PT118944B - Processo para preparar uma farinha de cereais modificada, uma farinha de cereais modificada e um alimento processado à base de farinha de cereais - Google Patents

Abstract

A INVENÇÃO INCLUI UM PROCESSO PARA PREPARAR UMA FARINHA DE CEREAIS MODIFICADA (8) COMPREENDENDO A EXECUÇÃO DE UMA INCUBAÇÃO ENZIMÁTICA (102) DE UMA FARINHA DE CEREAIS DISPERSADA AQUOSA (3A) COMPREENDENDO ÉPSILON-POLILISINA (4) E TRANSGLUTAMINASE (5), EM QUE A ÉPSILON-POLILISINA (4) É INCORPORADA COVALENTEMENTE NAS PROTEÍNAS DA FARINHA DE CEREAIS DISPERSADA AQUOSA (3) APÓS UMA DISPERSÃO (100) E MISTURA (101) COM ÁGUA (2), E OPCIONALMENTE AGENTES DE REDUÇÃO (9) E CONSERVAÇÃO (10); OBTENDO-SE UMA FARINHA DE CEREAIS MODIFICADA DISPERSADA AQUOSA (6), QUE É SEPARADA (103), OBTENDO-SE UMA FARINHA HÚMIDA (7) E EM SEGUIDA SECA (104), OBTENDO-SE A FARINHA DE CEREAIS MODIFICADA (8). O PROCESSO POSSIBILITA PREPARAR UM PRODUTO COMPREENDENDO CONCENTRAÇÕES REDUZIDAS DE EPITOPOS TÓXICOS RELACIONADOS COM A DOENÇA CELÍACA E NÃO ALTERA A DIGESTIBILIDADE DAS PROTEÍNAS. A FARINHA DE CEREAIS MODIFICADA (8) EXIBE UM AUMENTO DA RESISTÊNCIA MÁXIMA À EXTENSÃO OU EXTENSIBILIDADE TOTAL COMPARADA COM A FARINHA DE CEREAIS (1).

Description

DESCRIÇÃO

PRQCESSQ PARA PREPARAR UMA FARINHA DE CEREAIS MQDIFICADA, UMA FARINHA DE CEREAIS MODIFICADA E UM ALIMENTO PROCESSADO À BASE DE FARINHA DE CEREAIS

Campo da técnica

A presente invenção refere-se a um processo para preparar uma farinha de cereais modificada, e à farinha de cereais modificada obtida, além de um alimento processado à base de farinha de cereais produzido com utilização da mesma farinha de cereais modificada. A presente invenção está no campo técnico do tratamento de farinha através de adição de materiais à mesma antes do cozimento.

Antecedentes da Técnica

Os cereais, incluindo o trigo, têm uma grande importância em todo o mundo, fornecendo alimentos básicos, apoiando a economia e garantindo a segurança alimentar. São vitais para a nutrição humana, tradições culturais e oportunidades de desenvolvimento, servindo como uma fonte significativa de rendimento para agricultores e indústrias associadas. Adicionalmente, os cereais contribuem para a alimentação de gado, aplicações industriais e a resiliência climática, tornando-os essenciais para o desenvolvimento sustentável.

O glúten, um complexo proteico encontrado no trigo, confere propriedades viscoelásticas únicas que permitem a produção de diversos produtos alimentares a partir da farinha de trigo (Wieser et al., 2023). No entanto, indivíduos com doença celíaca sofrem uma intensa reação inflamatória quando consomem glúten ou proteínas semelhantes presentes no centeio e cevada. A doença celíaca tornou-se num dos

- 2 distúrbios gastrointestinais mais predominantes na nossa sociedade hoje em dia. Embora o tratamento primário seja uma dieta sem glúten ao longo de toda a vida, pode produzir resultados subideais em alguns casos.

A doença celíaca é uma doença autoimune desencadeada pelo consumo de glúten, uma proteína encontrada em cereais, por exemplo, trigo, cevada e centeio. Em indivíduos com doença celíaca, certos péptidos derivados de glúten podem desencadear uma resposta imune que danifica o revestimento do intestino delgado. Estes péptidos específicos são conhecidos como epitopos tóxicos.

Os principais epitopos tóxicos identificados no glúten estão associados a proteínas, nomeadamente AlfaGliadinas, Gama-Gliadinas, Ómega-Gliadinas de Trigo. As alfa-gliadinas compreendem a sequência peptídica QPQLPYPQPQLPY, especialmente a secção QPQLPYPQ, que é conhecida como sendo um epitopo tóxico. Esta sequência é resistente à digestão por enzimas do sistema digestivo humano e pode desencadear uma resposta imune em indivíduos com doença celíaca. As gama-gliadinas são outra classe de proteínas presentes no glúten. A sequência peptídica QLQPFPQPQLPY é um dos epitopos tóxicos encontrados nas gamagliadinas. Tal como o epitopo da alfa-gliadina, esta sequência é resistente à digestão e pode levar a reações imunes. Omega-gliadinas também contribuem para a formação de epitopos tóxicos. A sequência é semelhante ao epitopo de alfa-gliadina que contém a sequência PQQPFPQPEQPQ. Secalinas são uma classe de proteínas encontradas no centeio. A sequência peptídica LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF é um epitopo tóxico presente em plântulas de trigo. Esta sequência é altamente resistente à degradação por enzimas digestivas e pode desencadear respostas imunes.

