis e as vias de administração para os humanos. A eficácia e a toxicidade terapêuticas, isto é, ED5o (a dosagem terapeuticamente efectiva em 50% da população) e a LD50 (a dose letal para 50% da população) podem ser determinadas utilizando-se procedimentos farmacêuticos padronizados em culturas celulares ou em animais experimentais. A razão de dosagem dos efeitos tóxicos para os terapêuticos é o índice terapêutico, podendo este ser expresso como a razão LD50/ED50.

Sao preferíveis as composições farmacêuticas que 79 ΡΕ1276867 exibam altos índices terapêuticos. A informação obtida através dos ensaios em culturas celulares e dos estudos em animais é utilizada na formulação do intervalo de dosagem para a utilização em humanos. A dosagem contida em tais composições é preferível estar dentro de um intervalo de concentrações em circulação que incluam o ED50 com muito pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem varia dentro deste intervalo dependendo do tipo de forma de dosagem aplicada, da sensibilidade do paciente e da via de administração. A dosagem exacta será determinada pelo praticante, sob o ponto de vista dos factores relacionados com o sujeito que necessita de tratamento. A dosagem e a administração são ajustadas de modo a fornecerem níveis suficientes do ingrediente activo ou de modo a manterem o efeito desejável. Os factores que podem ser levados em conta incluem a severidade do estado da doença, o estado de saúde geral do paciente, a idade, o peso e o sexo do paciente, a dieta, o tempo e a frequência de administração, a(as) combinação(ões) do fármaco, as reacções de susceptibilidade e as tolerância/resposta à terapia. As composições farmacêuticas de duração prolongada podem ser administradas todos os 3 a 4 dias, todas as semanas, ou uma vez cada duas semanas, dependendo do tempo de semi-vida e da taxa de "clearance" da formulação em particular.

As quantidades normais de dosagem podem variar desde 0,1 a 100,000 microgramas, até a uma dosagem total de cerca de lg, dependendo da via de administração. Uma 80 ΡΕ1276867 orientação acerca de dosagens e métodos de libertação em particular é fornecida na literatura que se encontra geralmente disponível aos praticantes da especialidade. Aqueles com perícia na especialidade irão empregar formulações diferentes para nucleótidos e para proteínas ou para os seus inibidores. De um modo semelhante, a libertação dos polinucleótidos ou dos polipéptidos será específica para cada célula em particular, condições, localização, etc.

Se o regente é um anticorpo de cadeia simples os polinucleótidos que codificam o anticorpo podem ser construídos e introduzidos numa célula tanto ex vivo como in vivo, utilizando-se técnicas bem estabelecidas incluindo, mas não estando limitadas a, transferência do ADN mediada por policatião-transferrina, transfecção com ácidos nucleicos encapsulados ou nus, fusão celular mediada por lipossomas, transporte intracelular de esferas de látex revestidas com ADN, fusão do protoplasto, infecção virai, electroporação, "gene gun" e transfecção mediada por fosfato de cálcio ou de DEAE.

As dosagens efectivas in vivo de um anticorpo estão dentro do intervalo de cerca de 5μρ até cerca de 5C^g/kg, cerca de 50μρ até cerca de 5mg/kg, cerca de ΙΟΟμρ até cerca de 50(^g/kg de peso corporal do paciente e cerca de 200 até cerca de 250μρ^ρ de peso corporal do paciente. Para a administração de polinucleótidos que codificam anticorpos de cadeia simples, as dosagens efectivas in vivo 81 ΡΕ1276867 estão dentro do intervalo de cerca de lOOng até cerca de 200ng, de 500ng até cerca de 50mg, cerca de l^q até cerca de 2mg, cerca de 5μg até cerca de 50C^g e cerca de 2C^g até cerca de lOC^g de ADN.

Se o produto da expressão é um ARNm, o reagente é preferencialmente um oligonucleótido "antisense" ou uma ribozima. Os polinucleótidos que expressam os oligonu-cleótidos "antisense" ou as ribozimas podem ser introduzidos nas células através de uma variedade de métodos, tal como descrito mais abaixo.

Preferencialmente, um reagente reduz a expressão de um gene do LT-GPCR ou a actividade de um polipéptido do LT-GPCR por, pelo menos, cerca de 10, preferencialmente cerca de 50, ainda mais preferencialmente cerca de 75, 90 ou 100% relativamente à ausência do reagente. A eficácia do mecanismo escolhido para se diminuírem os níveis de expressão de um gene do LT-GPCR ou da actividade de um polipéptido do LT-GPCR pode ser avaliada utilizando-se métodos bem conhecidos na especialidade, como por exemplo, a hibridização de sondas nucleotídicas com um ARNm específico para o LT-GPCR, RT-PCR quantitativo, detecção imunológica de um polipéptido do LT-GPCR ou medição da actividade do LT-GPCR.

Em qualquer uma das formas de realização descritas acima, qualquer uma das composições farmacêuticas da invenção pode ser administrada em combinação com outros 82 ΡΕ1276867 agentes terapêuticos adequados. A selecção dos agentes adequados para serem utilizados em terapia combinada pode ser feita por alguém com perícia regular na especialidade, de acordo com os princípios farmacêuticos convencionais. A combinação de agentes terapêuticos pode actuar siner-gisticamente para realizar o tratamento ou a prevenção de diversos distúrbios que se encontram descritos mais acima. Utilizando-se esta abordagem, uma pessoa pode ser capaz de alcançar uma eficácia terapêutica com dosagens baixas de cada agente, reduzindo assim a potencialidade de efeitos secundários adversos.

