PT1137786E

PT1137786E - Quimeras de proteína do invólucro/receptor de vírus e métodos de utilização.

Info

Publication number: PT1137786E
Application number: PT00968759T
Authority: PT
Inventors: Anthony Louis Devico; Timothy R Fouts; Robert G Tuskan
Original assignee: Univ Maryland Biotech Inst
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2007-07-13
Also published as: EP1137786B1; DE60034211T2; ES2284532T3; WO2001027294A9; EP1137786A1; ATE358726T1; WO2001027294A1; CY1106691T1; AU7862500A; DE60034211D1; DK1137786T3

Description

DESCRIÇÃO

"QUIMERAS DE PROTEÍNA DO INVÓLUCRO/RECEPTOR DE VÍRUS E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se, de um modo geral, a interacções entre o ligando receptor e, mais especificamente, a polipéptidos quiméricos tendo sequências do polipéptido do invólucro do virus e do polipéptido do receptor celular, que se ligam entre si e mimetizam as propriedades estruturais, funcionais e imunogénicas que ocorrem naturalmente, quando a proteína do vírus e o receptor interagem in vivo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A imunidade humoral, que surge após infecção primária com HIV-1, pode não prevenir a progressão para SIDA (R. A. Koup et al., Nature, 370:416 (1994); R. A. Koup et al., J. Virol., 68:4650-5 (1994)). No entanto, é provável que a imunidade humoral possa prevenir a infecção se um indivíduo tiver um título elevado de anticorpos neutralizantes antes da exposição ao vírus. Este conceito é largamente suportado por estudos de imunização passiva, nos quais foram submetidos chimpanzés a transfusão com anticorpos monoclonais neutralizantes anti-V3 ou anti-soros neutralizantes reunidos, de título elevado na proximidade do momento do desafio com vírus isento de células 1 (E. A. Emini et al., Nature, 355:728-30 (1992); R Shibata et al., Nat. Med, 5:204-10 (1999)). Foi obtida protecção em ambos os grupos de estudo, indicando que a imunidade humoral pode ser protectora desde que estejam presentes os anticorpos adequados, em titulo suficiente, no momento ou imediatamente após o desafio.

Os estudos adicionais sugerem que a imunidade humoral possa ser protectora contra o HIV-1. Por exemplo, a imunização passiva utilizando o sistema de murganho SCID-hu, demonstrou que os anticorpos monoclonais humanos específicos para o domínio de ligação a CD4 da gpl20 podem prevenir a infecção (M. C. Gauduin et al., Nat. Med, 3:1389-93 (1997); P.W. Parren et al., AIDS, 9:Fl-6 (1995)). Em segundo lugar, a transferência passiva de uma "imunoadesina" CD4-Ig bivalente, uma quimera produzida entre a CD4 e a cadeia pesada da IgG2 humana, pode proteger no sistema de desafio ao HIV-1 de chimpanzé (J.W. Eichberg et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 8:1515-9 (1992); RH. Ward et al., Nature, 352:434-6 (1991)). Em terceiro lugar, os anticorpos neutralizantes correlacionam-se significativamente com a imunidade protectora contra SIV (J.L. Heeney et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:10803-8 (1998)). Em quarto lugar, estudos de transferência passiva em macacos rhesus, demonstraram que títulos elevados de anticorpos de chimpanzé, específicos para o isolado HIV-lDHi2, proporcionam imunidade esterilizante contra SHIVDhi2t em macacos rhesus, se fosse utilizada uma concentração suficiente dos anticorpos (R. Shibata et al., Nat. Med., 5:204-10 (1999)). Em quinto lugar, experiências de transferência passiva em macacos rhesus, utilizando HlVIg, 2G12 e 2F5, demonstraram uma protecção 50% melhor em grupos receptores, em comparação com controlos não-receptores, contra o desafio com SHIV-89.6P (Mascola et al., J. Virol., 73:4009-18 (1999)). 2

Estes estudos suportam a ideia que as estratégias de imunização que promovem respostas de anticorpos neutralizantes persistentes, de título elevado (ou altamente eficazes), de especificidade ampla, podem ser protectoras. Tem sido difícil obter uma estratégia bem sucedida para atingir este objectivo. As formulações de subunidade do invólucro do HIV monomérico ou oligomérico recombinante que foram testadas, promovem respostas neutralizantes contra uma gama estreita de isolados (J.P. Moore et al., AIDS, 9:5117-136 (1995); Q. J. Sattentau, Curr. Opin.

Immunol., 8:540-5 (1996); R. Wyatt et al., Science, 280:1884-8 (1998)) .

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, são proporcionados polipéptidos quiméricos contendo uma sequência polipeptídica do invólucro do vírus e uma sequência polipeptídica do receptor virai, na qual a sequência polipeptídica do invólucro e a sequência polipeptídica do receptor se encontram ligadas por um espaçador. As sequências do polipéptido do invólucro e do polipéptido do receptor virai dos polipéptidos quiméricos podem-se ligar entre si. Os polipéptidos quiméricos da invenção são úteis para induzir uma resposta imunitária e para produzir anticorpos. Os polipéptidos quiméricos da invenção são, também, úteis para a prevenção, inibição ou melhoria de uma infecção virai, por protecção passiva contra a infecção virai ou por produção de uma resposta imunitária (i. e., anticorpos ou uma resposta CTL), por exemplo, por administração a um indivíduo. 3 A sequência polipeptídica do invólucro do virus do polipéptido quimérico é a gpl20 do HIV (e. g., HIV-1 ou HIV-2) completa ou um seu fragmento. A sequência polipeptídica do receptor virai é uma sequência polipeptídica da CD4, completa ou um seu fragmento, tais como os domínios Dl e D2. A introdução de genes do envelope derivados de vírus, que utilizam co-receptores alternativos, podem ampliar, adicionalmente, o potencial destas moléculas de cadeia única, fornecendo protecção contra a infecção virai, para diferentes tipos celulares que expressam os diferentes co-receptores. São, também, proporcionados polipéptidos quiméricos tendo domínios heterólogos. Esses domínios heterólogos fornecem uma funcionalidade distinta e incluem, por exemplo, marcações, adesinas e agentes imunopotenciadores. Os domínios heterólogos podem ter uma sequência de aminoácido, tal como uma sequência polipeptídica c-myc ou uma sequência polipeptídica de imunoglobulina (e. g., uma sequência polipeptídica de cadeia pesada).

De acordo com a presente invenção, são proporcionadas sequências polinucleotídicas, tendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando polipéptidos quiméricos da invenção. Os polinucleótidos podem ser incluídos num vector de expressão e são úteis para expressar polipéptidos quiméricos.

De acordo com a presente invenção, são proporcionados anticorpos e seus fragmentos funcionais que se ligam aos polipéptidos quiméricos da invenção. Os anticorpos são úteis em métodos de tratamento e em métodos de diagnóstico. Esses anticorpos podem neutralizar o vírus da imunodeficiência, in 4 vitro ou in vivo e podem ser, também, úteis na inibição da infecção com o vírus da imunodeficiência, por exemplo, por protecção passiva. Esses anticorpos podem-se ligar a um epitopo produzido pela ligação da sequência polipeptídica do invólucro do vírus e da sequência polipeptídica do receptor virai. Esse epitopo, por exemplo, pode estar presente numa sequência polipeptídica do envelope.

Os polipéptidos, polinucleótidos e anticorpos quiméricos da invenção são úteis, por exemplo, para tratamento a infecção virai ou para indução de uma resposta imunitária. Deste modo, de acordo com a presente invenção, são proporcionados polipéptidos, polinucleótidos e anticorpos quiméricos, num veículo farmaceuticamente aceitável.

Os métodos para produzir um anticorpo incluem a administração de um polipéptido quimérico da invenção, numa quantidade suficiente para o indivíduo produzir anticorpos contra o polipéptido quimérico. Esses métodos podem ser, também, úteis, por exemplo, para inibir ou melhorar a infecção virai num indivíduo ou para protecção passiva, quando o anticorpo é administrado a um indivíduo receptor.

Os métodos para inibir a infecção virai num indivíduo incluem a administração de uma quantidade eficaz de um polipéptido quimérico da invenção ou um polinucleótido codificando um polipéptido quimérico da invenção, para inibir a infecção virai de uma célula. 0 polipéptido quimérico administrado pode prevenir a infecção virai, por ligação a um co-receptor virai nas células do indivíduo ou produzir uma resposta imunitária protectora. 0 polipéptido quimérico pode ser administrado numa quantidade suficiente para melhorar a infecção 5 virai no indivíduo. Um método que produz uma resposta imunitária pode produzir uma resposta de anticorpo ou uma resposta CTL. Os anticorpos produzidos podem neutralizar o vírus da imunodeficiência in vitro. Os anticorpos podem-se, também, ligar a um epitopo exposto pela ligação das duas sequências polipeptídicas do polipéptido quimérico. São, também, proporcionados métodos para identificar agentes que modulam a ligação ou a interacção entre um vírus e um co-receptor do vírus e um vírus e um receptor do vírus. Numa forma de realização, um método inclui fazer contactar um polipéptido quimérico, tendo uma proteína do invólucro de um vírus que se liga a um co-receptor, com um polipéptido do co-receptor (e. g., uma sequência polipeptídica CCR5 ou CXCR4) sob condições que permitam a ligação do polipéptido quimérico e do polipéptido do co-receptor, na presença e na ausência de um agente de teste e a detecção da ligação na presença e na ausência do agente de teste. A diminuição da ligação na presença do agente de teste identifica um agente que inibe a ligação entre o vírus e o polipéptido do co-receptor do vírus. Numa outra forma de realização, um método inclui fazer contactar um polipéptido quimérico, sob condições que permitem a ligação intramolecular no interior do polipéptido quimérico, na presença e na ausência de um agente de teste e a detecção da ligação ou interacção intramolecular no interior do polipéptido quimérico. A diminuição da ligação, na presença do agente de teste, identifica um agente que inibe a ligação ou interacção intramolecular entre o vírus e o polipéptido do receptor do vírus na quimera. 0 agente pode ser adicionado antes ou após fazer contactar o polipéptido quimérico com o polipéptido do co-receptor do 6 vírus. 0 polipéptido do co-receptor ou do receptor do vírus podem estar presentes na superfície de uma célula intacta, a qual pode estar presente num animal, tal como um primata não-humano. Os métodos podem ser realizados, utilizando um vírus da imunodeficiência, tais como HIV, SIV e semelhantes. Os agentes de teste incluem uma biblioteca de agentes, tais como péptidos, moléculas orgânicas, anticorpos e seus fragmentos, antivirais, co-receptores do vírus, fragmentos funcionais e seus miméticos peptídicos. A presente invenção proporciona um polipéptido quimérico compreendendo uma sequência polipeptídica do invólucro do vírus e uma sequência polipeptídica do receptor virai que tem uma afinidade de ligação para a sequência polipeptídica do invólucro do vírus, em que o polipéptido do invólucro do vírus é gp 120 do HIV ou seus fragmentos e o polipéptido do receptor virai é a CD4 ou seus fragmentos, em que a sequência polipeptídica do invólucro do vírus e a sequência polipeptídica do receptor virai estão ligadas por um espaçador de aminoácido que é posicionado entre estes, para formar um polipéptido de cadeia única, consistindo o espaçador de aminoácido em resíduos de aminoácido com comprimento suficiente para permitir o enrolamento do polipéptido de cadeia única, permitindo, deste modo, que a sequência polipeptídica do invólucro do vírus e a sequência polipeptídica do receptor virai formem um complexo intramolecular interactuante.

