PT116392B - Método e composição para estabilizar e armazenar adn à temperatura ambiente e utilizações dos mesmos - Google Patents

Método e composição para estabilizar e armazenar adn à temperatura ambiente e utilizações dos mesmos Download PDF

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Abstract

A PRESENTE DIVULGAÇÃO REFERE-SE À UTILIZAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UMA EMULSÃO DE CERA DE PARAFINA COMO UM CONSERVANTE OU ESTABILIZANTE DE ADN, À TEMPERATURA AMBIENTE. ESTÁ TAMBÉM ABRANGIDO UM SUBSTRATO COMPREENDENDO A REFERIDA COMPOSIÇÃO. SÃO TAMBÉM DIVULGADOS OS MÉTODOS PARA UTILIZAR A REFERIDA COMPOSIÇÃO, ASSIM COMO O MÉTODO PARA IDENTIFICAR UMA AMOSTRA DE ADN PREVIAMENTE ESTABILIZADA NUMA EMULSÃO DE CERA DE PARAFINA QUE ESTÁ ADICIONALMENTE IMPREGNADA EM SUBSTRATOS DE MATERIAL LENHOCELULÓSICO.

Description

DESCRIÇÃO MÉTODO E COMPOSIÇÃO PARA ESTABILIZAR E ARMAZENAR ADN À TEMPERATURA AMBIENTE E UTILIZAÇÕES DOS MESMOS
Domínio Técnico
[0001] A presente divulgação refere-se à utilização de uma composição compreendendo uma emulsão de cera de parafina e ADN como um estabilizante de ADN em substratos de material lenhocelulósico. Tem aplicação num número de domínios emergentes onde é necessária a conservação da integridade da informação no ADN. Estes incluem a utilização de ADN em aplicações de marcação e rastreio, o desenvolvimento de dispositivos de armazenamento à base de ADN ou a conservação de amostras de ADN em estudos ambientais.
Técnica Anterior
[0002] O ácido desoxirribonucleico ou ADN é conhecido pelo seu papel como transportador de informação nos organismos vivos. No entanto, recentes avanços tecnológicos em áreas tais como a síntese, sequenciação de ADN e ciências de nanomateriais, abriram novas possibilidades além do seu papel biológico. Devido à sua capacidade para armazenar informação ao nível molecular, o ADN ou os materiais à base de ADN estão agora a ser utilizados numa variedade de aplicações tais como marcação de produtos e armazenamento de dados.
[0003] A complexidade crescente e a consequente vulnerabilidade das cadeias de abastecimento levaram a uma procura de novas tecnologias capazes de proteger toda a cadeia de abastecimento. As etiquetas moleculares à base de ADN são integradas numa gama de materiais e produtos e, se necessário, utilizadas inequivocamente para identificar as origens dos produtos. Tecnologias desenvolvidas em torno deste princípio estão atualmente a ser comercializadas (por exemplo Applied DNA Sciences e Haelixa).
[0004] Embora ainda em desenvolvimento, outro setor que utiliza as características intrínsecas do ADN é o armazenamento de dados. O aumento rápido na informação digital está a suscitar problemas relacionados com o armazenamento de dados. Os arquivos permanentes de dados acedidos raramente baseiam-se atualmente em bandas magnéticas. No entanto, esta abordagem não é sustentável no longo prazo. Como um exemplo, considerando um centro de dados que armazena um exabyte em unidades de banda magnética, estimativas sugerem que seriam necessários aproximadamente mil milhões de dólares US ao longo de 10 anos para construir e manter essa estrutura (Extance, Andy, 2016, Nature 537, 22-24). Há uma necessidade urgente de soluções de armazenamento de alta densidade, a longo prazo. A ideia de utilizar ADN como um meio de armazenamento de dados está a ganhar lentamente ímpeto. Muito recentemente, investigadores da Universidade de Washington e a Microsoft mostraram um sistema automatizado para o armazenamento de dados, que incluía passos de escrita (síntese de ADN) e leitura (sequenciação de ADN) (Ceze et al., 2019, Nature Scientific Reports, 9:4998). A maior vantagem de utilizar ADN é a densidade de armazenamento de dados. Atualmente, a maior unidade de banda magnética tem 14 terabytes, muito próximo do limite previsto para a tecnologia de 1 TB in-2. No ADN, por outro lado, pode ser conseguida uma densidade de armazenamento máxima de 455 exabytes (455 x 106 TB) por grama. Isto significa que toda a informação produzida no mundo em 1 ano poderia ser armazenada em 4 g de ADN (Noite et al., 2018, Nature 365-381).
[0005] A utilização generalizada de ADN na rastreabilidade ou como uma alternativa credível aos métodos atuais de armazenamento de dados continua limitada por três passos/tecnologias chave: síntese de ADN, recuperação/sequenciação de ADN e armazenamento de ADN. A procura crescente em várias aplicações tais como medicina e ciência forense tem promovido o desenvolvimento de tecnologias de síntese e sequenciação.
[0006] Contudo, no presente, continuam por existir desenvolvimentos tecnológicos no armazenamento de ADN. Se armazenado a 4 °C em solução, o ADN começa a decompor-se em questão de semanas. A -80 °C, no estado sólido, a vida útil prolonga-se até aos 3-5 anos (Noite et al., 2018, Nature 365-381) . No entanto, armazenar o ADN a -80 °C é logisticamente exigente. Além disso, no caso de desastres naturais ou outros eventos importantes, a falta de eletricidade pode impedir a conservação com sucesso da integridade do ADN. São necessárias novas tecnologias e métodos para armazenar e manter a integridade do ADN num prazo mais longo à temperatura ambiente.