Qualquer um dos métodos terapêuticos descritos mais acima pode ser aplicado a qualquer sujeito com necessidade de tal tratamento, incluindo, por exemplo, mamíferos, tais como, cães, gatos, vacas, cavalos, coelhos, macacos e, de maior preferência, humanos. Métodos de Diagnóstico

Os GPCRs também podem ser utilizados em ensaios de diagnostico para a detecção de doenças e deficiências ou susceptibilidade para doenças e deficiências relacionadas com a presença de mutações nas sequências dos ácidos nucleicos que codificam um GPCR. Tais doenças, como uma via de exemplo, estão relacionadas com a transformação celular, tal como nos tumores e cancros e com diversas doenças cardiovasculares, incluindo a hipertensão e a hipotensão, também como doenças que advêm de um fluxo sanguíneo anor- 83 ΡΕ1276867 mal, secreção anormal da aldoesterona induzida pela angio-tensina e outros controlos anormais da homeostasia dos fluidos e dos electrólitos.

Podem ser determinadas as diferenças entre as sequências de ADNc e as genómicas que codificam um GPCR em indivíduos afectados com uma doença e em indivíduos normais. Se é observada uma mutação em alguns ou em todos os indivíduos afectados mas não nos indivíduos normais, então é provável que a mutação seja o agente causador da doença.

As diferenças nas sequências entre um gene de referência e um gene contendo mutações podem ser reveladas pelo método directo de sequenciação do ADN. A acrescentar, os segmentos de ADN clonados podem ser utilizados como sondas para se detectarem segmentos de ADN específicos. A sensibilidade deste método é grandemente aumentada quando combinada com a PCR. Por exemplo, uma sequência iniciadora de sequenciação pode ser utilizada com um produto de PCR de cadeia dupla ou uma molécula molde de cadeia simples gerada através de um PCR modificado. A determinação da sequência é executada através de procedimentos convencionais, utilizando-se nucleótidos marcados com radioactividade ou através de procedimentos de sequenciação automática, utili-zando-se alvos fluorescentes.

Os testes genéticos baseados nas diferenças das sequências de ADN podem ser levados a cabo através da detecção da alteração Da mobilidade electroforética dos 84 ΡΕ1276867 fragmentos de ADN em geles com ou sem agentes desna-turantes. Podem ser visualizadas pequenas eliminações ou inserções nas sequências, por exemplo, através da electro-forese em gel de alta resolução. Os fragmentos de ADN de diferentes sequências podem ser distinguidos em geles desnaturantes de formamida com gradiente, nos quais as mobilidades dos diferentes fragmentos de ADN são retardadas nos geles em diferentes posições de acordo com as suas temperaturas de fusão ou de fusão parcial (ver, por exemplo, Myers et al., Science 230, 1242, 1985) . As alterações das sequências em localizações especificas também podem ser reveladas através de ensaios de protecção pela nuclease, tal como a protecção por RNase e SI ou pelo método de clivagem química (por exemplo, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85, 4397-4401, 1985). Deste modo, a detecção de uma sequência de ADN específica pode ser executada através de métodos tais como a hibridização, a protecção pela RNase, a clivagem química, a sequenciação directa do ADN ou a utilização de enzimas de restrição no ADN genómico e "Southern blotting". A acrescentar aos métodos directos, tal como a electroforese em gel e a sequenciação de ADN, as mutações também podem ser detectadas através da análise in situ.

Os níveis alterados de um GPCR também podem ser detectados em diversos tecidos. Os ensaios utilizados para se detectarem os níveis dos polipéptidos do receptor numa amostra corporal, como por exemplo o sangue ou uma biopsia de um tecido, derivada de um hospedeiro, são bem do 85 ΡΕ1276867 conhecimento para aqueles com perícia na especialidade e incluem o radioimunoensaio, ensaios de ligação competitiva, análise através de "western blot" e ensaios de ELISA. EXEMPLO 1

Detecção da Actividade da Proteína LT-GPCR 0 polinucleótido da SEQ ID N°:l é inserido no vector de expressão pCEV4 e o vector de expressão resultante, pCEV4-polipéptido LT-GPCR, é transfectado em células embrionárias humanas de rim 293. As células são raspadas de um frasco de cultura para 5 ml de Tris HC1, 5 mM EDTA, a pH 7,5, e são lisadas por sonicação. Os lisados celulares são centrif ugados a 1000 rpm, durante 5 minutos, a 4°C. O sobrenadante é centrifugado a 30000 x g, durante 20 minutos, a 4°C. O sedimento é suspenso em tampão de ligação, contendo 50 mM de Tris HC1, 5 mM de MgSCq, 1 mM de EDTA, 100 de mM NaCl, a pH 7,5, suplementado com 0,1% de BSA, 2 pg/ml de "phosphoramidon". Diluições óptimas de suspensões de membranas, definidas como a concentração de proteína necessária para ligar menos de 10% de um radioligando adicionado, isto é, Alfa-latrotoxina (ALX) marcada com 125I, são adicionadas a microplacas de polipropileno, de 96 poços, contendo o ligando, péptidos não-marcados e tampão de ligação, para um volume final de 250 μΐ.

