PT115361B

PT115361B - Composições e métodos para impressão em 3d de matrizes fibrosas com propriedades antimicrobianas incorporando óxido de grafeno e poli (e-caprolactona)

Info

Publication number: PT115361B
Application number: PT115361A
Authority: PT
Inventors: Ferreira Melo Sofia; De Castro Gonçalves Almada Lobo Inês; Carvalheira Neves Sara
Original assignee: Inst De Engenharia Biomedica Ineb
Priority date: 2019-03-12
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2021-06-04
Also published as: EP3952932C0; EP3952932A1; WO2020185106A1; EP3952932B1; PT115361A; US20220152271A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AOS PARÂMETROS DE UMA COMPOSIÇÃO DE POLI (E-CAPROLACTONA) ¿ PLC ¿ E ÓXIDO DE GRAFENO (GO) PARA USO NA ELIMINAÇÃO DE BACTÉRIAS QUE CAUSAM INFEÇÕES EM PACIENTES IMPLANTADOS COM DISPOSITIVOS MÉDICOS, POR EXEMPLO STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS E ESCHERICHIA COLI. A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE TAMBÉM A UM MÉTODO DE CONSTRUÇÃO DE FIBRAS DE PLC/GO E DE MATRIZES FIBROSAS ATRAVÉS DE FABRICO ADITIVO E EXTRUSÃO HÚMIDA, UTILIZANDO A COMPOSIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO E, POR EXEMPLO, IMPRESSÃO EM 3D. O REFERIDO MÉTODO E COMPOSIÇÕES PODEM SER DESENVOLVIDOS PARA PRODUZIR UMA MATRIZ FIBROSA EM QUE AS CONCENTRAÇÕES DE PLC/GO E O DIÂMETRO DA FIBRA SÃO TAIS QUE AS LÂMINAS DE GO SÃO INCORPORADAS, MAS AO MESMO TEMPO EXPOSTAS NA SUPERFÍCIE DO POLÍMERO, CONFERINDO PROPRIEDADES BACTERICIDAS AO MATERIAL, MANTENDO A SUA BIOCOMPATIBILIDADE. COMO TAL, A PRESENTE INVENÇÃO DIZ AINDA RESPEITO A UMA MATRIZ BACTERICIDA FIBROSA DE PLC/GO E AOS DISPOSITIVOS MÉDICOS IMPLANTADOS QUE COMPREENDEM ESSA MATIZ. A COMPOSIÇÃO, MÉTODO, MATRIZ E DISPOSITIVOS MÉDICOS DA PRESENTE INVENÇÃO PODEM SER UTILIZADOS DE FORMA VANTAJOSA PARA OBTER MATRIZES DE PLC/GO E DISPOSITIVOS MÉDICOS COM PROPRIEDADES BACTERICIDAS QUE TENHAM UM RISCO REDUZIDO DE INFEÇÕES ASSOCIADAS A IMPLANTES.

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA IMPRESSÃO EM 3D DE MATRIZES FIBROSAS COM PROPRIEDADES ANTIMICROBIANAS INCORPORANDO ÓXIDO DE GRAFENO E POLI (ECAPROLACTONA)

Campo técnico da invenção

A presente invenção refere-se a composições e métodos 3D para produzir uma matriz de Poli (e-caprolactona) - PCL - e Óxido de Grafeno (GO) com propriedades bactericidas contra bactérias que causam infeções em doentes implantados com dispositivos médicos. Como tal, a presente invenção enquadra-se no campo técnico dos polímeros, nomeadamente dos compósitos de PCL/GO, na biotecnologia médica e, especificamente, nos dispositivos médicos com propriedades bactericidas.

Estado da arte

Um dos principais desafios associados aos dispositivos implantáveis é encontrar estratégias eficientes para fazer face à adesão bacteriana e consequente infeção [1]. A colonização do dispositivo por bactérias pode levar ao seu mau funcionamento, uma vez que pode resultar na formação de biofilmes no local de implantação [2] . Isto representa um grave problema de saúde, agravado pela crescente resistência a antibióticos, causando a perda do dispositivo implantado ou mesmo a sépsis [3]. Este problema tem sido objeto de uma investigação extensiva, mas a desejável prevenção ou uma solução eficaz ainda não foi encontrada.