Numa forma de realização preferida do polipéptido quimérico, o HIV do polipéptido do invólucro do vírus é HIV-1 ou HIV-2. Em formas de realização preferidas adicionais, o HIV é um HIV com tropismo para os macrófagos ou tropismo para os linfócitos, o polipéptido do invólucro do vírus compreende uma 7 mutação no local de quebra da furina no terminal C do polipéptido da gpl20 do HIV e faltam 60 aminoácidos no terminal amina e 20 aminoácidos no terminal carboxilo do polipéptido da gpl20 do HIV.

Numa forma de realização preferida adicional do polipéptido quimérico, o polipéptido da CD4 compreende os domínios D 1 e D2, 0 espaçador do polipéptido quimérico tem, de um modo preferido, de 5 a 200 aminoácidos, de um modo mais preferido, de 10 a 100 aminoácidos, de um modo mais preferido, de 15 a 50 aminoácidos e, de um modo muito preferido, de 20 a 40 aminoácidos. O espaçador do polipéptido quimérico pode compreender uma sequência peptidomimética.

Em formas de realização preferidas, o polipéptido quimérico da presente invenção compreende, adicionalmente, um domínio heterólogo, o qual pode ser, opcionalmente, seleccionado de uma marcação, uma adesina e um agente imunopotenciador. 0 domínio heterólogo pode compreender uma sequência de aminoácido, de um modo preferido, uma sequência polipeptídica c-myc. Em formas de realização preferidas, a sequência imunopotenciadora é uma sequência polipeptídica de imunoglobulina, a qual, de um modo preferido, é uma sequência polipeptídica de cadeia pesada. De um modo muito preferido, o polipéptido quimérico compreende um polipéptido do invólucro do vírus, com uma mutação no local de quebra da furina, no terminal C da gp 120 do HIV e compreende, adicionalmente, um domínio heterólogo, o qual é uma sequência polipeptídica de imunoglobulina. 0 polipéptido quimérico da invenção pode compreender, adicionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.

Uma sequência polinucleotídica compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando o polipéptido quimérico da invenção é uma forma de realização preferida, tal como é uma composição compreendendo essa sequência polinucleotídica e um veiculo farmaceuticamente aceitável. A sequência polinucleotídica da invenção incluida num vector de expressão e uma célula hospedeira contendo um desses vectores de expressão, são formas de realização adicionais. A invenção proporciona a utilização do polipéptido quimérico em qualquer das suas formas de realização ou de um polinucleótido que codifica esse polipéptido quimérico, para a produção de um medicamento para o tratamento ou inibição, num indivíduo, de uma doença infecciosa seleccionada do grupo consistindo em Vírus da Imunodeficiência Humana, SIV, FIV, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e Sarcoma de Kaposi; sendo uma utilização preferida a produção de um medicamento para o tratamento, inibição, prevenção ou melhoria do Vírus da Imunodeficiência Humana num indivíduo. Os indivíduos preferidos para essas utilizações são humanos e o vírus é, de um modo preferido, HIV-1 ou HIV-2. A invenção proporciona, adicionalmente, um método para identificar um agente que inibe uma interacção entre um vírus e um co-receptor de vírus, em que o referido método não é realizado num ser humano, compreendendo os passos de: (a) fazer contactar o polipéptido quimérico da invenção com um co-receptor de vírus, sob condições que permitem a ligação do polipéptido quimérico e do co-receptor, na presença e na ausência de um agente de teste; e (b) detecção da ligação na presença e na ausência do agente de teste, em que a diminuição da ligação na presença do agente de teste identifica, deste modo, um agente 9 que inibe a ligação entre o virus e o co-receptor do vírus. 0 agente de teste pode ser adicionado antes ou após fazer contactar o polipéptido quimérico com o co-receptor do vírus. Numa forma de realização preferida, o agente de teste é uma biblioteca de agentes. 0 agente de teste é, de um modo preferido, seleccionado do grupo consistindo num péptido, numa molécula orgânica, num anticorpo, num antiviral, num co-receptor do vírus da imunodeficiência ou seu fragmento funcional. Num método preferido, o co-receptor do vírus da imunodeficiência é uma sequência polipeptídica CCR5 ou CXCR4. Numa forma de realização preferida do método, o co-receptor do vírus está presente na superfície de uma célula intacta, estando a célula, de um modo preferido, presente num animal não-humano, de um modo mais preferido, num primata não-humano. A invenção proporciona, também, um método para identificar uma sequência polipeptídica quimérica que inibe a infecção virai de uma célula, em que o referido método não é realizado num humano e compreende os passos de (a) fazer contactar uma célula susceptível à infecção virai com uma partícula virai infecciosa, na presença e na ausência da sequência polipeptídica quimérica da invenção; e (b) determinação de se a sequência polipeptídica quimérica inibe a infecção virai da célula, identificando, deste modo, uma sequência polipeptídica quimérica que inibe a infecção virai. 0 polipéptido quimérico pode ser adicionado antes ou após fazer contactar a célula com a partícula virai infecciosa. Numa forma de realização preferida, o método é realizado num animal não-humano, de um modo preferido, num primata não-humano. São proporcionados, também, métodos para identificar uma sequência polipeptídica quimérica que modula (inibe ou estimula) a infecção virai de uma célula. Numa forma de realização, um 10 método inclui fazer contactar uma célula susceptivel à infecção virai com uma partícula virai infecciosa, na presença e na ausência da sequência polipeptídica quimérica; e determinando se o polipéptido quimérico modula (inibe ou estimula) a infecção virai da célula (in vitro ou in vivo) .

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é um diagrama de uma construção polinucleotídica que codifica para polipéptidos quiméricos representativos. 0 polipéptido quimérico de cadeia única completa (FLSC) compreende uma gpl20 do HIV (estirpe BaL), um polipéptido espaçador com 20 aminoácidos, uma sequência polipeptídica da CD4, compreendendo os domínios Dl e D2 (D1D2) e uma "marcação" com o péptido myc. A quimera de cadeia única truncada (TcSC) contém eliminações em Cl (região constante 1) , VI (região variável 1), V2 e C5. A quimera FLSC R/T apresenta uma mutação única no local de quebra da furina, um R é modificado para um T, no terminal C da gpl20. As eliminações indicadas para TcSC estão numeradas de acordo com a sequência da gpl20 da BaL. A FIG. 2 é uma análise de transferência de Western de sobrenadante de cultura celular, contendo polipéptido quimérico solúvel FLSC e TcSC, expresso por células 293-SC. A imunotransferência foi realizada com gpl20 (faixas 1 a 4) e CD4 (faixas 5 a 8) e as setas indicam, ordenadas por mobilidade decrescente no gel, cadeia única de gpl20-CD4 (cadeia única), gpl20 quebrada (fragmento de gpl20) e CD4 quebrada (fragmento de CD4). 11 A FIG. 3 é uma análise de gpl20-CD4 expresso por células 293-SC; a gpl20-CD4 não-reticulada encontra-se na faixa 1 e a gpl20-CD4 reticulada encontra-se na faixa 2. A FIG. 4 é uma análise de imunotransferência de FLSC após reticulação. No gráfico de barras é apresentada a percentagem relativa (%) de proteína total, para cada uma das diferentes concentrações de FLSC (1-0,03 μΜ) : (A), 65% 172 kD; (B) , 25% 302 kD; e (C) , oligómero de ordem 10% superior. A FIG. 5a-5C é uma análise de ligação da quimera gpl20-CD4. (A) , Cadeia única completa (FLSC) incubada com anticorpos anti-gpl20 (17b, 48d, A32 e Cll) em comparação com gpl20/rsCD4 reticulada e gpl20 não-complexada. 17b, 48d e A32 têm afinidade, preferencial, para gpl20 complexada (gpl20). As barras são apresentadas com o erro padrão. (B), Concentração de ligação metade da máxima recíproca de anticorpos monoclonais humanos anti-gpl20 em FLSC e TcSC (ELISA). (C) , metade da ligação recíproca máxima de anticorpos monoclonais IgGlbl2, F91 e 205-469, os quais reagem com o domínio de ligação da CD4 à gpl20. A FIG. 6 é uma análise da quimera gpl20-CD4 (FLSC, TcSC) que se liga a células Ll.2 que expressam o co-receptor CCR5 (R5) ou CXCR4 (X4) . As células de controlo que não expressam CCR5 ou CXCR4 são indicadas como Ll.2. Os complexos ligados foram detectados por citometria de fluxo, utilizando 5 pg/mL de Mab45 anti-CD4. Os valores apresentados são de um estudo representativo, realizado três vezes. 12 A FIG. 7 é uma análise da gpl20-CD4 (FLSC, TcSC) que se liga ao co-receptor, na presença de anticorpos que se ligam à gpl20 (17b, 48d, A32, Cll e 2G12) e um anticorpo gp41 (F240) . As células L1.2 expressaram o co-receptor CCR5 (R5) , CXCR4 (X4) ou nenhum co-receptor (L1.2), como indicado. Os controlos isentos de anticorpo são indicados como As medições de fundo obtidas com células não tratadas são indicadas como Os complexos ligados foram detectados por citometria de fluxo utilizando Mab45 5 pg/mL. Os resultados são apresentados como percentagem de ligação em relação à intensidade da fluorescência média, obtida no ensaio de controlo emparelhado. São apresentados valores médios derivados de três estudos distintos. Os erros padrão são apresentados com barras. A FIG. 8 é uma análise de neutralização de vírus, de HIV-I2044 (um isolado específico para X4) e de HIV-lBai (um isolado específico para r5), pelos complexos FLSC, TcSC BaLgpl20 e BaLgpl20-rsCD4. As células U373 expressaram CD4, quer R5, quer X4 e β-galactosidase regulada pelo promotor LTR do HIV-1. Não foi alcançado um ID90 para FLSC e TcSC contra HIV-I2044 com as concentrações máximas testadas e é, consequentemente, apresentado como >10 ug/mL. A FIG. 9 é um diagrama do gene quimérico gpl20-CD4-IgGl apresentando os domínios de codificação. Consiste, essencialmente, no gpl20-CD4 original, subclonado num plasmídeo que tem as regiões Cl, C2 e C3 da cadeia pesada igGl, permitindo, deste modo, a expressão do polipéptido quimérico gpl20-CD4-IgGl. 13 A FIG. 10 é uma análise de imunotransferência de um polipéptido quimérico gpl20-CD4-IgGl expresso em células 293. 0 gpl20-CD4-IgGl quimérico foi isolado a partir do sobrenadante de cultura (faixa 1) e é apresentado em

comparação com o polipéptido da gpl20 da estirpe BaL do HIV purificado (faixa 2). A gpl20 quebrada é indicada pela seta e co-migra com gpl20 purificada. A FIG. 11 é uma análise de diluição reciproca do polipéptido quimérico gpl20-CD4-IgGl ligado a células Ll.2 expressando o co-receptor. As células Ll.2 expressando CCR5 e CXCR4, são como indicado. A FIG. 12 é uma análise de um mAb bloqueante (17b) na ligação de FLSC-IgGl a células que expressam CCR5, demonstrando que FLSC-IgGl interage com o co-receptor R5, através do domínio de ligação a R5 em gpl20. A FIG. 13 mostra a estabilidade melhorada das moléculas gpl20-CD4 (FLSC) após mutação do local de quebra da furina (R->T) .