Nos ensaios de equilíbrio da saturaçao da ligação, as preparações das membranas são incubadas na presença 86 ΡΕ1276867 de concentrações crescentes (de 0,1 nM até 4 nM) do ligando 125 j

As misturas da reacção de ligação são incubadas durante uma hora, a 30°C. A reacção é parada utilizando-se uma filtração através de filtros GF/B tratados com 0,5% de polietilenoimina, usando-se um colector de células. A radioactividade é medida num contador de cintilações e a informação é analisada num programa computorizado de regressão não-linear. Uma ligação não especifica é definida como a quantidade de radioactividade que permanece após a incubação da proteína de membrana na presença de 100 nM de péptido não-marcado. A concentração de proteína é medida pelo método de Bradford, utilizando-se o Bio-Rad Reagent, usando-se como padrão albumina de soro bovino. É demonstrada a actividade da proteína LT-GPCR do polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°:2. EXEMPLO 2

Ensaios de ligaçao do radioligando Células embrionárias humanas de rim 293 trans-fectadas com um polinucleótido que expressa o GPCR humano tipo latrofilina são raspadas de um frasco de cultura para 5 ml de Tris HC1, 5 mM EDTA, a pH 7,5, e são lisadas por sonicação. Os lisados celulares são centrifugados a 1000 rpm, durante 5 minutos, a 4°C. O sobrenadante é centri-fugado a 30000 x g, durante 20 minutos, a 4°C. O sedimento é suspenso em tampão de ligação, contendo 50 mM de Tris 87 ΡΕ1276867 HC1, 5 mM de MgS04, 1 mM de EDTA, 100 de mM NaCl, a pH 7,5, suplementado com 0,1% de BSA, 2 μρ/ιηΐ de aprotinina, 0,5mg/ml de leupeptina e 10 μρ/ιηΐ de f osf oramidon. Diluições óptimas de suspensões de membranas, definidas como a concentração de proteína necessária para ligar menos de 10% do radioligando adicionado, isto é, Alfa-latrotoxina (ALX), são adicionadas a microplacas de polipropileno, de 96 poços, contendo o ligando marcado com 125I ou o composto a testar, péptidos não-marcados e tampão de ligação, para um volume final de 250 μΐ·

Nos ensaios de equilíbrio da saturação da ligação, as preparações das membranas são incubadas na presença de concentrações crescentes (de 0,1 nM até 4 nM) do ligando marcado com 125I ou do composto a testar (actividade específica de 2200Ci/mmol). As afinidades de ligação dos diferentes compostos a testar são determinadas em ensaios de equilíbrio da competição da ligação, utilizando-se 0,1 nM de péptido-125I, na presença de doze concentrações diferentes de cada composto a testar.

As misturas da reacção de ligação são incubadas durante uma hora, a 30°C. A reacção é parada utilizando-se uma filtração através de filtros GF/B tratados com 0,5% de polietilenoimina, usando-se um colector de células. A radioactividade é medida num contador de cintilações e a informação é analisada num programa computorizado de regressão não-linear.

Uma ligação não específica é definida como a ΡΕ1276867 quantidade de radioactividade que permanece após a incubação da proteína de membrana na presença de 100 nM de péptido não-marcado. A concentração de proteína é medida pelo método de Bradford, utilizando-se o Bio-Rad Reagent, usando-se como padrão albumina de soro bovino. Um composto a testar que aumente a radioactividade da proteína de membrana de, pelo menos, 15% relativamente à radioactividade da proteína de membrana que não foi incubada com o composto a testar, é identificado como um composto que se liga ao polipéptido humano LT-GPCR. EXEMPLO 3

Efeito de um composto a testar na formaçao do AMP cíclico mediada pelo LT-GPCR humano A inibição da formação do AMPc mediada pelo receptor pode ser analisada em células hospedeiras que expressem o LT-GPCR humano. As células são plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas em salino fosfatado tamponado Dulbecco's (PBS, do Inglês, Dulbecco's phosphate buffered saline), suplementado com 10 mM de HEPES, 5 mM de teofilina, 2 μρ/ml de aprotinina, 0,5mg/ml de leupeptina e 10 μρ/ιηΐ de fosforamidon, durante 20 minutos, a 37°C, em 5% de CO2. O meio é aspirado e a reacção é parada pela adição de 100 mM de HC1. As placas são guardadas a 4°C, durante 15 minutos. 0 conteúdo em AMPc na solução de paragem é medido através de um radioimunoensaio. A radioactividade é quantificada utilizando-se um contador gama equipado com um software de redução de dados. 89 ΡΕ1276867

Um composto a testar que diminua a radioactividade do conteúdo de um poço relativamente à radioactividade do conteúdo de um poço na ausência do composto a testar é identificado como um potencial inibidor da formação do AMPc. Um composto a testar que aumente a radioactividade do conteúdo de um poço relativamente à radioactividade do conteúdo de um poço na ausência do composto a testar é identificado como um potencial intensificador da formaçao do AMPc. EXEMPLO 4