[0007] Já são comercializadas algumas soluções. A maioria delas baseia-se em tecnologias de encapsulamento de ADN. Por exemplo, a tecnologia DNAshell, comercializada pela empresa Imagene, baseia-se no confinamento de ADN dessecado e purificado sob uma atmosfera inerte dentro de minicápsulas estanques ao ar de aço inoxidável (http://www.imagene.eu). Embora esta tecnologia possa estabilizar o ADN durante intervalos de tempo prolongados, o seu encapsulamento envolve uma série de passos que requerem o envolvimento de pessoal e equipamento especializados.
[0008] Como outro exemplo, refere-se o protocolo para a proteção e o encapsulamento de ADN em sílica desenvolvido por Paunescu et al. (Paunescu et al., 2013 Nature 24402448) . Esta técnica permite a recuperação de ADN após exposição a 70 °C durante uma semana, o que é equivalente a 2 000 anos na Europa central (Grass, R. N., 2015, Angew. Chemie - Int. Ed. 54, 2552-2555). No entanto, após encapsulamento em sílica, a recuperação de ADN não é uma tarefa trivial. Esta envolve um protocolo que utiliza fluoreto de hidrogénio tamponado, uma solução mordente que requer uma série de medidas de precaução quando se manuseia.
Descrição Geral
[0009] A presente divulgação refere-se a um processo para estabilizar ADN à temperatura ambiente utilizando emulsão de cera de parafina como um veículo e materiais lenhocelulósicos como suporte sólido.
[0010] Para o âmbito e interpretação da presente divulgação, define-se que temperatura ambiente deve ser considerada como uma temperatura entre 15-30 °C, preferencialmente entre 18-25 °C, mais preferencialmente entre 20-22 °C.
[0011] O ADN é estabilizado numa emulsão de parafina, aumentando a sua vida útil consideravelmente e sem a necessidade de medidas de conservação adicionais tais como refrigeração. A proteção química da cera de parafina é maximizada ainda mais impregnando ou injetando a emulsão de ADN/parafina em materiais lenhocelulósicos, proporcionando assim proteção física adicional e estabilização a longo prazo.
[0012] A presente divulgação refere-se a um processo para estabilizar ADN. Como mencionado acima, o ADN começará a decompor-se dentro de semanas se não for estabilizado apropriadamente, comprometendo assim a sua aplicação como uma etiqueta ou como um meio de armazenamento de informação. As metodologias atuais para estabilizar o ADN são logisticamente exigentes (armazenamento a -80 °C) ou de trabalho intensivo (encapsulamento e libertação a partir de micro ou nanoparticulas).
[0013] A presente divulgação descreve um processo para estabilizar fragmentos de ADN utilizando uma emulsão de cera de parafina como um veículo e materiais lenhocelulósicos como suporte. Assim que o ADN é estabilizado na emulsão de parafina, a sua vida útil é consideravelmente prolongada sem a necessidade de medidas de conservação adicionais tais como refrigeração.
[0014] A proteção química da emulsão de cera de parafina é maximizada ainda mais se impregnada ou injetada em materiais lenhocelulósicos, que proporcionarão proteção física adicional. Por conseguinte, a presente divulgação cai dentro do domínio de conservação e armazenamento de ADN com implicações óbvias nos domínios emergentes, onde é necessária a conservação da integridade da informação no ADN.
[0015] Por exemplo, mas sem limitação, a presente divulgação poderia ser a base para o desenvolvimento de tecnologias de marcação e rastreio de ADN para madeira ou dispositivos de armazenamento de dados para armazenamento frio (neste contexto, armazenamento frio refere-se ao armazenamento de dados inativos numa base a longo prazo ou indefinida).
[0016] Uma das vantagens técnicas principais da presente divulgação é a sua simplicidade. A estabilização do ADN é mais simples e mais rentável quando comparada com as tecnologias e protocolos de estabilização/conservação (por exemplo, protocolos de encapsulamento). A formulação consiste em combinar ADN com a emulsão de cera de parafina. A emulsão de ADN/cera de parafina é depois conservada durante pelo menos três meses à temperatura ambiente sem degradação significativa. Os métodos de encapsulamento, pelo contrário, requerem geralmente protocolos demorados e equipamento de laboratório.
[0017] A emulsão de ADN/cera de parafina é utilizada para impregnar e marcar materiais lenhocelulósicos. Em comparação com as tecnologias de seguimento e rastreio alternativas, a marcação com ADN de materiais lenhocelulósicos tem várias vantagens em relação às tecnologias de marcação (do Inglês taggant technologies) concorrentes. O termo marcação refere-se a caracteristicas de segurança invisíveis que são autenticadas apenas por sistemas de leitura avançados ou análise laboratorial (por exemplo, materiais inertes, alumínio ou partículas raras). A maioria destas tecnologias e métodos de deteção baseiam-se nas propriedades óticas das etiquetas. Uma vez que a sua deteção não é dependente das suas propriedades óticas, as etiquetas de ADN/cera de parafina podem ser aplicadas a uma grande gama de materiais lenhocelulósicos, incluindo objetos/produtos relacionados. O ADN pode ser depois detetado a níveis vestigiais extremos através de métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR). Níveis baixos de marcação permitem aplicações mais rentáveis, onde têm de ser marcadas quantidades elevadas de materiais (por exemplo, materiais em madeira bruta) . Finalmente, a capacidade intrínseca do ADN para transportar informação é utilizada para desenhar sistemas de codificação complexos reforçando, desse modo, a segurança da etiqueta.