Os organismos mais comumente associados à infeção de implantes poliméricos são Staphylococcus spp. [4,5], com o Staphylococcus epídermídís nas posições primordiais [6], mas também bactérias Gramnegativas da família Enterobacteríacea, tais como a Escheríchía coli. Estas são ambas bactérias que formam biofilmes e produzem polissacarídeos quando prolifera numa superfície [7], que potenciam a sua sobrevivência. O S. epídermídís tem uma resistência naturalmente elevada aos antimicrobianos, o que gera grandes preocupações. A E. coli também apresenta resistência a antibióticos como a penicillina, uma vez que a membrana que reveste a parede celular lhe fornece uma barreira adicional.

A adesão bacteriana à superfície de dispositivo médicos não é um fenómeno isolado, mas sim um processo em evolução. Inicialmente, existe uma ligação rápida à superfície, mediada quer por fatores não específicos (como a tensão superficial, a hidrofobia e as forças eletrostáticas) quer por adesinas específicas [8], seguidas de uma fase de acumulação, durante a qual as bactérias aderem entre si e formam o biofilme [9] . As alternativas aos antibióticos estão a ser exploradas exaustivamente, e os materiais derivados do carbono estão a receber uma atenção crescente [10] . Desde o primeiro isolamento do grafeno (G) em 2004 [11], os seus derivados foram desenvolvidos e investigados, geralmente conjugados com polímeros para produzir matrizes ou utilizados para modificar a sua superfície [12-14]. Em 2010, as propriedades antibacterianas dos materiais à base de grafeno foram exploradas pela primeira vez [15], levando a um número crescente de publicações que descrevem alguns materiais à base de grafeno (MBG) como nanomateriais antimicrobianos [16-21]. A interação entre os MBGs e os sistemas biológicos também foi estudada [22-25], dando algumas informações sobre o seu efeito em diferentes tipos de organismos. No entanto, estas interações devem ser exploradas mais pormenorizadamente no que diz respeito aos MBGs imobilizados em matrizes poliméricas, uma vez que as suas características podem variar. As propriedades antimicrobianas, por exemplo, são conhecidas por serem diferentes quando comparam MBGs em suspensão com MBGs imobilizados numa superfície [21,26-28]. Além disso, o contacto físico direto de bactérias com MBGs numa superfície (seja com arestas afiadas ou planos basais) é um requisito para que os biomateriais contendo MBGs tenham uma ação antibacteriana, sem qualquer efeito quando não existe contacto direto [28,29] . Formas menores e mais oxidadas de MBGs têm sido associadas com uma maior biocompatibilidade em relação às células de mamíferos [30]. Além disso, foram descritas propriedades bactericidas mais fortes em formas oxidadas de grafite (GO) e nanoplaquetas de grafeno [18,21,31]. Está descrito que a orientação e exposição das lâminas de GO na superfície das fibras são parâmetros importantes, sendo fatores essenciais para as propriedades antibacterianas [28]. Para criar matrizes fabricadas em 3D na engenharia de tecidos, foi previamente descrita a combinação de fabrico de aditivo com a extrusão húmida [32-34]. A poly (e caprolactona) (PCL) está atualmente entre os polímeros sintéticos mais frequentemente utilizados [35]. As fibras de PCL montadas em estruturas 3D aleatórias ou organizadas foram amplamente estudadas no âmbito das abordagens de engenharia de tecidos [36-39]. A PCL é altamente apelativa devido às suas características físicas-químicas e mecânicas [40,41], e pelos seus produtos de degradação não serem tóxicos. A PCL recebeu a aprovação da Food and Drug Administration (FDA) e a marcação europeia de conformidade (CE) numa série de aplicações de entrega de medicamentos e de dispositivos médicos [40] . Além disso, este polímero apresenta vantagens adicionais, nomeadamente biodisponibilidade, custo relativamente baixo, adequação a modificação [42] e um tempo de biodegradação relativamente longo, o que o torna amplamente utilizado também em implantes de longo prazo [43] . Foram tentadas melhorias no desempenho da PCL através da sua modificação, nomeadamente através da adição de novos componentes como o GO [39] . Embora poucos estudos estejam disponíveis [44], a incorporação de GO em matrizes de PCL levou a melhorias em termos de propriedades hidrofílicas, propriedades mecânicas, térmicas e biocompatibilidade [45-47].

No entanto, a capacidade destes métodos para produzir matrizes de PCL/GO com propriedades antibacterianas não pode ser extrapolada e os métodos escolhidos para a produção de matizes antimicrobianas à base de fibras devem ser de tal forma a que a exposição do GO seja aumentada.

Isto porque os efeitos antibacterianos GO têm sido associados com stress oxidativo induzido ou com a perturbação física das bactérias, exigindo assim a exposição GO na superfície da fibra, para que exista contacto com as bactérias.