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada na verificação de que um polipéptido quimérico compreendendo um polipéptido de envelope do HIV e um receptor CD4 podem formar um complexo interactuante com capacidade de ligação a um co-receptor. No polipéptido quimérico, a ligação da gpl20 do HIV à CD4 mimetiza o estado de transição da proteína de envelope-CD4, que ocorre quando o HIV se liga à CD4 presente nas células; a gpl20 apresenta epitopos 14 conservados, expostos após a formação de complexos que interagem directamente com co-receptor, CCR5. A formação do estado de transição do envelope-CD4 e subsequente ligação ao co-receptor celular é um passo critico na infecção de células pelo HIV. Consequentemente, os anticorpos ou outros agentes que previnem ou inibem a ligação de gpl20-CD4 ao co-receptor, por exemplo, pela ligação aos epitopos expostos após a formação do complexo gpl20-CD4, pode inibir a interacção do vírus com o co-receptor, mediando, deste modo, a protecção contra a infecção com HIV.

Consequentemente, os polipéptidos quiméricos da invenção ou um ácido nucleico codificando polipéptidos quiméricos podem ser utilizados terapeuticamente para tratamento, inibição, prevenção ou melhoria de infecção virai, por exemplo, pela indução de uma resposta imunitária contra o complexo do estado de transição formado após a ligação de uma proteína do invólucro do vírus a um polipéptido do receptor. Esses polipéptidos quiméricos aqui, também, referidos como moléculas de "cadeia única", podem ser utilizados para rastrear agentes que inibem, previnem ou interrompem a ligação da sequência polipeptídica do invólucro à sequência do receptor polipeptídico no interior da sequência quimérica ou a ligação da quimera a uma sequência polipeptídica do co-receptor, identificando, deste modo, potenciais agentes terapêuticos, para o tratamento da infecção virai correspondente. Por exemplo, um agente que inibe, previne ou interrompe a ligação do complexo do polipéptido do envelope do vírus da imunodeficiência-CD4 a CCR5, pode ser um agente terapêutico para tratar um indivíduo apresentando ou em risco de apresentar HIV. 15

Os polipéptidos quiméricos são, também, úteis para produzir anticorpos específicos para o complexo proteína do invólucro-receptor interactuante. Esses anticorpos específicos podem ser utilizados para passiva, mesmo na ausência de ligação intramolecular entre a proteína do invólucro do vírus e o receptor, um polipéptido quimérico pode ser mais eficaz na promoção de uma resposta imunitária do que uma sequência polipeptídica do invólucro do vírus isolada.

Os polipéptidos quiméricos contendo um polipéptido do invólucro do vírus que se ligam a um receptor e a um co-receptor apresentam a vantagem adicional de proteger passivamente contra a infecção virai, pela inibição do acesso do vírus a co-receptores celulares in vivo. Para além disso, esses polipéptidos quiméricos podem ser utilizados para rastrear agentes terapêuticos, pela identificação de agentes que inibem, previnem ou interrompem a ligação do polipéptido quimérico ao co-receptor. Por exemplo, um agente que inibe, previne ou interrompe a ligação do complexo polipéptido do envelope do vírus da imunodeficiência-CD4 a CCR5, pode ser um agente terapêutico para tratar um indivíduo apresentando ou em risco de apresentar HIV.

De acordo com a presente invenção, são proporcionados polipéptidos quiméricos compreendendo uma sequência polipeptídica do invólucro do vírus e uma sequência polipeptídica do receptor virai, ligadas por um espaçador. A sequência polipeptídica do invólucro e a sequência polipeptídica do receptor do polipéptido quimérico estão ligadas por um espaçador, de forma a que as duas sequências polipeptídicas do 16 polipéptido quimérico, de um modo preferido, se liguem ou interajam. A sequência polipeptidica do invólucro é uma sequência polipeptidica do invólucro de um virus da imunodeficiência. Numa forma de realização, a sequência polipeptidica do invólucro e a sequência polipeptidica do receptor são fragmentos activos de uma sequência nativa completa correspondente.

Como aqui utilizado, o termo "invólucro" significa uma sequência polipeptidica de origem virai que se pode ligar a células. De um modo geral, as proteínas do invólucro do vírus estão presentes na proximidade da superfície exterior da partícula virai e permitem a ligação e subsequente penetração na membrana celular. No entanto, uma sequência polipeptidica do invólucro inclui qualquer proteína virai capaz de ligação ou interacção com um polipéptido do receptor. As sequências polipeptídicas do invólucro como aqui definidas podem ser associadas não-covalentemente ou covalentemente com outras entidades moleculares, tais como, hidratos de carbono, ácidos gordos, lípidos e semelhantes. As sequências polipeptídicas do invólucro podem conter múltiplas sequências polipeptídicas de vírus. Por exemplo, pode ser, também, incluída uma sequência polipeptidica gag com uma sequência polipeptidica do invólucro, num polipéptido quimérico, para manter a sequência polipeptidica do invólucro numa conformação que se liga a uma sequência polipeptidica do receptor.

As sequências polipeptídicas do invólucro do vírus para utilização nos polipéptidos quiméricos da invenção, têm origem em vírus da imunodeficiência humana, tal como o HIV. 17

Como aqui utilizado, o termo "receptor" significa qualquer polipéptido expresso por uma célula a que um vírus se possa ligar. De um modo geral, esses receptores encontram-se naturalmente presentes na superfície de uma célula, mas podem ser modificados. Os polipéptidos do receptor podem ser associados não-covalentemente ou covalentemente com outras entidades moleculares, tais como hidratos de carbono, ácidos gordos, lípidos e semelhantes. Um polipéptido do receptor pode compreender um ou múltiplos segmentos de polipéptido contíguos que se encontram ligados covalentemente ou não-covalentemente. Essas entidades moleculares ou outras sequências polipeptídicas podem ser importantes para a conformação do receptor, por exemplo, para ligação a uma sequência polipeptídica do invólucro. Deste modo podem ser, consequentemente, incluídos elementos adicionais nos polipéptidos quiméricos da invenção, incluindo moléculas importantes para a conformação do receptor. A sequência polipeptídica do receptor é a do receptor humano CD4 . São conhecidos na técnica outros receptores (ver, por exemplo, Tabela 1; ver, também, "Cellular Receptors for Animal Viruses" Eckard Wimmer, ed; Cold Sping Harbour Press (1994)) . 18

TABELA 1 COMPARATIVA PRECEPTOR (SUBUNIDADE DE LIGAÇÃO) VIRUS (FAMÍLIA) REFERENCIAS Moléculas semelhantes à Imunoglobulina VCAM-1 EMC-D (Picornavaridae) Huber (1994) [CAM-1] (primeiro Grupo principal HRV, CAV Colonno et al. (1986); domínio) 13,18,21 Greve et al. (1989); (picornaviridae) Staunton et al. (1989); Tomassini et al. (1989) PVR (primeiro domínio) Vírus polio Koike et al. (1990); (Picornaviridae) Mendelsohn et al. (1989) CD4 (primeiro domínio) HIV-2, 2; SIV (Lentiviridae) Dalgleish et al. (1984); Klatzmann et al. (1984) Vírus herpes humano 7 Lusso et al. (1994) CEA, vários membros Vírus da hepatite de Williams et al.(1991) (primeiro domínio) murganho (Coronaviridae) MHC I vírus da Floresta Semliki? (Togaviridae) Helenius et al.(1978); Oldstone et al.(1980); Vírus da desidrogenase do factato Inada e Mims (1984); Citomegalovírus de murganho (Herpesviridae) Wykes et al.(1993); SV-40 Breau et al.(1992) MHC II Vírus Visna (Lentiviridae) Dalziel et al. (1991) Integrinas VLA-2 (cadeia a) Vírus ECHO 1.8 Bergelson et al. (1992, (Picornaviridae) 1993) 19 (continuação)

Integrinas (Proteína de ligação a RGD) FMDV (Picornaviridae) Fox et al. (1989) ; Mason et al. (1994) ανβ3 (vibronectina) CAV 9, vírus ECO 22 (Picornaviridae) Roivainen et al. (1994) Proteínas de Transporte Análogo de transportador de fosfato Vírus da leucemia do gibão (Retroviridae) Murino anfotrópico Vírus da leucemia (Retroviridae) Johann et ai.(1992) Miller et al. (1994) Transportador catiónico de aminoácidos Vírus ecotrópico da leucemia murina (Retroviridae) Albritton et al.(1989) Receptores Sinalizantes Família das proteínas do receptor LDL Grupo menor HRV (Picornaviridae) Subgrupo A da leucose aviária Vírus do sarcoma (família?) Hofer et al. (1994 Bates et al. {1993) ; Connolly et al. (1994) Receptor da acetilcolina (oí-1 ) Receptor EGF Vírus da raiva (Rhabdoviridae) Vírus vacinia (Poxviridae) Leniz (1990) Marsh e Eppstein (1987) antigénio da diferenciação dos leucócitos [CD9] Vírus da imunodeficiência felina (Lentiviridae) Willett et al. (1994) Outros Aminopeptidase Vírus corona humano 229E (Coronaviridae) TGEV (Coronaviridae) Yeager et al.(1992) Delmas et al.(1992) Receptor de complemento CR2 EBV (Herpesviridae) McClure (1992) 20 (continuação)

Outros Receptor da laminina de elevada afinidade Vírus Sindbis (Togaviridae) Wang et al. (1992) Factor acelerador da decomposição [CD55] Vírus ECHO 7 (6, 11, 12, 20, 21,) Bergelson et al.(1994) Proteína do cofactor membranar Vírus do sarampo (Morbilliviridae) Dõrig et al. (1993) Moesina Vírus do sarampo (Morbilliviridae) Dunster et al. (1994) Glicoforina A EMCV (Picornaviridae) Reovírus (Reoviridae) Allaway e Barness (1986) Paul e Lee (1987) Galactosilceramida HIV-I (Lentiviridae) Bhat et al.(1991) Antigénio do eritrócito P Parvovírus B 19 (Parvoviridae) Brown et al. (1993) BLVRcp. 1 Vírus da leucemia bovino (Retroviridae) Ban et al. (1993) Sialoglicoproteína GP-2 Vírus Sendai (Paramyxoviridae) Suzuki et al.(1985) Ácido siálico Vírus influenza (Orthomysoviridae) Reoviridae (Reoviridae) Rotavírus porcino do grupo A (Rotaviridae) Coronavírus humano OC43, coronavírus bovino (Coronaviridae) Herrler et al. (1985) Fernandes et al.(1994) Rolsma et al.(1994) Vlasak et al.(1988) Sulfato de Heparano Citomegalovírus humano (Herpesviridae) HSV Compton et al.(1993) WuDunn e Spear (1989)

Como aqui utilizado, o termo "co-receptor" significa qualquer receptor que é ligado após ou em conjunto com a ligação do vírus ao receptor. Deste modo, os co-receptores incluem qualquer polipéptido ou entidade molecular presente numa célula 21 que facilita a entrada do vírus, directa ou indirectamente, por ligação ao complexo polipéptido-receptor do vírus. Para além de co-receptores que facilitam a entrada do vírus nas células, são, também, incluídos co-receptores que medeiam a ligação ou o tropismo celular, sem facilitar, directa ou indirectamente, a entrada do vírus. 0 domínio transmembranar 7 (7-TM) contendo receptores da quimiocina, tais como CCR5 e CXCR4, os quais se podem ligar ao vírus da imunodeficiência, são exemplos particulares de co-receptores. Os co-receptores adicionais incluem CCR-2b, CCR3, CCR8, V28/CXCR1, US28, STRL 33BOB/TYMSTR, GPR15/Bonzo e GPR1.