[0018] Numa forma de realização da presente divulgação, a impregnação de materiais lenhocelulósicos com emulsão de ADN/cera de parafina é utilizada para desenvolver sistemas de armazenamento frio para o armazenamento de informação baseado em ADN. Armazenamento frio refere-se ao armazenamento de dados inativos numa base a longo prazo ou indefinida. Ao proporcionar uma barreira física, os materiais lenhocelulósicos complementam adicionalmente a proteção química proporcionada pela cera de parafina ao ADN. Portanto, tem implicações óbvias no desenvolvimento de sistemas de armazenamento frio. Como um exemplo, mas não estando limitado a, este é utilizado para desenvolver dispositivos de armazenamento frio para armazenar palavraspasse e/ou outros dados sensíveis desligado da rede protegendo-os das quebras de segurança na rede. Além da densidade de armazenamento de dados, uma vantagem de utilizar ADN para armazenar informação sensível é o facto de que o ADN é um mecanismo de armazenamento de informação universal em sistemas biológicos. Contrariamente a outros dispositivos de armazenamento de dados ultrapassados (por exemplo, discos compactos e disquetes), o ADN não se tornará obsoleto.
[0019] Para os especialistas em biologia molecular, serão óbvias outras formas de realização. Por exemplo, mas sem limitação, é utilizado para desenvolver kits de conservação de ADN para conservar amostras de ADN em estudos ambientais. Os estudos baseados em ADN têm sido utilizados de forma crescente em medicina, monitorização e conservação da biodiversidade. Um desafio comum nestes estudos é a necessidade de protocolos de conservação de ADN. Além disso, há também a necessidade de manter as amostras congeladas em trânsito. Numa forma de realização, a cera de parafina é utilizada para estabilizar o ADN à temperatura ambiente durante o transporte.
[0020] A proteção proporcionada pela emulsão de cera de parafina é maximizada ainda mais pela imobilização prévia do ADN em nanoparticulas. 0 encapsulamento ou adsorção do ADN em nanoparticulas proporciona o benefício de adicionar outra camada de proteção ao ADN. Como um exemplo, mas sem limitação, é utilizado para aumentar a resistência do ADN às condições agressivas das linhas de produção (por exemplo, temperaturas altas e gamas de pH extremo). Também pode ser utilizado para proteger o ADN dos efeitos prejudiciais da radiação ultravioleta (UV).
[0021] A presente divulgação baseia-se no facto de que a emulsão de cera de parafina estabiliza o ADN, aumentando a sua vida útil. Refere-se a uma formulação com base em cera de parafina que estabiliza o ADN à temperatura ambiente e é impregnada ou injetada em materiais de base lenhocelulósica. Os passos envolvidos na formulação e produção de ADN estabilizado com emulsão de cera de parafina são: i) Realizar o isolamento do ADN, ii) Imobilização do ADN, iii) Realizar a mistura do ADN com a emulsão de cera de parafina, iv) Incorporar a emulsão de ADN/cera de parafina em materiais lenhocelulósicos, v) Extrair e detetar o ADN após a estabilização.
i) Realizar o isolamento do ADN
[0022] O ácido nucleico pode ser produzido sinteticamente (amplicões de ADN), amplificado através de reação em cadeia da polimerase (PCR) ou métodos semelhantes, ou isolado a partir do ambiente ou uma fonte biológica (ADN genómico). O ADN pode ser de cadeia simples ou dupla. Numa forma de realização da presente divulgação, a informação alfanumérica é convertida na sequência de ADN de quatro bases para armazenamento de dados. Um exemplo de um esquema de informação de codificação em ADN é descrito na patente internacional WO 2013/178801 A2. A sequência de ADN sintético é em seguida sintetizada. Noutra forma de realização da presente divulgação, é utilizada a técnica de PCR para amplificar fragmentos de ADN de origem natural a utilizar como marcadores ou etiquetas de ADN, como anteriormente descrito na patente internacional WO 2015/026254. Numa forma de realização adicional da presente divulgação, o ADN é extraído de amostras biológicas e conservado em emulsão de cera de parafina à temperatura ambiente até análise.
ii) Imobilização do ADN
[0023] Numa forma de realização, o ADN é adicionado nu (do Inglês naked) ou imobilizado (adsorvido, intercalado ou encapsulado) em nanopartículas antes da estabilização na emulsão de cera de parafina. Nalgumas formas de realização, antes de adicionar a emulsão de cera de parafina, o ADN será encapsulado. A encapsulação do ADN tem o benefício de prolongar adicionalmente a sua vida útil, complementando a proteção/estabilização de base proporcionada pela parafina. Vários métodos de encapsulação de ADN são conhecidos dos especialistas na ciência de nanomateriais/biologia molecular.