Por um lado, as fibras precisam de ser suficientemente largas para incorporar lâminas GO que apresentem diâmetros que variam entre 2 e 10 pm. Isto exclui técnicas de produção de fibras nanométricas, tais como o método conhecido por eletrospinning [46,48- 50].

Por outro lado, a exposição do GO em matrizes produzidos por técnicas dependentes da fusão é conhecida por ser difícil de obter [28], uma vez que as lâminas de GO são geralmente cobertas ou encapsuladas pelo polímero nas fibras obtidas [51].

Assim, os métodos conhecidos no estado da técnica para incorporação de GO em matrizes PCL não resolvem o problema de controlar a orientação e exposição das lâminas de GO na superfície das fibras, de modo a alcançar propriedades antibacterianas.

Estes factos são divulgados de forma a ilustrar o problema técnico abordado pela presente divulgação.

Breve descrição da invenção

A presente invenção descreve os parâmetros de uma composição de Poli (e-caprolactona) - PCL - e óxido de grafeno (GO) para uso na eliminação de bactérias que causam infeções em doentes implantados com dispositivos médicos, por exemplo Staphylococcus epidermidis. A dita composição pode ser utilizada num método de impressão 3D de fibras de PCL/GO e de matrizes fibrosas por fabrico aditivo e extrusão húmida. Nas composições e métodos acima mencionados, as concentrações de PCL/GO e o diâmetro da fibra são tais que as lâminas GO são incorporadas, mas ao mesmo tempo expostas na superfície do polímero, conferindo propriedades bactericidas ao material, mantendo simultaneamente a biocompatibilidade.

Assim, uma forma de realização da presente invenção refere-se a uma composição de Poli (e-caprolactona) e óxido de grafeno para uso na eliminação de bactérias que causam infeções em doentes implantados com dispositivos médicos que compreende: um solvente consistindo de Tetrahidrofurano (THE); Óxido de grafeno (GO) na concentração final entre 5% e 7,5% (p/p) , de preferência 5% (p/p) ; Poli (e-caprolactona) - PCL- na concentração final entre 7,5% e 15% (p/v), de preferência 7,5% (p/v); Um não solvente de coagulação constituído por etanol, como descrito na reivindicação 1.

Noutra forma de realização, a referida bactéria que causa infeções em doentes implantados com dispositivos médicos compreende por exemplo Staphylococcus epidermidis e Escherichia coli, como descrito na reivindicação 2 .

Noutra forma de realização, o referido polímero de poly (ecaprolactona) e óxido de grafeno é construído numa matriz, tal como descrito na reivindicação 3.

Noutra forma de realização, o referido polímero poly (e-caprolactona) e óxido de grafeno é construído numa matriz fibrosa, tal como descrito na reivindicação 4 .

Outra forma de realização da presente invenção refere-se a um matriz fibrosa de Poli (e-caprolactona) e óxido de grafeno para matar bactérias que causam infeções em doentes implantados com dispositivos médicos que compreendem: um solvente consistindo de Tetrahidrofurano (THF); Óxido de grafeno (GO) na concentração final entre 5% e 7,5% (p/p), de preferência 5% (p/p); Poli (e-caprolactona) - PCL- na concentração final entre 7,5% e 15% (w/v), de preferência 7,5%; um não solvente de coagulação consistindo de etanol, tal como descrito na reivindicação 5.

Noutra forma de realização, as fibras têm um diâmetro de 50 a 100 pm, de preferência de lOOprn, conforme descrito na reivindicação 6.

Numa outra forma de realização, a referida bactéria que causa infeções em doentes implantados com dispositivos médicos compreende por exemplo a infeção por Staphylococcus epídermídís e Escheríchía colí, como descrito na reivindicação 7.

Noutra forma de realização, a referida composição ou matriz está compreendida num dispositivo médico, como descrito na reivindicação 8.

Noutra forma de realização, o referido dispositivo médico é selecionado da lista composta por suturas cirúrgicas, matrizes 3D para implantes de engenharia de tecidos, bem como outros exemplos não limitantes de dispositivos médicos implantáveis, tais como um stent, um implante vascular, um implante dentário e um implante ósseo, como descrito na reivindicação 9.

