PT1228197E - Bactérias simbióticas e suas aplicações. - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

BACTÉRIAS SIMBIÓTICAS E SUAS APLICAÇÕES O invento tem por objecto novas bactérias simbióticas e suas aplicações, designadamente, para a despoluição do meio ambiente.

Sabe-se que as bactérias simbióticas, comummente chamadas rizóbia, têm um papel importante no meio ambiente e na agricultura. Ao formarem simbioses com as leguminosas são efectivamente responsáveis, em grande parte, pela fixação do azoto atmosférico na terra.

Estes microrganismos são bactérias do solo e desenvolvem, na maior parte das 18000 espécies da família das leguminosas, órgãos especializados, chamados nódulos, nas quais reduzem o azoto atmosférico em amoníaco em benefício da planta hospedeira. A formação destes nódulos resulta de uma troca de sinais simbióticos entre a planta e as bactérias. Esta troca inicia-se pela exsudação pela planta de compostos indutores (geralmente flavonóides) dos genes de nodulação.

Então, as bactérias produzem sinais de nodulação, os factores Nod, que induzem a formação de nódulos nas raízes, ou, mais raramente, nos caules, e permitem a infecção da planta hospedeira pelas bactérias. 1 4952

Notar-se-á igualmente que a presença de uma leguminosa num solo permite o enriquecimento do solo em rhizobium: efectivamente, por um lado a multiplicação de rhizobium é favorecida em relação às outras bactérias na rizosfera de uma leguminosa, por outro lado, na senescência dos nódulos, são relançados para o solo rhizobiums específicos da leguminosa.

Até hoje, foram identificados três ramos de rizóbia, a saber, ramo de Rhizobium / Mesorhizobium / Sinorhizobium / Allorhizobium, o de Azorhizobium e de Bradyrhizobium.

De maneira surpreendente, os inventores evidenciaram que as leguminosas podem estabelecer uma simbiose fixadora de azoto com bactérias que não pertencem aos ramos previamente citados. 0 isolamento e a caracterização destas bactérias permitem dispor de estirpes de interesse e explorar os seus genes ou os caracteres particulares destas estirpes para aplicações de despoluição. É igualmente possível dispor de sequências nucleotídicas que podem ser transferidas para bactérias para lhes conferir essas propriedades de despoluição. 0 invento tem portanto por objectivo fornecer novas bactérias capazes de formarem associações simbióticas com leguminosas. 2 4952 visa igualmente a obtenção e a cultura destas estirpes bacterianas. 0 invento visa adicionalmente tirar vantagem das propriedades destas bactérias para formar associações utilizáveis para a despoluição do solo, do ar e da água, permitindo a conservação e o desenvolvimento no meio ambiente a tratar de uma bactéria simbiótica com propriedades de despoluição.

As bactérias de acordo com o invento são bactérias isoladas do seu meio ambiente natural e purificadas. São caracterizadas por se tratarem de bactérias metilotróficas capazes de formarem nódulos radiculares e de fixarem o azoto com plantas da familia das leguminosas. 0 carácter metilotrófico facultativo das estirpes do invento torna-as capazes de crescer rapidamente em meio mínimo sintético que só contem metanol como única fonte de carbono e de energia. Este crescimento é semelhante ao observado com substratos carbonatados clássicos, como os piruvatos, succinatos e outros.

As estirpes do invento apresentam as propriedades metilotróficas e de nodulação de estirpes que compreendem sequências de ARN16S correspondentes à SEQ ID N°l.

Mais especialmente, apresentam o carácter metilotrófico de estirpes que compreendem sequências de 3 4952 nucleótidos capazes de codificarem para a grande subunidade do metanol-desidrogenase (MDH), cuja sequência codificadora da posição 260 a 2000 no gene mxaF corresponde à SEQ ID N°2. O invento visa em particular as estirpes do género Methylobacterium. Estirpes deste tipo são Methylobacterium nodulans, tais como as isoladas e purificadas a partir de nódulos de Crotalaria e, designadamente, a estirpe Methylobacterium nodulans ORS2060, depositada sob o n.° 12342 em 27 de Outubro de 1999 na CNCM (Collection Nationale de Culture de Micro-organismes) Instituto Pasteur, 28 Rue do Dr Roux, Paris, França.