Efeito de um composto a testar na mobilização do cálcio intracelular A concentração do cálcio intracelular livre pode ser medida através de microespectrofluorometria, utilizando-se o corante indicador fluorescente Fura-2/ΑΜ (Bush et al., J. Neurochem. 57, 562-74, 1991). Células transfectadas estavelmente são semeadas numa placa de cultura de 35mm contendo uma lamela de cobertura de vidro inserida. As células são lavadas com HBS, incubadas com um composto a testar e cobertas com 100 μΐ de Fura-2/ΑΜ (10 μΜ), durante 20-40 minutos. Após a lavagem com HBS para a remoção da solução de Fura-2/ΑΜ, as células são equilibradas em HBS durante 10-20 minutos. As células são então visualizadas sobre uma objectiva de 40x num microscópio Fluovert FS, da Leitz . A emissão fluorescente é determinada a 510 nM, com comprimentos de onda excitatórios alternando entre os 90 ΡΕ1276867 340 nM e os 380 nM. A informação em bruto da fluorescência é convertida para concentrações de cálcio, utilizando-se curvas padrão da concentração de cálcio e software de técnicas de análise. Um composto a testar que aumente a fluorescência por, pelo menos, 15%, relativamente à fluorescência na ausência do composto a testar, é identificado como um composto que mobiliza o cálcio intracelular. EXEMPLO 5

Efeito de um composto a testar no metabolismo dos fosfo-inositídeos Células que expressam estavelmente o ADNc do LT-GPCR humano são semeadas numa placa de 96 poços e são postas em cultura até o crescimento ser confluente. No dia antes do ensaio, o meio de crescimento é mudado para 100 μΐ de meio contendo 1% de soro e 0,5 μΟί de 3H-miinositol. As placas são incubadas durante a noite numa incubadora de CO2 (5% de CO2, a 37°C). Imediatamente antes do ensaio, o meio é removido e substituído por 200 μΐ de PBS, contendo 10 nM de LiCl, e as células são equilibradas na presença do novo meio durante 20 minutos. Durante este intervalo, as células também são equilibradas com o antaqonista, adicionado numa alíquota de 10 μΐ de uma solução concentrada a 20x em PBS. A acumulação do 3H-inositol fosfato, resultante do metabolismo dos fosfolípidos de inositol, é iniciada pela adição de 10 μΐ de uma solução contendo o composto a testar. São adicionados 10 μΐ ao primeiro poço, para se medir a acumulação basal. Onze concentrações diferentes do 91 ΡΕ1276867 composto a testar são ensaiadas nos 11 poços seguintes de cada fila da placa. Todos os ensaios são executados em duplicado repetindo-se as mesmas adições em duas filas consecutivas da placa. As placas são incubadas numa incubadora de CO2, durante uma hora. A reacção é terminada pela adição de 15 μΐ de ácido tricloroacético (TCA) a 50% v/v, seguindo-se uma incubação de 40 minutos, a 4°C. Após a neutralização do TCA, com 40 μΐ de Tris a 1M, o conteúdo dos poços é transferido para uma placa filtrante Mul-tiscreen HV (Millipore) , contendo Dowex AGI-X8 (200-400 "mesh", forma de formiato). As placas de filtração são preparadas adicionando-se 200 μΐ de uma suspensão de Dowex AGI-X8 (50% v/v, água:resina) a cada poço. As placas de filtração são colocadas numa rampa de filtração de vácuo para se lavar ou eluir a cama de resina. Cada poço é lavado 2 vezes com 200 μΐ de água, seguindo-se de 2 x 200 μΐ de tetraborato de sódio a 5 mM/formato de amónio a 60 mM.

Os 3H-IPs são eluidos com 200 μΐ de formato de amónio a 1,2 M/ácido fórmico a 0,1 para placas de 96 poços vazias. O conteúdo de cada poço é adicionado a 3 ml de mistura de cintilação e a radioactividade é determinada por um contador de cintilações líquidas. EXEMPLO 6 Métodos de Ligação ao Receptor