Outra forma de realização da presente invenção refere-se a um método para a construção de uma matriz fibrosa de Poli (e-caprolactona) e óxido de grafeno por fabrico aditivo e extrusão húmida de:

a) Dispersão do óxido de grafeno (GO) em Tetrahidrofurano (THF), solvente a uma concentração final de 5% a 7,5% (p/p) , de preferência5% (p/p);

b) Dissolver a Poli (e-caprolactona) - PCL- na mistura anterior com uma concentração de 7,5% a 15% (p/v) , de preferência 7,5% (p/v).

c) Carregar a mistura anterior numa seringa de vidro ou numa cabeça de impressora 3D

d) Extrusão da mistura THE/ PCL/GO num banho de coagulação composto por etanol

e) Lavagem das matrizes PCL/GO com etanol e secagem , como descrito na reivindicação 10.

Noutra forma de realização do método da presente invenção, a referida extrusão da mistura THE/ PCL/GO é realizada camada a camada numa máquina de deposição nos eixos XYZ ou numa impressora 3D, como descrito na reivindicação 11.

Descrição detalhada da Invenção

A presente invenção descreve os parâmetros de uma composição de Poli (e-caprolactona) - PCL - e óxido de grafeno (GO) para uso na eliminação de bactérias que causam infeções em doentes implantados com dispositivos médicos, por exemplo Staphylococcus epidermidis. A composição pode ser utilizada num método de impressão 3D de fibras de PCL/GO e de matrizes fibrosas por fabrico aditivo e extrusão húmida. Nas composições e métodos acima mencionados, as concentrações de PCL/GO e o diâmetro da fibra são tais que as lâminas GO são incorporadas, mas ao mesmo tempo expostas na superfície do polímero, conferindo propriedades bactericidas ao material, mantendo simultaneamente a biocompatibilidade.

O GO é preparado de acordo com o Método modificado de Hummer [52] ajustando o volume/massa dos reagentes para uma produção de maior escala (2000 mL) . Brevemente, 320 mL de H2SO4 (obtida na empresa VWR) são misturados com 80 mL de H3PO4 (Chem-Lab) numa proporção de 4:1, e agitados à temperatura ambiente (TA) para uma melhor oxidação. 8 g de grafite (grafite de carbono em pó, obtido por exemplo na American Elements, de pureza superior a 99%, diâmetro entre 7 e 11 pm) é adicionada a esta solução e depois arrefecida até 0 °C usando um banho de gelo, antes da adição gradual de 48 g de KMnO4 (JMGS). A solução é aquecida até 35 °C e agitada durante 2 horas. Depois de baixar a temperatura para 0 °C, são lentamente adicionados 1200 mL de água destilada. Isto é seguido por uma adição cuidadosa de H₂O₂ 35% (WWR) até que a libertação de oxigénio pare. A solução é deixada em repouso durante a noite e depois decantada para separar o depósito sólido do sobrenadante ácido. O restante produto é lavado com dH₂O e esta solução aquosa é centrifugada a 4000 rotações por minuto (rpm) durante 20 minutos a TA. Este passo é repetido até que o pH de água de lavagem seja igual ao pH da dH₂O. No final deste processo, é executada uma sonicação durante 6h para esfoliar o material oxidado em óxido de grafeno.

Para preparar o polímero de PCL (obtido a partir da Sigma-Aldrich, média da Mn 80.000 g mol) incorporando o GO, é necessário utilizar um solvente adequado. Assim, o primeiro teste para definição dos parâmetros ótimos da composição da presente invenção foi a seleção de um solvente de PCL eficaz, que simultaneamente disperse o GO. A homogeneidade e estabilidade de dispersão do GO foi avaliada em diferentes solventes orgânicos geralmente considerados potenciais solventes para PCL, nomeadamente: clorofórmio (VWR), acetona (JMGS) e Tetrahidrofurano (VWR). A dispersão aquosa do GO é centrifugada durante Ih a TA e 15000 rpm e a água do sobrenadante é decantada. O GO foi resuspenso em cada um dos solventes e os testes de dissolução de PCL foram efetuados utilizando uma concentração de polímero de 15% p/v com agitação magnética permanente (300 rpm) a TA. A dispersão do GO no clorofórmio não foi alcançada, revelando grandes agregados de GO e uma ausência de afinidade do GO para com este solvente. Pelo contrário, a acetona e o THE exibiram um comportamento semelhante, produzindo dispersões com o GO perfeitamente disperso, estáveis mesmo após 10 dias. Todos os solventes testados foram capazes de dissolver PCL, embora esta dissolução tenha sido apenas parcial quando a acetona foi utilizada.

Por conseguinte, o THE demonstrou ser capaz de dispersar perfeitamente o GO enquanto dissolve eficazmente PCL, pelo que o THE é o solvente ideal (Tabela 1).