- 3 Nos últimos anos, foram feitos avanços significativos no nosso entendimento da fisiopatologia da doença celíaca. As proteínas do glúten, caracterizadas por um alto teor de resíduos de prolina (10-15 %), exibem resistência parcial à degradação por proteases humanas durante a digestão. Como resultado, grandes péptidos de glúten persistem no lúmen intestinal após a digestão, garantido a sobrevivência de epitopos imunoestimulatórios. Estes péptidos passam, então, a barreira epitelial intestinal e entram na lâmina própria, onde ocorrem as reações imunes adaptativas. Uma etapa crucial neste processo é a desamidação de certos péptidos de glúten pela transglutaminase tecidular (TG2). Esta modificação aumenta a sua afinidade para o complexo antigénio leucocitário humano HLA-DQ2 ou HLA-DQ8, os quais são os fatores genéticos mais importantes na doença celíaca, presentes nas células apresentadoras de antigénio. Subsequentemente, ocorre uma ativação de células T auxiliares CD4+, que leva à produção de citocinas pró-inflamatórias (Lebwohl and Rubio-Tapia, 2021; Nilsen et al., 1998; Sollid, 2002). Adicionalmente, as células-T CD4+ desempenham um papel importante na ativação e promoção da expansão clonal de células B, que eventualmente se diferenciam em células plasmáticas e produzem anticorpos contra glúten e TG2 (Di Sabatino e Corazza, 2009). À medida que a cascata inflamatória prossegue, a libertação de metaloproteinases e outros mediadores que danificam os tecidos induz hiperplasia da cripta e atrofia das vilosidades (Green and Cellier, 2007). Estas mudanças contribuem para os sintomas característicos e danos observados na doença celíaca.

Com o aumento crescente relacionado com as intolerâncias relacionadas com o glúten, o mercado de produtos isentos de glúten tem crescido substancialmente.

- 4 Estes produtos abrangem uma variedade de itens alimentares concebidos para emular alimentos tradicionais ou substituir o glúten por outros ingredientes, tais como polissacáridos hidrocolóides e proteínas de diferentes fontes. Estes substitutos são essenciais para fornecer estrutura à massa e alcançar uma textura aceitável (Ribeiro et al., 2019; Ziobro et al., 2013) . No entanto, é importante observar que a adesão a uma dieta isenta de glúten pode ser consideravelmente mais dispendiosa do que qualquer outra dieta sem restrições e pode carecer de equilíbrio nutritivo adequado. Além do mais, os produtos isentos de glúten enfrentam certas limitações tecnológicas, levando a propriedades texturais inferiores (Marciniak et al., 2021) .

As concentrações seguras de epitopos tóxicos em farinhas para indivíduos com doença celíaca são extremamente baixas, idealmente próximas de zero. Mesmo quantidades muito pequenas destes epitopos tóxicos podem desencadear uma resposta imune e provocar danos no revestimento do intestino em indivíduos com doença celíaca.

Reduzir a quantidade de epitopos tóxicos em farinhas é uma etapa crítica na produção de produtos isentos de glúten seguros para indivíduos com doença celíaca.

A separação mecânica é um processo que tem o objetivo de remover as camadas exterior do grão, em que os grãos como o trigo são limpos e as camadas exteriores (sêmeas) são removidas.

O processamento por calor é um processo que pode desnaturar as proteínas, potencialmente alterando a estrutura de epitopos tóxicos e reduzindo os efeitos prejudiciais. No entanto, temperaturas excessivamente altas também podem afetar a qualidade e sabor do produto final.

A fermentação de massa lêveda envolve a utilização de bactérias naturais e leveduras para fermentar a pasta ao

- 5 longo de um período prolongado. Este processo pode degradar algumas das proteínas do glúten, reduzindo potencialmente a concentração de epitopos tóxicos. No entanto, nem todos os processos de massa lêveda são igualmente eficazes e alguns produtos de massa lêveda comerciais podem não fornecer uma redução de glúten suficiente.

O cruzamento e a modificação genética é outra abordagem seguida pelos investigadores, que estão a explorar formas de desenvolver variedades de trigo com níveis reduzidos de epitopos tóxicos através do cruzamento e da modificação genética.

O tratamento por campo elétrico pulsado é uma tecnologia emergente que envolve a aplicação de pequenas rajadas de campo elétrico em grãos ou farinhas. Este tratamento pode romper as estruturas de proteínas e potencialmente reduzir a toxicidade dos epitopos.

O tratamento enzimático é outro processo comum de degradar ou modificar as proteínas que contêm os epitopos tóxicos. Por exemplo, certas proteases podem hidrolisar proteínas do glúten, potencialmente reduzindo a concentração de sequências tóxicas.

Problema da técnica

A eficácia dos tratamentos enzimáticos pode variar, sendo bastante comum que a redução da concentração dos epitopos tóxicos nativos, após a ação enzimática, não seja adequada, sendo obtidas concentrações inseguras na farinha tratada para indivíduos que sofrem de doença celíaca e é importante garantir que as enzimas utilizadas sejam seguras e aprovadas para redução de glúten.

Esforços para abordar a exigência de uma dieta isenta de glúten levaram a várias abordagens que tinham como objetivo destoxificar as proteínas de glúten. Métodos

- 6 cientificamente sólidos incluem proteólise de epitopos imunodominantes, transamidação de resíduos de glutamina encontrados em gliadinas ricas em glutamina e modificação genética com utilização de técnicas avançadas de edição de genomas (Ribeiro et al. , 2021; Ribeiro et al., 2018) . Embora estas estratégias direcionadas ao glúten sejam muito promissoras, a maioria delas tende a causar impacto negativo nas propriedades funcionais do glúten. O método de proteólise, por exemplo, resulta na perda da viscoelasticidade característica do glúten e dificulta as interações proteicas, rompendo a formação da rede de glúten. (Wieser et al., 2023) . Em relação às reações de transamidação, foi constatado que certos nucleófilos de amina, tal como a L-lisina ou os seus derivados éster, afetam adversamente as propriedades viscoelásticas da farinha de trigo resultante (Heredia-Sandoval et al. , 2014) . Além disso, a digestibilidade das farinhas pode ser afetada (Ribeiro et al., 2020). Linhagens de trigo geneticamente modificado com baixo teor de gliadina mostram que são promissoras na produção de alimentos satisfatórios. No entanto, reduzir o teor de gliadina causa impacto no equilíbrio entre gluteninas e gliadinas, afetando assim as propriedades reológicas do glúten (Gil-Humanes et al., 2014). Dúvidas acerca da utilização de organismos geneticamente modificados (GMOs) podem impedir a aceitação desta abordagem, conforme observado por (Laursen, 2016).