Ensaios Padrão de Ligação. Os ensaios de ligação são levados a cabo num tampão de ligação contendo 50 mM de HEPES, pH 7,4, 0,5% de BSA e 5mM de MgCl2. O ensaio padrão 92 ΡΕ1276867 para a ligação de um radioligando a fragmentos de membrana contendo polipéptidos do LT-GPCR é levado a cabo como a seguir se descreve, em placas de microtitulação de 96 poços (por exemplo, placas Dynatech Immulon II Removaell). 0 radioligando é diluído em 50 μΐ de tampão de ligação+ PMSF/Baci até ás cpm desejadas, sendo depois adicionadas aos poços alíquotas de 50 μΐ. Para as amostras de ligações não-específicas, também é adicionado a cada poço 5 μΐ de ligando frio a 40 μΜ. A ligação é iniciada pela adição a cada poço de 150 μΐ de membrana diluída até à concentração desejada em tampão de ligação+ PMSF/Baci (10-30 μρ de proteína de membrana/poço) . As placas são depois cobertas com seladores de placas de mylar Linbro (Flow Labs) e colocadas num Dynatech Microshaker II. A ligação é deixada a ocorrer à temperatura ambiente, durante 1-2 horas, e é parada por centrifugação da placa, durante 15 minutos, a 2,000 x g. Os sobrenadantes são decantados e os sedimentos de membrana são lavados uma vez, por adição de 200 μΐ de tampão de ligação arrefecido em gelo, uma breve agitação, e uma nova centrifugação. Os poços individuais são colocados em tubos de 12x75 mm e medidos num contador LKB Gammamaster (75% de eficiência). Por este método a ligação específica é idêntica àquela medida quando o ligando livre é removido por filtração rápida (3-5 segundos) e lavado em filtros de fibra de vidro revestidos a polietilenoimina. São também utilizadas três variações de ensaios padrão de ligação. 93 ΡΕ1276867 1. Os ensaios de ligação competitiva do radioligando com uma gama de concentrações do ligando frio versus ligando marcado com 125I são levados acabo como se descreveu acima mas com uma modificação. Todas as diluições do ligando a serem ensaiadas são feitas em PMSF/Baci a 40x para uma concentração 40x da concentração final no ensaio. As amostras de péptidos (5 μΐ cada) são então adicionadas pelos poços de microtitulação. As membranas e o radioligando são diluídos em tampão de ligação isento de ini-bidores de proteases. 0 radioligando é adicionado e misturado com o ligando frio e depois a ligação é iniciada pela adição das membranas. 2. A ligação química cruzada do radioligando com o receptor é feita após um passo de ligação idêntico ao ensaio padrão. Contudo, o passo da lavagem é feito com tampão de ligação sem o BSA, para se reduzir a possibilidade de ligações cruzadas não-específicas do radioligando com o BSA. 0 passo de ligação cruzada é levado a cabo como descrito mais abaixo.

3. Também são levados a cabos ensaios de ligação em grande escala para se obterem sedimentos de membrana para os estudos de solubilização do complexo ligando-receptor e para a purificação do receptor. Estes são idênticos aos ensaios padrão excepto que (a) a ligação é levado a cabo em tubos de propileno, em volumes de 1-250 ml, (b) a concentração da proteína de membrana é sempre 0,5 mg/ml, e (c) para a purificação do receptor, a concentração do BSA 94 ΡΕ1276867 no tampão de ligação é reduzida para 0,25% e o passo de lavagem é feito com tampão de ligação sem o BSA, para se reduzir a contaminação do receptor purificado com BSA. EXEMPLO 7

Ligaçao Química Cruzada do Radioligando com o Receptor

Após um passo de ligação do radioligando como descrito acima, os sedimentos de membrana são ressuspensos em 200 μΐ, por poço da placa de microtitulação, de tampão de ligação sem BSA, arrefecido em gelo. Depois, são adicionados 5 μΐ por poço de N-5-azido-2-nitrobenzoiloxi-succinimida (ANB-NOS, Pierce) a 4mM em DMSO e misturados. As amostras são mantidas em gelo e são irradiadas com UV, durante 10 minutos, com uma lâmpada Mineralight R-52G (UVP Inc., San Gabriel, Calif.), a uma distância de 5-10 cm. Depois as amostras são transferidas para tubos de microcentrifuga da Eppendorf, as membranas são sedimentadas por centrifugação, os sobrenadantes são removidos e as membranas são solubilizadas em tampão de amostra SDS segundo Laemmli para electroforese em géis de poli-acrilamida (PAGE, do Inglês "polyacrylamide gel electro-phoresis") . A PAGE é levada a cabo tal como descrito mais abaixo. As proteínas marcadas com radioactividade são visualizadas através da autoradiografia dos geles secos em filmes Kodak XAR, utilizando-se ecrãs intensificadores de imagem, da Dupont. 95 ΡΕ1276867 EXEMPLO 8

Solubilizaçao das Membranas A solubilização das membranas é levada a cabo num tampão que contém Tris a 25 mM, pH 8, glicerol a 10% (p/v) e CaCl2 a 0,2 mM (tampão de solubilização). Os detergentes de elevada solubilidade, incluindo o Triton X-100, o desoxicolato, o desoxicolato:lisolecitina, o CHAPS e os detergentes "zwiteriónicos" são reconstituídos no tampão de solubilização a uma concentração de 10% e armazenados em alíquotas congeladas. A lisolecitina é feita de fresco devido à sua insolubilidade quando é congelada-descongelada e a digitonina é feita de fresco, a baixas concentrações, devido a sua solubilidade ser mais limitada.

Para solubilizar as membranas, os sedimentos lavados após o passo de ligação são ressuspensos livres de partículas visíveis, pipetando e agitando com um vortex em tampão de solubilização a 100,000 x g, durante 30 minutos. Os sobrenadantes são removidos e guardados em gelo e os sedimentos são desprezados. EXEMPLO 9

