PT1266008E - Ligando de tipo 1 da proteína ligante de cálcio de indução neuronal aguda - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"LIGANDO DE TIPO 1 DA PROTEÍNA LIGANTE DE CÁLCIO DE INDUÇÃO NEURONAL AGUDA" Área da Invenção

Esta invenção refere-se a polipéptidos identificados de novo e a polinucleótidos que codificam polipéptidos tais como o por vezes referido daqui em diante como "ligando da ANIC-BP-1", à sua utilização em diagnóstico e na identificação de compostos que possam ser agonistas, antagonistas potencialmente úteis em terapia e à produção desses polipéptidos e polinucleótidos.

Contexto da Invenção 0 processo de descoberta de fármacos está presentemente a sofrer uma revolução fundamental ao acolher a "genómica funcional", isto é, biologia de alto rendimento baseada no genoma ou em genes. Esta abordagem, como meio para identificar genes e produtos de genes como alvos terapêuticos, está rapidamente a ultrapassar abordagens anteriores baseadas na "clonagem posicionai". Um fenótipo que é uma função biológica ou doença genética é identificado e este é então seguido novamente até ao gene responsável com base na sua posição no mapa genético. A genómica funcional baseia-se fortemente em tecnologias de sequenciação de DNA de alto rendimento e nas várias ferramentas da bioinformática para identificar sequências de genes de interesse potencial a partir das muitas bases de dados de biologia molecular presentemente disponíveis. Há uma necessidade continuada de identificar e 2 caracterizar mais genes e seus polipéptidos/proteínas relacionados como alvos para a descoberta de fármacos.

Resumo da Invenção A presente invenção refere-se ao ligando da ANIC-BP-1, em particular a polipéptidos do ligando da ANIC-BP-1 e polinucleótidos do ligando da ANIC-BP-1, materiais recombinantes e métodos para a sua produção. Esses polipéptidos e polinucleótidos têm interesse no que se refere a métodos de tratamento de certas doenças, incluindo, mas não se limitando a acidente vascular cerebral, traumatismo craniano, esclerose múltipla, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, lesão da espinal-medula, daqui em diante referidas como "doenças da invenção". Num aspecto suplementar, a invenção refere-se a métodos para identificar agonistas e antagonistas (por exemplo, inibidores) utilizando os materiais fornecidos pela invenção e ao tratamento com os compostos identificados de estados associados a desequilíbrio do ligando da ANIC-BP-1. Ainda noutro aspecto, a invenção refere-se a ensaios de diagnóstico para detectar doenças associadas a actividade ou níveis inapropriados do ligando da ANIC-BP-1.

Descrição da Invenção

Num primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipéptidos do ligando da ANIC-BP-1. Esses polipéptidos incluem: (a) um polipéptido codificado por um polinucleótido compreendendo a sequência da ID SEQ NO: 1; 3 (b) um polipéptido compreendendo uma sequência polipeptídica possuindo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2; (c) um polipéptido compreendendo a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2; (d) um polipéptido tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2; (e) a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2, e (f) um polipéptido tendo ou compreendendo uma sequência polipeptídica que tem um índice de Identidade de 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 ou 0,99 em comparação com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2.

Crê-se que os polipéptidos da presente invenção são membros da família de polipéptidos da família de proteínas contendo um motivo alfa não funcional. Em consequência, têm interesse porque foram recentemente identificados três membros de genes descritos da família ANIC-BP, denominados ANIC-BP-1, ANIC-BP-2 e ANIC-BP-1B. Verificou-se que o ANIC-BP-1 está regulado positivamente num modelo de rato de traumatismo craniano, como descoberto pela técnica de expressão diferencial de mRNA.

As propriedades biológicas do ligando da ANIC-BP-1 são daqui em diante referidas como "actividade biológica do ligando da ANIC-BP-1" ou "actividade do ligando da ANIC-BP-1". Preferivelmente, um polipéptido da presente invenção 4 exibe pelo menos uma actividade biológica do ligando da ANIC-BP-1.

Fragmentos dos polipéptidos da invenção podem ser empregues na produção do polipéptido completo correspondente por sintese de péptidos; em consequência, estas variantes podem ser empregues como intermediários para produzir os polipéptidos completos da invenção. Os polipéptidos da presente invenção podem estar na forma da proteina "madura" ou podem fazer parte de uma proteina maior, tal como um precursor ou uma proteina de fusão. É frequentemente vantajoso incluir uma sequência de aminoácidos adicional que contém sequências secretoras ou lider, pró-sequências, sequências que auxiliam a purificação, por exemplo, múltiplos residuos histidina, ou uma sequência adicional para conferir estabilidade durante a produção recombinante.

Os polipéptidos da presente invenção podem ser preparados de qualquer forma adequada, por exemplo, por isolamento a partir de fontes de ocorrência natural, a partir de células-hospedeiro geneticamente manipuladas compreendendo sistemas de expressão (vide infra) ou por sintese quimica, utilizando, por exemplo, sintetizadores de péptidos automáticos, ou por uma combinação desses métodos. Meios para preparar esses polipéptidos estão bem compreendidos na área.

Noutro aspecto, a presente invenção refere-se a polinucleótidos do ligando da ANIC-BP-1. Esses polinucleótidos incluem: 5 (a) um polinucleótido compreendendo uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência polinucleotídica da ID SEQ NO: 1; (b) um polinucleótido compreendendo o polinucleótido da ID SEQ NO: 1; (c) um polinucleótido tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com o polinucleótido da ID SEQ NO: 1 ; (d) o polinucleótido da ID SEQ NO: 1; (e) um polinucleótido compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2; (f) um polinucleótido compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica o polipéptido da ID SEQ NO: 2; (g) um polinucleótido tendo uma sequência polinucleotídica que codifica uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2; (h) um polinucleótido que codifica o polipéptido da ID SEQ NO: 2/ 6 (i) um polinucleótido tendo ou compreendendo uma sequência polinucleotídica que tem um índice de Identidade de 0, 95, 0, 96, 0, 97, 0, 98 ou 0,99 em comparação com a sequência polinucleotidica da ID SEQ NO: 1 ; (j) um polinucleótido tendo ou compreendendo uma sequência polinucleotidica que codifica uma sequência polipeptídica que tem um índice de Identidade de 0,95, 0,96, 0,97, 0,98 ou 0,99 em comparação com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2, e polinucleótidos que são complementares aos polinucleótidos acima mencionados ao longo de todo o seu comprimento.

Num aspecto suplementar, a presente invenção fornece polinucleótidos que são transcritos de RNA das sequências de DNA da presente invenção. Em conformidade, é fornecido um polinucleótido de RNA que: (a) compreende um transcrito de RNA da sequência de DNA que codifica o polipéptido da ID SEQ NO: 2; (b) é o transcrito de RNA da sequência de DNA que codifica o polipéptido da ID SEQ NO: 2; (c) compreende um transcrito de RNA da sequência de DNA da ID SEQ NO: 1, ou (d) é o transcrito de RNA da sequência de DNA da ID SEQ NO: 1, e polinucleótidos de RNA que são complementares a estes. 7 A sequência polinucleotídica da ID SEQ NO: 1 exibe homologia com AB011096 (KIAA0524; Nagase T. et ai., DNA Research 5, 31-39; 1998) . A sequência polinucleotídica da ID SEQ NO: 1 é uma sequência de cDNA que codifica o polipéptido da ID SEQ NO: 2. A sequência polinucleotídica que codifica o polipéptido da ID SEQ NO: 2 pode ser idêntica à sequência codificadora de polipéptidos da ID SEQ NO: 1 ou pode ser uma sequência diferente da ID SEQ NO: 1, a qual, em resultado da redundância (degenerescência) do código genético, também codifica o polipéptido da ID SEQ NO: 2. 0 polipéptido da ID SEQ NO: 2 está relacionado com outras proteínas da família da família de proteínas contendo um motivo alfa não funcional, possuindo homologia e/ou semelhança estrutural com GI-3043572 (KIAA0524; Nagase T. et al., DNA Research 5_, 31-39; 1998).

Espera-se que os polipéptidos e polinucleótidos preferidos da presente invenção tenham, inter alia, funções/propriedades biológicas semelhantes aos seus polipéptidos e polinucleótidos homólogos. Suplementarmente, polipéptidos e polinucleótidos preferidos da presente invenção têm pelo menos uma actividade de ligando da ANIC-BP.

Podem obter-se polinucleótidos da presente invenção utilizando técnicas comuns de clonagem e rastreio a partir de uma biblioteca de cDNA derivada de mRNA em células de osso, cérebro, mama, cólon, células germinativas, coração, ovário, pâncreas, paratiróide, placenta, baço, amígdalas, útero e cólon humanos (ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Clonig: A Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1989)). Também podem obter-se polinucleótidos da invenção 8 a partir de fontes naturais, como bibliotecas de DNA genómico, ou podem ser sintetizados utilizando técnicas bem conhecidas e comercialmente disponíveis.

Quando os polinucleótidos da presente invenção são utilizados para a produção recombinante de polipéptidos da presente invenção, o polinucleótido pode incluir a sequência codificadora para o polipéptido maduro, por si própria, ou a sequência codificadora para o polipéptido maduro em fase de leitura com outras sequências codificadoras, como as que codificam uma sequência líder ou secretora, uma sequência pré-, pró- ou prepro-proteína, ou outras porções de péptidos de fusão. Por exemplo, pode ser codificada uma sequência marcadora que facilita a purificação do polipéptido fundido. Em certas especificações preferidas deste aspecto da invenção, a sequência marcadora é um péptido hexa-histidina, como fornecida no vector pQE (Qiagen, Inc.) e descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1989) 8_6: 821-824, ou é uma cauda de HA. 0 polinucleótido também pode conter sequências 5' e 3' não codificadoras, tais como sequências transcritas e não traduzidas, sinais de processamento e poliadenilação, sítios de ligação de ribossomas e sequências que estabilizam mRNA.

Os polinucleótidos que são idênticos, ou que têm identidade suficiente com uma sequência polinucleotídica da ID SEQ NO: 1 podem ser utilizados como sondas de hibridização para cDNA e DNA genómico ou como "primers" para uma reacção de amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, PCR) . Essas sondas e "primers" podem ser utilizados para isolar cDNAs completos e clones genómicos que codificam polipéptidos da presente invenção e para 9 isolar cDNA e clones genómicos de outros genes (incluindo genes que codificam parálogos de fontes humanas e ortólogos e parálogos de espécies diferentes da humana) que têm elevada semelhança de sequências com a ID SEQ NO: 1, tipicamente pelo menos 95% de identidade. Sondas e "primers" preferidos compreenderão geralmente pelo menos 15 nucleótidos, preferivelmente pelo menos 30 nucleótidos, e podem ter pelo menos 50, se não pelo menos 100 nucleótidos. Sondas particularmente preferidas terão entre 30 e 50 nucleótidos. "Primers" particularmente preferidos terão entre 20 e 25 nucleótidos.