Há necessidade de identificar um tratamento que reduza apropriadamente a concentração dos epitopos tóxicos nativos relacionados com a doença celíaca, evitando prejudicar as propriedades mecânicas da farinha de cereais, por exemplo, a sua força ou extensibilidade, bem como evitar prejudicar as suas propriedades de digestibilidade.

- 7 Solução do problema

A presente invenção resolve os problemas da técnica anterior ao desenvolver um tratamento enzimático em que épsilon-polilisina é incorporada covalentemente nas proteínas da referida farinha de cereais por catálise enzimática provocada por transglutaminase.

As ligações covalentes formadas entre épsilonpolilisina e as proteínas da referida farinha de cereais reduzem significativamente a libertação de epitopos tóxicos para pacientes celíacos.

A presente invenção diz respeito a um processo para tratar farinha de cereais, particularmente, glúten. Neste processo, um péptido de origem natural chamado épsilonpolilisina (épsilon -PL), que é geralmente reconhecido como seguro (GRAS) certificado nos Estados Unidos, é incorporado covalentemente nas proteínas do glúten. Esta incorporação reduz significativamente a quantidade de epitopos tóxicos relacionados com a doença celíaca. De modo importante, esta incorporação não altera as propriedades de digestibilidade das proteínas da farinha. Além do mais, épsilon-PL é um ingrediente económico e facilmente acessível. Dependendo da sua concentração, pode aumentar a resistência da massa à extensão e força ou melhorar a extensibilidade e a viscosidade da massa, sendo que ambas são vitais para a produção, nomeadamente, de pão e biscoitos, respetivamente.

Efeitos vantajosos da invenção

O processo para preparar uma farinha de cereais modificada de acordo com a invenção torna possível preparar uma farinha de cereais modificada que compreende concentrações reduzidas da quantidade de epitopos tóxicos nativos relacionados com a doença celíaca encontrados nas farinhas originais. Adicionalmente, a farinha de cereais

- 8 modificada exibe um aumento significativo da resistência máxima à extensão ou extensibilidade total em comparação com a farinha original.

A farinha de cereais modificada resultante exibe qualidades reológicas melhoradas em comparação com farinhas controlo, dependendo da concentração de épsilon-polilisina utilizada. Por exemplo, utilizar 1 mol de épsilonpolilisina/mol de glutamina de farinha leva a propriedades de força aumentadas, enquanto concentrações mais altas, como 5 mol de épsilon-polilisina/mol de glutamina de farinha, resultam em propriedades viscosas melhoradas.

Outra vantagem do processo de acordo com a invenção é que este tratamento não tem efeitos adversos na digestibilidade das farinhas.

Breve descrição dos desenhos

Com o propósito de promover um entendimento dos princípios de acordo com as modalidades da presente invenção, será feita referência às modalidades ilustradas nas figuras e à terminologia utilizada para as descrever. De qualquer modo, deve ser entendido que não há intenção de limitar o âmbito da presente invenção às figuras. Quaisquer alterações ou modificações subsequentes das características inventivas ilustradas no presente documento, bem como quaisquer aplicações adicionais dos princípios e modalidades da invenção ilustrada, que normalmente poderiam ocorrer a um versado na técnica tendo esta descrição, são consideradas como estando dentro do âmbito da invenção reivindicada.

Figura 1

[Figura 1] ilustra uma representação em bloco de uma modalidade do processo para preparar uma farinha de cereais modificada.

Figura 2

[Figura 2] ilustra a caracterização do efeito da incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas da farinha em relação à libertação de epitopos tóxicos para pacientes celíacos, em que o sinal ns representa não signifieativo e os sinais *, **, *** e ****, referentes ao critério de significância, representam: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001.

Figura 3

[Figura 3] ilustra a caracterização do efeito da incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas da farinha em relação à digestibilidade, em que o sinal ns representa não signifieativo.

Figura 4

[Figura 4] ilustra curvas de extensão microextensográficas de Kieffer da massa produzida com farinha de cereais modificada e farinhas comparativas.

Figura 5

[Figura 5] ilustra a máxima resistência à extensão da massa produzida com farinha de cereais modificada e farinhas comparativas, em que o sinal ns representa não signifieativo e os sinais *, **, *** e ****, referentes ao critério de significância, representam: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001.

Figura 6

[Figura 6] ilustra a extensibilidade total da massa produzida com utilização de uma farinha de cereais modificada e farinhas comparativas, em que o sinal ns representa não

- 10 signifieativo e os sinais *, **, *** e ”, referentes ao critério de significância, representam: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001.

Descrição das modalidades

A invenção refere-se, num primeiro aspeto, conforme ilustrado na Figura 1, a um processo para preparar uma farinha de cereais modificada caracterizado por compreender as seguintes etapas:

a) Executar uma etapa de dispersão (100) de uma farinha de cereais (1) em água ou numa solução aquosa (2) obtendo uma farinha de cereais dispersada aquosa (3); e

b) Executar uma etapa de mistura (101) através da adição de épsilon-polilisina (4) à referida farinha de cereais dispersada aquosa (3); e

c) Executar uma etapa de mistura (101) através da adição de uma transglutaminase (5) à referida farinha de cereais dispersada aquosa (3); e

d) Executar uma etapa de incubação enzimática (102) da farinha de cereais dispersada aquosa (3) que compreende épsilon-polilisina (4) e transglutaminase (5), em que a épsilon-polilisina é incorporada covalentemente nas proteínas da referida farinha de cereais; obtendo uma farinha de cereais modificada dispersada aquosa (6); e

e) Executar uma etapa de separação (103) de uma farinha de cereais modificada húmida (7) a partir da farinha de cereais modificada dispersada aquosa (6); e

f) Executar uma etapa de secagem (104) da farinha de cereais modificada húmida (7), obtendo uma farinha de cereais modificada (8); e em que as etapas b) e c) são executadas em qualquer ordem entre si.

- 11 Na Figura 1, a farinha de cereais dispersada aquosa (3) que compreende épsilon-polilisina (4) e transglutaminase (5) é identificada com o número de referência (3a).