Tabela 1. Solventes testados para dispersar go e dissolver PCL.

Solvente	Dispersão GO	Dissolução de PCL
Clorofórmio	Formação de agregados de GO; dispersão do GO fraca após ultrasonicação	Dissolução completa após 3 horas; aparência clara
Acetona	Dispersão homogénea de GO após ultra-sonicação	Dissolução parcial durante a noite; aparência clara quando aquecido
Tetrahidrofurano	Dispersão homogénea de GO após ultra-sonicação	Dissolução completa durante a noite; aparência clara

Foi então utilizada uma mistura THF/polimero para avaliar a combinação ótima de solvente/não solvente. Foram testados os não-solventes de PCL, nomeadamente isopropanol (VWR, Alemanha) e etanol (VWR, Alemanha), para avaliar o melhor banho de coagulação para obter os filamentos de polímero.

O etanol mostrou ser compatível com boa definição do desenho das fibras e precipitação relativamente rápida de fibra de polímero durante a troca de solventes/não solventes. Além disso, o excesso de etanol é fácil de eliminar das matrizes através da evaporação. O isopropanol também foi testado como um banho de coagulação e embora um desempenho semelhante tenha sido observado quando comparado com o etanol, foi alcançada uma definição de fibra ligeiramente pior. Como tal, o etanol foi selecionado como o componente da coposição ideal para o banho de coagulação (Tabela 2).

Tabela 2. Combinações solventes/não solventes testadas para a coagulação da fibra do polímero.

Solvente	Não solvente	Observação
Tetrahidrofurano	Etanol	Várias camadas podem ser impressas; diâmetro de fibra a rondar os lOOpm; boa definição de fibra

Tetrahidrofurano

Isopropanol

Várias camadas podem ser impressas; diâmetro de fibra a rondar os lOOpm; definição de fibra razoável

Foram testadas diferentes concentrações de PCL e GO, variando entre 7,5% e 15% p/v (peso de PCL por volume de solvente) e de 0% a 10% p/p (peso de GO por peso de PCL), respetivamente. Os resultados da avaliação da combinação PL/GO ideal são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Avaliação das concentrações ideais de PCL e GO.

Concentração de PCL (p/v)	Concentração de GO (p/p)	Observações
7,5%	0%	Viscosidade adequada; sem entupimento.
7,5%	5%	Viscosidade adequada; obstrução ocasional; fibras mostraram poros mais largos (secção transversal) na presença de GO.
7.5%	7,5%	Alta viscosidade; obstrução ocasional; fibras mostraram poros mais largos na presença de GO.
7,5%	10%	Viscosidade muito alta; entupimento frequente; Agregados de GO observados.
15%	0%	Alta viscosidade; sem entupimento.
15%	5%	Alta viscosidade; obstrução ocasional; fibras mostram poros mais

		largos na presença de GO.
15%	7,5%	Viscosidade muito alta; entupimento constante; Agregados de GO observados; não imprimível.
15%	10%	Viscosidade muito alta; entupimento constante; Agregados de GO observados; não imprimível.

Para a concentração de PCL a 7,5% (p/v), foram testadas concentrações de GO entre 0% e 10%, (p/p) embora a maior concentração de GO tenha dificultado o processo de extrusão da solução, causando frequentes entupimentos de agulhas.

No que diz respeito à concentração de PCL de 15%, a concentração de GO não pode ser aumentada acima de 5%, uma vez que concentrações mais elevadas afetaram o processo de impressão devido a constante entupimento observado. Além disso, observaram-se grandes efeitos na morfologia da fibra.

Uma concentração de PCL de 7,5% (p/v) e uma gama de concentrações de GO de 5% a 7,5% (p/p) proporcionaram, portanto, as condições ideais, permitindo a produção de fibras porosas com diferentes quantidades de carregamento de GO.

Assim, na forma de realização preferencial da composição da presente invenção, o GO é disperso num solvente consistindo de THF em concentrações finais entre 5% e 7,5% (p/p). O PCL é dissolvido durante a noite a TA nestas dispersões para uma concentração final de polímero de 7,5% (p/v) . Os filamentos de polímero são obtidos num banho de coagulação não solvente consistindo de etanol.

Dada a sua viscosidade adequada, as composições acima mencionadas permitem o desenvolvimento de um método de produção de matrizes à base de fibras que empregua uma combinação de fabrico aditivo e extrusão húmida em que uma ponta de distribuição é alimentada com uma solução de composição polimérica e submersa num não solvente do polímero que causa a sua precipitação e a formação de filamentos.