iii) Realizar a mistura do ADN com a emulsão de cera de parafina
[0024] Numa forma de realização da presente divulgação, as moléculas de ADN são solubilizadas em água e adicionadas à emulsão de cera de parafina. O ADN na emulsão de cera de parafina é estável à temperatura ambiente durante pelo menos três meses. A concentração do ADN depende da sua aplicação. Podem ser utilizadas concentrações variáveis para compensar diferentes velocidades de degradação do ADN. Uma gama de métodos moleculares são utilizados pelos especialistas em biologia molecular para calibrar as concentrações de ADN (por exemplo, medição espetrofotométrica e PCR quantitativa em tempo real).
iv) Incorporar a emulsão de ADN/cera de parafina em materiais lenhocelulósicos
[0025] Numa forma de realização da presente divulgação, a formulação de ADN (nu ou imobilizado) e emulsão de cera de parafina é aplicada a uma gama de materiais lenhocelulósicos. A emulsão de cera de parafina é utilizada rotineiramente em materiais lenhocelulósicos para aumentar a sua hidrofobicidade e resistência contra as condições meteorológicas e água (Wiertelak e Czarnecki., 1935, Ind. Eng. Chem. 27, 5, 543-547) . Por conseguinte, a emulsão de cera de parafina é um veículo ideal para impregnar e estabilizar ADN em materiais lenhocelulósicos. A emulsão de ADN/cera de parafina pode ser depois utilizada para marcar estes materiais (por exemplo, madeira e cortiça). Considerando que estes tipos de materiais proporcionarão proteção física adicional ao ADN que já está quimicamente estabilizado, a presente divulgação pode ser também utilizada para desenvolver dispositivos para armazenamento de dados em ADN (por exemplo, armazenamento frio).
v) Extrair e detetar o ADN após a estabilização
[0026] Numa forma de realização da presente divulgação, após incorporação em materiais lenhocelulósicos, o ADN tem de ser recuperado e detetado/lido. Em algumas formas de realização, uma amostra de material lenhocelulósico é colhida para extração do ADN. Após colheita da amostra, o ADN é extraído do material lenhocelulósico com um protocolo de extração de ADN. Para os especialistas em biologia molecular, são conhecidos vários protocolos e kits para ADN. Por exemplo, extração de ADN com fenol-clorofórmio (D. N. Miller, J. E. Bryant, E. L. Madsen, e W. C. Ghiorse Appl. Environ. Microbiol. 65:4715-4724, 1999). Também são bem conhecidas várias abordagens moleculares para a deteção e/ou leitura de ADN. Por exemplo, mas sem limitação, PCR convencional, PCR quantitativa em tempo real para detetar e quantificar fragmentos de ADN específicos e sequenciar o ADN.
[0027] Numa forma de realização, a presente divulgação refere-se à utilização de uma composição que compreende uma emulsão de cera de parafina como um conservante ou estabilizante de ADN. Numa forma de realização adicional, a presente divulgação refere-se também à utilização da referida composição, em que a composição compreende ainda um substrato de material lenhocelulósico.
[0028] Numa forma de realização, o ADN é estabilizado desde 4 a 40 °C, preferencialmente 20 a 30 °C, mais preferencialmente 20 a 22 °C.
[0029] Numa forma de realização, a presente divulgação compreende a utilização da composição como um conservante ou estabilizante de ADN a 15-30 °C, preferencialmente 20 a 22 °C.
[0030] Numa forma de realização, a presente divulgação compreende a utilização da referida composição para marcar e/ou rastrear um artigo, preferencialmente para a identificação da origem de produto e passo de produção numa cadeia de abastecimento. Numa forma de realização adicional, também está abrangida a utilização da referida composição para armazenamento de dados em ADN, nomeadamente para armazenamento de informação a longo prazo e desligado 11 da rede, preferencialmente armazenamento de palavras-passe desligado da rede.
[0031] Um aspeto da presente divulgação compreende a utilização da composição de acordo com qualquer uma das formas de realização do presente documento, em que a emulsão de cera de parafina compreende pelo menos 40% (p/p) de parafina hidrogenada; preferencialmente 45% - 60% (p/p) de parafina hidrogenada, mais preferencialmente 50% - 55% (p/p) de parafina hidrogenada.
[0032] Numa forma de realização, a presente divulgação compreende a utilização da referida composição em que a emulsão compreende ainda pelo menos 0,0001% (p/v) de ADN por volume de emulsão de cera de parafina, mais preferencialmente, pelo menos 0,0002% (p/v).
[0033] Um aspeto da presente matéria-objeto refere-se à utilização da composição de acordo com qualquer uma das formas de realização da presente divulgação, em que a amostra de ADN está nua ou ligada a uma nanoparticula. Numa forma de realização, a amostra de ADN está encapsulada, intercalada ou adsorvida à nanoparticula.
[0034] Numa forma de realização, é divulgada a utilização da composição de acordo com qualquer uma das formas de realização divulgadas em que a composição compreende ainda uma marcação para deteção do ADN. Numa forma de realização adicional, a referida marcação pode ser um composto de fósforo de conversão ascendente, preferencialmente fluoreto de itrio e sódio, itérbio e érbio dopado; ou oxifluoreto de itrio e sódio, itérbio e érbio dopado.
[0035] Um aspeto da presente divulgação refere-se a uma composição para estabilização de ADN em substrato de material lenhocelulósico compreendendo parafina e ADN.