Épsilon-polilisina é um biopolímero natural com propriedades antimicrobianas. É um tipo de homopolímero que consiste em aminoácidos de L-lisina ligados por ligações isopeptídicas. Foi constatado que este polímero exibe fortes efeitos inibidores contra uma ampla gama de microorganismos, incluindo bactérias, fungos e certos vírus. É produzido através de fermentação por uma estirpe específica chamada Streptomyces albulus.

Uma das utilizações industriais principais da épsilon-polilisina é como conservante alimentar natural. Pode prolongar a vida útil de vários produtos alimentares, ao inibir o crescimento de micro-organismos deteriorantes e patógenos de origem alimentar. É frequentemente utilizado em produtos como carne, marisco, laticínios e itens de panificação.

Transglutaminase é uma enzima que catalisa a formação de ligações covalentes entre proteínas. É encontrada de forma natural em vários organismos, incluindo animais, plantas e micro-organismos. Em aplicações industriais, a transglutaminase microbiana derivada de bactérias específicas é utilizada pelas suas propriedades de reticulação de proteínas. Esta pode unir proteínas, levando a mudanças na textura, estrutura e propriedades funcionais dos produtos alimentares. Na panificação, transglutaminase pode melhorar as propriedades da massa fornecendo melhor textura e volume ao pão e a outros produtos de panificação.

A presente invenção resolve os problemas da técnica anterior ao desenvolver um tratamento enzimático em que épsilon-polilisina é incorporada covalentemente nas

- 12 proteínas da referida farinha de cereais por catálise enzimática provocada por transglutaminase.

É inesperado para uma pessoa versada na técnica que a incorporação de Épsilon-polilisina nas proteínas da farinha de cereais, ao formar ligações covalentes entre épsilon-polilisina e as proteínas da referida farinha de cereais, reduza significativamente a libertação de epitopos tóxicos, resultando em farinha de cereais modificada, particularmente adequada para pacientes celíacos.

Em modalidades preferenciais do processo para preparar uma farinha de cereais modificada, o pH da referida água ou solução aquosa (2) na etapa a) está na faixa de 5 a 8. Ainda mais preferencialmente, a solução aquosa (2) é uma solução tampão com um pH entre 5 e 8, preferencialmente está na faixa de 6,5 a 7,5.

Em modalidades preferenciais do processo para preparar uma farinha de cereais modificada, a proporção entre a farinha de cereais (1) e a referida água ou solução aquosa (2) na etapa a) está na faixa de 1 a 50 % em peso em relação ao volume da referida água ou solução aquosa (2).

Preferencialmente, pelo menos um aditivo selecionado a partir do grupo que consiste num agente de redução (9), num agente de conservação (10), num agente antioxidante, num agente de branqueamento ou numa levedura inativada é adicionado à referida farinha de cereais dispersada aquosa (3) .

Conforme ilustrado na Figura 1, o agente de redução (9) ou o agente de conservação (10) podem ser adicionados durante a etapa de mistura (101), mas os referidos aditivos também podem ser adicionados durante a etapa de dispersão (100) ou durante a etapa de incubação enzimática (102).

Adicionar um agente de redução (9) aquando da preparação da farinha de cereais serve um propósito

- 13 específico no cozimento, particularmente quando o trabalho é feito com pasta ou massa crua que contém farinha de cereais. O principal papel de um agente de redução (9) neste contexto é melhorar a extensibilidade, fermentação e desempenho de cozimento geral da massa crua ou da pasta. Preferencialmente, o referido agente de redução (9) é pelo menos um a partir do grupo que consiste em glutationa ou Lcisteína, ainda mais preferencialmente glutationa. Em modalidades preferenciais, a concentração do agente de redução (9) na farinha de cereais dispersada aquosa (3) está na faixa de 0,01 a 100 mmol/L, preferencialmente está na faixa de 0,1 a 50 mmol/L, mais preferencialmente está na faixa de 10 a 30 mmol/L.

Preferencialmente, o referido agente de conservação (10) é pelo menos um a partir do grupo que consiste em ácido sórbico e os seus sais, sorbato de potássio, ácido propiónico e os seus sais, propionato de cálcio, benzoato de sódio, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio e ou natamicina, preferencialmente sorbato de potássio ou propionato de cálcio. Em modalidades preferenciais, a concentração do agente de conservação (10) está na faixa de 0,0025 % e 0,100 %, preferencialmente está na faixa de 0,015 % a 0,040 %, em relação à quantidade mássica da farinha de cereais.

Preferencialmente, o referido agente antioxidante é pelo menos um a partir do grupo que consiste em bissulfito de sódio ou metabissulfito de sódio. Preferencialmente, o referido agente de branqueamento é pelo menos um a partir do grupo que consiste em bissulfito de sódio ou metabissulfito de sódio.

Em modalidades preferenciais, a concentração de épsilon-polilisina (4) na farinha de cereais dispersada aquosa (3), na etapa c, está na faixa de 0,01 a 10 mol/mol de glutamina de farinha, preferencialmente com 0,01 to 5

- 14 mol/mol, ainda mais preferencialmente com 0,8 to 1,2 mol/mol como a concentração de faixa preferencial. Podem ser utilizados diferentes graus de polimerização (DP) nomeadamente, na faixa de DP=2 a DP= 60, preferencialmente na faixa de DP=10 a DP=30.

Em formas de realização preferenciais, na etapa c, a quantidade adicionada de transglutaminase (5) na farinha de cereais dispersada aquosa (3) está na faixa de 0,1 a 20 Unidades/g de farinha de cereais, mais preferencialmente 0,8 a 1,2 Unidades/g de farinha de cereais.

Preferencialmente, a etapa de incubação (102) da farinha de cereais dispersada aquosa (3) que compreende épsilon-polilisina (4) e transglutaminase (5) é executada a uma temperatura de 2°C a 60°C durante 1 h a 48 horas, mais preferencialmente a uma temperatura de 30°C a 40°C durante16 h a 32 horas.