Numa forma de realização, a composição acima mencionada é carregada numa seringa de vidro com uma agulha com diâmetro interno de 184 pm (28G) que é utilizada para a deposição de matrizes e a solução THF/GO/ PCL é extrudida num banho de coagulação de etanol utilizando uma bomba de seringa.

Quando impressas, as matrizes de PCL/GO são lavadas 3-5 vezes com etanol, secas numa hote de exaustão e cortados com um diâmetro de 4 mm de diâmetro. As matrizes são esterilizadas com óxido de etileno seguindo o protocolo estabelecido para esterilização de materiais médicos (Millex).

Assim, outra forma de realização da presente invenção refere-se a um método de construção de fibras de PCL/GO através de fabrico aditivo e extrusão húmida compreendendo os passos de:

a) Dispersão do óxido de grafeno (GO) em solvente consistindo de THF, a uma concentração final de 5% a 7,5% (p/p), de preferência 5% p/p;

b) Dissolução da PCL na mistura anterior com uma concentração de 7,5% a 15% (p/v), de preferência 7,5% (p/v);

c) Carregamento da mistura anterior numa seringa ou numa cabeça de impressora 3D;

d) Extrusão da mistura THE/ PCL/GO num banho de coagulação consistindo de etanol;

e) Lavagem das matrizes de PCL/GO em etanol e secagem das matrizes.

Noutra forma de realização do método da presente invenção, a fabricação camada a camada das matrizes também pode ser realizada usando uma máquina de deposição nos eixos XYZ, adaptando a configuração anteriormente descrita por Neves et al. [53]. Podem ser ajustados parâmetros de impressão como o fluxo da bomba de seringa (F) e a velocidade de deposição (Vdep) do equipamento XYZ (definido como percentagem relativa aos parâmetros de origem do equipamento de deposição), que podem variar entre 0,5 mL/h e 1,0 mL/h e entre 5 0% a 120%, respetivamente.

Numa das formas de realização, os parâmetros de impressão são definidos como F = 0,5 mL/h e Vdep = 80%, que mostrou ser a opção ideal, dado o compromisso entre a boa definição de fibra e o consumo de tempo.

O design 3D pode ser variado e otimizado em termos de distâncias xyz inter-fibras e de empacamento entre camadas. O melhor ajuste para estruturas bem definidas e precisamente espaçadas é alcançado através de distâncias xy que variam de 200 pm a 400 pm, distâncias z de 20 pm a 80 pm, e empacamento entre camadas de 50 pm a 200 pm. Um desenho 3D final das matrizes é apresentado na Figura 1 (esquema virtual) e na Figura 2 (imagens de estereomicroscópio) incluindo vistas de topo e de secção transversal.

A análise por microscopia eletrónica de varrimento das matrizes corrobora a deposição e arranjo preciso dos filamentos, mostrando o empacamento entre camadas, visível tanto na vista de topo como nos cortes transversais (Figura 3).

O diâmetro médio das fibras pode ser medido ao longo de fibras diferentes, matrizes com 0% de GO que apresentam diâmetros médios de 107 ± llpm, matrizes com 5% de GO têm diâmetro de 102 ± 9pm e matrizes com 7,5% de GO apresentam 103 ± 13pm de diâmetro. A partir da análise por microscopia eletrónica de varrimento, também é possível confirmar a incorporação de GO nas fibras e a sua exposição. As vistas de topo da superfície das fibras mostram a exposição de GO, tanto na concentração de 5% como a 7,5% de GO (Figura 3) . As lâminas de GO sobressaem da superfície, criando uma topografia enrugada, com a rugosidade superficial e a irregularidade a aumentar em função da concentração de GO que é incorporado (Figura 3).

Nas secções transversais é possível observar que a porosidade interna das fibras muda com a presença de GO dentro da matriz de PCL. O tamanho e a irregularidade dos poros aumentam em proporção direta à quantidade de GO incorporado. A análise da microscopia eletrónica de varrimento permite demonstrar que são fabricados com sucesso matrizes de GO/ PCL com uma rede 3D de poros e que a exposição de GO na superfície das fibras é alcançada em matrizes de 5% e 7,5% de GO.

Assim, utilizando as composições e métodos de fabrico aditivo e extrusão húmida acima mencionados é possível produzir fibras de PCL/GO com uma gama entre 50 - 150 pm de diâmetro (Figura 3) . Isto é suficientemente largo para incorporar lâminas de GO, embora seja estreito o suficiente para que as lâminas GO fiquem expostas de modo a conferir atividade antibacteriana mediada por GO às fibras da matriz (Figura 3).