Um polinucleótido que codifica um polipéptido da presente invenção, incluindo homólogos de espécies diferentes da humana, pode ser obtido por um processo compreendendo os passos de rastrear uma biblioteca, em condições de hibridização restritas, com uma sonda etiquetada tendo a sequência da ID SEQ NO: 1 ou respectivo fragmento, preferivelmente com pelo menos 15 nucleótidos, e isolar clones de cDNA completo e genómicos contendo essa sequência polinucleotídica. Essas técnicas de hibridização são bem conhecidas do técnico experimentado. Condições de hibridização restrita preferidas incluem incubação durante a noite a 42°C numa solução compreendendo: formamida 50%, 5XSSC (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM) , fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5χ solução de Denhardt, sulfato de dextrano 10% e 2 0 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado, seguido de lavagem dos filtros em 0,1XSSC a cerca de 65°C. O técnico experimentado apreciará que, em muitos casos, uma sequência de cDNA isolada estará incompleta, pois a região que codifica para o polipéptido não se prolonga 10 completamente até ao terminal 5'. Isto é uma consequência da transcriptase reversa, uma enzima inerentemente com baixa "capacidade de processamento" (uma medida da capacidade da enzima para permanecer ligada ao modelo durante a reacção de polimerização) , não conseguindo completar uma cópia de DNA do modelo de mRNA durante a síntese do primeiro filamento de cDNA. Há vários métodos disponíveis e bem conhecidos dos experimentados na área para obter cDNAs completos, ou para prolongar cDNAs curtos, por exemplo, os baseados no método de Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA (RACE) (ver, por exemplo, Frohman et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 85, 8998-9002, 1988). Modificações recentes da técnica, exemplificadas pela tecnologia Marathon (marca registada) (Clontech Laboratories Inc.), por exemplo, simplificaram de modo significativo a busca de cDNAs mais longos. Na tecnologia Marathon (marca registada), prepararam-se cDNAs a partir de mRNA extraído de um tecido escolhido e uma sequência "adaptadora" ligada a cada extremidade. Depois efectua-se amplificação de ácidos nucleicos (PCR) para amplificar a extremidade 5' "em falta" do cDNA utilizando uma combinação de "primers" oligonucleotídicos específicos para genes e específicos para adaptadores. Seguidamente repete-se a reacção de PCR utilizando "primers" "encaixados", isto é, "primers" concebidos para hibridizarem no produto amplificado (tipicamente um "primer" específico para adaptadores que hibridiza suplementarmente a 3' na sequência adaptadora e um "primer" específico para genes que hibridiza suplementarmente a 5' na sequência do gene conhecido). Os produtos desta reacção podem então ser analisados por sequenciação de DNA, e pode construir-se um cDNA completo quer reunindo o produto 11 directamente ao cDNA existente, para dar origem a uma sequência completa, quer efectuando uma PCR completa separada utilizando a nova informação de sequência para a concepção do "primer" 5'.

Os polipéptidos recombinantes da presente invenção podem ser preparados por processos bem conhecidos na área a partir de células-hospedeiro geneticamente manipuladas compreendendo sistemas de expressão. Em conformidade, num aspecto suplementar, a presente invenção refere-se a sistemas de expressão compreendendo um polinucleótido ou polinucleótidos da presente invenção, a células-hospedeiro que são geneticamente manipuladas com esses sistemas de expressão e à produção de polipéptidos da invenção por técnicas recombinantes. Também podem empregar-se sistemas de tradução sem células para produzir essas proteínas utilizando RNAs derivados das construções de DNA da presente invenção.

Para a produção recombinante, as células-hospedeiro podem ser geneticamente manipuladas de modo a incorporarem sistemas de expressão, ou respectivas porções, para polinucleótidos da presente invenção. Os polinucleótidos podem ser introduzidos em células-hospedeiro por métodos descritos em muitos manuais laboratoriais de referência, como Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology" (1986) e Sambrook et al. (ibid.) . Métodos preferidos para introduzir polinucleótidos em células-hospedeiro incluem, por exemplo, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transvecção, microinjecção, transfecção mediada por lípidos catiónicos, electroporação, transdução, "scrape loading", introdução balística ou infecção. 12

Exemplos representativos de hospedeiro apropriados incluem células bacterianas, como células de Estreptococos, Estafilococos, E. coli, Estreptomices e Bacillus subtilis; células fúngicas, como células de levedura e células de Aspergillus; células de insectos, como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animais, como células CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 e de melanoma de Bowes, e células de plantas.

Pode utilizar-se uma grande variedade de sistemas de expressão, por exemplo, sistemas cromossómicos, epissomais e derivados de virus, por exemplo, vectores derivados de plasmideos bacterianos, de bacteriófagos, de transposões, de epissomas de levedura, de elementos de inserção, de elementos cromossómicos de levedura, de virus tais como baculovirus, virus papova, como SV40, virus vacinia, adenovirus, virus da variola das aves domésticas, vírus pseudo-raiva e retrovírus, e vectores derivados de combinações destes, tais como os derivados de elementos genéticos de plasmideos e bacteriófagos, como cosmídeos e fagemideos. Os sistemas de expressão podem conter regiões de controlo que regulam e geram expressão. Em geral, pode utilizar-se qualquer sistema ou vector que seja capaz de manter, propagar ou expressar um polinucleótido para produzir um polipéptido num hospedeiro. A sequência polinucleotidica apropriada pode ser inserida num sistema de expressão por qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas e de rotina, tais como, por exemplo, as apresentadas em Sambrook et al. (ibid.). Sinais de secreção apropriados podem ser incorporados no polipéptido desejado para permitir a secreção da proteína traduzida para o lúmen do retículo endoplasmático, espaço periplasmático ou 13 ambiente extracelular. Estes sinais podem ser endógenos ao polipéptido ou podem ser sinais heterólogos.

Se for desejado que um polipéptido da presente invenção seja expresso para utilização em ensaios de rastreio, é geralmente preferido que o polipéptido seja produzido na superfície da célula. Neste caso, as células podem ser recolhidas antes da utilização no ensaio de rastreio. Se o polipéptido for segregado para o meio, o meio pode ser recuperado de modo a recuperar e purificar o polipéptido. Se for produzido intracelularmente, as células devem primeiramente ser submetidas a lise antes de se recuperar o polipéptido.

Os polipéptidos da presente invenção podem ser recuperados e purificados a partir de culturas de células recombinantes por métodos bem conhecidos, incluindo precipitação com sulfato de amónio ou etanol, extracção com ácidos, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia com fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia em hidroxilapatite e cromatografia com lectina. Muito preferivelmente, emprega-se para a purificação cromatografia líquida de alto desempenho. Podem empregar-se técnicas bem conhecidas para o redobramento de proteínas para regenerar a conformação activa quando o polipéptido é desnaturado durante a síntese intracelular, isolamento e/ou purificação.

Os polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizados como reagentes de diagnóstico através da detecção de mutações no gene associado. A detecção de uma forma mutada do gene caracterizado pelo polinucleótido da 14 ID SEQ NO: 1 no cDNA ou sequência genómica e que está associada a uma disfunção fornecerá uma ferramenta de diagnóstico que pode reforçar ou definir um diagnóstico de uma doença, ou susceptibilidade a uma doença, resultante de sub-expressão, super-expressão ou expressão espacial ou temporal alterada do gene. Indivíduos com mutações no gene podem ser detectados ao nível do DNA por uma variedade de técnicas bem conhecidas na área.

Podem obter-se ácidos nucleicos para diagnóstico a partir das células de um sujeito, tal como a partir de sangue, urina, saliva, biopsia de tecidos ou material de autópsia. 0 DNA genómico pode ser utilizado directamente para detecção ou pode ser amplificado enzimaticamente utilizando PCR, preferivelmente RT-PCR, ou outras técnicas de amplificação antes da análise. 0 RNA ou cDNA também pode ser utilizado de forma semelhante. Podem detectar-se deleções e inserções através de uma alteração da dimensão do produto amplificado em comparação com o genótipo normal. Podem identificar-se mutações pontuais por hibridização de DNA amplificado para sequências de nucleótidos de ligandos de ANIC-BP etiquetadas. As sequências perfeitamente emparelhadas podem ser distinguidas de hélices duplas desemparelhadas por digestão com RNase ou por diferenças nas temperaturas de fusão. Também podem detectar-se diferenças nas sequências de DNA por alterações da mobilidade electroforética de fragmentos de DNA em géis, com ou sem agentes desnaturantes, ou por sequenciação directa de DNA (ver, por exemplo, Myers et al., Science (1985) 230: 1242). Alterações de sequências em localizações específicas também podem ser reveladas por ensaios de protecção de nucleases, como protecção de RNase e Sl, ou 15 pelo método de clivagem química (ver Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1985) 85: 4397-4401).

Pode construir-se uma série de sondas oligonucleotídicas compreendendo sequências polinucleotídicas de ligandos da ANIC-BP, ou respectivos fragmentos, para conduzir um rastreio eficiente, por exemplo, de mutações genéticas. Essas séries são, preferivelmente, séries ou grelhas de alta densidade. Os métodos de tecnologia de séries são bem conhecidos e têm aplicabilidade geral, podendo ser utilizados para abordar uma variedade de questões em genética molecular, incluindo expressão de genes, ligação genética e variabilidade genética; ver, por exemplo, M. Chee et al. Science, 274, 610-613 (1996) e outras referências aí citadas.

Também se pode utilizar a detecção de níveis anormalmente decrescidos ou aumentados de polipéptido ou expressão de mRNA para diagnosticar ou determinar a susceptibilidade de um sujeito a uma doença da invenção. A expressão decrescida ou aumentada pode ser medida ao nível do RNA utilizando qualquer um dos métodos bem conhecidos na área para a quantificação de polinucleótidos, tais como, por exemplo, amplificação de ácidos nucleicos, por exemplo, PCR, RT-PCR, protecção de RNase, coloração "Northern" e outros métodos de hibridização. Técnicas de ensaio que podem ser utilizadas para determinar níveis de uma proteína, como um polipéptido da presente invenção, numa amostra derivada de um hospedeiro são bem conhecidas dos experimentados na área. Esses métodos de ensaio incluem radioimunoensaios, ensaios de ligação competitiva, análise de Coloração "Western" e ensaios de ELISA. 16

Assim e noutro aspecto, a presente invenção revela um estojo de diagnóstico compreendendo: (a) um polinucleótido da presente invenção, preferivelmente a sequência de nucleótidos da ID SEQ NO: 1, ou respectivo transcrito de RNA; (b) uma sequência de nucleótidos complementar à de (a); (c) um polipéptido da presente invenção, preferivelmente o polipéptido da ID SEQ NO: 2.

Será apreciado que, nesses estojos, (a), (b) ou (c) podem constituir um componente substancial. Esse estojo terá aplicação no diagnóstico de uma doença ou susceptibilidade a uma doença, particularmente doenças da invenção, entre outras.