As mutantes das estirpes acima definidas, e designadamente da estirpe ORS2060, entram igualmente no âmbito do invento desde que tenham as propriedades de crescerem em compostos monocarbonados como única fonte de carbono e de formarem nódulos em leguminosas.

De acordo com o invento, as estirpes bacterianas podem ser isoladas a partir de nódulos radiculares de leguminosas seguindo, por exemplo, o protocolo descrito nos exemplos. Como variante recorrer-se-á à rizóbia, cujo carácter de metilotrofia foi modificado, por exemplo, por simples mutagénese, a fim de a tornar explorável. Ainda de acordo com uma outra variante, confere-se a uma bactéria, por transgénese, o carácter de metilotrofia e as propriedades de nodulação procuradas, das quais é naturalmente desprovida. 4 4952 0 crescimento rápido em metanol, tal como ilustrado pelos exemplos, os perfis SDS-PAGE e/ou a sequenciação, permitem verificar que as estirpes produzidas estão inteiramente conformes com o invento.

Graças à sua capacidade para formar associações simbióticas com leguminosas, as bactérias metilotróficas de acordo com o invento são particularmente úteis para aplicações referentes à despoluição dos compartimentos sol/ar/água e, designadamente, na poluição automóvel. As bactérias do solo permitem assim degradar, designadamente, compostos poluentes emitidos pelos gases de escape dos veículos e, de um modo geral, todo o composto tóxico ou poluente, tendo como aplicação, por exemplo, a reabilitação de carreiras órfãs. 0 invento visa assim a cultura de leguminosas associadas às bactérias acima definidas em zonas de poluição. Proceder-se-á assim, com vantagem, a essas culturas ao longo de zonas de tráfego em meio urbano ou rural.

As culturas de leguminosas serão inoculadas pelas bactérias que possuem propriedades metilotróficas e de nodulação de acordo com o invento.

Nestas aplicações na despoluição utilizar-se-á, com vantagem, como leguminosa crotalárias e lotononis em zona tropical e mediterrânea, e plantas forrageiras, designadamente as luzernas em zona temperada e mediterrânea. 5 4952

Vantajosamente as bactérias apresentam-se sob a forma de inoculo. Pode tratar-se de inoculo formado de uma suspensão bacteriana destinada a ser pulverizada numa cultura de leguminosas, ou ainda esferas, por exemplo de alginato, contendo bactérias.

Noutras formas de realização, o inoculo bacteriano encerra o grão de leguminosa, disseminado então em sementeira no local a tratar. Estes inóculos nessa qualidade fazem igualmente parte do invento.

Outras caracteristicas e vantagens do invento serão dadas nos exemplos seguintes, dados a titulo puramente ilustrativo, nos quais se faz referência às figuras 1 a 3, que representam as curvas de crescimento da estirpe ORS2060. - em M 72 que contem metanol como única fonte de carbono (figura 1), - em M 72 com substratos monocarbonados como única fonte de carbono (figura 2), - em M 72 com substratos carbonados e metanol (figura 3).