No que diz respeito ao potencial antimicrobiano das estruturas desenvolvidas, nomeadamente a atividade antibacteriana em relação à Staphylococcus epidermidis, o efeito da presença de GO é notado após um período relativamente curto (2h) , sendo aparentemente bactericida (Figura 4).

Os efeitos antibacterianos das matrizes de PCL/GO avaliados após a incubação de 2h e 24h com S. epidermidis mostram que no ensaio de 2h de incubação são encontradas quantidades mais elevadas de bactérias mortas em 5% de GO (1,10 ± 0,93 bactérias/10⁴pm² de fibra) e em 7,5% de GO (1,94 ± 1,10 bactérias/10⁴pm²) relativamente a matrizes com 0% de GO (0,07 ± 0,10 bactérias/10⁴pm²) (p = 0,0014 e p < 0, 0001, respetivamente) (Figura 4A).

A incorporação de GO promove a morte bacteriana, com as percentagens de bactérias mortas a aumentarem de apenas 2,9% em 0% de GO para 41,8% em 5% de GO e 53,8% em 7,5% de GO (Figura 4A).

Num ensaio de incubação de 24h o efeito bactericida das matrizes contendo GO é confirmado e as taxas de mortalidade são mais elevadas em comparação com as obtidas após a incubação de 2h, sendo de 13,7% em 0% de GO, e atingindo 71,9% em 5% de GO e 77,8% em matrizes com 7,5% de GO (Figura 4B) . O número de bactérias mortas voltou a ser maior em matrizes com 5% ou 7,5% de GO, quando comparado com matrizes com 0% de GO (p < 0,0001 em ambas as concentrações); (Figura 4B).

Além disso, o número de bactérias vivas que aderiram às matrizes foi significativamente menor em matrizes contendo GO (p=0, 0001), com apenas cerca de 1,7 bactérias/10⁴pm²) , comparando com cerca de 5,3 bactérias/10⁴pm² em matrizes de PCL com 0% de GO. Estes resultados surpreendentes também demonstram que, embora o número de bactérias vivas aumente em matrizes de PCL com 0% de GO de 2h a 24h, isso não ocorre em matrizes contendo GO. Em 5% e 7,5% de GO, o número de bactérias vivas é mantido ao longo das 24h, revelando o efeito bactericida destas matrizes ao longo do tempo.

O GO parece atuar como um agente bactericida, mais do que contribuir para a formação de uma superfície anti-incrustação. Os dados revelaram que uma concentração de GO de 5% parece ser suficiente para produzir os efeitos bactericidas desejados em todos os ensaios realizados, uma vez que não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre esta concentração e a mais alta (7,5% de GO).

Assim, um efeito antibacteriano é desvendado, possivelmente em diferentes bactérias, incluindo, mas não se limitando a S. epídermídís, um dos microrganismos mais encontrados em infeções associadas a implantes.

No que diz respeito à biocompatibilidade in vitro, a linha celular de fibroblastos humanos HFF-1 mostrou uma morfologia diferenciada após 7 dias de cultura em todas as condições, o que indica que as matrizes não são citotóxicas (Figura 5).

Uma vez que a infeção bacteriana representa uma ameaça constante quando são utilizados dispositivos médicos implantáveis, a presente invenção sugere um desempenho promissor de matrizes de PCL/GO em várias aplicações biomédicas, tais como suturas cirúrgicas ou matrizes 3D para engenharia de tecidos, nos quais PCL é atualmente utilizado.

Assim, outra forma de realização da presente invenção refere-se aos dispositivos médicos que compreendem as matrizes, a composição e as fibras acima mencionados que são implantados num animal ou no corpo humano, tais como suturas cirúrgicas, matrizes 3D para implantes de tecido sociável, bem como outros exemplos não limitantes de dispositivos médicos implantáveis, tais como um stent, um implante vascular, um implante dentário e um implante ósseo.

Em conclusão, a extrusão húmida combinada com o fabrico aditivo permitiu a produção de matrizes fibrosas de PCL/GO bem definidas com diâmetros médios de fibra de 100 pm. Uma concentração de 5% de GO foi suficiente para expor as lâminas de GO na superfície das fibras. Propriedades antimicrobianas matrizes fibrosas compósitas de PCL/GO organizadas em 3D foram demonstradas pela primeira vez, revelando o efeito bactericida dependente do tempo do GO e um aumento da taxa de mortalidade de cerca de 14% em matrizes de PCL puro para quase 80% em matrizes com 7,5% de GO, após 24h de contacto. A avaliação da biocompatibilidade ín vítro mostrou que as matrizes de PCL/GO permitiram a adesão de fibroblastos humanos que se espalharam ao longo das fibras durante 7 dias de cultura. Como tal, as matrizes fibrosas contendo GO desenvolvidos nesta invenção promoveram a morte bacteriana, ao mesmo tempo que permitiram a adesão de células humanas. Estas caracteristicas demonstram os parâmetros da incorporação de GO em matrizes fibrosas de polímeros para obtenção de propriedades antimicrobianas em infeções associadas a dispositivos implantáveis.