[0036] Outro aspeto da presente divulgação refere-se a um substrato compreendendo a composição descrita em qualquer uma das formas de realização do presente documento. Numa forma de realização, o substrato é um material lenhocelulósico, preferencialmente selecionado a partir de: madeira, derivados de madeira, fibras lenhocelulósicas, bagaço de cana-de-açúcar, resíduos de casca de laranja, espigas de milho, caules e folhas de milho, palha de arroz, cascas de amendoim, papel, jornal, palha de trigo, pé de banana, farelo de arroz, farelo de trigo, polpa de maçã, fibra de cachos de fruto sem óleo de palma, folhas de faia, resíduo de eucalipto, cortiça, ou combinações dos mesmos. Preferencialmente o material lenhocelulósico é selecionado a partir de: madeira, derivados de madeira, cortiça, papel, ou combinações dos mesmos.
[0037] A presente divulgação refere-se também a um método para obter o substrato compreendendo a composição descrita na presente divulgação, compreendendo os seguintes passos: (i) amplificar ou extrair uma amostra de ADN; (ii) misturar a referida amostra de ADN com uma emulsão de cera de parafina; (iii) impregnar a mistura anterior num material lenhocelulósico; em que o ADN é conservado e estabilizado devido a uma proteção físico-química sinérgica conferida pela parafina e material lenhocelulósico.
[0038] Numa forma de realização, o referido método compreende ainda o passo de adicionar uma marcação à mistura para deteção do ADN.
[0039] Numa forma de realização, a emulsão de cera de parafina misturada com o ADN é impregnada num material lenhocelulósico por pulverização ou injeção.
[0040] Um aspeto da presente divulgação refere-se a um método para a identificação de ADN, o método compreendendo os seguintes passos: (i) obter uma composição compreendendo ADN e uma emulsão de cera de parafina suportada num material lenhocelulósico; (ii) opcionalmente, identificar a referida composição no suporte por meio de uma marcação, preferencialmente uma marcação responsiva à luz; (iii) extrair a composição impregnada compreendendo o ADN e uma emulsão de cera de parafina do material lenhocelulósico, preferencialmente raspando uma pequena porção do suporte sólido impregnado; (iv) processar o material com uma solução de extração de ADN, preferencialmente uma solução de extração à base de brometo de Cetrimónio (CTAB) ; e (v) detetar o ADN por meio de métodos de biologia molecular, preferencialmente reação em cadeia da polimerase.
Breve Descrição dos Desenhos
[0041] As seguintes figuras proporcionam formas de realização preferidas para ilustrar a descrição e não devem ser vistas como limitando o âmbito da invenção.
[0042] Figura 1: Diferentes fases no processo de emulsão de ADN/cera de parafina.
[0043] Figura 2: Quantificação por PCR em tempo real do ADN na emulsão de cera de parafina imediatamente depois de misturar o ADN (controlo), após 30, 60 e 90 dias à temperatura ambiente. Os valores são expressos como Ct (inversamente proporcional à quantidade de ADN alvo). Houve um claro efeito de estabilização da emulsão de cera de parafina no ADN.
[0044] Figura 3: Quantificação por PCR em tempo real do ADN na emulsão de cera de parafina depois de ter sido pulverizada em madeira 1) imediatamente após aplicação
Controlo; 2) após 30 dias no escuro - Escuro e 3) após 30 dias de exposição a condições ambientais adversas Atmosféricas. Embora uma fração do ADN estabilizado pela parafina na madeira se tenha degradado após 30 dias de exposição às condições atmosféricas, aquele permanecia detetável em níveis consideravelmente altos. Os valores são expressos como Ct (inversamente proporcional à quantidade de ADN alvo).
[0045] Figura 4: Diferentes fases no desenvolvimento de um dispositivo para armazenamento de dados em ADN com base em materiais lenhocelulósicos. Neste exemplo, a emulsão de cera de parafina foi utilizada como veículo para o ADN e a cortiça foi utilizada como um suporte físico.
[0046] Figura 5: Quantificação por PCR em tempo real do ADN quando aplicado em cortiça utilizando a emulsão de cera de parafina como veículo - protótipo do dispositivo de armazenamento de dados à base de ADN. O envelhecimento acelerado foi simulado expondo o protótipo a 60 °C durante 30, 60 e 150 dias. O ADN foi estável até 150 dias a 60 °C (equivalente a 5 anos à temperatura ambiente).
Descrição Detalhada da Invenção
[0047] A presente divulgação refere-se à utilização de uma composição que compreende uma emulsão de cera de parafina e ADN como um estabilizante de ADN em substratos de material lenhocelulósico. Também são divulgados os métodos para utilizar a referida composição. Também está abrangido o método para identificar uma amostra de ADN previamente estabilizada numa emulsão de cera de parafina que está adicionalmente impregnada em substratos de material lenhocelulósico.
[0048] Um aspeto da presente divulgação compreende uma formulação que estabiliza o ADN à temperatura ambiente e pode ser utilizada para impregnar e conservar ADN em materiais lenhocelulósicos. A formulação inclui misturar ADN, nu ou imobilizado em nanoparticulas, com a emulsão de cera de parafina.
[0049] Numa forma de realização da presente divulgação, a estabilização do ADN na emulsão de cera de parafina é realizada do seguinte modo:
a) Amplificação ou extração do ADN:
[0050] Numa forma de realização da presente divulgação, o primeiro passo na formulação da emulsão de ADN/cera de parafina requer a produção de amplicões de ADN. Este passo depende da aplicação da formulação e não é necessário em todas as formas de realização possíveis. A técnica de PCR pode ser utilizada para amplificar os fragmentos de ADN.