Análise dos Receptores Solubilizados y _ 125

Apos a ligaçao dos ligandos marcados com I e a solubilização das membranas com detergente, o complexo R:L intacto pode ser analisado através de quatro métodos 96 ΡΕ1276867 diferentes. Todos eles sao levados a cabo em gelo ou numa sala arrefecida entre os 4-10°C. 1. Cromatografia em coluna (Knuhtsen et al., Biochem. J. 254, 641-647, 1988) . Colunas de Sephadex G-50 (8 x 250 mm) são equilibradas com tampão de solubilização, contendo este detergente, a uma concentração que é a utilizada para a solubilização de membranas, e 1 mg/ml de albumina sérica bovina. As amostras das membranas solubilizadas (0,2-0,5 ml) são aplicadas ás colunas e eluidas com uma velocidade de fluxo de cerca de 0,7 ml/minuto. As amostras (0,18 ml) são recolhidas. A radioactividade é determinada num contador gama. Os volumes de vazio das colunas são determinados através do volume da eluição de azul de dextrano. A radioactividade que é eluida no volume de vazio é considerada como que estando ligada à proteína. A radioactividade que é eluida mais tarde, no mesmo volume que os ligandos livres marcados com I, e considerada nao-ligada. 2. Precipitação com polietilenoglicol (Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 318-322, 1972). Num tubo de 12 x 75 mm de polipropileno, para uma amostra de 100 μΐ de membranas solubilizadas, são adicionados 0,5 ml de globu-lina gama bovina (Sigma) a 1% (p/v) em tampão de fosfato sódico a 0,1 M, seguidos de 0,5 ml de polietilenoglicol (Sigma) a 25% (p/v) e depois misturados. A mistura é mantida em gelo durante 15 minutos. Depois são adicionados por amostra 3 ml de fosfato de sódio a 0,1 M, a pH 7,4. As amostras são filtradas rapidamente (1-3 segundos) através de um filtro de fibra de vidro Whatman GF/B e são lavadas 97 ΡΕ1276867 com 4 ml do tampao fosfato. 0 complexo receptor precipitado com PEG:ligando- I e determinado através de contagem dos gama dos filtros. 3. Ligaçao a filtros GFB/PEI (Bruns et al., Analytical Biochem. 132, 74-81, 1983) . Filtros de fibra de vidro

Whatman GF/B são embebidos em polietilenoimina (PEI, Sigma) a 0,3%, durante 3 horas. As amostras de membranas solubi-lizadas (25-100 μΐ) são substituídas em tubos de 12 x 75 mm de polipropileno. Depois, são adicionados a cada amostra 4 ml do tampão de solubilização sem detergente e as amostras são filtradas imediatamente (1-3 segundos) através dos filtros GFB/PEI e são lavadas com 4 ml do tampão de solubilização. As CPM do complexo receptor: ligando-125I adsor-vido aos filtros são determinados por contagem dos gama. 4. Carvão/Dextrano (Paul and Said, Peptides 7[Suppl. 1], 147-149, 1986) . Dextrano T70 (0,5g, Pharmacia) é dissolvido num litro de água, sendo depois adicionados 5g de carvão activado (Norit A, alcalino; Fischer Scientific). A suspensão é agitada durante 10 minutos, à temperatura ambiente, sendo depois guardada a 4°C até ser utilizada. Para se medir o complexo R:L, são adicionadas 4 partes, por volume, de carvão/dextrano a uma parte, por volume, de membrana solubilizada. As amostras são misturadas e mantidas em gelo durante 2 minutos e depois são centrifugadas durante 2 minutos, a 11000 x g, numa microcentrífuga Beckman. 0 radioligando livre adsorve ao carvão/dextrano e é desprezado com o sedimento. Os complexos receptor:li- 98 ΡΕ1276867 gando-125I permanecem no sobrenadante e são determinados por contagem dos gama. EXEMPLO 10

Purificação do Receptor A ligação do receptor-biotina ás membranas GH4CI é levada a cabo tal como acima descrito. As incubações ocorrem durante 1 hora, à temperatura ambiente. No protocolo de purificação padrão, as incubações de ligação contêm 10 nM de Bio-S29. 0 ligando-125I é adicionado na forma de um elemento radioactivo marcador, a níveis de 5000-100000 cpm por mg de proteína de membrana. As incubações controlo contêm 10 μΜ de ligando frio para saturarem o receptor com o ligando não-biotinilado. A solubilização do complexo receptor:ligando é também levada a cabo tal como acima descrito, com 0,15% de deoxicolato:lisolecitina no tampão de solubilização que contém CaCl2 a 0,2 mM, para se obterem sobrenadantes a 100000 x g contendo o complexo R:L solubilizado. A estreptavidina imobilizada (estreptavidina "cross-linked" a 6% de agarose acamada, Pierce Co; "SA-agarose) é lavada com tampão de solubilização e adicionada ás membranas solubilizadas na quantidade de 1/30 do volume final. A mistura é incubada com agitação constante por rotação top a topo, durante 4-5 horas, a 4-10°C. Depois a mistura é aplicada a uma coluna e o material não ligado é lavado ao longo da coluna. A ligação do radioligando à SA- 99 ΡΕ1276867 agarose é determinada por comparação das cpm no sobrena-dante a 100000 x g relativamente ás do efluente da coluna após a adsorção à SA-agarose. Finalmente a coluna é lavada com 12-15 volumes de coluna com tampão de solubiliza-ção+0,15% de deoxicolato:lisolecitina+1/500 (vol/vol) de 4pase a lOOx. A coluna de estreptavidina é eluida com tampão de solubilização+EDTA a 0,lmM+EGTA a 0, lmM+GTP-gama-S (Sigma) a 0,lmM+ desoxicolato:lisolecitina a 0,15%(peso/vol)+1/1000 (vol/vol) de 4pase a lOOx. Primeiro, um volume de coluna de tampão de eluição é feito passar através da coluna e o fluxo é parado durante 20-30 minutos. Depois, mais 3-4 volumes de coluna de tampão de eluição são passados através da coluna. Os eluidos são todos juntos.