As sequências polinucleotidicas da presente invenção são valiosas para estudos de localização cromossómica. A sequência é especificamente dirigida para, e pode hibridizar com uma localização particular num cromossoma humano individual. 0 mapeamento de sequências relevantes para cromossomas de acordo com a presente invenção é um primeiro passo importante na correlação dessas sequências com doenças associadas a genes. Depois de uma sequência ter sido mapeada para uma localização cromossómica precisa, a posição física da sequência no cromossoma pode ser correlacionada com dados do mapa genético. Esses dados encontram-se, por exemplo, em V. McKusick, "Mendelian Inheritance in Man" (disponibilizado em rede através da Johns Hopkins University Welch Medicai Library). Em seguida identificam-se as relações entre genes e doenças que foram 17 mapeadas para a mesma região cromossómica por análise de ligação (co-hereditariedade de genes fisicamente adjacentes). Podem determinar-se as localizações cromossómicas humanas precisas para uma sequência genómica (fragmento de gene, etc.) utilizando o Mapeamento de Híbridos Radioactivos (RH) (Walter, M., Spillett, D., Thomas, P., Weissenbach, J., e Goodfellow, P. (1994) "A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes" Nature Genetics 1_, 22-28) . Alguns painéis de RH são disponibilizados pela Research Genetics (Huntsville, AL, E.U.A.), por exemplo, o painel de RH GeneBridge4 (Hum. Mol. Genet. Março 1996; _5(3): 339-46 "A radiation hybrid map of the human genome" Gyapay G., Schmitt K., Fizames C., Jones H., Veja-Czarny N., Spillett D., Muselet D., Prud'Homme J.F., Dib C., Auffray C., Morissette J., Weissenbach J., Goodfellow P.N.). Para determinar a localização cromossómica de um gene utilizando este painel, efectuam-se 93 PCRs utilizando "primers" concebidos a partir do gene de interesse em DNAs de RH. Cada um destes DNAs contém fragmentos genómicos humanos aleatórios mantidos num fundo de hamster (linhas de células híbridas humano/hamster). Estas PCRs resultam em 93 pontuações que indicam a presença ou ausência do produto de PCR do gene de interesse. Estas pontuações são comparadas com pontuações criadas utilizando produtos de PCR de sequências genómicas de localização conhecida. Esta comparação é conduzida em http://www.genome.wi.mit.edu/. 0 gene da presente invenção mapeia para o cromossoma humano Cromossoma 17 (D17S922-D17S798).

As sequências polinucleotídicas da presente invenção também são ferramentas valiosas para estudos de expressão em tecidos. Esses estudos permitem determinar padrões de 18 expressão de polinucleótidos da presente invenção, que podem dar uma indicação quanto aos padrões de expressão dos polipéptidos codificados em tecidos, por detecção dos mRNAs que os codificam. As técnicas utilizadas são bem conhecidas na área e incluem técnicas de hibridização in situ para clones dispostos em série numa grelha, como hibridização de micro-séries de cDNA (Schena et al., Science, 270, 467-470, 1995, e Shalon et al., Genome Res., 6, 639-645, 1996) e técnicas de amplificação de nucleótidos, como PCR. Um método preferido utiliza a tecnologia TAQMAN (Marca registada) disponibilizada pela Perkin Elmer. Os resultados destes estudos podem fornecer uma indicação quanto à função normal do polipéptido no organismo. Adicionalmente, estudos comparativos do padrão de expressão normal de mRNAs com o de mRNAs codificados por uma forma alternativa do mesmo gene (por exemplo, uma tendo uma alteração no potencial codificador de polipéptidos ou uma mutação reguladora) podem fornecer discernimentos valiosos quanto ao papel dos polipéptidos da presente invenção, ou da sua expressão inapropriada em doença. Essa expressão inapropriada pode ser de natureza temporal, espacial ou simplesmente quantitativa.

Os polipéptidos da presente invenção são expressos em osso, cérebro, mama, cólon, células germinativas, coração, ovário, pâncreas, paratiróide, placenta, baço, amígdalas, útero, cólon.

Um aspecto suplementar da presente invenção revela anticorpos. Os polipéptidos da invenção, ou seus fragmentos, ou células que os expressam, podem ser utilizados como imunogenes para produzir anticorpos que são imunoespecificos para polipéptidos da presente invenção. O 19 termo "imunoespecífico" significa que os anticorpos têm afinidade substancialmente maior para os polipéptidos da invenção do que a sua afinidade para outros polipéptidos relacionados da técnica anterior.

Podem obter-se anticorpos gerados contra polipéptidos da presente invenção por administração dos polipéptidos, ou fragmentos contendo epítopos, a células de um animal, preferivelmente um animal não humano, utilizando protocolos de rotina. Para a preparação de anticorpos monoclonais pode utilizar-se qualquer técnica que forneça anticorpos produzidos por culturas de linhas celulares continuas. Exemplos incluem a técnica de hibridoma (Kohler, G. e Milstein, C. Nature (1975) 256: 495-497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., Immunology Today (1983) _4: 72) e a técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). Técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples, como as descritas na Patente U.S. N° 4 946 778, também podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples para polipéptidos desta invenção. Também podem ser utilizados ratinhos transgénicos, ou outros organismos, incluindo outros mamíferos, para expressar anticorpos humanizados.

Os anticorpos acima descritos podem ser empregues para isolar ou para identificar clones que expressam o polipéptido ou para purificar os polipéptidos por cromatografia de afinidade. Anticorpos dirigidos contra polipéptidos da presente invenção também podem ser empregues para tratar doenças da invenção, entre outras. 20 20 e suspensões

Polipéptidos e polinucleótidos da presente invenção também podem ser utilizados como vacinas. Em conformidade, num aspecto suplementar, a presente invenção refere-se a um método para induzir uma resposta imunológica num mamifero, que compreende inocular o mamifero com um polipéptido da presente invenção adequado para produzir uma resposta imunológica de anticorpos e/ou células T, incluindo, por exemplo, células T produtoras de citoquinas ou células T citotóxicas, para proteger esse animal de uma doença, quer a doença já esteja ou não estabelecida no indivíduo. Uma resposta imunológica num mamífero também pode ser induzida por um método que compreende distribuir um polipéptido da presente invenção via um vector que dirige a expressão do polinucleótido e que codifica para o polipéptido in vivo, de modo a induzir essa resposta imunológica para produzir anticorpos com a finalidade de proteger esse animal de doenças da invenção. Um modo de administrar o vector consiste em acelerá-lo para as células desejadas na forma de um revestimento em partículas ou de outro modo. Esse vector de ácido nucleico pode compreender DNA, RNA, um ácido nucleico modificado ou um híbrido de DNA/RNA. Para utilização como vacina, um polipéptido ou vector de ácido nucleico será normalmente fornecido na forma de uma formulação (composição) de vacina. A formulação pode compreender suplementarmente um transportador adequado. Uma vez que um polipéptido pode ser degradado no estômago, é preferivelmente administrado de modo parentérico (por exemplo, injecção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intradérmica). Formulações adequadas para administração parentérica incluem soluções para injecção esterilizadas aquosas e não aquosas que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do receptor, 21 esterilizadas aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão ou agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas num estado liofilizado que requer apenas a adição do transportador liquido esterilizado imediatamente antes da utilização. A formulação de vacina também pode incluir sistemas adjuvantes para intensificar a imunogenicidade da formulação, como sistemas óleo-em-água e outros sistemas conhecidos na área. A dosagem dependerá da actividade especifica da vacina e pode ser facilmente determinada por experimentação de rotina.

Os polipéptidos da presente invenção têm uma ou mais funções biológicas que são relevantes em um ou mais estados de doença, em particular as doenças da invenção aqui mencionadas antes. Em consequência, é útil identificar compostos que estimulem ou inibam a função ou nivel do polipéptido. Em conformidade, num aspecto suplementar, a presente invenção proporciona um método de rastreio de compostos para identificar aqueles que estimulam ou inibem a função ou nivel do polipéptido. Esses métodos identificam agonistas ou antagonistas que podem ser empregues para fins terapêuticos e profilácticos para essas doenças da invenção aqui mencionadas antes. Os compostos podem ser identificados a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, células, preparações sem células, bibliotecas químicas, colecções de compostos químicos e misturas de produtos naturais. Esses agonistas ou antagonistas identificados desse modo podem ser substratos, ligandos, receptores, enzimas, etc., naturais ou modificados, como pode ser o caso do polipéptido, um respectivo mimético estrutural ou funcional (ver Coligan et ai., "Current 22

Protocols in Immunology" 1(2): Capítulo 5 (1991)) ou uma molécula pequena. 0 método de rastreio pode simplesmente medir a ligação de um composto candidato ao polipéptido, ou a células ou membranas contendo o polipéptido, ou respectiva proteína de fusão, através de uma etiqueta directamente ou indirectamente associada ao composto candidato. Alternativamente, o método de rastreio pode envolver medir ou detectar (qualitativamente ou quantitativamente) a ligação competitiva de um composto candidato ao polipéptido contra um competidor etiquetado (por exemplo, agonista ou antagonista). Suplementarmente, estes métodos de rastreio podem testar se o composto candidato resulta num sinal gerado por activação ou inibição do polipéptido, utilizando sistemas de detecção apropriados para as células contendo o polipéptido. Os inibidores da activação são geralmente avaliados na presença de um agonista conhecido, observando-se o efeito sobre a activação pelo agonista pela presença do composto candidato. Suplementarmente, os métodos de rastreio podem simplesmente compreender os passos de misturar um composto candidato com uma solução contendo um polipéptido da presente invenção, para formar uma mistura, medir na mistura uma actividade de ligandos da ANIC-BP e comparar a actividade de ligandos da ANIC-BP da mistura com uma mistura de controlo que não contém o composto candidato.

Os polipéptidos da presente invenção podem ser empregues em métodos de rastreio convencionais de baixa capacidade e também em formatos de rastreio de alto rendimento (HTS) . Esses formatos de HTS incluem não só a utilização bem assente de placas de microtítulo de 96 e, 23 mais recentemente, 384 cavidades, mas também métodos emergentes, como o método de nanocavidades descrito por Schullek et al., Anal. Biochem., 246, 20-29 (1997).

Proteínas de fusão, como as preparadas a partir de porções Fc e polipéptidos de ligandos da ANIC-BP, como aqui descrito antes, também podem ser utilizadas para ensaios de rastreio de alto rendimento com a finalidade de identificar antagonistas para o polipéptido da presente invenção (ver D. Bennett et al., J. Mol. Recognition, _8: 52-58 (1995), e K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 27 0 (16) : 9459-9471 (1995)) . Técnicas de rastreio

Os polinucleótidos, polipéptidos e anticorpos para o polipéptido da presente invenção também podem ser utilizados para configurar métodos de rastreio com a finalidade de detectar o efeito de compostos adicionados sobre a produção de mRNA e polipéptido em células. Por exemplo, pode construir-se um ensaio ELISA para medir níveis segregados ou associados a células de polipéptido utilizando anticorpos monoclonais e policlonais por métodos comuns conhecidos na área. Este pode ser utilizado para descobrir agentes que possam inibir ou intensificar a produção de polipéptido (também denominados antagonistas ou agonistas, respectivamente) a partir de células ou tecidos adequadamente manipulados.