[0051] Numa forma de realização da presente divulgação, os seguintes iniciadores foram utilizados para amplificar um fragmento de ADN de cadeia dupla com 237 pb a partir de um isolado bacteriano:
441 F-l | SEQ ID NO.l: - 5'- AGCACTTTAAGTTGGGAGGA -3' e,
678 R | SEQ ID NO.2: - 5'- CGCTACACAGGAAATTCCA -3'.
[0052] As amplificações por PCR foram realizadas em reações de 50 microlitros. Foi preparada uma mistura principal para a reação utilizando DreamTaq PCR Master Mix (2x) (Thermofisher Scientific). A concentração final dos iniciadores 441 F-l e 678 R foi 0,4 μΜ. 2 pL do ADN bacteriano previamente extraído foram adicionados à reação. As condições do ciclo de amplificação por PCR foram as seguintes: 95 °C durante 2 minutos, seguida de 30 ciclos de °C durante 20 s, 55 °C durante 20 s e 73 °C durante 40 s. Foi realizado um passo de alongamento final de 1 minuto a 72 °C.
[0053] Noutra forma de realização da presente divulgação, o ADN genómico foi extraído de amostras ambientais para estabilização. Para os especialistas na técnica, estão disponíveis vários protocolos ou kits comerciais para extrações de ADN a partir de uma gama de diferentes amostras ambientais (por exemplo, solo, água, plantas, tecidos animais).
b) Emulsão de ADN/cera de parafina
[0054] Noutra forma de realização da presente divulgação, fragmentos de PCR de DNA amplificado ou genómico obtidos como descrito nas tarefas anteriores (imobilizados em nanoparticulas ou nus), foram misturados numa emulsão de cera de parafina.
[0055] Numa forma de realização da presente divulgação, a fórmula da emulsão de cera de parafina inclui aproximadamente 50% (p/p) de parafinas hidrogenadas e 50% (p/p) de água.
[0056] Numa forma de realização adicional da presente divulgação, pode ser adicionada uma marcação à emulsão de ADN/cera de parafina para deteção ou visualização rápida em linhas de produção. Como um exemplo, mas sem limitação, um composto de fósforo de conversão ascendente que proporciona um sinal visível quando exposto a canetas de laser pode ser adicionado à formulação.
c) Aplicação da emulsão de ADN/cera de parafina a materiais lenhocelulósicos
[0057] Numa forma de realização da presente divulgação, a emulsão de ADN/cera de parafina pode ser utilizada para marcar/etiquetar madeira. A emulsão de ADN/cera de parafina é aplicada na madeira para associar o material a uma localização geográfica ou passo de produção específico e, mais tarde, se for necessário, utilizada para certificar a origem da madeira ou um tratamento ou passo de produção específico na cadeia de abastecimento (por favor, ver exemplo 1) . Numa forma de realização da presente divulgação, a emulsão de ADN/cera de parafina pode ser pulverizada sobre a área a comercializar.
[0058] Noutra forma de realização da presente divulgação, a emulsão de ADN/cera de parafina pode ser injetada dentro da madeira.
[0059] Noutra forma de realização da presente divulgação, a proteção química proporcionada pela emulsão de cera de parafina pode ser combinada com a proteção física dos materiais lenhocelulósicos, e utilizada para desenvolver um dispositivo de armazenamento de informação à base de ADN. Este pode ser utilizado para o armazenamento da informação a longo prazo e desligado da rede, incluindo armazenamento desligado da rede de palavras-passe.
d) Extração e deteção de ADN
[0060] Numa forma de realização da presente divulgação, foi ainda aplicado um protocolo de extração de ADN para extrair o ADN impregnado dos materiais lenhocelulósicos. Uma amostra de ADN foi recolhida raspando uma pequena área superficial (aproximadamente 1 cm2) . A amostra foi em seguida colocada num tubo de 2 mL de matriz A de lise (MP Biomedicals) , submergida em 700 pL de uma solução de extração à base de CTAB (pH=8, CTAB 0,06 M, Tris-HCl 0,1 M, EDTA 0,02 M, NaCl 1,4 M e 0,5% de PVP) e lisada mecanicamente com um instrumento Fast Prep® (MP Biomedicals). No passo final da extração, o ADN purificado foi eluido em 30 pL de água desionizada. Noutra forma de realização da invenção, a presença de fragmentos de ADN específicos foi detetada nas amostras de ADN por PCR em tempo real quantitativa (qPCR) . As amplificações por PCR foram realizadas em reações de 20 microlitros. Uma mistura principal para a reação foi preparada utilizando HOT FIREPol EvaGreen qPCR Supermix (lx) (Solis BioDyne) . A concentração final dos iniciadores 441 F-l e 678 R foi de 0,1 μΜ. Foram adicionados 2,5 pL da amostra de ADN à reação. Foi utilizado BSA a 0,1 mg/mL como um aditivo para a reação. As condições de qPCR específicas foram as seguintes: 95 °C durante 12 minutos, seguido de 35 ciclos de 95 °C durante 20 s, 55 °C durante 30 s e 72 °C durante 45 s. A intensidade do sinal de fluorescência foi medida durante um passo a 80 °C durante 10 s para dissociar os dímeros iniciadores. A especificidade do produto foi confirmada por análise da curva de fusão. Os dados da curva de fusão foram obtidos começando em 60 °C e aumentando em 0,3 °C a cada 15 s até um máximo de 95 °C. Durante a etapa de fusão foi obtida uma leitura da placa a cada incremento de 0,3 °C.