Como aqui utilizados, os termos "polipéptido", "proteína" e "péptido" são utilizados alternadamente para designar um polímero em sequência com, pelo menos, dois aminoácidos covalentemente ligados por uma ligação amida, independentemente do comprimento ou da modificação pós-tradução (e. g., glicosilação, fosforilação, lipidação, miristilação, ubiquitinação, etc.). São incluídos D- e L- aminoácidos e misturas de D- e L- aminoácidos. 0 polipéptido quimérico refere-se a uma sequência de aminoácidos tendo duas ou mais partes que não são, geralmente, encontradas, em conjunto, numa sequência de aminoácidos natural.

Como aqui divulgado, um polipéptido quimérico tendo uma sequência polipeptídica da CD4 e uma sequência polipeptídica do invólucro da gpl20 do HIV que se liga a CD4, podem ligar-se entre si na quimera, quando separados por uma sequência de aminoácidos espaçadora. A quimera gpl20-CD4 tem capacidade de ligação a um co-receptor, tal como CCR5. Deste modo, numa outra forma de realização, o polipéptido quimérico tem uma sequência 22 polipeptídica do invólucro de um vírus que se liga um co-receptor. A CD4 parece ser o alvo para a entrada de vários vírus associados com a imunodeficiência. Por exemplo, as células do sistema imunitário, tais como os linfócitos e os macrófagos expressam CD4 e são susceptíveis à infecção pelo HIV, SIV, vírus herpes 7 e muitos outros vírus. Como aqui utilizado, o termo "imunodeficiência", quando utilizado em referência a um vírus, significa que o vírus é capaz de infectar células de origem imunitária ou células que participam na resposta imunitária e, geralmente, essa infecção pode comprometer a função imunitária de um hospedeiro infectado. Deste modo, a invenção é aplicável a qualquer polipéptido do invólucro do vírus de qualquer vírus ou estirpe virai que se possa ligar a CD4.

De acordo com a presente invenção, são proporcionados polipéptidos quiméricos tendo uma sequência polipeptídica do invólucro do vírus da imunodeficiência. Em vários aspectos, a sequência polipeptídica do invólucro é uma sequência polipeptídica do HIV. Em outros aspectos, o vírus é um HIV com tropismo para macrófagos ou tropismo para linfócitos. Num outro aspecto, o HIV é HIV-1 ou o HIV-2. Em vários outros aspectos, a sequência polipeptídica do invólucro é gpl20.

As sequências polipeptídicas do receptor e do invólucro do vírus, do polipéptido quimérico, requerem uma região espaçadora entre estas, por exemplo, para formar um complexo interactuante entre os dois polipéptidos. Apesar de não ser pretendido ser limitado pela teoria, acredita-se que o espaçador permita o movimento ou a flexibilidade entre as sequências do receptor e 23 do polipéptido do invólucro do vírus, para formar um complexo interactuante.

Como aqui utilizado, o termo "espaçador" refere-se a uma parte física ou química ou ligação covalente ou não-covalente de qualquer tamanho ou natureza que liga a sequência polipeptídica do invólucro do vírus à sequência polipeptídica do receptor, permitindo, simultaneamente, a flexibilidade necessária ou movimento para formar um complexo interactuante. Na presente invenção, de um modo preferido, o espaçador liga as duas sequências polipeptídicas numa orientação "topo a topo". "Topo a topo" significa que o aminoácido do terminal amina ou carboxilo do polipéptido do invólucro está ligado ao aminoácido do terminal amina ou carboxilo da sequência polipeptídica do receptor. Deste modo, um espaçador pode ligar o aminoácido do terminal carboxilo da sequência polipeptídica do invólucro ao aminoácido do terminal amina da sequência polipeptídica do receptor, como aqui exemplificado para a gpl20 do HIV e CD4, por exemplo. Alternativamente, o espaçador pode ligar o aminoácido do terminal amina do polipéptido do invólucro ao aminoácido do terminal carboxilo do polipéptido do receptor ou os aminoácidos do terminal carboxilo das sequências polipeptídicas ou dois aminoácidos do terminal amina das sequências polipeptídicas.

Os exemplos particulares de espaçadores incluem um ou mais aminoácidos ou um peptidomimético. Um espaçador de aminoácido pode ter, essencialmente, qualquer comprimento, por exemplo, apenas 5 ou, tanto como, 200 ou mais aminoácidos. Deste modo, um espaçador de aminoácido pode ter desde, cerca de 10 a cerca de 100 aminoácidos ou ter desde, cerca de 15 a cerca de 50 aminoácidos. De um modo preferido, o espaçador tem desde, cerca de 20 a cerca de, 40 aminoácidos. Outros exemplos de espaçadores 24 incluem uma ligação persulfureto entre os terminais das sequências polipeptidicas. É, também, contemplado um espaçador de hidrato de carbono. Os especialistas na técnica terão conhecimento ou poderão facilmente determinar outras partes que possam funcionar para permitir a formação de um complexo interactuante entre a sequência polipeptidica do invólucro do virus e a sequência polipeptidica do receptor.

As sequências polipeptidicas do receptor e do invólucro podem ter qualquer comprimento em aminoácidos. De um modo preferido, estas têm um comprimento que permite que as sequências polipeptidicas se liguem entre si, quando num polipéptido quimérico. Deste modo, as sequências polipeptidicas do receptor e do invólucro incluem as sequências polipeptidicas nativas do receptor, completas e do invólucro, completas, assim como partes das sequências polipeptidicas. São incluídas, por exemplo, truncamentos de aminoácidos, eliminações internas ou subunidades das sequências polipeptidicas do receptor e do invólucro. De um modo preferido, essas formas modificadas têm capacidade de interacção entre si. Por exemplo, é preferido que uma sequência polipeptidica do invólucro truncada ou eliminada tenha capacidade de interacção com uma sequência polipeptidica do receptor. Um exemplo de uma sequência polipeptidica do receptor truncada são os domínios D 1 e D2 da CD4, os quais têm capacidade de interacção com a sequência polipeptidica do invólucro do HIV (FIG. 9) . Um exemplo de uma sequência polipeptidica do invólucro truncada é uma gpl20 do HIV truncada à qual faltam os 60 aminoácidos do terminal amina e os 20 aminoácidos do terminal carboxilo (e. g., em TcSC).

Deste modo, de acordo com a presente invenção, são proporcionados polipéptidos quiméricos, incluindo sequências 25 truncadas ou eliminadas internamente. Numa forma de realização, a sequência polipeptidica do invólucro do virus ou a sequência polipeptidica do receptor têm um ou mais aminoácidos removidos, em comparação com a sua sequência polipeptidica completa correspondente. Num aspecto, a sequência polipeptidica truncada do invólucro do vírus é uma sequência polipeptidica do invólucro do HIV e, num outro aspecto, a sequência polipeptidica truncada do receptor é uma sequência da CD4. Como aqui exemplificado, a sequência polipeptidica truncada do invólucro do HIV é uma gpl20 à qual faltam 60 aminoácidos do terminal amina ou 20 aminoácidos do terminal carboxilo e um polipéptido da CD4 truncado, compreendendo os domínios D 1 e D2. Em vários outros aspectos, o polipéptido quimérico compreende uma sequência polipeptidica do invólucro do vírus eliminada internamente ou uma sequência polipeptidica da CD4 eliminada internamente.

Para além das sequências polipeptídicas truncadas, eliminadas internamente e subunidades, são incluídas modificações adicionais de sequências polipeptídicas. Essas modificações incluem substituições menores, variações ou derivatizações da sequência de aminoácidos de uma ou de ambas as sequências polipeptídicas que compreendem o polipéptido quimérico, desde que o polipéptido quimérico modificado tenha, substancialmente, a mesma actividade ou função que o polipéptido quimérico não modificado. Por exemplo, uma sequência polipeptidica do invólucro ou do receptor do vírus pode ter hidratos de carbono, ácidos qordos (palmitato, miristato), lípidos, serem fosforilados ou terem outras modificações pós-tradução tipicamente associadas com sequências polipeptídicas. 26

Como aqui utilizado, o termo "substancialmente a mesma actividade ou função", quando utilizado em referência a um polipéptido quimérico, deste modo, modificado, significa que o polipéptido conserva a maior parte, a totalidade ou mais da actividade associada com o polipéptido não modificado, como aqui descrito ou conhecido na técnica. Por exemplo, são aqui incluídos truncamentos ou eliminações internas que não perturbem significativamente (e. g., destruam) a interacção entre a sequência polipeptídica do invólucro do vírus e a sequência polipeptídica do receptor, como no truncamento da sequência do polipéptido da CD4 exemplificado. De um modo semelhante, são aqui incluídas modificações que não afectam a capacidade do polipéptido quimérico para interagir com o co-receptor. Do mesmo modo, são incluídas modificações de polipéptidos quiméricos que não afectam a capacidade de indução de uma resposta imunitária mais potente do que a administração da proteína do invólucro do vírus isolada.

Os polipéptidos quiméricos modificados que estão "activos" ou "funcionais", aqui incluídos, podem ser identificados através de um ensaio funcional de rotina. Utilizando, por exemplo, ensaios de ligação de anticorpos, ensaios de ligação do co-receptor (em solução, in vitro em células intactas, e. g., Exemplos IV, etc.) ou pela determinação da indução de epitopos expostos num complexo do estado de transição normalmente ocultado quando as duas sequências polipeptídicas não se ligam, é possível determinar, facilmente, se o polipéptido quimérico modificado tem actividade. Os polipéptidos quiméricos que induzem uma resposta imunitária mais potente podem ser identificados pela medição dos títulos de anticorpo, por exemplo, após a administração da quimera a um indivíduo. As modificações que destroem a interacção entre a sequência 27 polipeptídica do invólucro do vírus e a sequência polipeptídica do receptor ou a capacidade de um polipéptido quimérico tendo uma sequência polipeptídica do invólucro do vírus e uma sequência do receptor, as quais não interagem para induzir uma resposta imunitária mais potente, não têm substancialmente a mesma actividade ou função que o polipéptido quimérico correspondente, não modificado e, como tal, não são incluídas.

Como aqui utilizado, os termos "homologia" ou "homólogo", utilizado em referência a polipéptidos, referem-se à semelhança da sequência de aminoácidos entre dois polipéptidos. Quando uma posição de um aminoácido em ambos os polipéptidos é ocupada por aminoácidos idênticos, estes são homólogos nessa posição. Deste modo, "substancialmente homóloga" significa uma sequência de aminoácidos que é significativamente, mas não completamente, homóloga e que conserva a maior parte ou a totalidade da actividade da sequência à qual é homóloga.

Uma vez que os polipéptidos quiméricos modificados irão conservar a actividade ou a função associada com o polipéptido quimérico não modificado, os polipéptidos quiméricos modificados irão, de um modo geral, apresentar uma sequência de aminoácidos "substancialmente idêntica" ou "substancialmente homóloga" à sequência de aminoácidos do polipéptido não modificado. Como aqui utilizado, o termo "substancialmente idêntica" ou "substancialmente homóloga", quando utilizado em referência a uma sequência polipeptídica, significa que uma sequência do polipéptido é, pelo menos, 50% idêntica a uma sequência de referência. Os polipéptidos modificados e os polipéptidos substancialmente idênticos ião ter, tipicamente, pelo menos, 70%, alternativamente 85%, mais provavelmente 90% e, muito provavelmente 95% de homologia com um polipéptido de referência. 28

Para polipéptidos, o comprimento de comparação, para obter as homologias percentuais entre sequências acima descritas irá ser, geralmente de, pelo menos, 25 aminoácidos, alternativamente, pelo menos 50 aminoácidos, mais provavelmente, pelo menos 100 aminoácidos e, mais provavelmente, 200 ou mais aminoácidos.