Um polipéptido da presente invenção pode ser utilizado para identificar receptores ligados a membranas ou solúveis, se existirem, através de técnicas comuns de ligação de receptores conhecidas na área. Estas incluem, 24 mas não se limitam a ligação de ligandos e ensaios de formação de ligações cruzadas, nos quais o polipéptido é etiquetado com um isótopo radioactivo (por exemplo, 125I), quimicamente modificado (por exemplo, biotinilado) ou fundido a uma sequência peptidica adequada para detecção ou purificação, e incubado com uma fonte do receptor putativo (células, membranas de células, sobrenadantes de células, extractos de tecidos, fluidos corporais). Outros métodos incluem técnicas biofisicas, tais como ressonância de plasmões de superfície e espectroscopia. Estes métodos de rastreio também podem ser utilizados para identificar agonistas e antagonistas do polipéptido que competem com a ligação do polipéptido aos seus receptores, se existirem. Métodos comuns para conduzir esses ensaios estão bem compreendidos na área.

Exemplos de antagonistas de polipéptidos da presente invenção incluem anticorpos ou, nalguns casos, oligonucleótidos ou proteínas que estão intimamente relacionados com os ligandos, substratos, receptores, enzimas, etc., como pode ser o caso do polipéptido, por exemplo, um fragmento dos ligandos, substratos, receptores, enzimas, etc., ou uma molécula pequena que se liga ao polipéptido da presente invenção mas que não induz uma resposta, de modo que a actividade do polipéptido é prevenida. Métodos de rastreio também podem envolver a utilização de tecnologia transgénica e o gene do ligando da ANIC-BP-1. A área da construção de animais transgénicos está bem assente. Por exemplo, o gene do ligando da ANIC-BP-1 pode ser introduzido, por microinjecção, no pró-núcleo masculino de oócitos fertilizados, transferência retroviral para 25 embriões pré- ou pós-implantação ou injecção de células estaminais embrionárias geneticamente modificadas, tal como por electroporação, em blastocistos do hospedeiro. Animais transgénicos particularmente úteis são os denominados animais "knock-in", nos quais um gene do animal está substituído pelo equivalente humano no genoma desse animal. Os animais transgénicos "knock-in" são úteis no processo de descoberta de fármacos para a validação do alvo quando o composto é especifico para o alvo humano. Outros animais transgénicos úteis são os denominados animais "knock-out", nos quais a expressão do ortólogo animal de um polipéptido da presente invenção e codificado por uma sequência de DNA endógena numa célula está parcialmente ou completamente anulada. 0 gene "knock-out" pode ser dirigido para células ou tecidos específicos, pode ocorrer apenas em certas células ou tecidos, em consequência das limitações da tecnologia, ou pode ocorrer em todas, ou substancialmente todas, as células do animal. A tecnologia de animais transgénicos também oferece um sistema de expressão-clonagem animal completo, no qual genes introduzidos são expressos para dar origem a grandes quantidades de polipéptidos da presente invenção. São revelados estojos de rastreio para utilização nos métodos acima descritos. Esses estojos de rastreio compreendem: (a) um polipéptido da presente invenção; (b) uma célula recombinante que expressa um polipéptido da presente invenção; 26 (c) uma membrana celular que expressa um polipéptido da presente invenção, ou (d) um anticorpo para um polipéptido da presente invenção, cujo polipéptido é, preferivelmente, o da ID SEQ NO: 2.

Será apreciado que, nesses estojos, (a), (b) , (c) ou (d) podem constituir um componente substancial.

Glossário

Fornecem-se as seguintes definições para facilitar a compreensão de certos termos aqui frequentemente utilizados antes. "Anticorpos", tal como é aqui utilizado, inclui anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos quiméricos, de cadeia simples e humanizados, bem como fragmentos Fab, incluindo os produtos de uma biblioteca de expressão de Fab ou outras imunoglobulinas. "Isolado" significa alterado "pela mão do homem" a partir do seu estado natural, isto é, se ocorrer na natureza, foi alterado ou removido do seu ambiente original, ou ambos. Por exemplo, um polinucleótido ou um polipéptido naturalmente presente num organismo vivo não está "isolado", mas o mesmo polinucleótido ou polipéptido separado dos materiais coexistentes do seu estado natural está "isolado", tal como o termo é aqui empregue. Além disso, um polinucleótido ou polipéptido que é introduzido num organismo por transformação, manipulação genética ou por qualquer outro método recombinante está "isolado" mesmo 27 que ainda esteja presente nesse organismo, cujo organismo pode ser vivo ou não vivo. "Polinucleótido" refere-se geralmente a qualquer polirribonucleótido (RNA) ou polidesoxirribonucleótido (DNA) , que pode ser RNA ou DNA não modificado ou modificado. "Polinucleótidos" incluem, sem limitação, DNA de filamentação simples e dupla, DNA que é uma mistura de regiões de filamentação simples e dupla, RNA de filamentação simples e dupla e RNA que é uma mistura de regiões de filamentação simples e dupla, moléculas hibridas compreendendo DNA e RNA que podem ter filamentação simples ou, mais tipicamente, filamentação dupla, ou uma mistura de regiões de filamentação simples e dupla. Adicionalmente, "polinucleótido" refere-se a regiões de filamentação tripla compreendendo RNA, ou DNA, ou RNA e DNA. 0 termo "polinucleótido" também inclui DNAs ou RNAs contendo uma ou mais bases modificadas e DNAs ou RNAs com colunas vertebrais modificadas por motivos de estabilidade ou outros. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiadas e bases invulgares, como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita em DNA e RNA; assim, "polinucleótido" abrange formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de polinucleótidos tal como se encontram tipicamente na natureza, bem como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células. "Polinucleótido" também abrange polinucleótidos relativamente curtos, frequentemente referidos como oligonucleótidos. "Polipéptido" refere-se a qualquer polipéptido compreendendo dois ou mais aminoácidos unidos entre si por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, 28 isto é, isósteros peptídicos. "Polipéptido" refere-se tanto a cadeias curtas, habitualmente referidas como péptidos, oligopéptidos ou oligómeros, como a cadeias mais longas, geralmente referidas como proteínas. Os polipéptidos podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados por genes. "Polipéptidos" incluem sequências de aminoácidos modificadas quer por processos naturais, como processamento pós-tradução, quer por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na área. Essas modificações estão bem descritas em textos básicos e em monografias mais pormenorizadas, bem como em volumosa literatura de investigação. As modificações podem ocorrer em qualquer sítio de um polipéptido, incluindo a coluna vertebral peptídica, as cadeias laterais de aminoácidos e os terminais amino ou carboxilo. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo grau ou em graus variáveis em vários sítios de um dado polipéptido. Um dado polipéptido também pode conter muitos tipos de modificações. Os polipéptidos podem ser ramificados, em resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificações. Polipéptidos cíclicos, ramificados e cíclicos e ramificados podem resultar de processos naturais pós-tradução ou podem ser preparados por métodos sintéticos. Modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, biotinilação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma fracção heme, ligação covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, ligação covalente de um lípido ou derivado de lípido, ligação covalente de fosfatidilinositol, formação de ligações cruzadas, ciclização, formação de ligações dissulfureto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de 29 âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição de aminoácidos, mediada por RNA de transferência, a proteinas, como arginilação, e ubiquitinação (ver, por exemplo, "Proteins - Structure and Molecular Properties" 2a Edição, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nova Iorque, 1993/ Wold, F. "Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", 1-12, em "Post-translational Covalent Modification of Proteins" B. C. Johnson, Editor, Academic Press, Nova Iorque, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors" Meth. Enzymol., 182, 626-646, 1990, e Rattan et al. "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging" Ann. N.Y. Acad. Sei., 663, 48-62, 1992). "Fragmento" de uma sequência polipeptidica refere-se a uma sequência polipeptidica que é mais pequena do que a sequência de referência mas que retém essencialmente a mesma função ou actividade biológica do polipéptido de referência. "Fragmento" de uma sequência polinucleotidica refere-se a uma sequência polinucleotidica que é mais pequena do que a sequência de referência da ID SEQ NO: 1. "Variante" refere-se a um polinucleótido ou polipéptido que difere de um polinucleótido ou polipéptido de referência mas que retém as suas propriedades essenciais. Uma variante tipica de um polinucleótido difere do polinucleótido de referência quanto à sequência de nucleótidos. Alterações na sequência de nucleótidos da variante podem ou não alterar a sequência de aminoácidos de um polipéptido codificado pelo polinucleótido de 30 referência. Alterações de nucleótidos podem resultar em substituições, adições, deleções, fusões e truncamentos de aminoácidos no polipéptido codificado pela sequência de referência, como discutido abaixo. Uma variante tipica de um polipéptido difere do polipéptido de referência quanto à sequência de aminoácidos. Em geral, as alterações são limitadas de modo que as sequências do polipéptido de referência e da variante sejam intimamente semelhantes globalmente e, em muitas regiões, idênticas. Um polipéptido variante e um de referência podem diferir quanto à sequência de aminoácidos por uma ou mais substituições, inserções, deleções em qualquer combinação. Um residuo de aminoácido substituído ou inserido pode ou não ser codificado pelo código genético. Substituições conservativas tipicas incluem Gly, Ala; Vai, Ile, Leu; Asp, Glu; Asn, Gin; Ser, Thr; Lys, Arg, e Phe e Tyr. Uma variante de um polinucleótido ou polipéptido pode ter ocorrência natural, como um alelo, ou pode ser uma variante que não se sabe se ocorre naturalmente. Variantes de ocorrência não natural de polinucleótidos e polipéptidos podem ser preparadas por técnicas de mutagénese ou por sintese directa. Também estão incluídos como sendo variantes polipéptidos possuindo uma ou mais modificações pós-tradução, por exemplo, glicosilação, fosforilação, metilação, ADP ribosilação e afins. Especificações incluem metilação do aminoácido N-terminal, fosforilações de serinas e treoninas e modificação de glicinas C-terminais. "Alelo" refere-se a uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocorrendo num dado locus do genoma. "Polimorfismo" refere-se a uma variação da sequência de nucleótidos (e sequência polipeptídica codificada, se relevante) numa dada posição do genoma numa população. 31 "Polimorfismo de um Único Nucleótido" (SNP) refere-se à ocorrência de variabilidade de nucleótidos na posição de um único nucleótido do genoma numa população. Um SNP pode ocorrer num gene ou em regiões intergénicas do genoma. Os SNPs podem ser avaliados utilizando Amplificação Especifica para Alelos (ASA). Para o processo são necessários pelo menos 3 "primers". Utiliza-se um "primer" comum em complemento reverso ao polimorfismo a ser avaliado. Este "primer" comum pode situar-se entre 50 e 1500 pares de bases da base polimórfica. Os outros dois (ou mais) "primers" são idênticos entre si, com a excepção da base 3' final oscilar de modo a corresponder a um dos dois (ou mais) alelos que perfazem o polimorfismo. Em seguida, conduzem-se duas (ou mais) reacções de PCR em DNA amostra, cada uma utilizando o "primer" comum e um dos "Primers" Específicos para Alelos. "Variante de Processamento", tal como é aqui utilizado, refere-se a moléculas de cDNA produzidas a partir de moléculas de RNA inicialmente transcritas da mesma sequência de DNA genómico mas que sofreram processamento alternativo de RNA. Ocorre processamento alternativo de RNA quando um transcrito de RNA primário sofre processamento, geralmente para a remoção de intrões, que resulta na produção de mais do que uma molécula de mRNA, cada uma das quais pode codificar diferentes sequências de aminoácidos. O termo variante de processamento também se refere às proteínas codificadas pelas moléculas de cDNA acima. "Identidade" reflecte uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, determinada por comparação das sequências. Em geral, identidade refere-se a uma 32 correspondência exacta de nucleótido para nucleótido ou de aminoácido para aminoácido das duas sequências polinucleotidicas ou duas polipeptídicas, respectivamente, em todo o comprimento das sequências a ser comparado. "% de Identidade" - Para sequências onde não há uma correspondência exacta, pode determinar-se uma "% de identidade". Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para se obter uma correlação máxima entre as sequências. Isto pode incluir inserir "hiatos" em qualquer uma ou em ambas as sequências, para aumentar o grau de alinhamento. Pode determinar-se uma % de identidade em todo o comprimento de cada uma das sequências a serem comparadas (denominado alinhamento global), que é particularmente adequada para sequências de comprimentos iguais ou muito semelhantes, ou em comprimentos mais pequenos e definidos (denominado alinhamento local), que é mais adequada para sequências de comprimentos diferentes. "Semelhança" é uma medida suplementar e mais sofisticada da relação entre duas sequências polipeptidicas. Em geral, "semelhança" significa uma comparação entre os aminoácidos de duas cadeias polipeptidicas, numa base residuo por residuo, tomando em consideração não só correspondências exactas entre pares de residuos, um de cada uma das sequências a serem comparadas (como para identidade), mas também, quando não houver uma correspondência exacta, se, numa base evolutiva, um residuo é um substituto provável de outro. A esta probabilidade está associada uma "pontuação" a partir da qual se pode determinar a "% de semelhança" das duas sequências. 33