Exemplos:
Exemplo 1: Avaliação da estabilidade da emulsão de ADN/cera de parafina na madeira para aplicações de marcação e rastreio
[0061] O presente exemplo mostra os passos envolvidos na formulação e aplicação da emulsão de ADN/cera de parafina em madeira. Pretendeu-se ainda avaliar a sua estabilidade antes e depois da aplicação em materiais lenhocelulósicos ao pulverizar sobre uma determinada área. Observou-se que o
ADN na emulsão de cera de parafina antes da aplicação não mostrou sinais de degradação após três meses no escuro à temperatura ambiente, como detetado por PCR em tempo real quantitativa. Após aplicação da emulsão de ADN/cera de parafina na madeira, foi possível detetar o ADN a níveis altos após 30 dias de exposição a condições meteorológicas naturais e eventos climáticos (exposição à luz solar, variações de temperatura, chuva e ciclos húmido-seco). A deteção inequívoca da etiqueta de ADN permitiu a autenticação com sucesso do material lenhocelulósico após exposição a condições ambientais adversas.
[0062] A Figura 1 mostra os passos necessários para incorporar a amostra de ADN numa emulsão de cera de parafina, descrita do seguinte modo:
[0063] Amplificação de ADN: Nesta forma de realização da presente divulgação, os fragmentos de ADN utilizados para marcar a madeira foram amplificados a partir de um isolado bacteriano. Foi utilizada PCR com iniciadores 441 F-l e 678 R para amplificar um fragmento de ADN de cadeia dupla com 237 pb (ver a) Amplificação ou extração de ADN da descrição detalhada da presente divulgação).
[0064] Formulação da emulsão de ADN/cera de parafina: Os fragmentos de ADN foram misturados com uma emulsão de cera de parafina (ver tópico b) Emulsão de ADN/cera de parafina da descrição detalhada da presente divulgação). A estabilidade do ADN quando misturado com parafina foi avaliada quantificando o ADN com PCR em tempo real no início e após três meses à temperatura ambiente no escuro. Não foi detetada degradação significativa durante este período (Figura 2). Uma nanopartícula de fósforo de conversão ascendente (0,1% p/v de Érbio itérbio de sódio fluoreto de ítrio, Sigma) foi adicionada à solução para confirmar a aplicação com sucesso da marcação na madeira através de excitação com luz de laser a 980 nm.
[0065] Aplicação da emulsão de ADN/cera de parafina em madeira: Nesta forma de realização, a emulsão de ADN/cera de parafina foi pulverizada numa determinada área na madeira. A aplicação com sucesso da emulsão de cera de parafina foi confirmada utilizando uma caneta de laser de 5 mW no infravermelho a 980 nm que excita a conversão ascendente do fósforo e gera um sinal ótico visível.
[0066] Extração e deteção de ADN: A amostra de ADN foi recolhida raspando uma pequena área da madeira (1 cm2) . 0 ADN foi então extraído utilizando uma solução de extração à base de CTAB. A etiqueta de ADN foi detetada utilizando PCR em tempo real quantitativa com iniciadores específicos 441 F-l e 678 R (ver tópico d) Extração e deteção de ADN da descrição detalhada da presente divulgação) e os resultados comparados com os respetivos controlos sem a emulsão de cera de parafina. O ADN foi quantificado em três condições experimentais específicas: imediatamente após aplicação, após um mês no escuro e após um mês de exposição a condições ambientais adversas (exposição à luz solar, variações de temperatura, chuva e ciclos húmido-seco). Foi possível detetar ADN mesmo após um mês de exposição a condições ambientais adversas (Figura 3).
Exemplo 2: Desenvolvimento de um dispositivo para armazenamento de dados em ADN com base em materiais lenhocelulósicos.
[0067] O presente exemplo mostra os passos (Figura 4) envolvidos no desenvolvimento de um protótipo de armazenamento de dados em ADN utilizando emulsão de cera de parafina como um veículo e um material lenhocelulósico como suporte. A cortiça foi escolhida como o material lenhocelulósico devido às suas propriedades de vedação.
[0068] Foi avaliada a capacidade do protótipo para manter o ADN estável ao longo do tempo. Foi demonstrado que o protótipo mantém o ADN estável até 5 meses a 60 °C, o que corresponde a 5 anos à temperatura ambiente. Concluiu-se que a integração do material de cortiça e da emulsão de cera de parafina pode ser utilizada para estabilizar o ADN durante armazenamento a longo prazo à temperatura ambiente.
[0069] O efeito da proteção química da emulsão de cera de parafina combinado com as propriedades impermeáveis da cortiça aos líquidos e gases (proteção física) foi utilizado para desenvolver dispositivos de armazenamento de dados à base de ADN.
[0070] Como se mostra na Figura 4, esta forma de realização pode ser também dividida em diferentes passos, do seguinte modo:
[0071] Amplificação de ADN: Nesta forma de realização da presente divulgação, os fragmentos de ADN a armazenar foram amplificados a partir de um isolado bacteriano. A PCR foi utilizada com os iniciadores 441 F-l e 678 R para amplificar um fragmento de ADN de cadeia dupla com 237 pb (ver tópico a) Amplificação ou extração de ADN da descrição detalhada do presente documento).