Como aqui estabelecido, os polipéptidos substancialmente idênticos ou homólogos incluem adições, truncamentos, eliminações internas ou inserções, substituições conservadoras e não-conservadoras ou outras modificações localizadas em posições da sequência de aminoácidos que não destroem a função do polipéptido quimérico (como determinado por ensaios funcionais, e. g., como aqui descrito). Um exemplo particular de uma substituição consiste em um ou mais aminoácidos serem substituídos por outro resíduo, química ou biologicamente semelhante. Como aqui utilizado, o termo "substituição conservadora" refere-se a uma substituição de um resíduo por um resíduo química ou biologicamente semelhante. Os exemplos de substituições conservadoras incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, tais como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por aspártico ou glutamina por asparagina e semelhantes. Os especialistas na técnica irão reconhecer os vários aminoácidos que podem ser modificados ou substituídos por outros resíduos quimicamente semelhantes, sem alterar substancialmente a actividade.

Os polipéptidos substancialmente idênticos ou homólogos incluem, também, os que apresentam modificações que melhoram ou conferem uma função ou actividade adicional. Por exemplo, FLSC 29 R/T tem um local da furina mutado, o qual aumenta a estabilidade do FLSC modificado (ver, e. g., FIG. 13).

Os polipéptidos modificados incluem, adicionalmente, "derivados químicos", nos quais um ou mais dos aminoácidos aí presentes têm uma cadeia lateral quimicamente alterada ou derivatizada. Esses polipéptidos derivatizados incluem, por exemplo, aminoácidos nos quais os grupos amina livres formam cloridratos de amina, grupos p-tolueno sulfonilo, grupos carobenzoxilo; os grupos carboxilo livres formam sais, ésteres metílicos e etílicos; grupos hidroxilo livres que formam derivados O-acilo ou O-alquilo, assim como derivados de aminoácidos de ocorrência natural, por exemplo, 4-hidroxiprolina, para a prolina, 5-hidroxilisina para a lisina, homosserina para a serina, ornitina para a lisina e assim sucessivamente. São, também, incluídos D-aminoácidos e derivados de aminoácidos que podem alterar a ligação covalente, por exemplo, a ligação persulfureto que se forma entre dois resíduos de cisteína que produz um polipéptido ciclizado.

Outro exemplo de uma modificação consiste na adição de um domínio heterólogo que fornece uma funcionalidade distinta a qualquer dos dois polipéptidos ou ao polipéptido quimérico. Um domínio heterólogo pode ser qualquer molécula pequena orgânica ou inorgânica ou macromolécula, desde que esta forneça uma função adicional. Os domínios heterólogos podem ou não afectar a interacção ou a afinidade entre o polipéptido do invólucro do vírus e o polipéptido do receptor. Os exemplos particulares de domínios heterólogos que fornecem uma função distinta, incluem uma sequência de aminoácidos que fornece direccionamento (e. g., ligando do receptor, anticorpo, etc.), função imunopotenciadora 30 (e. g., imunoglobulina, um adjuvante), permitem a purificação, o isolamento ou a detecção (e. g., myc, marcação T7, poli-histidina, avidina, biotina, lectinas, etc.).

Os domínios heterólogos particulares aqui exemplificados incluem uma sequência polipeptídica c-myc e uma sequência polipeptídica de cadeia pesada IgGl. Como aqui exemplificado, um domínio heterólogo pode ter múltiplas funções. Por exemplo, IgGl pode funcionar como um imunopotenciador in vivo, assim como funcionar como uma molécula adesiva que pode ser purificada, isolada ou detectada (e. g., por reacção com um anticorpo secundário, tendo uma actividade enzimática, tais como peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina). 0 especialista na técnica terá conhecimento de outros domínios heterólogos e pode seleccioná-los quando apropriado, dependendo da aplicação e da função pretendida.

Deste modo, de acordo com a presente invenção, são proporcionados polipéptidos quiméricos tendo um ou mais domínios heterólogos. Numa forma de realização, o domínio heterólogo é uma sequência polipeptídica c-myc (glu-gln-lys-leu-ile-ser-glu-glu-asp-leu; SEQ ID N°. 1). Numa outra forma de realização, o domínio heterólogo é uma sequência polipeptídica de imunoglobulina compreendendo a cadeia pesada.

Como aqui utilizados, os termos "isolado" ou "substancialmente puro", quando utilizados como modificadores dos polipéptidos quiméricos, seus fragmentos de sequência e polinucleótidos da invenção, significam que estes são produzidos por intervenção humana e separados do seu ambiente celular nativo in vivo. De um modo geral, os polipéptidos e os polinucleótidos separados, deste modo, são substancialmente 31 isentos de outras proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais estes se encontram naturalmente associados.

Tipicamente, um polipéptido é substancialmente puro quando este é isento, pelo menos, 60% em peso, de proteínas e outras moléculas com as quais este se encontra naturalmente associado. A preparação é, provavelmente, pelo menos, 75%, mais provavelmente, pelo menos, 90% e muito provavelmente, pelo menos, 95% pura, em peso. O polipéptido quimérico substancialmente puro pode ser obtido, por exemplo, pela expressão de um polinucleótido codificando o polipéptido em células e isolando o polipéptido produzido. Por exemplo, como estabelecido nos exemplos, a expressão de um polinucleótido recombinante codificando um polipéptido gpl20-CD4 em células de mamífero permite isolar o polipéptido quimérico a partir do meio de cultura, utilizando uma coluna de imunoafinidade. Alternativamente, o polipéptido quimérico pode ser sintetizado quimicamente. A pureza pode ser medida por qualquer método apropriado, e. g., electroforese em gel de poliacrilamida e subsequente coloração do gel (e. g., coloração de prata) ou por análise por HPLC.

Os polipéptidos quiméricos da invenção e suas modificações podem ser preparados por vários métodos conhecidos na técnica. As modificações dos polipéptidos podem ser introduzidas por mutagénese dirigida para um local (e. g., baseada em PCR) ou aleatória (e. g., EMS) por eliminação com exonuclease, por modificação química ou por fusão com sequências polinucleotídicas codificando um domínio heterólogo, por exemplo. Os polipéptidos quiméricos podem ser obtidos por expressão de um polinucleótido, codificando o polipéptido numa 32 célula hospedeira, tais como bactérias, leveduras ou células de mamifero e purificando o polipéptido quimérico expresso, por purificação utilizando métodos bioquímicos típicos (e. g., purificação por imunoafinidade, purificação em gel, rastreio de expressão etc.). Em Deutscher et al., {Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology, Vol. 182, Academic Press (1990)) são descritos outros métodos bem conhecidos. A invenção proporciona, adicionalmente, polinucleótidos codificando os polipéptidos quiméricos da invenção, seus fragmentos e sequências complementares. Numa forma de realização, os ácidos nucleicos da invenção codificam o polipéptido quimérico gpl20-CD4 aqui exemplificado. Numa outra forma de realização, os ácidos nucleicos da invenção codificam gpl20-CD4, no qual a gpl20 apresenta sequências de aminoácidos truncadas, a partir do terminal amina e carboxilo. Numa outra forma de realização, os ácidos nucleicos da invenção codificam gpl20-CD4-IgGl quimérico.

Como aqui utilizado, os termos "ácido nucleico", "polinucleótido", "oligonucleótido" e "iniciador" são utilizados alternadamente, em referência ao ácido desoxirribonucleico (ADN) ou ribonucleico (ARN), de cadeia dupla ou simples, linear ou circular. O ARN pode ser ARNm ARNr, ARNt ou ARNi anti-sentido, nâo-processado ou processado. O ADN pode ser ADN complementar (ADNc), ADN genómico ou anti-sentido. São, especificamente, incluídos análogos de nucleótido e derivados, tais como os que são resistentes à degradação por nuclease, os quais podem actuar para codificar um polipéptido quimérico da invenção. Os oligonucleótidos e polinucleótidos resistentes à nuclease são particularmente úteis para as vacinas de ácido nucleico da invenção aqui descritas. 33

Um polinucleótido "isolado" ou "substancialmente puro" significa que o ácido nucleico não se situa imediatamente contiguo às sequências codificantes, quer da extremidade 5', quer da extremidade 3', às quais é imediatamente contiguo no genoma de ocorrência natural do organismo do qual este deriva. 0 termo inclui, consequentemente, por exemplo, um ADN recombinante (e. g., um fragmento de ADNc ou de ADN genómico produzido por PCR ou tratamento com endonuclease de restrição produzido durante a clonagem), assim como um ADN recombinante incorporado num vector, um plasmideo de replicaçâo autónoma ou vírus ou um ADN genómico de um procariota ou eucariota. Este inclui, também, por exemplo, uma parte de ADN recombinante de uma quimera ou fusão. 0 termo não inclui, consequentemente, ácidos nucleicos presentes, mas não caracterizados, entre milhões de sequências numa biblioteca genómica ou de ADNc ou numa digestão de restrição de uma biblioteca fraccionada num gel.

Os polinucleótidos da invenção incluem, também, ácidos nucleicos que são degenerados em consequência do código genético. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais é especificada por mais de um codão. São incluídas todas as sequências polinucleotídicas degeneradas que codificam polipéptidos quiméricos da invenção.

Os polinucleótidos da invenção podem ser obtidos utilizando técnicas padrão conhecidas na técnica (e. g., clonagem molecular, síntese química) e a pureza pode ser determinada por electroforese em gel de poliacrilamida ou de agarose, análise de sequenciação e semelhantes. Os polinucleótidos podem ser, também, isolados, utilizando hibridação ou técnicas baseadas em computador que são bem conhecidas na técnica. Essas técnicas incluem, mas não estão limitadas a: (1) hibridação das 34 bibliotecas de ADN genómico ou ADNc com sondas para detectar sequências nucleotidicas homólogas; (2) rastreio com anticorpos de polipéptidos expressos por sequências de ADN (e. g., utilizando uma biblioteca de expressão); (3) reacção em cadeia da polimerase (PCR) de ADN genómico ou ADNc, utilizando iniciadores capazes de emparelhamento com uma sequência de ácidos nucleicos de interesse; (4) pesquisa em computador de sequências relacionadas, em bases de dados de sequências; e (5) rastreio diferencial de uma biblioteca de ácidos nucleicos subtraída. Deste modo, para obter outros polinucleótidos codificando receptores, tais como, por exemplo, os que codificam CD4, as bibliotecas podem ser rastreadas para a presença de sequências homólogas. A invenção inclui, também, polinucleótidos substancialmente homólogos. Como aqui utilizado, o termo "homólogo", quando utilizado em referência a moléculas de ácidos nucleicos, refere-se à semelhança entre duas sequências nucleotidicas. Quando uma posição de nucleótido em ambas as moléculas é ocupada por nucleótidos idênticos, então, estes são homólogos nessa posição. As sequências de ácido nucleico "substancialmente homólogas" são, pelo menos 50% homólogas, mais provavelmente, pelo menos 75% homólogas e, muito provavelmente, 90% ou mais homólogas. Tal como com os polipéptidos quiméricos substancialmente homólogos da invenção, os polinucleótidos substancialmente homólogos aos polinucleótidos da invenção codificando polipéptidos quiméricos, codificam polipéptidos que conservam a maior parte ou a totalidade da actividade ou função associada à sequência à qual são homólogos. Para polinucleótidos, o comprimento da comparação entre sequências irá ser, de um modo geral, pelo menos 30 nucleótidos, alternativamente, pelo menos 50 nucleótidos, mais provavelmente, pelo menos 75 nucleótidos e, muito provavelmente, 35 110 ou mais nucleótidos. São conhecidos na técnica, algoritmos para identificar sequências homólogas que têm em consideração espaços na sequência polinucleotídica e oligonucleótidos mal emparelhados, tal como BLAST (ver, e. g., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)).