Métodos para comparar a identidade e semelhança de duas ou mais sequências são bem conhecidos na área. Assim, por exemplo, programas disponibilizados no Pacote de Análise de Sequências de Wisconsin, versão 9.1 (Devereux J. et al., Nucleic Acids Res., 12_, 387-395, 1984, disponibilizado pelo Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, E.U.A.), por exemplo, os programas BESTFIT e GAP, podem ser utilizados para determinar a % de identidade entre dois polinucleótidos e a % de identidade e a % de semelhança entre duas sequências polipeptidicas. 0 programa BESTFIT utiliza o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (J. Mol. Biol., 147, 195-197, 1981, Advances in

Applied MathematicSf 2^, 482-489, 1981) e encontra a melhor região única de semelhança entre duas sequências. 0 programa BESTFIT é mais adequado para comparar duas sequências polinucleotídicas ou duas polipeptidicas de comprimentos diferentes, em que o programa presume que a sequência mais pequena representa uma porção da maior. Em comparação, o programa GAP alinha duas sequências, encontrando uma "semelhança máxima" de acordo com o algoritmo de Neddleman e Wunsch (J. Mol. Biol., _48_, 443- 453, 1970) . O programa GAP é mais adequado para comparar sequências aproximadamente do mesmo comprimento, esperando-se um alinhamento ao longo de todo o comprimento. Preferivelmente, os parâmetros "Gap Weight" e "Length Weight" utilizados em cada programa são 50 e 3 para sequências polinucleotídicas e 12 e 4 para sequências polipeptidicas, respectivamente. Preferivelmente, determinam-se % de identidades e semelhanças quando as duas sequências a serem comparadas estão optimamente alinhadas.

Também são conhecidos na área outros programas para determinar identidade e/ou semelhança entre sequências, por 34 exemplo, a família de programas BLAST (Altschul S. F. et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, 1990, Altschul S. F. et al., Nucleic Acids Res., 25_: 389-3402, 1997, disponibilizada pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Maryland, E.U.A., e acessíveis através da página em rede do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson W.R., Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W. R. e Lipman D. J., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 8_5, 2444-2448, 1988, disponibilizada como parte do Pacote de Análise de Sequências de Wisconsin).

Preferivelmente, utiliza-se a matriz de substituição de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff S. e Henikoff J. G., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 8_9, 10915-10919, 1992) em comparações de sequências polipeptídicas, incluindo quando sequências de nucleótidos são primeiramente traduzidas para sequências de aminoácidos antes da comparação.

Preferivelmente, utiliza-se o programa BESTFIT para determinar a % de identidade de uma sequência de busca polinucleotídica ou polipeptídica relativamente a uma sequência de referência polinucleotídica ou polipeptídica, em que as sequências de busca e de referência estão optimamente alinhadas e os parâmetros do programa têm o valor por defeito, como aqui descrito antes. "índice de Identidade" é uma medida da relação entre sequências que pode ser utilizada para comparar uma sequência candidata (polinucleótido ou polipéptido) e uma sequência de referência. Assim, por exemplo, uma sequência polinucleotídica candidata tendo, por exemplo, um índice de Identidade de 0,95 em comparação com uma sequência 35 polinucleotídica de referência é idêntica à sequência de referência com a excepção da sequência polinucleotídica candidata poder incluir, em média, até cinco diferenças por cada 100 nucleótidos da sequência de referência. Essas diferenças são seleccionadas do grupo que consiste em pelo menos uma deleção, substituição, incluindo transição e transversão, ou inserção de nucleótidos. Estas diferenças podem ocorrer nas posições do terminal 5' ou 3' da sequência polinucleotídica de referência ou em qualquer sítio entre estas posições terminais, espalhadas quer individualmente entre os nucleótidos da sequência de referência quer em um ou mais grupos contíguos na sequência de referência. Por outras palavras, para obter uma sequência polinucleotídica com um índice de Identidade de 0,95 em comparação com uma sequência polinucleotídica de referência, uma média de até 5 em cada 100 dos nucleótidos da sequência de referência pode ser deletada, substituída ou inserida, ou qualquer combinação destes, como aqui descrito antes. O mesmo se aplica, mutatis mutandis, para outros valores do índice de Identidade, por exemplo, 0,96, 0, 97, 0, 98 e 0, 99.

De modo semelhante para um polipéptido, uma sequência polipeptídica candidata tendo, por exemplo, um índice de Identidade de 0,95 em comparação com uma sequência polipeptídica de referência é idêntica à sequência de referência com a excepção da sequência polipeptídica poder incluir, em média, até cinco diferenças por cada 100 aminoácidos da sequência de referência. Essas diferenças são seleccionadas do grupo que consiste em pelo menos uma deleção, substituição, incluindo substituição conservativa e não conservativa, ou inserção de aminoácidos. Estas diferenças podem ocorrer nas posições do terminal amino ou 36 carboxi da sequência polipeptídica de referência ou em qualquer sitio entre estas posições terminais, espalhadas quer individualmente entre os aminoácidos da sequência de referência quer em um ou mais grupos contíguos na sequência de referência. Por outras palavras, para obter uma sequência polipeptídica com um índice de Identidade de 0,95 em comparação com uma sequência polipeptídica de referência, uma média de até 5 em cada 100 dos aminoácidos da sequência de referência pode ser deletada, substituída ou inserida, ou qualquer combinação destes, como aqui descrito antes. O mesmo se aplica, mutatis mutandis, para outros valores do índice de Identidade, por exemplo, 0,96, 0, 97, 0, 98 e 0, 99. A relação entre o número de diferenças de nucleótidos ou aminoácidos e o índice de Identidade pode ser expressa na equação seguinte: na < xa - (xa · I) , em que: na é o número de diferenças de nucleótidos ou aminoácidos, xa é o número total de nucleótidos ou aminoácidos da ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 2, respectivamente, I é o índice de Identidade, • é o símbolo do operador multiplicação, e 37 em que qualquer produto não inteiro de xa e I é arredondado para baixo até ao inteiro mais próximo antes de ser subtraído de xa. "Homóloqo" é um termo genérico utilizado na área para indicar uma sequência polinucleotídica ou polipeptídica possuindo um grau elevado de relação de sequências com uma sequência de referência. Essa relação pode ser quantificada determinando o grau de identidade e/ou semelhança entre as duas sequências como aqui definido antes. Pertencem ao âmbito deste termo genérico os termos "ortólogo" e "parálogo". "Ortólogo" refere-se a um polinucleótido ou polipéptido que é o equivalente funcional do polinucleótido ou polipéptido noutra espécie. "Parálogo" refere-se a um polinucleótido ou polipéptido que, na mesma espécie, é funcionalmente semelhante. "Proteína de fusão" refere-se a uma proteína codificada por dois genes não relacionados e fundidos, ou respectivos fragmentos. Foram revelados exemplos nas patentes U.S. 5541087, 5726044. No caso de Fc-ligando da ANIC-BP-1, empregar uma região Fc de imunoglobulina como parte de uma proteína de fusão é vantajoso para proceder à expressão funcional de Fc-ligando da ANIC-BP-1 ou fragmentos do ligando, para melhorar as propriedades farmacocinéticas dessa proteína de fusão quando utilizada para terapia e para gerar um ligando da ANIC-BP-1 dimérico. A construção de DNA Fc-ligando da ANIC-BP-1 compreende, na direcção 5' para 3', uma cassete de secreção, isto é, uma sequência de sinal que desencadeia a exportação a partir de uma célula de mamífero, DNA que codifica um fragmento da região Fc de imunoglobulina, como parceiro de fusão, e um DNA que codifica o ligando da ANIC-BP-1 ou respectivos fragmentos. 38

Em algumas utilizações será desejável conseguir alterar as propriedades funcionais intrinsecas (ligação do complemento, ligação de Receptores de Fc) por mutação dos lados funcionais de Fc deixando o restante da proteína de fusão inalterado, ou proceder à deleção completa da parte Fc após a expressão.

Descrição das Figuras

Figura 1:

Interacção do ligando da ANIC-BP-1 com ANIC-BP-1 em S. cerevisiae EGY48/pSHl8-32

Transformou-se S. cerevisiae EGY48/18-32 (Clontech) utilizando plasmídeos que codificam proteínas de fusão com o domínio de activação de LexA e Gal-4 como indicado nas figuras. Na parte inferior da figura. Colónias simples foram isoladas e inseridas rapidamente em Meio sem histidina, triptofano e uracilo com (-WHU-Xgal) ou sem (-WHU) 40 mg/1 de X-Gal e em Meio sem histidina, triptofano, leucina e uracilo contendo 40 mg/1 de X-Gal (-WHLU-XGal). O crescimento de todas as estirpes em Meio -WHU indica a presença de plasmídeos. A cor azul de levedura e crescimento em Meio sem leucina indica interacção de iscos e presas (Via 5 e via C), uma vez que a expressão de genes repórter depende de um esquema de selecção de Dois Híbridos. As vias 1-5 e vias A-B são utilizadas como controlos. A via C indica interacção de ANIC e ANIC-BP1 neste Sistema de Dois Híbridos de Levedura. 39

Figura 2: A Estirpe de S. cerevisiae EGY48-pSH18-34 foi transformada com plasmídeos que codificam proteínas de fusão como indicado na Figura. Avaliou-se a actividade do gene repórter da β-Galactosidase utilizando ONPG como descrito ("Yeast Protocols Handbook", Clontech).

Exemplos suplementares

Construções de plasmídeos:

Clonagem de pDBLeu - ANIC-BP-1: 0 cDNA que codifica a ANIC-BP-1 foi amplificado por PCR utilizando os "primers" ANICBP-Y2H2-up (ID SEQ NO: 3, "primer" 1) e ANICBP-Y2H-low (ID SEQ NO: 4, "primer" 2) e ligado no vector pCR2.1T0P0 (Invitrogen). Subsequentemente, o vector foi clivado utilizando Nhel e Ncol e o fragmento que codifica Mo25 foi ligado em pDBLeu.