As formas de realização acima descritas são combináveis.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1: modelo 3D dos matrizes produzidas.

Vista de topo (onde o dx e o dy são exibidos· e a vista de secção transversal (onde o dz é mostrado e onde é observável o empacamento entre camadas;

Figura 2: Imagens esterecmicroscópicas de matrizes de PCL com 0%, 5% e

7,5% de GO.

A faixa inferior representa regiões ampliadas das imagens da faixa superior. Barra de escala: superior - 5 mm; fundo (zoom) - 500 pm.

Foram impressas matrizes fibrosas de PCL/GO com aproximadamente 1,2 cm x 1,2 cm, de acordo com o modelo 3D anteriormente divulgado na Fig. 1. As matrizes obtidas com 0% GO (PCL puro) são brancas, e a incorporação de GO dentro da matriz polimérica pode ser verificada pela mudança de cor, uma vez que os matrizes contendo GO apresentam uma cor castanha clara (para 5% de GO) e castanho escuro (para 7,5% de GO) . Como se pode observar, as fibras são bem definidas e precisamente traçadas seguindo o design virtual.

Figura 3: Análise por microscopia eletrónica de varrimento das principais vistas e secções transversais das matrizes PCL com 0%, 5% e 7,5% de GO.

Barra de escala (de cima para a linha inferior) : vista de topo - 400 pm, 50 pm, 2 pm; fundo - 200 pm, 50 pm.

Figura 4: Propriedades antibacterianas de matrizes fibrosas de PCL/GO Adesão de S. epidermídis a matrizes de PCL com 0%, 5% e 7,5% de GO, após incubação de 2h e 2 4h em 10% v/v de plasma suplementado com meio TSB. As bactérias foram coradas com o kit de viabilidade bacteriana LIVE/DEAD Backlight bacterial viability kit (da Thermofisher) e contadas por microscopia confocal. É exibido o gráfico de contagem bactérias vivas e mortas por 10⁴pm^z de fibra. São indicadas diferenças estatisticamente significativas no número de bactérias vivas e mortas (*) em. comparação com. os matrizes de 0% de GO em cima das barras (p 0,05; teste Kruskal-Wallis não paramétrico).

Figura 5: Avaliação da biocompatibilidade in vitro

Imagens representativas da microscopia confocal da interação de fibroblastos humanos HFF-1 com matrizes de PCL com 0%, 5% e 7,5% GO, após 1 dia e 7 di.as de cultura. As células são identificadas pela coloração dos núcleos com DAPI (ADN) e do citoesqueleto (com F-actin). As fibras das matrizes podem ser identificadas pelas linhas fracas e claras. As imagens representam projeções de um único plano de planos do eixo z de 150 pm de altura. Barra de escala: 100 pm.

As seguintes referências devem ser consideradas aqui incorporadas na sua totalidade.

As seguintes reivindicações estabelecem ainda formas de realização da invenção.

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Lisboa 12 de março de 2020

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de construção de uma matriz fibrosa de Poli(ecaprolactona) - PCL - e óxido de grafeno por fabrico aditivo e extrusão húmida caracterizado por, compreender os passos de:

a) Dispersão do óxido de grafeno (GO) em Tetrahidrofurano (THE) solvente a uma concentração final de 5% a 7,5% (p/p) , de preferência 5% (p/p);

b) Dissolução de PCL na mistura anterior para uma concentração final entre 7,5% e 15%, de preferência 7,5%, medida na proporção de peso de PCL por volume total de fluído;

c) Aplicação da mistura anterior numa seringa ou numa cabeça de impressora 3D

d) Extrusão da mistura THF/PCL/GO num banho de coagulação consistindo de etanol

e) Lavagem das matrizes de PCL/GO com etanol e secagem das matrizes.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por, a referida extrusão da mistura THF/PCL/GO ser executada camada a camada numa máquina de deposição nos eixos XYZ ou numa impressora 3D.

Lisboa, 12 de março de 2020