Para além disso, os polinucleótidos são úteis como sondas de hibridação, de forma a identificar a presença ou a quantidade de um polinucleótido codificando um polipéptido quimérico, por exemplo, ARNm (Sambrook et al.r Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)). Tipicamente essas sondas são concebidas para ser especificas para a sequência pretendida, de forma a reduzir a probabilidade de hibridação com sequências não relacionadas. Essas sondas podem ser modificadas de forma a serem detectáveis utilizando radionuclideos, partes luminescentes e semelhantes.

As condições de hibridação podem ser, também, modificadas de forma a alcançar a especificidade pretendida. Um exemplo de condições de hibridação moderadamente severas é como se segue: SSC 2 X/SDS a 0,1% a, cerca de, 37 °C ou 42 °C (condições de hibridação); SSC 0,5 X/SDS a 0,1%, próximo da temperatura ambiente (lavagem de severidade baixa); SSC 0,5 X/SDS a 0,1% a, cerca de 42 °C (lavagem de severidade moderada) . Um exemplo de condições de hibridação de severidade moderadamente elevada é como se segue: SSC 2 X/SDS a 0,1% a cerca de, 37 °C ou 42 °C (condições de hibridação); SSC 0,5 X/SDS a 0,1% próximo da temperatura ambiente (lavagem de severidade baixa); SSC 0,5 X/SDS a 0,1% a cerca de 42 °C (lavagem de severidade moderada); e SSC 0,1 X/SDS a 0,1% a cerca de 52 °C (lavagem de severidade moderadamente elevada). Um exemplo de condições de hibridação de severidade elevada é como se segue: SSC 2 X/SDS a 0,1% a cerca 36 de 37 °C ou 42 °C (condições de hibridação) ; SSC 0,5 X/SDS a 0,1% próximo da temperatura ambiente (lavagem de severidade baixa); SSC 0,5 X/SDS a 0,1% a cerca de 42 °C (lavagem de severidade moderada); e SSC 0,1 X/SDS a 0,1% a cerca de 65 °C (lavagem de severidade elevada).

Os polinucleótidos da invenção podem, se desejado, estar nus ou estar num veiculo adequado para atravessar uma membrana celular (e. g., complexo polinucleótido-lipossoma ou um sistema de dispersão coloidal), contidos num vector (e. g., vector de retrovirus, vectores adenovirais e semelhantes) , ligados a esferas inertes ou outros domínios heterólogos (e. g., anticorpos, ligandos, biotina, estreptavidina, lectinas e semelhantes) ou outras composições apropriadas aqui divulgadas ou conhecidas na técnica. Deste modo, podem ser realizados e são contemplados meios de distribuição de polinucleótidos, virais e não-virais. Os polinucleótidos da invenção podem, também, conter sequências de ácido nucleico adicionais ligadas a si, que codificam um polipéptido tendo uma funcionalidade distinta, tais como os vários domínios heterólogos aqui estabelecidos. Os polinucleótidos da invenção podem ser, também, modificados, por exemplo, de forma a serem resistentes a nucleases, para aumentar a sua estabilidade numa formulação farmacêutica.

Os polinucleótidos da invenção são úteis para codificar polipéptidos quiméricos da invenção, especialmente, quando esses polinucleótidos são incorporados em sistemas de expressão aqui divulgados ou conhecidos na técnica. Consequentemente, são, também, incluídos polinucleótidos da invenção, incluindo um vector de expressão. 37

Para propagação ou expressão em células, os polinucleótidos da invenção podem ser inseridos num vector. 0 termo "vector" refere-se a um plasmideo, vírus ou outro veículo conhecido na técnica que possa ser manipulado por inserção ou incorporação de um ácido nucleico. Esses vectores podem ser utilizados para manipulação genética (i. e., "vectores de clonagem") ou podem ser utilizados para transcrever ou traduzir o polinucleótido inserido (i. e., "vectores de expressão"). Um vector contém, geralmente, pelo menos, uma origem de replicação para propagação numa célula e um promotor. São incluídos elementos de controlo, incluindo promotores presentes no interior de um vector de expressão, para facilitar a transcrição e a tradução adequadas (e. g., sinal de processamento de intrões, manutenção da grelha de leitura correcta do gene, de forma a permitir a tradução do ARNm na grelha correcta e codões de terminação). A expressão in vivo ou ín vitro dos polinucleótidos da invenção pode ser conferida por um promotor ligado operativamente ao ácido nucleico. "Promotor" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos mínima, suficiente para controlar a transcrição do ácido nucleico ao qual o promotor se encontra operativamente ligado (ver, e. g., Bitter et al., Methods in Enzymology, 153:516-544 (1987)). Os promotores podem controlar constitutivamente a transcrição, podem ser específicos para um tecido ou podem tornar a transcrição induzível ou repressível; esses elementos encontram-se, geralmente, localizados nas regiões 5' ou 3' do gene, deste modo, regulado.

Na presente invenção, para vírus que se ligam a um co-receptor, é vantajoso introduzir e expressar um polinucleótido codificando um polipéptido quimérico, nas células que são susceptíveis à infecção virai (e. g., células que 38 expressam o co-receptor). Deste modo, o polipéptido quimérico expresso irá ser segregado pela célula susceptivel transformada, em grande proximidade ao co-receptor, inibindo ou prevenindo, deste modo, o acesso do virus ao co-receptor o que, por sua vez, inibe ou previne a infecção virai das células. Pode ser ligado operativamente, um promotor especifico para um tecido a esta extremidade da sequência polinucleotidica, para permitir a expressão do polipéptido quimérico numa célula alvo apropriada.

Como aqui utilizado, a frase "promotor especifico para um tecido" significa um promotor que é activo em células ou tecidos particulares, que permite a expressão do polinucleótido operativamente ligado nas células particulares, e. g., células do fígado, células hematopoiéticas ou células de um tecido específico no interior de um animal. 0 termo abrange, também, os designados promotores "frouxos", os quais regulam a expressão de um ADN seleccionado maioritariamente num tecido, mas induzem, também, a expressão em um ou mais de outros tecidos.

Pode ser, também, utilizado um promotor induzível, para modular a expressão em células. "Promotor induzível" significa um promotor cujo nível de actividade aumenta em resposta ao tratamento com um sinal ou agente externo (e. g., promotor da metalotioneína IIA, promotor de choque térmico). Um "promotor repressível" ou "promotor condicional" significa um promotor cujo nível de actividade diminui em resposta a um repressor ou um composto equivalente. Quando o repressor deixa de estar presente, a transcrição é activada ou desreprimida. Esses promotores podem ser utilizados em combinação e podem, também, incluir sequências de ADN adicionais que são necessárias para a transcrição e expressão, tais como intrões e sequências intensificadoras. 39

Como aqui utilizado, o termo "operativamente ligado" significa que um polinucleótido seleccionado (e. g., codificando um polipéptido quimérico) e sequência (s) reguladora (s) estão ligadas de forma a permitir a transcrição, quando as moléculas apropriadas (e. g., proteínas activadoras da transcrição) se encontram ligadas à(s) sequência(s) reguladora(s). Tipicamente, um promotor está localizado na região 5' do polinucleótido e pode estar em grande proximidade do local de iniciação da transcrição, de forma a permitir que o promotor regule a expressão do polinucleótido. No entanto, é, também, possivel uma ligação operável indirecta, quando um promotor num primeiro vector controla a expressão de uma proteina que, por sua vez, regula um promotor controlando a expressão do polinucleótido num segundo vector.

Podem ser utilizados promotores constitutivos, tal como o T7 e semelhantes, assim como promotores induzíveis, tais como o pL do bacteriófago gama, plac, ptrp, ptac, na clonagem em sistemas bacterianos. Podem ser utilizados promotores constitutivos, tais como o SV40, o RSV e semelhantes ou promotores induzíveis derivados do genoma de células de mamífero (e. g., o promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (e. g., a repetição terminal longa do vírus de tumor mamário de murganho, o promotor tardio de adenovírus), na clonagem em sistemas de células de mamífero. Podem ser, também utilizados promotores produzidos por ADN recombinante ou técnicas de síntese, para permitir a transcrição das sequências de ácido nucleico da invenção.

Podem ser concebidos sistemas de expressão de mamífero que utilizam vírus ou elementos virais recombinantes, para controlar 40 a expressão. Por exemplo, quando são utilizados vectores de expressão de adenovírus, a sequência de ácidos nucleicos pode ser ligada a um complexo de controlo da transcrição/tradução de adenovírus, e. g., o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Alternativamente, pode ser utilizado o promotor 7.5K do vírus vaccinia (ver, e. g., Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79:7415-7419 (1982); Mackett et al., J. Virol., 49:857-864 (1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79:4927-4931 (1982)) .

Os sistemas de expressão de mamífero incluem, adicionalmente, vectores especificamente concebidos para métodos de "terapia génica", incluindo vectores adenovirais (Patentes U.S. N°. 5700470 e 5731172), vectores adeno-associados (Patente U.S. N°. 5604090), vectores de vírus herpes simplex (Patente U.S. N°. 5501979) e vectores retrovirais (Patentes U.S. N°. 5624820, 5693508 e 5674703 e publicações WIPO WO92/05266 e W092/14829). O gene codificante do polipéptido quimérico pode ser introduzido em veículos de distribuição de vacina, tais como vaccinia atenuada (M. Girard et al., CR Acad Sei III, 322:959-66 (1999); B. Moss et al., AIDS, 2 Suppl l:S103-5 (1988)), vírus da floresta de Semiliki (M. Girard et al., CR Acad Sei III, 322:959-66 (1999); S.P. Mossman et al., J. Virol., 70:1953-60 (1996)) ou Salmonella (R. Powell et al., em: Molecular Approaches to the control of infectious diseases, pp. 183-187, F. Bran, E. Norrby, D. Burton, e J. Meckalanos (ed), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1996); M.T. Shata et al., Mol Med Today, 6:66-71 (2000)) para proporcionar um meio eficiente e fiável para a expressão de proteína do invólucro do vírus adequadamente associada e enrolada e sequências do receptor, por exemplo, gpl20 e CD4. Os vectores baseados no vírus do papiloma bovino (BPV) têm a capacidade de replicar sob 41 a forma de elementos extra-cromossómicos (Sarver et al., Mol. Cell. Biol., 1:486 (1981)). Imediatamente após a entrada de um vector extra-cromossómico nas células de murganho, o vector replica até, cerca de, 100 a 200 cópias por célula. Uma vez que a transcrição do ADNc inserido não requer a integração do plasmideo no cromossoma do hospedeiro, ocorre um nível elevado de expressão. Esses vectores foram, também, utilizados em terapia génica (Patente U.S. N°. 5719054). São, também, incluídos vectores baseados no CMV (Patente U.S. N°. 5561063).