Meio e condições de cultura

Meio M 72: Composição em g/1: K2HP04 1,2 g 6 4952

CaCl22H20 34 mg MgS047H20 0,2 g NaCl 0,1 g F eCl36H20 1 mg (NH4)2S04 0,5 g oligoelementos 1 ml Agar 15 g pH7

Isolamento de Methylobacterium nodulans QRS2060 A estirpe ORS2060 foi isolada de um nódulo radicular colhido numa plantação de Crotalaria podocarpa (família das leguminosas, tribo Crotalariae) recolhida no Senegal. 0 isolamento das bactérias presentes no interior do nódulo foi feito de acordo com o protocolo descrito no artigo de Lajudie e al., 1994, Int. J. Syst. Bacteriol., 44 715-733. As bactérias foram seguidamente purificadas por várias culturas secundárias sucessivas de uma colónia isolada em meio YM (Vincent J.M., 1970, A manual for the practical study of root nodule bactéria. International Biological Program, Handbook n.° 15, p 3, Blackwell Scientific Publications, Ltd. Oxford) a 28°C. A cultura pura obtida foi inoculada numa plantação de Crotalaria podocarpa cultivada em condições de laboratório, e depois as bactérias foram reisoladas de um nódulo radicular colhido numa plantação de acordo com o protocolo descrito. As bactérias foram purificadas e a cultura pura obtida (estirpe ORS2060) é conservada a -80°C em meio YM adicionado com glicerol 20% final. 7 4952

Resistência aos antibióticos (concentração em pg/ml de meio YMA)

Controlo positivo: meio YMA cultura + Carbenicilina 100 R Ampicilina: 100 R - Neomicina 100 S Gentamicina 100 S 50 S 30 R Spectinomicina 100 - S Kanamicina 50 S Cloranfenicol 100 S/R Tetraciclina 10 S/R 20 S 30 S Ac. Nalidíxico 100 R Estreptomicina 100 S

Legenda: R: resistência, S: sensível, S/R: Não determinado.

Nas figuras 1 a 3 referem-se as curvas de crescimento em M 72 de ORS2060. A figura 1 dá em função do tempo (em h) a densidade óptica (DO) de 620nm da cultura bacteriana e a concentração em metanol mM. 8 4952

Os resultados obtidos mostram que o metanol é praticamente totalmente consumido depois de 24 h de cultura e que as estirpes libertam metanol como única fonte de carbono.

Na figura 2, relataram-se as curvas de crescimento (DO de 620nm em função do tempo em h) da estirpe ORS2060 com, como única fonte de carbono, formato (lOmM), formaldeído (lmM), e metilamina (10mM).

Os resultados obtidos mostram o carácter metilotrófico da estirpe.

Na figura 3 relataram-se as curvas de crescimento (DO de 620nm em função do tempo em h), com diferentes substratos carbonados com lOmM frutose, arabinose, glucose, succinato, piruvato, glutamato, galactose, lactose, sacarose, citrato e metanol 50mM.

Estes resultados confirmam o forte crescimento da estirpe em metanol comparado com os outros substratos.

Gene de nodulação nodA de uma estirpe de Methylobacterium nodulans A sequência parcial do gene nodA de uma Methylobacterium nodulans corresponde à SEQ ID N°3.

Utilização de associações de leguminosas com Methylobacterium nodulans como agentes antipoluição 4952

Procede-se à cultura de luzerna ao longo de autoestradas no Sul da França. Pulveriza-se nas plantações um inoculo de uma estirpe de Methylobacteríum nodulans em suspensão num meio inerte relativamente às bactérias e à luzerna. A simbiose rhizobium/leguminosa induz a formação de nódulos nos quais a bactéria se multiplica, depois da senescência dos nódulos é relançada uma importante quantidade de rhizobium, que enriquece o solo com estas bactérias.

Outras experiências compreendem a cultura de Crotalárias ao longo das estradas ou de auto-estradas.

As medições de poluição no meio ambiente destas culturas, comparadas com as das zonas com culturas tradicionais, tais como loendros, mostram o efeito benéfico das associações que seguem o invento na diminuição da taxa de produtos tóxicos poluentes no meio ambiente.

Protocolo experimental - Exemplos de substratos testados Metanol: 0 inoculo é preparado em metanol afim de induzir a formação do metanol-desidrogenase (MDH).

Aromáticos: 10 4952 0 tolueno (composto da gasolina importante em volume) permite verificar a abertura do ciclo e a utilização do radical metilo.