Clonagem de pLexA-MCS - ANIC-BP-1:

Os "Primers" Oligonucleotídicos Y2H-MCS1 (ID SEQ NO: 7, "primer" 3) e Y2H-MCS2 (ID SEQ NO: 8, "primer" 4) foram hibridizados e ligados em vector pLexA "restingated" com EcoRl e Sall (Clontech) para gerar o Vector pLexA-MCS contendo sítios de restrição únicos EcoRl, Sall, Xhol e Not 1.

Um fragmento que codifica a ANIC-BP-1 foi isolado do Vector pDBLeu-Mo25 utilizando EcoRl e Sall e foi ligado no 40

Vector pLexA-MCS para gerar pLexA-MCS-ANIC-BP-1. Todos os vectores foram confirmados por sequenciação. A sequência peptidica da proteína de fusão Gal4-ANIC-BP-1, compreendendo a proteína Gal4 (posição: 768-881) e uma sequência da proteína ANIC-BP-1 completa ligada de forma C-terminal, foi revelada na ID Sequência N° 5. A sequência peptidica correspondente da proteína de fusão LexA-ANIC-BP-1, compreendendo a sequência da proteína LexA (posição: 1-202) e uma sequência da proteína ANIC-BP-1 completa ligada de forma C-terminal, foi revelada na ID Sequência N° 6.

Rastreio de Dois Híbridos de Levedura para seleccionar proteínas que interagem com a ANIC-BP-1.

Um rastreio de Dois Híbridos de levedura (Proquest, Life Technologies) utilizando pDBLeu-ANIC-BP-1 como construção de isco foi efectuado como descrito (a selecção foi feita em meio Mínimo -Trp, -Leu, -His contendo 3-Aminotriazolo 25 mM). A interacção foi confirmada por ensaio de filtração com β-Galactosidase e meio sem Uracilo, Triptofano e Leucina, como descrito no protocolo dos fabricantes.

Um clone positivo foi isolado e sequenciado. O ligando da proteína de interacção correspondente foi denominado ligando da ANIC-BP-1 e as sequências foram reveladas nas ID SEQ NO: 1 e NO: 2.

Confirmação da interacção ANIC-BP-l/ligando da ANIC-BP-1 utilizando um esquema de selecção de Dois Híbridos de Levedura baseado em LexA. 41

Para confirmar a interacção num esquema de selecção

diferente, utilizou-se o sistema de Dois Híbridos LexA

Matchmaker (Clontech) de acordo com as condições dos fabricantes. Utilizou-se como isco o vector pLexA-MCS-ANICBP. Utilizou-se como presa o vector pPC86-ANICBPligand, que foi isolado no sistema de Dois Híbridos de Levedura baseado em Gal4, como descrito acima.

As interacções de EfrinaB2 com PICK1 e uma nova proteína contendo o Domínio PDZ foram utilizadas como controlos positivos na estirpe de S. cerevisiae EGY48-pSH18-32. 0 crescimento de colónias em meio sem Leucina e a cor azul das colónias indicam interacção de proteínas isco e presa.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> Merck Patent GmbH <120> Ligando da ANIC-BP-1 <130> Ligando da ANIC-BP-1 <140> <141> <160>8 <170> Patent In Versão 2.1 <210> 1 <211> 2700

<212> DNA 42 <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (363) .. (2432) <22 0> <223> Descrição do ligando da proteína ANIC-BP-1 <4 0 0> 1 agccatcect cgeetgofccg ctctctxctt tcgcccacte cctgcatctg ggcetgcatc 60 acettcgce» aeegetecce egateetgcc gacactcctc ccccaaactc etgaeeggca 1^0

ccettgcetg gtacccttct cteeattcct eeceetccat cccctttccc cgaeceetct ISO cgggecccKc tcttcecaaa acecgiggfcet ctccgcgtgg ecccgcctcc aggccgggga 240 tgscccccgc ggccccgcgc ccatggtcct gacgetgefct etcfcecgect acaagctgfcg 300 tcgcttcttc gccatgtcgg gcccacggeg gggcgccgag çggctggcgg tgectgggcc 360 ag atg ggg gcg gtg gca cgg gee eat ggfc 339 ctg egg gtg gce êgg 40?

Met Gly Ala Vãl Ala Arg Ala His Gly Gly teu Arg Vai Ala Arg 1 S 10 1$ gcc Ala GCfC Arg gaa Glu agt Ser gfcc Vai 20 gcc Ala 933 Gly gge Gly -agg Arg cac His 25 cga Arg 39* Gly gea Ala 99a Gly cgc Arg 30 cct Pro 4SS ggâ Gly 9=9 Ala Cgc Arg get Ala 35 gee Ala 93» Gly gct Ala gca Ala gca Ala 40 93= Gly efct Leu gtc Vai cgc Arg gct Ala 4S gaa Glu gea Alã S03 93= Gly 339 Gly =33 Arg so ege Arg gcg Ala 99= Gly cgt Arg 395 Gly 55 cgc Arg =93 Arg cct Pro 39= Gly cga Arg €0 get Gly ctt Leu CCS Pro 551 aefc TAr 99* Gly 65 gga Gly 39a Gly ggc Gly ctg Leu gct Ala >0 get Ala gcg Ala gee Ala 3*9 Vai 39= Oly 75 cgc Arg 3*3 Glu gta Vai gee Ala S9:9 cag ggfc cfeg tgc qac gcc ate cgc etc gat ggc gge cte gac cfcg etg 64? 43

Gin Gly Leu Cyã ASp Ais lie Arg Leu Asp Gly Gly Leu Asp Leu Leu SO 85 50 95 cgg etg etg eag 3«g «cg 9*9 etg 9«i acg ogt gtg cag gtc S«9 485 Leu Arg Leu Leu Gin Ala Pro Glu Leu Glu Thr Arg Val Glu-Ala Ala 100 lòâ 110 cgc ctg ctg 939 cag ate ctg gtg gct gag ase cga gac ege gtg 9«9 743 Arg 1««. Leu Glu Gin Sle teu Val Ala Glu As» Arg Asp Arg Val Ala 115 120 125 ogc att 999 eeg 99« gtg ate ctg asc ctg •icg **g gaa ege gaa cc: 781 Arg lie Gly Leu Gly Val lis Leu Asa Leu Ala Lys Glu Arg Glu Pra 130 135 140 9ta 9*9 etg gtg «99 agt 999 tea ggc ate ttg s*g cae atg ttc aag 638 Vai Glu Leu Ala Arg Ser Gly Ser Gly lie Leu Glu. Hia Met Phe Lys 145 ISO 155 cafc £eg 9*9 9*9 sca tge c&g *99 ctg gtg s«g gtxç 99« 99« dg gac 887 HlS Ser Glu Glu Thr Cys Gin Arg Leu val Ala Ala Gly Gly Leu Asp ISO 165 170 175 seg 9cg efcg tat «33 tgc «9« tgt a cg 9« ccc 9«9 etg etg ege CáC 835 val Leu Tyr ^rp Cyss Arg Arg Thr Asp Pro Alá Léu Leu Arg His 190 185 ISO tgc 9«9 ctg gcg ecg 99« aae tgc gcg etg esc 999 -gge eag gcg gtg 863 Cys Ala Leu Ala Leu Gly Asa Cys Ala Leu Aís Gly Gly Glu Ala val 155 200 205 cag rcga ege atg gta gag aag egç gça gçç gag tgg etc tfcc ceg etc 1031 Gtn Arg Arg S4èt Val Glu Lye Arg Alã Ala Glu Trp Leu Phe Fm Leu 210 215 220 9<=« tfce tee **S 9*9 gae 9*9 etg ctt teg ttg cac gee tgc cte 9«* 1075 Ala Fh.e Ser Lys Glu Asp Glu Leu. Leu Ser Leu Mie Ala Cys L®u Ala 325 239 235 gca 9«9 Stg ctg geg SUÊ aa« a$g gag 9tg 9*9 tgt 9*9 gtg gag sge 1127 Vai Alá val Leu Ala Thr Asn Lys Glu Val Glu Arg Glu Val Glu Arg 240 245 250 2SS fccg gg« «cg ctg g«g etc gtg 9*3 ccg ctt gtg gee teg etg gac ect 117S Ser Gly Thr Leu Ala Leu Val Glu Pr© Leu Val Alá Ser Leu Asp Pro aso 245 270 93« egc tftc gee ege tgfc etg gtg gac 9«C age gac aes age tag 99« 1223 Gly As·® Ffce Ala Arg Cys Leu Val Àsp Ala Ser Asp Thr Ser Gin Gly 275 280 285 cgc 993 CCS gaç g«c çtg esg ege Ctc stg etg etc gae tet aac 1271 Arg Gly Pro Asp Asg Leu Gin Arg Leu Vai Pr© Leu Leu Asp Ser Aso 290 295 300 cgc «3 g*g S«3 cag tgt ate 999 gtt tte tác ctt tge gee 9*9 get 1310 Arg Leu Glu Ala Gin cys 11© Gly Ala Phe Tyr Leu Cys Ais Glu Ala 3 OS 310 315 gcc ate aag age ctg caa ggt aag acc aag gtg ttc age gâc ate 93c 1367 A.1& Ile Lys ser Le« Gin Gly LV3 Thr Lys Vãl she ser A®p He Gly 44 320 325 gce etc csg age ctg Aâ3 ege ©fcg Stt Ala Xle Gin Ser L#u Lys Ar» Leu Vai 340 aa-3 teg geg «f 9'ce aag ege S«9' «fcg Lys Ser Ala Leu Ala Lys Ar» Ala Leu 355 350 c ea. cgg eee ate erg eee eee gtg ase Pro Arg Pro Jlé Leu Pr© Ser VAI Pro 370 3T§ eag aeg tgg ctg eag cag ãtc 9St ttc Gin Thr Trp Leu 61a 01n Xle Gly Ph® 3SS 300 cgg »«» eag esc? gfeg gat ggc gac CL» Aí"0 G1 w Gin Gl.n Va 1 Asp Gly Asp Leu 400 405 gaa etc «a» are gse ©tg »»<= efcg áaa Glu Leu ΟΧ* Thr Aap Lêòs Gly Met Lys 420 ttc tSK sag ete aeg »*« etc aag Phe Phe Arg Glu Leu Tàr Glu Leu Lya 435 440 cgc gee cgc age aae atg gcg gac tgg Cys Asp Arg Ser Asa Leu Ala Asp TAp 4$0 455 fcfcc cge eag tae ace tas gge utg st« Ph® Arg •Gin Tyr Tfcr Tyr Gly Leu vai 465 4-70 ctg cfcg c*c ege »o» tet »a» ea.g eag Leu Leu Kís Arg Vai Ser 61« Gin Gla 430 4 as eac ertg ggc gt» cac ege gee ç»t â£e Hi9 Leu Gly Vs 1 .Bis SOO Arg Ala Axg 11® eta cae tcc eeg efcg cee ε»ΐ aefc SSL Leu Ms Ser Pro Leu Pro Cys Thr siy sis 530 CCS »*t gtc ttc ate tac cee CS3 Pre> Asa Vai Ph® llfi Ssr Tyr Arg Arg S30 53 $ ago cfcc ct» aag St» c«c ctg èag Ct,g Ser L-fiU Leu Lys Vai Ki» Leu GlU Leu 54 S 55Q ga:S sm »eg «a» ufcg gaa gc* m<s aag Âsp Vel Glu Lye Leu Glu Ala Gly Lys