Ainda mais preferencialmente, o processo de síntese quimioenzimático, quando conduzido sob condições de redução, com a adição de um agente de redução (9), aumenta significativamente a atividade enzimática da transglutaminase durante a modificação química mediada enzimaticamente de epitopos tóxicos do glúten (Ribeiro et al. , 2015) .

Em formas de realização preferenciais, a etapa de separação (103) é pelo menos uma do grupo que consiste numa centrifugação ou numa filtração. A centrifugação ou filtração pode ser utilizada para remover o excesso de água da farinha tratada. A farinha de cereais modificada húmida (7) pode ser lavada com água antes de ser submetida à etapa de secagem (104).

Em formas de realização preferenciais, a etapa de secagem (104) pode ser executada num forno ou num dispositivo de liofilização. Antes do processo de secagem principal é

- 15 possível realizar uma pré-etapa de secagem para reduzir o teor de humidade inicial. Isto pode ajudar a prevenir a formação de grumos e facilitar secagem mais eficaz.

Quando o processo principal de secagem for a secagem em forno, preferencialmente a farinha de cereais modificada húmida (7) é espalhada em camada fina em tabuleiros ou suportes de cozimento. Isto permite melhor circulação de ar e secagem mais uniforme. A temperatura do forno é preferencialmente definida para uma temperatura inferior a 100°C para evitar a degradação térmica da farinha. Dependendo do teor de humidade e do tipo de farinha modificada, o processo de secagem pode levar de várias horas a um dia ou mais.

Quando o principal processo de secagem for a liofilização (criodessecação), preferencialmente a farinha de cereais modificada húmida (7) é espalhada em camada fina em tabuleiros ou pratos próprios para congelamento, e os tabuleiros são inseridos num congelador e congelam a farinha até ficar sólida. O congelamento ajuda a manter a integridade estrutural da farinha durante o processo de secagem subsequente. Os tabuleiros congelados são transferidos para uma câmara de liofilização, que contém uma bomba a vácuo que reduz a pressão para criar vácuo. A farinha congelada será exposta a pressão baixa, fazendo com que a água congelada sublime diretamente de gelo para vapor. A temperatura na câmara de liofilização é aumentada gradualmente para aumentar a sublimação.

Depois de a farinha estar adequadamente seca, esta é arrefecida antes de ser embalada, utilizando uma embalagem resistente à humidade para evitar a reabsorção de humidade.

Preferencialmente, a farinha de cereais é pelo menos uma do grupo que consiste em farinha de trigo (Triticum spp.), farinha de aveia (Avena sativa), farinha de centeio

- 16 (Secale spp.), farinha de cevada (Hordeum spp.), farinha de triticale, farinha de arroz (Oryza sativa), farinha de milho (Zea mays), farinha de espelta (Triticum spelta), farinha de painço, farinha de sorgo, farinha de trigo mourisco (Fagopyrum esculentum), ou derivados germinados das mesmas, por exemplo, malte. Triticale é um híbrido de trigo (Triticum) e centeio (Secale).

A invenção refere-se, num segundo aspeto, a uma farinha de cereais modificada que compreende épsilonpolilisina covalentemente incorporada nas proteínas da referida farinha de cereais ao efetuar um tratamento de transglutaminase na presença de épsilon-polilisina.

Preferencialmente, a farinha de cereais modificada apresenta o rácio de massa de épsilon-polilisina covalentemente incorporada nas proteínas da referida farinha de cereais na gama de 0,001 a 3,5 % em peso em relação ao peso da referida farinha de cereais modificada, ainda mais preferencialmente está na faixa de 0,1 a 1,0 %.

Preferencialmente, a farinha de cereais modificada é obtida de acordo com o processo definido no primeiro aspeto da invenção.

A invenção refere-se, num terceiro aspeto, a um alimento processado à base de farinha de cereais caracterizado por ser produzido a partir de uma farinha de cereais modificada, de acordo com o segundo aspeto da invenção, como uma matéria-prima.

O alimento processado à base de farinha de cereais compreende pão, biscoitos, cereais de pequeno-almoço, alimentos tipo snack, bolachas tipo cracker, pretzels, batatas fritas, bolos de pastelaria, bolachas, queques e outros produtos cozinhados, pizas, tortilhas, wraps, noodles, panquecas, bolos, tartes cobertas, tartes, misturas

- 17 instantâneas de panquecas, misturas instantâneas de bolos ou barras de cereais.

Exemplos

Exemplo 1.

Para destoxificar farinha de trigo (Triticum spp.) e aumentar as propriedades de força da massa de trigo, a farinha foi dispersa em água por agitação na proporção de 20,5 % em peso em relação ao volume de água. Em seguida, nesta ordem, foram adicionados o conservante sorbato de potássio (0,025 % em relação à massa da farinha de trigo), agente de redução glutationa (20 mmol/L na farinha de trigo dispersada aquosa) e épsilon-polilisina (1 mol /mol de glutamina de farinha). O biocatalisador transglutaminase (1 Unidade/g grama de farinha de cereais) é adicionado mais tarde. A mistura é mantida a 37 °C durante vinte e quatro horas. Após este período de tratamento, a farinha é separada da mistura de reação por centrifugação, lavada sucessivamente com água e seca por liofilização.

Exemplo 2.

Para destoxificar o glúten e aumentar as propriedades de força da massa, o glúten foi disperso em água por agitação na proporção de 2 % em peso em relação ao volume de água. Em seguida, nesta ordem, foram adicionados o conservante sorbato de potássio (0,025 % em relação à massa do glúten), agente de redução L-cisteína (30 mmol/L no glúten dispersado aquoso) e épsilon-polilisina (1 mol /mol de glutamina de glúten). O biocatalisador transglutaminase (10 Unidades/g grama de glúten) é adicionado mais tarde. A mistura é mantida a 37 °C durante vinte e quatro horas. Após este período de tratamento, o glúten é separado da mistura

- 18 de reação por centrifugação, lavado sucessivamente com água e seco por liofilização.

Exemplo 3.