Para a expressão em leveduras, podem ser utilizados vários vectores contendo promotores constitutivos ou induzíveis (ver, e. g.f Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, C. 13, ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoe. & Wiley Interscience (1988); Grant et al., "Expression and Secretion Vectors for Yeast", em Methods in Enzymology, Vol. 153, pp. 516-544, ed. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y. (1987); Glover, DNA Cloning, Vol. II, C. 3, IRL Press, Wash., D.C. (1986); Bitter, "Heterologous Gene Expression in Yeast," Methods in Enzymology, Vol. 152, pp. 673-684, ed. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. (1987); e The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, ed. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vol. I e II (1982)). Pode ser utilizado um promotor de levedura constitutivo, tal como ADH ou LEU2 ou um promotor induzível, tal como GAL, ("Cloning in Yeast," R. Rothstein, Em: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol. 11, C. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C. (1986)). Alternativamente, são conhecidos na técnica e podem ser utilizados vectores que facilitam a integração de sequências de ácido nucleico exógenas num cromossoma de levedura, através, por exemplo, de recombinação homóloga. Os cromossomas artificiais de levedura (YAC) são, tipicamente, utilizados quando os polinucleótidos inseridos são demasiado grandes para os vectores 42 de expressão em levedura mais convencionais (e. g., maiores do que, cerca de, 12 kb) .

Deste modo, de acordo com a presente invenção, são proporcionados polinucleótidos codificando os polipéptidos quiméricos da invenção. Os polinucleótidos podem ser inseridos num vector de expressão, para a expressão in vitro (e. g., utilizando kits de transcrição/tradução in vitro, os quais se encontram disponíveis comercialmente) ou podem ser inseridos num vector de expressão que contém uma sequência promotora que facilita a expressão em procariotas ou em eucariotas, por transferência de um ácido nucleico apropriado para uma célula, órgão, tecido ou organismo adequados, in vivo.

Como aqui utilizado, um "transgene" é qualquer parte de um polinucleótido inserido artificialmente numa célula hospedeira e que se torna parte do organismo que se desenvolve a partir dessa célula. Um transgene pode incluir um ou mais promotores e qualquer outro ADN, tais como intrões, necessários para a expressão do ADN seleccionado, estando tudo operativamente ligado ao ADN seleccionado e pode incluir uma sequência intensificadora. Um transgene pode incluir um polinucleótido que é parcial ou inteiramente heterólogo (i. e., exógeno) em relação ao organismo transgénico ou pode representar um gene homólogo a um gene endógeno do organismo. Os transgenes podem-se integrar no genoma da célula hospedeira ou serem mantidos como um plasmídeo auto-replicante.

Como aqui utilizado, uma "célula hospedeira" é uma célula na qual é introduzido um polinucleótido que pode ser propagado, transcrito ou codificar o polipéptido expresso. 0 termo inclui, também, qualquer descendência da célula hospedeira alvo. É 43 entendido que nem toda a descendência pode ser idêntica à célula parental, dado que podem estar presentes mutações que ocorrem durante a replicação.

As células hospedeiras incluem, mas não estão limitadas a, bactérias, leveduras, células de insecto e de mamífero. Por exemplo, bactérias transformadas com vectores de expressão de polinucleótidos de bacteriófago recombinantes, ácidos nucleicos de plasmídeo ou ácidos nucleicos de cosmídeos; levedura transformada com vectores de expressão de levedura recombinantes; sistemas de células vegetais infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes (e. g., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão de plasmídeos recombinantes (e. g., plasmídeo Ti), sistemas de célula de insecto infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes (e. g., baculovírus) ou sistemas de células animais infectadas com vectores de expressão de vírus recombinantes (e. g., retrovírus, adenovírus, vírus vaccinia) ou sistemas de células animais transformadas, concebidos para a expressão estável.

Para a expressão a longo prazo de polipéptidos da invenção, é preferida a expressão estável. Deste modo, utilizando, por exemplo, vectores de expressão contendo as origens de replicação virais, as células podem ser transformadas com um ácido nucleico controlado por elementos de controlo apropriados (e. g., sequências promotoras/intensificadoras, terminadores da transcrição, locais de poliadenilação, etc.). Não sendo pretendido ser restringido ou, deste modo, limitado por qualquer teoria em particular, é considerado que a manutenção estável de vectores de expressão em células de mamífero ocorre por 44 integração do vector num cromossoma da célula hospedeira. Opcionalmente, o vector de expressão pode, também, conter um ácido nucleico codificando um marcador seleccionável, conferindo resistência a uma pressão selectiva ou um repórter indicando as células nas quais o gene foi introduzido, permitindo, deste modo, que sejam identificadas, cultivadas e expandidas as células que apresentam o vector. Como aqui utilizado, "gene repórter" significa um gene cuja expressão pode ser ensaiada; esses genes incluem, sem restrição, lacZ, genes da biossintese de aminoácidos, e. g. 0 gene LEU2 de levedura, luciferase ou o gene da transacetilase do cloranfenicol de mamifero (CAT). Os genes repórter podem estar integrados no cromossoma ou serem mantidos em plasmideos de replicação autónoma (e. g., plasmideos de 2 micron de levedura). Alternativamente, o marcador seleccionável pode situar-se num segundo vector co-transfectado numa célula hospedeira com um primeiro vector contendo um polinucleótido da invenção.

Podem ser utilizados vários sistemas de selecção, incluindo, mas não limitados ao gene neomycin, o qual confere resistência ao aminoglicósido G418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)) e o gene hygromicyn, o qual confere resistência a higromicina (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)). Recentemente, foram descritos genes seleccionáveis adicionais, nomeadamente, trpB, o qual permite que células utilizem a índole em vez de triptofano; hisD, o qual permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:8047 (1988)); e ODC (descarboxilase da ornitina), o qual confere resistência ao inibidor da descarboxilase da ornitina, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. (1987)). 45

Como aqui utilizado, o termo "transformação" significa uma modificação genética numa célula após a incorporação de um polinucleótido (e. g., um transgene) exógeno à célula. Deste modo, "uma célula transformada" é uma célula na qual ou em cuja descendência, foi introduzido um polinucleótido através de técnicas recombinantes. As células transformadas não incluem um ser humano completo. A transformação de uma célula hospedeira pode ser realizada por técnicas convencionais conhecidas dos especialistas na técnica. Quando a célula hospedeira é eucariota, os métodos de transformação com ADN incluem, por exemplo, fosfato de cálcio, microinjecção, electroporação, lipossomas e vectores virais. As células eucariotas podem ser, também, co-transformadas com sequências polinucleotidicas da invenção ou seus fragmentos e uma segunda molécula de ADN codificando um marcador seleccionável, como aqui descrito ou, de qualquer outra forma, conhecidas na técnica. Outro método consiste em utilizar um vector virai eucariota, tal como o virus 40 de simio (SV40) ou o virus do papiloma bovino, para infectar de um modo transiente ou transformar células eucariotas e expressar a proteína (ver, e. g., Eukaryotic Virai Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed. (1982)). Quando o hospedeiro é procariota (e. g., E. coli), as células competentes que têm capacidade de incorporação de ADN podem ser preparadas a partir de células recolhidas após a fase de crescimento exponencial e, subsequentemente, tratadas pelo método do CaCl2, utilizando processos bem conhecidos na técnica. A transformação de procariotas pode, também, ser realizada por fusão de protoplastos da célula hospedeira.

Os polipéptidos e polinucleótidos quiméricos da invenção e os vectores de expressão que os contêm, podem ser encapsulados 46 no interior de lipossomas, utilizando técnicas padrão e podem ser introduzidos em células ou em organismos completos. São preferidos lipossomas catiónicos para a distribuição de polinucleótidos. A utilização de lipossomas para introduzir várias composições in vitro ou in vivo, incluindo proteínas e polinucleótidos, é conhecida dos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Patentes U.S. N°. 4844904, N°. 5000959, N°. 4863740 e 4975282) .

Os lipossomas podem ser direccionados para um tipo celular ou tecido de interesse, pela adição de um ligando, tal como um polipéptido, para o qual foi identificado um receptor celular correspondente, à preparação de lipossomas. Por exemplo, no caso de um vírus que infecta uma célula CD4+, as células CD4+ são um alvo apropriado e a gpl20 do HIV poderia constituir um ligando apropriado para a introdução intracelular de um lipossoma contendo um polipéptido ou sequência polinucleotídica quiméricos da invenção. Podem ser, também, utilizados anticorpos monoclonais no direccionamento; muitos desses anticorpos específicos para uma ampla gama de proteínas da superfície celular são conhecidos dos especialistas na técnica e encontram-se disponíveis. O ligando seleccionado é covalentemente conjugado a uma âncora lipídica em lipossomas pré-formados ou é incorporado durante a preparação dos lipossomas (ver Lee & Low, J. Biol. Chem., 269:3198 (1994); Lee & Low Biochim. Biophys. Acta, 1233:134 (1995)) .

Os polipéptidos quiméricos da invenção e os polinucleótidos que os codificam podem ser introduzidos num organismo completo. Em particular, para polipéptidos quiméricos que contêm um polipéptido do invólucro do vírus que se liga ao co-receptor, animais transgénicos não-humanos expressando os polipéptidos 47 quiméricos da invenção seriam úteis para estudar os efeitos da expressão quimérica a longo prazo, assim como para determinar se o polipéptido quimérico expresso pode proteger ou inibir a infecção por um virus correspondente.

Deste modo, numa outra forma de realização, a invenção proporciona animais transgénicos não-humanos que expressam polipéptidos quiméricos. Os animais preferidos são susceptiveis à infecção virai para a qual é conhecida uma sequência polipeptidica do receptor correspondente. Os animais preferidos são os susceptiveis à infecção pelo virus da imunodeficiência, incluindo mamíferos, tais como primatas não-humanos (e. g., macacos, chimpanzés, símios, gibões, orangotangos, etc.), animais domésticos e gado, como aqui descrito. 0 termo "animal transgénico" refere-se a qualquer animal não-humano cuja linha celular somática ou germinal contém a informação genética recebida, directa ou indirectamente, por manipulação genética deliberada ao nível subcelular, tal como por microinjecção ou infecção com vírus recombinante. 0 termo "transgénico" inclui, adicionalmente, células ou tecidos (i. e., "célula transgénica", "tecido transgénico") obtidos a partir de um animal transgénico geneticamente manipulado, como aqui descrito. No presente contexto, um "animal transgénico" não abrange animais produzidos por cruzamento clássico ou fertilização in vitro, mas refere-se, antes, a animais nos quais uma ou mais células recebem uma molécula de ADN recombinante. Os animais transgénicos da invenção podem ser heterozigóticos ou homozigóticos no que respeita ao transgene. Os métodos para produzir animais transgénicos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patentes U.S. N°. 5721367, 5695977, 5650298 e 5614396) . 48

Deste modo, de acordo com a presente invenção, são proporcionados métodos para inibir, prevenir e melhorar uma infecção virai num indivíduo. Numa forma de realização, um método da invenção inclui a administração de uma quantidade eficaz de um polipéptido quimérico a um indivíduo, produzindo, deste modo, uma resposta imunitária suficiente para prevenir ou inibir a infecção virai no indivíduo. Ainda numa outra forma de realização, um método da invenção inclui a administração de uma quantidade eficaz de um polinucleótido codificando um polipéptido quimérico da invenção, a um indivíduo. Em vários aspectos, o polipéptido quimérico contém um polipéptido do invólucro do vírus da imunodeficiência, como aqui divulgado.