BSO 5SS 330 33S tcc t&ç tet açç aat. gge act 14 IS Ser 34.5 Tyr Ser Thr Aâfl GXy ISO Thr ®gç ctg ctg ggc 3-AS 9«g gig 1463 Arg Leu Le« Gly Gl.U 365 Glu V»I age tgg aag 330 gee gag »tt 1:511 S®:r Trp Lys Glu 300 Ala Glu Val tce aag taç tge »*» age 6t" 1553 Ser Lye T>r 3 95 Cye Glu ser Phe ctt çtg cgg ctc ácg 94» 9A3 1607 Leu Leu 410 Arg Leu Thr Glu Glu 415 ecg ggc etc ace ege aag agg 1655 Ser 433 Gly íl® Thr Arg Lys 430 Arg acé ttc gee aac tafc tet acg 1103 thr P&e Ala Asa Tyr 445 Ser Thr ctg ggc •age ctg »ac cc» ege IfSl Leu Gly Ser Leu 460 Asp Pr* Arg sgs fcgc 93« «t9 gaç ege tcc 17 SS ser Cys Gly 4?S Leu Asp Arg Ser ctg ctg gaa gae tgc S9C ate 114 7 Leu LiSU aso Glu Asp cys Gly lie 49$ ctc ®cg geg gee age gse At» 1096 Leu 505 Thr Ala AI A Arg Glu S10 MBS ggç aee cec agt ggs gac aet 1943 Gly Lys £x;o ser Gly 5:15 ASp Thr áèc tCA mt tcc cag ctg gee 1991 ASft Ser Gly Ser 540 Gin LéU Ala cat SBC fcte ASA gtc ttc att 203 S Kis Oiy Phe SSS Ser VAX The Ile ttc 9«3 gae aaa etc ate CA» 2007 PA® Glu s?o Asp Lys Leu 11® 61a 575 45 45 age gte atg ggt gee ege aac ttt gtg ttg gtg cta tea eet gga gea 2135 Ser Vai Met «ly Ala Arg Agn Phe Val Leu Val Leu Ser Prõ Gly Ala sao 585 S90 ctg gac aag tge atg eaa gac cat gac tgc aag gac tgg gtg cat aag 2163 Leu Asp Lys Cys Met Gin Asp HÁS À»p Cys Lys Asp Trp Val His Lys 53S 600 SOS gag att gtg act gct tta age tgc gg« aag aac att gtg ccc ate att 2331 Glu Xle Val Thr Ala Leu Ser Cys Gly Lys Asrt Ile Val Pr<? Ile Ile 610 615 620 gat SS<= tte gag tgg cct «ag ccc cag gtc ctg cct gag gac atg cag 2273 Asp Gly Ph.e Glu Trp Pro Glu Pro Gin Vál Leu Pro Glu Aep Ket Gin 625 630 635 gct gtg etc act ttc sac ggt ate aag tgg tcc cae gaa tac cag gag 2327 Ala Vai Leu Thr Phe Aâh Gly Ile LyS Trp Ser His Glu Tyr Gin Glu 640 645 650 65S gee acc att gag aag ate ate ege tcc ctg cag ggc ege tee tcc egg 2375 Ala Thr Ile GlU Lys Ile Ile Arg Phè Leu Gin Gly Arg Ser ser Arg 6SS S6S 676 gac tea tefc gea ggc tet gac a. Cr cr agt ttg g^g ggt gct gea ccc atg 2423 Asp ser Ser Ala Gly Ser Asp Thr Ser Leu Glu Gly Ala Pro Met 67$ 6' SD 665 ggt cca acc taaccagtcc ccagttccec agceetgetg tgaettscat 2473

Gly Pro Thr 690 ettfcctgaag g&acagctce tcaggaaatg gctctccctc tcctcagtat ttggagaggg caggccctgc çattgggttg ttcc&tegte tgggetette caacccactt agaactecee tgaaacc&gt cteectggge tgagacaacc 2S22 eeectgtecc ceaccctcat ggcccacctc 2552 aagggaagte aggcttgggc acgggaggtt 2652 tctgtctccg tcatgggg 2700

<210> 2 <211> 690 <212> PRT <213> Homo sapiens <223> Descrição do ligando da proteina ANIC-BP-1 46 <400> 2

Het I Gly Ala Vai Ala 5 Arg Ala Sis Gly Gly Leu 10 Arg Vai Ala Arg Ala, 15 Arg Gl» Ser Vai 20 Ala Gly Gly Arg Sis Arg Gly 25 Ala Gly Arg 30 Pro Gly Ma Arg Ala Ala 35 Gly Ala Ala Ala Gly ao Lsu val Arg Ala 4 5 GlU Ala Gly Gly Arg Arg Ala 50 Gly Arg Gly 55 Arg Airg Pr* Gly Arg 50 5iy Leu Sro Thtr Gly 65 Gly Gly Gly Leu Ala Ala 70 Ala Ala Vai Gly 73 Arg Glu vai Ala Glu 60 Gly Leu CyS Aâp Ala 85 ila Arg Leu AS£) Gly Gly 00 Leu Asp Leu. .Leu Leu Arg Leu Leu Gin 100 Ala Pro Glu Leu Glu 1.05 TAr Arg val Gl» Ala 110 Ala Arg Leu Leu Glu Olw. 115 Ile Leu Vai Ala Glu Í2G Asn Arg Asp Arg 125 Vai Ala Arg 11® Gly Léu Gly 130 val ile Leu 135 Asn Leu .Ala Lys Glu 140 Arg Glu Pr* vai Glu 145 Leu Ala Arg Ser Gly Ser 15 õ Gly He Leu Glu 155 Mís Mac. Phe LyS Sis ISO Ser Glu Slu Tfcr Cys 165 Gin Arg Leu Vai Ala Ala 170 Gly Gly Leu Asp Ala 175 Vai Leu Tyr Trp 100 cys Arg Arg Tlsr Asp 185 Pr» Ala Leu Leu Arg 130 His Cys Ala Leu Ala Leu 155 Gly Asn Cys Alá Leu 203 Hie Gly Gly Glu 2 05 Alá. vai Gin Arg Arg 34é£ Vai 210 Glu Lys Arg Ala Ala 21S Glu Trp Léu 220 Phe Pto Leu Ala Phe 225 Ser Lys Slu Asp Glu Leu 230 Leu ser Leu His 235 Ala cys Leu Ala Vai 240 Ala Vai Leu Ala Tht 245 Asn Lys Glu Vai Glu Arg 2 se Glu Vai Glu Arg Ser 355 Gly Thr Leu Ala 260 Leu Vai Glu Pro Leu 26S Vai Ala Ser Leu Asp 270 Pt* Gly Arg Phe Ala Arg 2 75 Cys Leu vai Asp Ala 2S0 Ser Asp Tfor Ser 205 Gin Gly Arg Sly Pr© Aa* A#p 290 Leu Gin Arg 295 Leu Vai Pr* Leu Lá» 300 A#p Asn Arg Leu 305 Gle Ala Gla. Cys 11« Gly 310 Ala pisa Tyr Leu 315 Cys Alá £$ à.w Ala Ala 320 47 lie Lys Ser Leu Gin 325 Gly Lys Thr Lys val 330 Fhe Ser Asp lie Gly 335 Ala Ile Gin Ser Leu 340 Lys Arg Leu Val Ser Tyr 345 Ser Thr Aã» Gly 3S0 Thr Lys Ser Ala Leu 355 Ala Lys Arg Ala Leu 360 Arg- Leu Leu Gly 81» 365 Glu vai Prç Arg Fm 370 He Leu Pró Sèr val 375 Pro Ser Trp Lys 61.U 300 Ala Glu val Gin Thr Trp Leu Gin Gin Ile Gly Fhe ser Lys Tyr Cys Glu Ser Pbe Arg 3SS 390 395 400

Glu Gin 61» Vai Asp Gly Asp Leu Leu L&v Arg Leu Thr Glu Glu Glu 405 410 415

Leu 6ia Thr Asp Leu Gly wet Lys Ser Sly Ile Thr teg Lys Arg Bhe 430 425 430

Phe Arg Glu 435 Leu Thr Glu Leu Lys Thr 440 Phe Ala Asn Tyr Ser Thr 44S Cys Aap Arg Ser 45Θ: Asn Leu Ala Asp Trp Leu Gly ser 455 Leu Asp Pr© Arg 460 The Arg Gin. 4 $5 Tyr Thr Tyr Gly 470 Leu Val Ser Cys Gly 475 Leu Asp Arg Ser Leu 480 Leu His Arg Val ser 485 Glu Gin Gin Leu Leu Glu 430 Asp Cys Gly Ile 4:93 His teu Gly Vai His 500 Arg Ala Arg Ile Leu SOS Thr Ala Ala Arg Glu M«r 510 Leu His ser Pr© SIS Leu Pro cys Thr Gly Gly 520 Lys Pxo Ser Gly Asp Thr 52 5 Fxo Asp val S38 Phe Ile Ser Tyr Arg 535 Arg Asn Ser Gly Ser Glu Leu Ala S40 Ser Leu Leu S4S Lys Val His Leu 550 Gin Leu Bis Gly Phe 555 ser vai. Fb« Ile Asp 560 Val Glu Lys Leu. Glu 565 Ala Gly Lys Phe Glu Asp 570 Lys Leu ile Gin 575 Ser vai Kefc Gly Ala. 580 Arg Asu Fhe Val Leu 5SS V4tl Leu Ser Fr·© Gly Ala 590 Leu Asp Lys Cys Het sss Glfi ÀSp His Asp Cys 600 Lys Asp Trp val His Lys 605 Glu

Ile Vâl Thr Ala Leu Ser Cys Gly Lys Asa Tle Vai J?ra Ile Sle Asp 610 61S 620

Gly S?hè Glu Trp Pt» <3lu Vro Gin Vai Leu w» Glu Asp Met Gin Ala 625 630 Ê3S 640 48

Vai hm Thr Phe Aen Gly lie Lys Trp Ser Bis <3iu Tyr Gin Glu Ala 64 5 650 6S5

Thr Ile Glu Lys íle lie Arg Phè Leu Gin Gly Arg Ser ser Arg Asp 660 665

Ser Ser Ala Gly Ser Asp Thr Ser Leu Glu Gly Alá Ala Pro Met Gly S7S 660 €SS

Pro Thr 6 90

<210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" 1 <400> 3 egatgetage atgccgttcc egtítggg 28

<210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: "primer" 2 <400> 4 c.gatccatgg ttaagctlct tgctgagc 2,8