Alcanos:

Como modelo dos alcanos presentes como compostos da gasolina ou como produtos da combustão das gasolinas, utilizam-se compostos em Cl a C6 em mistura e/ou separadamente: metano, etano, propano, butano, pentano e hexano em cadeias lineares. Os 6 compostos são testados separadamente. Efectuam-se igualmente testes com 2 compostos separadamente e em conjunto: C3 e C6. A coluna Poraplot® é apropriada para dosear a mistura. Éteres: 0 metilo t-butilo éter (MTBE) encontra-se em grande concentração nas gasolinas de certos países. Entre os métodos de dosagem disponíveis citar-se-ão os descritos por Auria e al., 1999, Appl. Microb. Biotech., 51: 498-503 e Cassada e al., Anal. Chem., 72:4654-4658. CO: A mistura teste para a análise dos gases de escape CO, CO2 e propano pelos garagistas é utilizada para testar a degradação do CO, ou noutros ensaios uma mistura CO/gás inerte. A dosagem de CO e de C02 é efectuada com 11 4952 um detector de condutividade térmica na coluna Altech CTRl.

Acetona

Gasolina sem chumbo (para um teste de crescimento + ou -) .

Pode dosear-se a gasolina por CFG (cromatografia em fase gasosa) não discriminatória que produz um único pico expresso em superfície convertida em equivalente metano.

Etanol (como referência de um álcool). Este teste apresenta um interesse para a utilização das estirpes em biofiltros.

Dispositivo experimental

Material

As experiências são realizadas em meio líquido agitado em frascos de 250 ml com divertículo que permitem uma medição directa da DO sem abertura do frasco.

Os frascos são fechados com um dispositivo em Teflon® (Mininert) que permite as injecções e as colheitas, e que evita a absorção dos compostos orgânicos voláteis (COV) na borracha das rolhas clássicas. 12 4952

Tratamentos

Procede-se a uma inoculação ao 10° dia com uma cultura de Methylobacterium nodulans em fim de fase exponencial em meio que contem metanol e extracto de levedura como fonte de vitaminas e substâncias de crescimento. O metanol residual no inoculo é doseado por CFG. A cultura é repetida 3 vezes para se assegurar que todo o vestígio de fonte de carbono inicial (metanol) desapareceu inteiramente.

As experiências são efectuadas com 2 repetições: 2 controlos em metanol + extracto de levedura 2 controlos sem adição de substrato 2 frascos por substrato.

Depois da primeira cultura o melhor dos dois frascos é utilizado para a inoculação dos dois outros frascos. Depois desta segunda cultura efectua-se uma terceira cultura, utilizando-se novamente o melhor dos dois frascos como fonte de inoculo. Efectuam-se controlos igualmente com cada substrato, mas sem Methylobacterium, para testar eventuais processos de degradação ou de imobilização abióticos.

Medições

Seguido do crescimento: DO de 540nm. 13 4952

Em função do crescimento: - seguido do COV no espaço de cabeça de uma cromatografia em fase gasosa + Detector de ionização de chama FID (uma colheita/dia), - eventualmente seguido do C02 e 02 no caso de uma baixa do COV no espaço de cabeça, - Medição do pH final.

Substratos e quantidades a utilizar:

Volume do frasco: 250 ml; Volume do diverticulo: 18 ml; Volume da cultura: 30 ml; Volume gasoso: 220 ml, sejam 44 ml de oxigénio.