Para destoxificar farinha de trigo (Triticum spp.) e aumentar as propriedades viscosas da massa de trigo, a farinha foi dispersa em água por agitação na proporção de 20,5 % em peso em relação ao volume de água. Em seguida, nesta ordem, foram adicionados o conservante sorbato de potássio (0,025 % em relação à massa da farinha de trigo), agente de redução glutationa (20 mmol/L na farinha de trigo dispersada aquosa) e épsilon-polilisina (5 mol /mol de glutamina de farinha). O biocatalisador transglutaminase (1 Unidade/g grama de farinha) é adicionado mais tarde. A mistura é mantida a 40 °C durante vinte e quatro horas. Após este período de tratamento, a farinha é separada da mistura de reação por centrifugação, lavada sucessivamente com água e seca por liofilização.

Exemplo 4.

Para destoxificar a farinha de centeio (Secale spp.) e aumentar as propriedades de força da massa de centeio, a farinha foi dispersa em água por agitação na proporção de 20,5 % em peso em relação ao volume de água. Em seguida, nesta ordem, foram adicionados o conservante sorbato de potássio (0,01 % em relação à massa da farinha de centeio), agente de redução glutationa (10 mmol/L na farinha de centeio dispersada aquosa) e épsilon-polilisina (1 mol /mol de glutamina de farinha). O biocatalisador transglutaminase (1 Unidade/g grama de farinha) é adicionado mais tarde. A mistura é mantida a 37 °C durante vinte e quatro horas. Após este período de tratamento, a farinha é

- 19 separada da mistura de reação por centrifugação, lavada sucessivamente com água e seca por liofilização.

Exemplo 5.

Para destoxificar a farinha de cevada (Hordeum spp.), a farinha foi dispersa em tampão fosfato de sódio (50 mmol/L; pH 7) por agitação numa proporção de 20,5 % em peso em relação ao volume de tampão fosfato de sódio. Em seguida, nesta ordem, foram adicionados o conservante sorbato de potássio (0,01 % em relação à massa da farinha de cevada), agente de redução glutationa (10 mmol/L na farinha de cevada dispersada aquosa) e épsilon-polilisina (1 mol /mol de glutamina de farinha). O biocatalisador transglutaminase (1 Unidade/g grama de farinha) é adicionado mais tarde. A mistura é mantida a 37 °C durante vinte e quatro horas. Após este período de tratamento, a farinha é separada da mistura de reação por centrifugação, lavada sucessivamente com água e seca um forno a vácuo.

Exemplo 6.

Para destoxificar malte, a farinha foi dispersa em tampão fosfato de sódio (50 mmol/L; pH 7) por agitação numa proporção de 2 % em peso em relação ao volume de tampão fosfato de sódio. Em seguida, nesta ordem, foram adicionados o conservante propionato de cálcio (0,01 % em relação à massa de malte), agente de redução glutationa (10 mmol/L no malte dispersado aquoso da farinha de cevada) e épsilon-polilisina (1 mol /mol de glutamina de malte). O biocatalisador transglutaminase (1 Unidade/g grama de malte) é adicionado mais tarde. A mistura é mantida a 37 °C durante vinte e quatro horas. Após este período de tratamento, o malte é separado da mistura de reação por centrifugação, lavado sucessivamente com água e seco num forno a vácuo.

- 20 A Figura 2 ilustra a caracterização do efeito da incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas de farinha em relação à libertação de epitopos tóxicos para pacientes celíacos medidos por imunoensaio por meio de anticorpo R5. As etiquetas da Figura 2 representam: Farinha de controlo (Farinha de controlo), a simples adição de polilisina (adição de épsilon -PL), tratada com transglutaminase microbiana (farinha tratada com mTG) e que contém incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas de farinha em diferentes proporções (mTG + épsilon -PL e mTG + 5X épsilon -PL) . ns não significativo, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001.

Nas Figuras 2 a 6, a amostra de eontrolo Farinha de eontrolo foi preparada sem a inelusão de épsilonpolilisina e sem enzima transglutaminase. A adição de Épsilon-PL envolveu o mesmo proeedimento, mas eom adição de épsilon-polilisina (5 mol épsilon-polilisina/mol glutamina) e sem a enzima transglutaminase. Para a farinha tratada eom mTG foi adieionada enzima transglutaminase (1 Unidade/grama de farinha de cereais) sem épsilon-polilisina. Nos casos de mTG - épsilon-PL e mTG - 5X épsilon-PL, tanto transglutaminase (1 Unidade/grama de farinha de cereais) como épsilon-polilisina, nas concentrações de 1 mol épsilonpolilisina/mol glutamina e 5 mol de épsilon-polilisina/mol de glutamina foram adicionados, respetivamente.

As diferenças entre os diferentes grupos de tratamento foram determinadas por análise de variância unidirecional (ANOVA). Comparações múltiplas de médias de tratamento foram feitas com utilização do teste post-hoc de Tukey e o critério de significância foi p<0,05. A etiqueta ns signifiea não signifieativo.

A Figura 3 ilustra a caracterização do efeito da incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas de

- 21 farinha em relação à digestibilidade. As etiquetas da Figura 3 representam: Farinha de controlo (Farinha de controlo), a simples adição de polilisina (adição de épsilon -PL), tratada com transglutaminase microbiana (farinha tratada com mTG) e que contém incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas de farinha em diferentes proporções (mTG + épsilon -PL e mTG + 5X épsilon -PL). ns não significativo.

A Figura 4 ilustra curvas de extensão microextensográficas de Kieffer da massa produzida com utilização de farinha de controlo (farinha de controlo), com simples adição de polilisina (adição de épsilon-PL), tratada com transglutaminase microbiana (farinha tratada com mTG) e que contém incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas de farinha em proporções diferentes (mTG + épsilon -PL e mTG + 5X épsilon -PL).

A Figura 5 ilustra a resistência máxima à extensão da massa produzida com utilização de farinha de controlo (farinha de controlo), com a simples adição de polilisina (adição de épsilon -PL), tratada com transglutaminase microbiana (farinha tratada com mTG) e que contém incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas de farinha em diferentes proporções (mTG + épsilon -PL e mTG + 5X épsilon -PL) . ns não significativo, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001.