[0072] Formulação da emulsão de ADN/cera de parafina: Os fragmentos de ADN foram misturados com uma emulsão de cera de parafina. Como mencionado noutras formas de realização da presente matéria-objeto, a fórmula da emulsão de cera de parafina inclui aproximadamente 50% (p/p) de parafinas hidrogenadas e 50% (p/p) de água (ver tópico b) da descrição detalhada da presente divulgação).
[0073] Aplicação da emulsão de ADN/cera de parafina em cortiça: A emulsão de ADN/cera de parafina foi aplicada numa pequena superfície de um pedaço quadrado de cortiça com 10 cm de largura e 3 cm de espessura. Um pedaço de cortiça igual foi colocado no topo para isolar a emulsão de ADN/cera de parafina. Os pedaços de cortiça foram então mantidos a 60 °C para simular o envelhecimento.
[0074] Extração e deteção de ADN: As amostras de cortiça foram recolhidas imediatamente após aplicação da emulsão de ADN/cera de parafina, após 30 dias a 60 °C, após 60 dias a 60 °C e após 150 dias a 60 °C. O ADN foi então extraído utilizando uma solução de extração à base de CTAB. O ADN foi detetado utilizando PCR em tempo real quantitativa com os iniciadores específicos 441 F -1 e 678 R (ver tópico d) Extração e deteção de ADN da descrição detalhada da presente divulgação). Embora houvesse uma ligeira diminuição na quantidade de ADN detetável nos primeiros 30 dias a 60 °C, a quantidade de ADN não mostrou alterações significativas após este período e até 150 dias a 60 °C, o que corresponde a aproximadamente 5 anos à temperatura ambiente (Figura 5) .
[0075] O termo compreendendo sempre que utilizado neste documento destina-se a indicar a presença das características, números inteiros, passos, componentes especificados, mas não para impedir a presença ou adição de uma ou mais outras características, números inteiros, passos, componentes ou grupos dos mesmos.
[0076] Evidentemente, a divulgação não está, de maneira alguma, restringida às formas de realização descritas e um especialista com conhecimentos médios na matéria irá prever muitas possibilidades de modificações às mesmas sem que se afaste da ideia básica da divulgação como definida nas reivindicações apensas.
[0077] As formas de realização descritas acima são obviamente combináveis.
[0078] As seguintes reivindicações dependentes definem formas de realização particulares da divulgação.

Claims (15)

1. Utilização de uma composição compreendendo uma emulsão de cera de parafina como conservante ou estabilizante de ADN.
2. Utilização da composição de acordo com a reivindicação anterior, em que a emulsão de cera de parafina é impregnada num material lenhocelulósico.
3. Utilização da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o ADN é estabilizado desde 4 a 40 °C, preferencialmente 20 a 30 °C, mais preferencialmente 20 a 22 °C.
4. Utilização da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores como um conservante ou estabilizante de ADN a 15-30 °C, preferencialmente 20 a 22 °C.
5. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para marcar e/ou rastrear um artigo.
6. Utilização da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores para o armazenamento de dados em ADN, preferencialmente para o armazenamento de informação a longo prazo e desligado da rede.
7. Utilização da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a emulsão compreende ainda pelo menos 0,0001% (p/v) de ADN por volume de emulsão de cera de parafina, preferencialmente, pelo menos 0,0002% (p/v).
8. Utilização da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a amostra de ADN está nua ou está ligada a uma nanoparticula.
9. Utilização da composição de acordo com a reivindicação anterior, em que a amostra de ADN está encapsulada, intercalada ou adsorvida à nanoparticula.
10. Utilização da composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a composição compreende ainda uma marcação para deteção do ADN.
11. Utilização da composição de acordo com a reivindicação anterior, em que a referida marcação é um composto de fósforo de conversão ascendente, preferencialmente fluoreto de itrio e sódio, itérbio e érbio dopado; ou oxifluoreto de itrio e sódio, itérbio e érbio dopado.
12. Método para estabilizar e armazenar ADN à temperatura ambiente descrito em qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo os seguintes passos: extrair ou amplificar uma amostra de ADN; misturar a referida amostra de ADN com uma emulsão de cera de parafina; impregnar a mistura anterior num material lenhocelulósico.
13. Método para estabilizar e armazenar ADN à temperatura ambiente de acordo com a reivindicação anterior, compreendendo ainda o passo de adicionar uma marcação à mistura para deteção do ADN.
14. Método para estabilizar e armazenar ADN à temperatura ambiente de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a emulsão de cera de parafina misturada com ADN é impregnada num material lenhocelulósico por pulverização ou injeção.
15. Método para estabilizar e armazenar ADN à temperatura ambiente compreendendo os seguintes passos: obter uma composição compreendendo ADN e uma emulsão de cera de parafina suportada num material lenhocelulósico; opcionalmente, identificar a referida composição no suporte por meio de uma marcação, preferencialmente uma marcação responsiva à luz; extrair o ADN impregnado do material lenhocelulósico, preferencialmente raspando uma pequena porção do suporte sólido impregnado; processar o material com uma solução de extração de ADN; detetar o ADN por meio de métodos de biologia molecular, preferencialmente reação em cadeia da polimerase.
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