Tratamento Fórmula PM Densidade Reacção Volmax para 44 ml 02 Metanol ch3oh 32 0, 79 CH3OH + 3/2 02-> C02 + 2H20 48 μΐ Etanol c2h5oh 46 0, 79 C2H5OH + 3 02- > 2C02+ 3H20 35,5 μΐ Tolueno C7H3 92 0, 86 C7H8 + 9 02 -> 7 C02 + 4H20 21 μΐ Metano ch4 16 Gasoso CHj+2 02->C02+2H20 22 ml gás Etano c2h6 30 Gasoso C2H6 + 7/2 02- > 2C02 + 3H20 12,6 ml gás Propano C3H8 44 Gasoso C3H8 +5 02- > 3C02 + 4H20 8,8 ml gás Butano C4H10 58 Gasoso C4H10 + 13/2 02-_> 4C02 + 5H20 5,9 ml gás Hexano C66H14 86 0,66 C6Hi4 + 19/2 02-> 6C02 + 7H20 25 μΐ MTBE C5H120 88 0,74 C85H120 + 15/2 02-> 5 C02 +6H20 29 μΐ Acetona c3h60 58 0,79 C3H60 + 4 02-> 3 C02 + 3H20 30 μΐ Gasolina sem chumbo C8Hi8 114 0,69 C8H2i8 + 25/2 02-> 8C02 + 9 H20 27 μΐ CO CO 28 Gasoso CO+1/2 02 -> C02 44 ml gás 14 4952 LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Institut de la Recherche pour le Développement <120> Novas bactérias simbióticas e as suas aplicações <130> 59924-1226 <140> <141> <150> 9914179 <151> 1999-11-10 <160> 3

<170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1450 <212> ADN <213> Organismo Desconhecido <220> sequência: Methylobacterium nodulans <223> Origem da <400> 1 agatcttgqc tgcggggtca aecatgggaa aggatcggcc agtagctggc cgggaggeag tgagtgatga ggaggaataa gttgctcgga gcccgtggst agcggâactg gçccgccgvC agataccctg caotggcgcc tcaaaggaat gcgcagaacc cggggacctg taagtcccgc gggggactgc ttacgggatg ctggagsasa aaggcggasc gcacacaccg gagggggcag taggggaacc tcagagcgáa gcggcagacg actaggçcta cgcgtctgat ctgaçaggat cagcggggaa çggectcagg gçcccggcca atesecçgge caaccacgga egagcgtaga tgçcccggtt gr.agv.ccacg gctascgctt. tgscggggac ttascôtccc çacacaggtg aacgsgegca csgtgataag gectacacsc tecccaaaag egctaocast cccgtcacac gcgacvtaegg cçvtggcggc agçettaaca ggtgagtaac gcgtçttg&sc ataccggats cgtccgcaag tagctgattg gtgggçrtâsC çatcagccec actgggaítg tattggacsÍã t.gggegsasg gt-tgtaaagc tcttttcttc acttcgugcc agcagccgcg gtaâagggtg egtaggcggc atgereeetcg atàttggcgg ggtgasattc çtagatattc ctgacgctga ggcgcgaaisg stgca&acça tgaatgcEãg taagcattcc gcctggggag cegcâcaagc: ggtggagcat. ctgacatggc aggctacgtg ccgcatggct gtcgtcagct accctcgccc ttagttgcca ccgcgaggaa ggtggggatg gt.gctúCõat: ggcggtgacà ccgtctcagt tsagáttqça cgtçgatcag cacgccacgg cacçggagtt gatcttâccc taeggtcagc gaecggeçtg catgcaagtc. gagcgggccc gtgccctvcg gttcggaaea gagaaaggct tgactgctça ggctcâccaa ggcgacçatc agàcácggcc cagactccta cctgatccag ccatgccgcg gagacçataa tgacggtacc gtaatacga» gggggctagc ccgccaagcc gggggtgaaa gcttgagacc ggasgaggac. gcaagaacac cagtggcgaa sgtgcggagc aaacaçgatt ccgttggggt gsstócscct tacggtcgca agactaaa&c gtggtçtaat tegaagsase gagagactca cgçstccctt cgígtcgtgs gatgttgggt tcattgagct gggeactcta acgtcaagtc ctsacggccc atgggaagcg aaggggcgac ctvtgcsact cçagtgcesg tgaatacgtt cccgeçccct gacggcgecg sgceeãccgc aagtcçtãse aaçgtaçccg 60 120 ISO 240 300 360 420 380 540 SOO 660 720' 760: 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1450 15 4952