A Figura 6 ilustra a extensibilidade total da massa produzida com utilização de farinha de controlo (farinha de controlo), com a simples adição de polilisina (adição de épsilon -PL), tratada com transglutaminase microbiana (farinha tratada com mTG) e que contém incorporação covalente de épsilon-polilisina em proteínas de farinha em diferentes proporções (mTG + épsilon -PL e mTG + 5X épsilon -PL). ns não significativo, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,000.

- 22 Nos resultados ilustrados nas Figuras 2 a 6, nomeadamente no caso do trigo, centeio e cevada, as farinhas tratadas retêm apenas 20 % ou menos da quantidade de epitopos tóxicos nativos relacionados com a doença celíaca encontrados nas farinhas originais. Adicionalmente, as farinhas modificadas exibem um aumento significativo da resistência máxima à extensão ou extensibilidade total, superior a 20 % em relação às farinhas originais, sem alterar as propriedades de digestibilidade.

Como utilizados nesta descrição, as expressões cerca de e aproximadamente referem-se a uma faixa de valores de mais ou menos 10 % do número especificado.

Além disso, o termo ou destina-se a significar um ou inclusivo em vez de um ou exclusivo. Isto é, a menos que especificado de outra forma, ou claro a partir do contexto, a frase X emprega A ou B destina-se a significar qualquer uma das permutações inclusivas naturais. Isto é, a frase X emprega A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes casos: X emprega A; X emprega B; ou X emprega A e B.

Além disso, os artigos um e uma, conforme utilizado neste pedido e reivindicações anexas deve ser geralmente interpretado como significando um ou mais, a menos que especificado de outra forma ou claro a partir do contexto que é direcionado a uma forma singular.

Além disso, como utilizado no presente documento, o termo exemplificativo destina-se a servir como uma ilustração ou exemplo de algo e não se destina a indicar uma preferência.

A matéria descrita acima é fornecida como uma ilustração da presente invenção e não deve ser interpretada como limitando-a. A terminologia utilizada com o propósito de descrever modalidades específicas, de acordo com a

- 23 presente invenção, não deve ser interpretada para limitar a invenção. Conforme utilizados nesta descrição, os artigos definidos e indefinidos, na sua forma singular, têm o objetivo de incluir na interpretação as formas plurais, a menos que o contexto da descrição indique explicitamente o contrário.

Será entendido que os termos eompreender e ineluir, quando utilizados nesta deserição, espeeifieam a presença das características, dos elementos, dos componentes, das etapas e das operações relacionadas, mas não excluem a possibilidade de outras características, elementos, componentes, etapas e operações estarem também contempladas.

Todas as modificações, desde que não modifiquem os recursos essenciais das reivindicações que se seguem, devem ser consideradas dentro do âmbito da proteção da presente invenção.

Lista de números de referência

1. Uma farinha de cereais

2. Água ou uma solução aquosa

3. Uma farinha de cereais dispersada aquosa

3a. Uma farinha de cereais dispersada aquosa que compreende épsilon-polilisina e transglutaminase

4. Épsilon-polilisina

5. Uma transglutaminase

6. Uma farinha de cereais modificada dispersada aquosa

7. Uma farinha de cereais modificada húmida

8. Uma farinha de cereais modificada

9. Um agente de redução

10. Um agente de conservação

100. Uma etapa de dispersão

101. Uma etapa de mistura

102. Uma etapa de incubação enzimática

103. Uma etapa de separação

104. Uma etapa de secagem

Lista de citações

Segue-se lista de citações:

Literatura não relacionada com patentes (NPL)

NPL1: Di Sabatino, A., & Corazza, G. R. (2009) . Coeliac disease. Lancet, 373(9673), 1480-1493.

NPL2: Gil-Humanes, J., Piston, F., AltamiranoFortoul, R., Real, A., Comino, I., Sousa, C., Rosell, C. M., & Barro, F. (2014). Reduced-gliadin wheat bread: an alternative to the gluten-free diet for consumers suffering gluten-related pathologies. PLoS One, 9(3), e90898.

NPL3: Green, P. H. R., & Cellier, C. (2007). Medical progress: Celiac disease. New England Journal of Medicine, 357(17), 1731-1743.

NPL4: Laursen, L. (2016). Will Europe toast GM wheat for gluten sufferers? Nat Biotechnol, 34(4), 369-371.

NPL5: Lebwohl, B., & Rubio-Tapia, A. (2021). Epidemiology, Presentation, and Diagnosis of Celiac Disease. Gastroenterology, 160(1), 63-75.

NPL6: Marciniak, M., Szymczak-Tomczak, A., Mahadea, D., Eder, P., Dobrowolska, A., & Krela-Kazmierczak, I. (2021). Multidimensional Disadvantages of a Gluten-Free Diet in Celiac Disease: A Narrative Review. Nutrients, 13(2), 643.

NPL7: Nilsen, E. M., Jahnsen, F. L., Lundin, K. E., Johansen, F. E., Fausa, O., Sollid, L. M., Jahnsen, J., Scott, H., & Brandtzaeg, P. (1998). Gluten induces an intestinal cytokine response strongly dominated by

- 25 interferon gamma in patients with celiac disease. Gastroenterology, 115(3), 551-563.

NPL8: Ribeiro, M., de Sousa, T., Sabença, C., Poeta, P., Bagulho, A. S., & Igrejas, G. (2021) . Advances in quantification and analysis of the celiac-related immunogenic potential of gluten. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 20(5), 4278-4298.

NPL9: Ribeiro, M., Lopes, S., Picascia, S., Gianfrani, C., & Nunes, F. M. (2020). Reinventing the nutraceutical value of gluten: The case of l-theanine-gluten as a potential alternative to the gluten exclusion diet in celiac disease. Food Chemistry, 324, 126840.

NPL10: Ribeiro, M., Picascia, S., Rhazi, L., Gianfrani, C., Carrillo, J. M., Rodriguez-Quijano, M., Branlard, G., & Nunes, F. M. (2019). Effect of in situ gluten-chitosan interlocked self-assembled supramolecular architecture on rheological properties and functionality of reduced celiac-toxicity wheat flour. Food Hydrocolloids, 90, 266-275.