Os eluidos da coluna de estreptavidina são incubados durante a noite (12-15 horas) conjuntamente com aglutinina do gérmen de trigo (agarose WGA, do Inglês "wheat germ agglutinin", Vector Labs) imobilizada para a adsorção do receptor através das interacções do hidrato de carbono ligado covalentemente com a lectina do WGA. A razão (vol/vol) da agarose-WGA relativamente ao eluido da coluna de estreptavidina é geralmente de 1:400. Também pode ser utilizado um intervalo entre 1:1000 até 1:200. Após o passo de ligação, a resina é sedimentada através de uma centrifugação, o sobrenadante é removido e guardado, e a resina é lavada 3 vezes (cerca de 2 minutos cada) com um tampão que contém HEPES a 50 mM, pH 8, MgCl2 a 5 mM e 0,15% de deoxicolato:lisolecitina. Para a eluição do receptor ligado 100 ΡΕ1276867 à WGA, a resina é extraída três vezes através de repetidas misturas (num misturador de vórtice, a baixa velocidade) sobre um período de 15-30 minutos em gelo, com 3 colunas de resina de cada vez, com N-N'-N''-triacetilquitotriose a lOmM, no mesmo tampão HEPES utilizado para lavar a resina. Após cada passo de eluição, a resina é sedimentada por centrifugação e o sobrenadante é removido cuidadosamente, livre de sedimento de agarose-WGA. Os três eluídos agrupados contêm o receptor purificado final. O material não-ligado à WGA contém subunidades da proteína G especi-ficamente eluídas da coluna de estreptavidina, também como contaminantes não-específicos. Todas estas fracções são congeladas e guardadas a -90°C. EXEMPLO 11

Identificação dos compostos em teste que se ligam aos polipéptidos LT-GPCR

Polipéptidos LT-GPCR purificados contendo a proteína glutationa-S-transferase e adsorvidos a poços de placas de microtitulação de 96 poços derivados com glutationa são postos em contacto com os compostos em teste pertencentes a uma pequena biblioteca, a pH 7,0, numa solução fisiológica tamponante. Os polipéptidos LT-GPCR compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:2. Os compostos em teste contêm um marcador fluorescente. As amostras são incubadas por um período de 5 minutos a uma hora. As amostras controlo são incubadas na ausência dos compostos em teste. 101 ΡΕ1276867 A solução tampão que contém os compostos em teste é lavada dos poços. A ligação de um composto em teste a um polipéptido LT-GPCR é detectada através da medição da fluorescência dos conteúdos dos poços. Um composto em teste que aumente a fluorescência de um poço de, pelo menos 15% relativamente à fluorescência de um poço no qual não foi incubado um composto em teste, é identificado como um composto que se liga a um polipéptido LT-GPCR. EXEMPLO 12

Identificação dos compostos em teste que diminuem a expressão do gene do LT-GPCR

Um composto em teste é administrado a uma cultura de células humanas gástricas, sendo estas incubadas a 37°C, por um período de 10 minutos a 45 minutos. Uma cultura com o mesmo tipo de células, incubada pelo mesmo período de tempo, sem o composto em teste, fornece o controlo negativo . 0 ARN é isolado das duas culturas tal como descrito em Chirgwin et al., Biochem. 18, 5294-99, 1979). São preparados "Northern-blots" utilizando-se 20 a 30 μρ de ARN total, sendo hibridizados a 65°C, em Express-Hyb (CLONTECH), com uma sonda marcada com 32P e específica para o LT-GPCR. A sonda contém, pelo menos 11 nucleótidos contíguos seleccionados a partir da complementar da SEQ ID N°: 1. Um composto em teste que diminua o sinal específico 102 ΡΕ1276867 do LT-GPCR relativamente ao sinal obtido na ausência de um composto em teste é identificado como um inibidor da expressão do gene do LT-GPCR. EXEMPLO 13

Tratamento do Síndroma de Zollinger-Ellison com um reagente que se liga especificamente a um produto do gene LT-GPCR A sintese de oligonucleótidos "antisense" do LT-GPCR compreendendo pelo menos 11 nucleótidos contíguos seleccionados a partir da complementar da SEQ ID N°:l é executada num sintetizador Gene Assembler, da Pharmacia, utilizando-se o procedimento do fosforamidito (Uhlmann et al. Chem. Rev. 90, 534-83, 1990) . Após a montagem e a desprotecção, os oligonucleótidos são precipitados duas vezes com etanol, são secos e dissolvidos em salino fosfatado tamponado (PBS, do Inglês, phosphate buffered saline) , para a concentração desejada. A pureza destes oligonucleótidos é testada através de uma electroforese capilar em gel e de um HPLC de troca iónica. Os níveis de endotoxinas na preparação dos oligonucleótidos são determinados utilizando-se o ensaio do Lisado de Amebócitos de Limulus (Bang, Biol. Buli. (Woods Hole, Mass.) 105, 361-362, 1953).