< 210 > 2 <211> 2000 < 212 > ADN <213> Organismo Desconhecido <220> <223> Origem da sequência: Methylobacterium nodulans <400> 2 cgat&aa*tg açgtçãcçca cacatatSãt gcgtgaacag -.gctgggcaa cgetgccçct gçgacggsaa agcag&teaa tçCtgaácgg cgtccccgaa acaagcccaa gcctcgccta aeggccacgc ccgatacccg tcatcggctfi gcacgggcga ccaaggscat gçgagggega ccqgsaeeaa qccégggegs Ccsaçttvgg çgstgctccc accgcaaegg agatcgaqja gegatccçga cgggctatca gcatcaacca tcsçcgrcgg agggcctcgç tggagegctt gaaccccggâ cgaagctgec aegtggsgat atcEtatgsís ggrgcgcgcg tcctacagsc acccactçcc gatttctaaa tcttatgasg cgçcteeaet gcttctcgat atgcagatgg gagacgcaca agtggetgcc ctggcççcgc gcccgtcgag stgtcçaaga cgacaactac ageaagctga gtggçagttc tcgâccggac: caegatgtac gtgcacacct gggcaegatc ctgcggçagg ctgcgaccfcs gtcaaccqeg gatcetcaag acgccgcv-cg egtctgetaag atcgagaati: tgtggtcaag gacaaggcga tctcaccgcc tacgacgccc ggattecgac ctgccgccgg ggggcccgge acctcgacít gggctggtac gcctatgase gççctggaac gagaecatgc cgasgtcgat accggcgagg Etacgcgggc gtcaacgtga caagctgctg acgcatccgg cgaoetgatc tccgcçqaca eaagtcgggc ctgccggtgc ggacatstgt; sectccgcga gegcaagctc ttetacatgg gccctascgc gcegçqeagt gggsgaecgc cagaacgecg caegtteaaa tgggagsaga cggsasegtg gtcttctseg gggtgaactg ctctgqaagg cacccâcaag ggceeccagt cggcctegtc ttcgaectgc cca»a*tatc «cagcatgáa cgaaccagág catcvirgagc asaaaccatí; açgaaaatac aaãTecgctcc ccggc.cgcgt gattgcggtfc cgttgscgaa cgcsggccct. teggcgctcg scgçgtg&tç ccegggàaga cgeegagasc gteaagaacc ccaCgaaggc gcqecgctcg caacaccttc gcgctqggcc gqagaaccc·; ítggccgggc cçcggccct.c gçccggcccg ccegggcgcc gcagaaçtgç caacacccae cgsctggaag ectgatctat. caaCaagtgg vv«qvsgaag çsçqçsgaag sãtcgtctac caccgtcasc aracggeaee ssaeeaggge catccgeacg cgegaegste ccagaceaag cgcggsctgg eggctteate ctcgggcçcg ctaqtacçgq gcggcçcgat gâcgçcaaga aacgcccaga acgetcacca gaactoggcg cgcçcccacg aacgcccatt atsgge.ggeg r.tcggcascg acqatgacca açgqqgqsqg gaccggagcg ascctcgasc gccstcaa-ga cgçatggaec caegatscct gattgggagç aesasgtatc gcctacgacg ggeçgaacgc aaggegegee atcggctatC gttggcggtt attgaaattg 60 attaataagt 120 acaaacatca 180 gqgeggggai 240 cgggqgtçtc 300 qgaacgacaa 360 actacgactc 420 tgaaggtgtc 460 tcgtqgacgq 5<S3~ tggtfcçesee 609 c99t:ggoççg 669 ccccgcccct 729 cgggcgagac 769 tcgcecccta 849 tgcgçggcta 900 ccacçgçtcc 960 aeggccagaa 1020 gcaccaactg 1080 gcaacccggc 1140 tcttcgcççg 1200 asgaçtggga 1.260 gcaaggagcg 1320 geaccascçg 1360 ccgtcgacct 1440 atetcgccaa 1500 âtgacccgga 1560 ccttcatgct 1620 egggcsegaa 1680 ccatcaccgg 1740 tegccaccgc 1800 actccgac-ãc 1860 çegtwccta 1920 ggccgggcgt 19S9 2 000 <210> 3 <211> 526 16