NPL11: Ribeiro, M., Nunes, F. M., RodriguezQuijano, M., Carrillo, J. M., Branlard, G., & Igrejas, G. (2018). Next-generation therapies for celiac disease: the gluten-targeted approaches. Trends in Food Science and Technology, 75, 56-71.

NPL11: Ribeiro, M., Nunes, F. M., Guedes, S., Domingues, P., Silva, A.M., Carrillo, J. M., RodriguezQuijano, M., Branlard, G., & Igrejas, G. (2015). Efficient chemo-enzymatic gluten detoxification: reducing toxic epitopes for celiac patients improving functional properties. Sci Rep 5, 18041.

NPL13: Sollid, L. M. (2002). Coeliac disease: dissecting a complex inflammatory disorder. Nat Rev Immunol, 2(9), 647-655..

- 26 NPL14: Wieser, H., Koehler, P., & Scherf, K. A. (2023). Chemistry of wheat gluten proteins: Quantitative composition. Cereal Chemistry, 100(1), 36-55.

NPL15: Ziobro, R., Witczak, T., Juszczak, L., & Korus, J. (2013). Supplementation of gluten-free bread with non-gluten proteins. Effect on dough rheological properties and bread characteristic. Food Hydrocolloids, 32(2), 213220.

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um processo para preparar uma farinha de cereais modificada com concentrações reduzidas de epítopos tóxicos caracterizado por compreender as seguintes etapas:

   a) Executar uma etapa de dispersão (100) de uma farinha de cereais (1) em água ou numa solução aquosa (2) obtendo uma farinha de cereais dispersada aquosa (3), em que o pH da referida água ou solução aquosa (2) está na faixa de 5 a 8; e

   b) Executar uma etapa de mistura (101) através da adição de épsilon-polilisina (4) à referida farinha de cereais dispersada aquosa (3); e

   c) Executar uma etapa de mistura (101) através da adição de uma transglutaminase (5) à referida farinha de cereais dispersada aquosa (3); e

   d) Executar uma etapa de incubação enzimática (102) da farinha de cereais dispersada aquosa (3) que compreende épsilon-polilisina (4) e transglutaminase (5), em que a épsilon-polilisina é incorporada covalentemente nas proteínas da referida farinha de cereais; obtendo uma farinha de cereais modificada dispersada aquosa (6); em que a etapa de incubação (102) da farinha de cereais dispersada aquosa (3) que compreende épsilon-polilisina (4) e transglutaminase (5) é executada a uma temperatura de 2 °C a 60 °C durante 1 h a 48 horas; e

   e) Executar uma etapa de separação (103) de uma farinha de cereais modificada húmida (7) a partir da farinha de cereais modificada dispersada aquosa (6); e

   f) Executar uma etapa de secagem (104) da farinha de cereais modificada húmida (7), obtendo uma farinha de cereais modificada (8) compreendendo épsilon-polilisina incorporada covalentemente nas proteínas da referida farinha

   - 2 de cereais por catálise enzimática provocada por transglutaminase, em que o rácio de massa de épsilonpolilisina covalentemente incorporada nas proteínas da referida farinha de cereais esté na faixa de 0,001 a 3,5 % em peso em relação ao peso da referida farinha de cereais modificada; e em que as etapas b) e c) são executadas em qualquer ordem entre si.
2. 2. O processo para preparar uma farinha de cereais modificada, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por pelo menos um aditivo selecionado a partir do grupo que consiste num agente de redução (9), num agente de conservação (10), num agente antioxidante, num agente de branqueamento ou numa levedura inativada ser adicionado à referida farinha de cereais dispersada aquosa (3).
3. 3. O processo para preparar uma farinha de cereais modificada, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por o referido agente de redução (9) ser pelo menos um a partir do grupo que consiste em glutationa ou Lcisteína.
4. 4. O processo para preparar uma farinha de cereais modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizado por o referido agente de conservação (10) ser pelo menos um a partir do grupo que consiste em ácido sórbico e os seus sais, sorbato de potássio, ácido propiónico e os seus sais, propionato de cálcio, benzoato de sódio, bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio ou natamicina.
5. 5. O processo para preparar uma farinha de cereais modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações

   - 3 anteriores, caracterizado por a concentração de épsilonpolilisina (4) na farinha de cereais dispersada aquosa (3) estar na faixa de 0,01 a 10 mol/mol de glutamina da farinha.
6. 6. O processo para preparar uma farinha de cereais modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a quantidade adicionada de transglutaminase (5) na farinha de cereais dispersada aquosa (3) estar na faixa de 0,1 a 20 Unidades/g de farinha de cereais.
7. 7. O processo para preparar uma farinha de cereais modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a referida etapa de separação (103) ser pelo menos uma do grupo que consiste numa centrifugação ou numa filtração.
8. 8. O processo para preparar uma farinha de cereais modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a referida farinha de cereais ser pelo menos uma do grupo que consiste em farinha de trigo, farinha de aveia, farinha de centeio, farinha de cevada, farinha de triticale, farinha de arroz, farinha de milho, farinha de espelta, farinha de painço, farinha de sorgo, farinha de trigo mourisco, ou derivados germinados das mesmas, por exemplo, malte.
9. 9. Uma farinha de cereais modificada caracterizada por compreender épsilon-polilisina covalentemente incorporada nas proteínas da referida farinha de cereais ao efetuar um tratamento de transglutaminase na presença de épsilon-polilisina e por ser obtida pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o

   - 4 rácio de massa de épsilon-polilisina covalentemente incorporada nas proteínas da referida farinha de cereais estar na faixa de 0,001 a 3,5 % em peso em relação ao peso da referida farinha de cereais modificada.
10. 10. Um alimento processado à base de farinha de cereais caracterizado por ser produzido a partir de farinha de cereais modificada, conforme definida na reivindicação 9, como uma matéria-prima.