Os oligonucleótidos "antisense" são administrados a um paciente com o Síndroma de Zollinger-Ellison. A severidade do Síndroma de Zollinger-Ellison do paciente é diminuída. ΡΕ1276867 103

PROTOCOLO DAS SEQUÊNCIAS

<110> Bayer AG

<120> REGULAÇÃO DO RECEPTOR HUMANO ACOPLADO À PROTEÍNA G TIPO-LATROFILINA <130> Lio021 Países Estrangeiros <140> <141> <150> US 60/191, 103 <151> 2000-03-22 <150> US 60/210, 745 <151> 2000-06-12 <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 479

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcagaoca® çtgatges&s 60 cttttfcocaa gecadtggaa 120 ggttacooct gfcgattetca ISO fcgitaafcgfcg ««acigegtís 240 tttcgaitif etgaaeggsc 300 agatgaaaat ateactassga tfctgaeggfa tctgaacfcat 420 taeogccatc attateste 419 gt.ttcetcct teeettt tei ictttacaâg efctd«»ctca tfctggcfegai ccaaaataga tggfcgtgaât fsattf«aca tgíjagcsga t ââggsggotg gasgtc&gat ttcagftfcta ctcecttagt acacpcagge gg&c&gç.ete caccaaagca aaaaafagaa ttgeatfecci «a&tgg&aag gâtgga&a&c gaegtacfcgfc gt&gata«SDC accacatfcsc. gctgttgcag caeggtggga gggtgccata tacfcctat ta aactatgfcág ttitaatgga etgaatcatg tggtttatac <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 íh« l*ea fçe çha Se i 5 ^is íSIr Set Lys Cya 10 Ser eh# Aa» Sex 1¾¾

Asfk Set A«p 6ln. * IS AÍS Ser Ala Gla. 104 ΡΕ1276867 20 Ζ5

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Claims

ΡΕ1276867 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para o rastreio de agentes que diminuam a actividade do LT-GPCR, compreendendo os passos de i) pôr em contacto um composto a testar com o polipéptido do LT-GPCR codificado por qualquer um dos polinucleó-tidos a ser seleccionados do grupo constituído por: a) um polinucleótido que codifica o polipéptido do LT-GPCR compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID N°:2; e b) um polinucleótido que compreende a sequência da SEQ ID N°:1; c) um polinucleótido cuja sequência diverge das sequências de polinucleótidos especificadas em (a) ou (b) como consequência da degeneração do código genético e; ii) detecção da ligação do composto a testar ao polipéptido do LT-GPCR, e em que o composto a testar que se liga ao polipéptido é identificado como um potencial agente terapêutico para a diminuição da actividade do LT-GPCR.
2. Método para o rastreio de agentes que regulem a actividade de um LT-GPCR, compreendendo os passos de: i) pôr em contacto um composto a testar com o polipéptido 2 ΡΕ1276867 do LT-GPCR codificado por qualquer um dos polinu-cleótidos especificados na reivindicação 1; e ii) detecção de uma actividade do LT-GPCR do polipéptido, e em que o composto a testar que aumente a actividade de LT-GPCR é identificado como um potencial agente terapêutico para o aumento da actividade do LT-GPCR, e em que o composto a testar que diminua a actividade do LT-GPCR do polipéptido é identificado como um potencial agente terapêutico para a diminuição da actividade do LT-GPCR.
3. Método para o rastreio de agentes que diminuam a actividade de um LT-GPCR, compreendendo os passos de: i) pôr em contacto um composto a testar com qualquer um dos polinucleótidos especificados na reivindicação 1 e ii) detecção da ligação do composto a testar ao polinucle-ótido, e em que o composto a testar que ligue ao poli-nucleótido é identificado como um potencial agente terapêutico para a diminuição da actividade do LT-GPCR. Lisboa, 27 de Outubro de 2006 ΡΕ1276867 1/1 Fig, 1 gcttxcfccofc tcttt&caag attQaácaaa ccaaaa&ags gaattgea-eâ a&gg&ggctg tfccsgfcgefcâ acacccággc tceefcfctfccfc cfctxaaetca fctcggetfafc tggtgtgôat tgg&gcagafc gâ&gfceagat cfccccfct&gt ggttcagcctc caec&a&gca ttgcâ&tce® gatggaaaac gtsg® taces gcfcgttgeag gggtgceata aacfeatgoag ctgcafcggtg easââgagâa caafcgg&aag gat^tactgt accacatccc ccsggtggga fcacfcetatfcç· tttta&tgga tqgtxtatac «fccagaecaa cfcfcttteeaa. ggtfcaeccct tgfctaatgtg ttt.cga.tttg ag&tgaaaat tttgacggga t&ccgccatc çe.ga.tgact«! gca&ctggaa acactgcgtc ctgaansggac atesefcacga fccfcg&actat attctcctc Fig. 2 PLLPFSHQSK KEN^QI-MTI* FTSFUSJjHSA MÊáFWTW SISEADOOISR *TtfV2WI&F KIDGVNWm .HIFVKVTÍjFR XMKSADAW RTOFDLJJTGQ G®?KSDOTíl I.YSPEMXTT1 ornsuasm umuresmã Tomiu»?* toraxilL·