4952 <212> ADN <213> Organismo Desconhecido <220> <223> Origem da sequência: Methylobacterium nodulans <400> 3 gaaaggccca .caacccgagt 60 ggçççggcgc gagacctgag 120 ât-atagccgc actgcgçcgç ISO •caggattgta cgcggtacgt 24 0 tgstgtâtc;: âgeccigasq 300 cgctgcagaa acatcctaca 360 gggtcççcgt gcggtccacc 420 açgacccact gstectaett 4.60 gacaaa 526 gcvggaatcg ggggçgtvta gcctgtgCaS rtcaceaagg ccggaccttg çagetcggcg acgctgcíig ctcagagatà ttcccgatts ccgsccatçc Swgc-aaggcc t:gggttai:gí: ttggggcggt agggactgeg ttceattegg gcaaggcsgg cgcgtctcga gaaggceast cgaacccccc sttcgaaçgç CtcgcgCgâc cgatctac'ic satcagtcât ct:cggs.scg tctagcgacc catgcMccc gagcçattgg gagttcctgc gçtcgasgtt çtagcggctc ccçgccgaac tcaatgctcg gttcggcacg atcgtgtccg acgegggtcg ocggctgtac

Lisboa, 21 de Junho de 2007 17

Claims (10)

1. 4952 REIVINDICAÇÕES 1. Bactérias simbióticas, isoladas e purificadas, caracterizadas por se tratar de bactérias metilotróficas capazes de formarem nódulos radiculares e de fixarem o azoto com plantas da família das leguminosas.
2. 2. Bactérias simbióticas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por apresentarem propriedades metilotróficas e de modulação de estirpes que compreendem sequências de ARN16S que correspondem à SEQ ID N°l.
3. 3. Bactérias simbióticas de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas por apresentarem o carácter metilotrófico de estirpes que compreendem sequências de nucléotidos capazes de codificarem para a grande subunidade do metanol-desidrogenase cuja sequência da posição 260 a 2000 no gene mxaF corresponde à SEQ ID N°2.
4. 4. Bactérias simbióticas de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizadas por pertencerem ao género Methylobacterium.
5. 5. Bactérias simbióticas de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas por se tratar de Methylobacterium nodulans, tais como isoladas e purificadas a partir de nódulos de Crotalaria.
6. 6. Estirpe de Methylobacterium nodulans depositada em 27 de Outubro de 1999 na CNCM sob ο n° I 2342 e mutantes desta estirpe capazes de crescerem em compostos 1 4952 monocarbonados como única fonte de carbono e de formarem nódulos em leguminosas.
7. 7. Aplicação das bactérias simbióticas de acordo com qualquer das reivindicações anteriores à despoluição dos compartimentos solo/ar/água, designadamente em poluição automóvel.
8. 8. Aplicação de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender a cultura de leguminosas como as crotalárias e a lotononis em zona tropical e mediterrânea, e como as plantas forrageiras, designadamente a luzerna, em zona temperada e mediterrânea.
9. 9. Aplicação de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada por as bactérias serem utilizadas sob a forma de inoculo.
10. 10. Inoculo bacteriano que compreende bactérias de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se apresentar sob a forma de uma suspensão de bactérias, ou ainda de esferas ou de um revestimento à volta do grão de leguminosa. Lisboa, 21 de Junho de 2007 2