<210> 5 <211> 496 <212> PRT 49 <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: proteína de fusão Gal4-ANIC-BP-l <400> 5 «et X Lys Leu. Leu Ser Ser S lie Glu. Gin. Ala Cys Asp lie 10 Cys Arg 15 Leu Lys tys Leu Lys 20 Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala 25 Lys 30 Cys Leu Lys Asm Asa Trp 3 5 Glu Cys Arg Tyr 4:0 Ser Pro Lys Thr Lys 45 Arg Ser Pro Leu Thr 50 Arg Ala His Leu Thr Glu ss Vai Glu Ser Arg Leu 60 Glu Arg Leu Glu «5 Gin Leu Phe Léu Léu 70 lie Phe Pro Arg Glu Asp Leu 7S Aap Met Ue 80 Leu Lys Het Asp Ser Léu SS Gin Asp lie Lys Ala Leu Leu 90 Thr Gly S5 Le» Phe vai Gin Asp Asn Vai 100 Asn Lys Asp Ala Vai Thr Asp 105 Arg 1X0 Leu Ala ser vai Glu Thr Asp «et U5 Pro Leu 120 Thr Léu Arg Gin Kis 125 Arg Xle Ser Ala Thr 13& Ser Ser Ser Glu Glu Ser 135 Ser Asm Lys Gly Gin 140 Arg Gin Leu Tte 145 Vai Ser Ser &rg Ser ISO Thr Pro Gly Ala Ser «et Pro IS 5 Phe Pro Phe 160 <Hy Lys Ser His Lys Ser l€S Pro Ala Asp Xle Vai Lys Asm 170 Leu Lys 175 Glu Ser «aé Ala vai ISO 01 u. Lys Gin Aap Ile Ser Asp Lys 1SS Lys ISO AXâ f3Xu, Lys Aliâ Thr Glu 19S Glu Vai Ser Lys 2õ0 Agn Léu Vai Ala «et 20S Lys Glu Xle Leis Tyr Cly Thr 210 ÃSÍ1 Glu Lys Glu 215 Pro Gin Thr Glu Ala 220 vai Ala Gin 50

Leu 225 Ala Gin Glu Leu Tyr 230 Asn $êr Gly Léu Leu 235 Ser Thr Leu Vai Ala 240 ASp Leu Gin Lsu Ile 245 Asp Phe Glu Gly Lys 250 Lys Asp vai Ala Gin lie 2SS Phe As» As» lia 250 Leu Arg Arg Gin Ile 2SS Q \y Thr Arg Thr Pro 270 Thr Vai Glu Tyr lie 27$ cys Thr Gin Gin Asn 280 ile Leu Phe «et Leu 285 Leu Lys 01y Tyr Glu Ser 290 Pro Glu Ile Ala Leu 255 As» Cys Gly ile 300 Wat Leu Arg Glu cys 305 Ile Arg Mis Glu Pro 310 Leu Ala Lys Ilé Ile 315 Léu Trp Ser Glu Cl» 320 phe Tyr Asp Pite Phe 325 Arg Tyr Vai Glu Heç 330 Ser Thr Phe ASp Ile Ala 335 Ser Asp Ala Phe 340 Alâ Thr Phe Lys Asp 345 Leu Leu Thr Arg His 350 Lys Leu L-eu Ser Ala 355 Glu Phe Leu Glu Gin 360 Mis Tyr Asp Arg Phe 3SS Phe Ser Glu Tyr Glu lye 370 Leu Leu 8i$ Ser Glu 375 Asn. Tyr Vai Thr 380 Lys Arg Gin Ser Leu 385 lys Leu Leu Gly Glu 300 Leu Leu Leu Asp Arg 395 Mis Asn Phe Thr Ile 4 00 Méfc Thr LyS Tyr Ils 405 Ser Lys Pro Glu Asn 410 Léu Lys Leu Met «et Ass 415 Leu Leu Arg Asp 420 Lys Ser Arg Asn lie 425 01» Phe Glu Ala Phe 430 His Vai Phe Lys Vai 435 Phe vai Ala As» Pro 440 As» Lys Thr Gin Pro 445 Ile Leu Asp Ile Léu Léu 450 Lys As» Gin Ala Lys 45$ Leu Ile Glu Phe 450 Leu Ser Lys Phe Gin 465 Aâti Asp Arg Thr Glu 470 Asp Glu Gin Phe Asn Asp 47S Glu Lys Th r Ty r 480 Leu Vai lys Gin Ile Arg Asp Leu 485 <210> 6 <211> 552 <212> PRT <213> Sequência Artificial Lys Arg 490 Pro Ala Gin Gin Glu Ala 495 <220> 51 <223> Descrição da Sequência Artificial: proteína de fusão LexA-ANIC-BP-1 <400> 6

Lys A ia Leu τί» Ala Arg 01n Gin Glu Val Phe Asp Leu ile Arg 1 s 10 15 Asp His lie Ser Gin Thr Gly Pro Pro Thr Arg Ala Glu Ile Ala 20 25 30 Gin Arg Leu. Gly Phe Arg Ser Pro Asn Ala Ala. Glu Glu His Leu Lys 35 40 45 Ala Leu Ala Arg Lys Gly Val lie Glu lie val Ser Gly Ala Ser Arg so 55 60 Oly lie Arg Leu Leu Gin Glu Glu Glu Glu Gly Leu Pro Leu Val Gly 65 70 75 80 Arg Vai Ala Ala Gly Glu Pro Leu Leu Ala Gin Glu His Ile Glu Gly 85 90 95 His Tyr Gin vai ASp Pro Ser teu Phe Lys Pro Asn Ala Asp Phe Leu 100 105 110 Leu. Arg vai ãer Gly Hec Ser Mac Lys Asp lie Gly lie Mec Asp Gly 115 120 125 Mp Lfiu Leu Ala Val. His Lys Thr Gin ASp Val Arg Asa Gly Gin Val 130 135 140 Vai Vai Ala Arg ils Asp Asp Glu val Thr Val Lys Arg Leu Lys Lys 145 ISO 1SS 160 Gin Gly Asm Lys Val Glu Leu Leu Pro Glu As» Ser Glu pha Lys Pro 165 170 175 lie Vai Vai Asp Leu Arg Gin Gin Ser Ph-e Thr lie Glu Gly Leu Ala ISO iâs 190 vai Oly vai n« Arg Asn Gly Asp Trp Leu Glu Phe Arg Ser Thr pro 19S 200 205 Gly Ala ser «et Pro J%e Pro Phe Gly Lys Ser HiS Lys Ser Pro Ala 210 215 220 52

Asp 22S Ile Vai Lys Asn Leu 220 Lys Glu Ser Met Ala 235 vai Leu Glu Lys Gin 24.0 Asp Ile Ser Asp Lys 2:4 5 Lys Ala Glu Lys Alá 250 Thr Glu Glu Val Ser 255 Lys Asn Leu vai Ala 360 Met Lys Glu Ile Leu SOS Tyr Gly Thr Asn Glu 270 Lys Glu PB®· 31» Thr 27$ Glu Ala Vai Ala Gin 200 Leu Ala Gin Glu Leu 28S Tyr Asn Ser Giy ÍíSU 290 Leu Ser Thr Leu Vai. 295 Ala Asp Leu Gin Leu 300 Ile. Asp Phe Glu Oly 3 OS Lys Lyâ A&p val Ala 310 Gin na. Phe Asn Asti 315 lie Leu Arg Arg Gin 330 Ile Sly Thr Arg Thr 325 Oro Thr Vai Glu Tyr 330 Ile Cys Thr Giti Gin 335 Asn lie Leu Phe Met 340 Leu Leu. Lys Gly Tyr 345 Glu Ser Pr® Glu Ile 350 Ala Léu AS» Cys G1 y 355 Ile Met. Leu Arg Gl » 3Ê0 cys Ile Arg Mis Glu 365 Pro Leu Ala Lys ile 3 70 Ile Leu Trp Ser Glu 375 Gin. Phe Tyr Asp Pb® 3SG phe Arg Tyr Val Glu 385 Met Ser Thr Phe Asa 390 ile Ala ser Asp A Ia 395 Phe Ale Thr Pis® Lys 400 Asp Leu Leu Thr Arg 405 Bis Lys Leu Leu Ser 410 Ala Glu Phe Leu Glu 413 Gin Ui» Tyr Asp Arg 420 Phe Phe ser GlU Tyr 425 Glu Lys Leu Leu Mis 430 Ser Glu As» Tyr Vai 435 Thr Lyâ Arg Glrt Ser 440 Leu Lys Leu Leu Sly Glu 445 Leu Leu Leu ASp 4S-0 Arg Hjs Asn Phe Thr 4SS Ile Met Thr Lys Tyr 460 Ile Ser Lys Pr® Glu 465 Asn Léu Lys Leu «st 470 Met Aen Leu Leu Arg 475 Asp Lys Ser Arg AS» 480 He 31» Phe Glu Ala 48S Fh® Mis Vai Phe Lys 490 vai Phe vai Ala Asn 495 Pr® Agn Lys Thr Gin SOO Pr® Ile Leu Asp Ile SOS Leu Leu Lys Asn Glu 510 Ala Lys Leu ile Glu SIS Phe Leu Ser Lys Phe 520 Gin Asn Asp Arg Thr 535 Glu Asp Glu 31» Fba 520 As» Asp Glu Lys Thr 535 Tyr Leu Vai Lys 03» 540 11« Arg Asp Leu Lys Arg Pr® Ala Gin Gin Glu Ala

§4S SSO 53 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: <4 0 0> 7 aatíccí sggt cgacclcgs ig gc ggccgct 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: <4 0 0> 8 "primer" 3 "primer" 4 iegaactgge cgcctcgagg ícgacctgg 29

Lisboa, 27 de Novembro de 2006

Claims (4)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína do ligando da ANIC-BP-1 isolada que se liga a uma proteína de fusão compreendendo a sequência da ANIC-BP-l das ID SEQs 5 e/ou 6 seleccionada do grupo que consiste em: (a) um polipéptido codificado por um polinucleótido compreendendo a sequência da ID SEQ NO: 1; (b) um polipéptido compreendendo uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2; (c) um polipéptido tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2; (d) a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2.

2. Polinucleótido isolado seleccionado de um dos grupos que consistem em: (a) um polinucleótido isolado compreendendo uma sequência polinucleotídica tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência polinucleotídica da ID SEQ NO: 1 ; (b) um polinucleótido isolado tendo pelo menos 95% de identidade com o polinucleótido da ID SEQ NO: 1; (c) um polinucleótido isolado compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2/ (d) um polinucleótido isolado tendo uma sequência polinucleotídica que codifica uma sequência polipeptídica tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência polipeptídica da ID SEQ NO: 2; (e) um polinucleótido isolado que é o equivalente de RNA de um polinucleótido de (a) até (d); 2 ou uma sequência polinucleotídica complementar ao referido polinucleótido isolado ao longo de todo o seu comprimento.

3. Sistema de expressão isolado compreendendo um polinucleótido capaz de produzir um polipéptido de qualquer uma das Reivindicações 1-2 quando o referido vector de expressão está presente numa célula hospedeiro compatível.

4. Célula hospedeiro recombinante não humana compreendendo o vector de expressão da Reivindicação 3 ou respectiva membrana que expressa o polipéptido de qualquer uma das Reivindicações 1-2. Lisboa, 27 de Novembro de 2006