Nos métodos para inibir, prevenir e melhorar uma infecção virai pode ser, também, produzida uma resposta imunitária, num indivíduo ao qual são administrados um polipéptido quimérico ou um polinucleótido codificando um polipéptido quimérico. A resposta imunitária irá ser, provavelmente, de natureza humoral, embora uma administração de um polinucleótido codificando um polipéptido quimérico possa induzir uma resposta CTL. É, também, entendido que os métodos da invenção podem ser, também, utilizados em combinação com outras terapias virais, como apropriado. A "quantidade eficaz" irá ser suficiente para inibir, prevenir ou melhorar uma infecção virai num indivíduo ou irá ser suficiente para produzir uma resposta imunitária num indivíduo. Deste modo, uma quantidade eficaz do polipéptido quimérico pode consistir na que promove uma resposta imunitária contra o polipéptido ou um vírus no qual a proteína do invólucro se baseia. Uma quantidade eficaz administrada a um indivíduo já infectado com o vírus pode, também, consistir na que reduz a 49 carga virai ou aumenta o número de células CD4+. Uma quantidade eficaz pode consistir na que inibe a transmissão do vírus de um indivíduo infectado para outro (não infectado ou infectado). Nos métodos da invenção, nos quais uma sequência polinucleotídica codificando um polipéptido quimérico é administrada a um indivíduo, pode ser produzida uma resposta CTL contra o polipéptido quimérico, contra um vírus contendo a sequência polipeptídica do invólucro correspondente.

Uma vez que os polipéptidos e os polinucleótidos quiméricos da invenção irão ser administrados a indivíduos, incluindo humanos, a presente invenção proporciona, também, formulações farmacêuticas compreendendo polipéptidos e polinucleótidos quiméricos da invenção. Consequentemente, as composições administradas a um indivíduo, irão encontrar-se numa formulação "farmaceuticamente aceitável" ou "fisiologicamente aceitável".

Como aqui utilizados, os termos "farmaceuticamente aceitável" e "fisiologicamente aceitável" referem-se a veículos, diluentes, excipientes e semelhantes, que podem ser administrados a um indivíduo, de um modo preferido, sem efeitos secundários adversos excessivos (e. g., náuseas, dores de cabeça, etc.). Essas preparações para a administração incluem soluções aquosas ou não-aquosas, suspensões e emulsões estéreis. Os exemplos de solventes não-aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais, tal como azeite e ésteres orgânicos injectáveis, tal como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções aquosas/alcoólicas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem fluidos e repositores de 50 nutrientes, repositores de eletrólitos (tais como os baseados na dextrose de Ringer) e semelhantes. Podem estar, também, presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes. Nos métodos da invenção, são aplicáveis várias formulações farmacêuticas apropriadas conhecidas na técnica, para administração a um indivíduo (e. g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990); e The Merck Index, 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ (1996)). O controlo da duração da acção ou da distribuição controlada de uma composição administrada, pode ser realizada pela incorporação da composição em partículas ou numa substância polimérica, tais como poliésteres, ácidos de poliamina, hidrogel, polivinilpirrolidona, etilenovinilacetato, metilcelulose, carboximetilcelulose, sulfato de protamina ou co-polímeros de lactido/glicolido, co-polímeros de polilactido/glicolido ou co-polímeros de etilenovinilacetato. A taxa de libertação da composição pode ser controlada, pela alteração da concentração ou da composição dessas macromoléculas. Por exemplo, é possível aprisionar a sequência tripeptídica enquadrada por arginina em microcápsulas preparadas por técnicas de coacervação ou por polimeria interfacial, por exemplo, pela utilização de, respectivamente, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina, microcápsulas de poli(metilmetacrolato) ou num sistema coloidal de distribuição de fármacos. Os sistemas de dispersão coloidal incluem complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, esferas e sistemas baseados em lípidos, incluindo emulsões de óleo-em-água, micelas, micelas mistas e lipossomas. 51

As composições administradas por um método da invenção podem ser administradas parentericamente por injecção, por perfusão gradual ao longo do tempo ou por administração de bolus (por exemplo, no caso da protecção passiva contra a infecção por HIV resultante de uma lesão por uma agulha de seringa) ou por um dispositivo implantável microfabricado. A composição pode ser administrada por inalação, intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutaneamente, intracavidade (e. g., vaginal ou anal), transdermicamente, topicamente ou intravascularmente. As composições podem ser administradas em doses múltiplas. As doses ou "quantidade eficaz", necessárias para o tratamento, inibição ou prevenção da infecção ou da transmissão virai ou para induzir uma resposta imunitária irão ser, de um modo preferido, suficientes para melhorar alguns ou a totalidade dos sintomas da infecção, embora a prevenção da progressão ou do agravamento da infecção seja, também, um resultado satisfatório para muitas infecções virais, incluindo o HIV. Uma quantidade eficaz pode ser facilmente determinada pelos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Ansel et al., Pharmaceutical Drug Delívery Systems, 5a ed. (Lea e Febiger (1990), Gennaro ed.)).

Os polipéptidos e os polinucleótidos quiméricos da invenção são, também, úteis para fins de diagnóstico. Por exemplo, pode ser utilizado um polipéptido quimérico tendo uma sequência polipeptidica do invólucro do virus, derivada de um virus que utiliza um co-receptor na infecção, para identificar indivíduos que expressam co-receptores que reduziram a afinidade de ligação ao polipéptido quimérico. Os indivíduos que apresentam uma afinidade de ligação reduzida irão ter, provavelmente, um risco reduzido de infecção pelo vírus. Alternativamente, os indivíduos que expressam co-receptores que têm uma afinidade de ligação 52 aumentada para o polipéptido quimérico irão, provavelmente, apresentar um risco aumentado de infecção virai. Deste modo, podem ser identificados indivíduos que têm risco aumentado ou reduzido de infecção virai. Por exemplo, os indivíduos que expressam um co-receptor CCR5 ou CXCR4 que tem afinidade aumentada ou reduzida para um polipéptido quimérico compreendido por gpl20 do HIV-CD4 irão apresentar, respectivamente, um risco aumentado ou reduzido de infecção por HIV. Consequentemente, esses métodos são, também, úteis para avaliar o prognóstico; os indivíduos que expressam um co-receptor com afinidade de ligação elevada apresentam, provavelmente, um prognóstico mais desfavorável.

No caso da polipéptidos quiméricos da invenção que têm uma sequência polipeptídica do invólucro do vírus de um vírus, que utiliza um co-receptor, esses polipéptidos quiméricos são úteis para identificar agentes que modulam a ligação do vírus ao co-receptor. Esses polipéptidos quiméricos da invenção são, também, úteis para identificar agentes que modulam a interacção/ligação intramolecular da sequência polipeptídica do invólucro do vírus à sequência do receptor no interior do polipéptido quimérico. Deste modo, os polipéptidos quiméricos da invenção que contêm o polipéptido do invólucro do vírus que podem não utilizar o co-receptor podem ser utilizados para identificar agentes que modulam a ligação da sequência do invólucro à sequência do receptor no interior da molécula quimérica.

Deste modo, de acordo com a presente invenção, são proporcionados métodos para identificar um agente que modula a ligação entre um vírus e um co-receptor do vírus e métodos para identificar um agente que modula a ligação entre um vírus e um 53 receptor do vírus em que os referidos métodos não são realizados num ser humano. Numa forma de realização, um método da invenção inclui fazer contactar um polipéptido quimérico com um polipéptido do co-receptor, sob condições que permitam a ligação entre o polipéptido quimérico e o polipéptido do co-receptor, na presença e na ausência de um agente de teste e a detecção da ligação na presença e na ausência do agente de teste. Numa outra forma de realização, um método da invenção inclui fazer contactar um polipéptido quimérico que forma um complexo intramolecular com um agente de teste e a detecção da ligação entre a sequência polipeptídica do invólucro do vírus e a sequência polipeptídica do receptor no interior da quimera. Uma quantidade reduzida de ligação na presença do agente de teste identifica, deste modo, um agente que inibe a interacção/ligação entre o vírus e o co-receptor ou o receptor do vírus. A ligação aumentada na presença do agente de teste identifica, deste modo, um agente que estimula a interacção/ligação entre o vírus e o co-receptor ou o receptor do vírus. 0 contacto pode ocorrer em solução, fase sólida, em células intactas ou num organismo, tal como um primata não-humano. Em várias formas de realização, o vírus é um vírus da imunodeficiência, tal como o HIV e o co-receptor é uma quimiocina, tais como CCR5 ou CXCR4. A ligação dos vírus que utilizam co-receptores para a penetração na célula é um passo crítico para a infecção subsequente, proliferação virai e os derradeiros sintomas patológicos que daí resultam. Deste modo, noutra forma de realização, são proporcionados métodos para identificar agentes que inibem a penetração celular, infecção e proliferação dos vírus, assim como agentes que melhoram os sintomas associados 54 com a infecção virai. Num método da invenção, para identificar esses agentes, o agente de teste pode ser adicionado após fazer contactar o polipéptido quimérico com o polipéptido do co-receptor ou, alternativamente, antes de fazer contactar o polipéptido quimérico com o polipéptido do co-receptor.

Os agentes candidatos incluem anticorpos, antivirais, uma sequência polipeptidica do co-receptor (e. g., de CCR5 ou CXCR4), peptidomiméticos ou seus fragmentos activos. Os agentes candidatos abrangem, também, numerosas classes químicas, incluindo moléculas orgânicas, como pequenos compostos orgânicos tendo um peso molecular superior a 50 e inferior a, cerca de, 2500 daltons. Os agentes candidatos compreendem grupos funcionais necessários para a interacção estrutural com proteínas, particularmente, ligações de hidrogénio e, tipicamente, incluem, pelo menos, uma amina, um grupo carbonilo, hidroxilo ou carboxilo, de um modo preferido, pelo menos, dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos compreendem, frequentemente, estruturas cíclicas ou heterocíclicas de carbono e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais acima. Os agentes candidatos encontram-se, também, entre biomoléculas, incluindo, mas não limitadas a, péptidos, sacáridos, esteróides de ácidos gordos, purinas, pirimidinas, seus derivados, análogos estruturais ou combinações.

Os agentes candidatos são obtidos a partir de uma ampla variedade de fontes, incluindo bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, encontram-se disponíveis numerosos meios para a síntese aleatória e dirigida de uma ampla gama de compostos orgânicos e biomoléculas, incluindo a expressão de oligonucleótidos e oligopéptidos aleatórios. 55

Alternativamente, encontram-se disponíveis ou são facilmente produzidas bibliotecas de compostos naturais, sob a forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais. Adicionalmente, as bibliotecas e os compostos produzidos natural ou sinteticamente são facilmente modificados através de processos químicos, físicos e bioquímicos convencionais e estes podem ser utilizados para produzir bibliotecas combinatórias. Os agentes farmacológicos conhecidos podem ser submetidos a modificações químicas dirigidas ou aleatórias, tais como acilação, alquilação, esterificação, amidificaçâo, etc., para produzir análogos estruturais.

Quando o método detecta a ligação, podem ser adicionadas uma ou mais das moléculas a uma marcação, quando a marcação possa proporcionar, directa ou indirectamente, um sinal detectável. Várias marcações incluem radioisótopos, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, enzimas, moléculas de ligação específica, partículas, e. g. partículas magnéticas e semelhantes. As moléculas de ligação específica incluem pares, tais como biotina e estreptavidina, digoxina e antidigoxina, etc. Para os membros de ligação específica, o membro complementar estará, normalmente, marcado com uma molécula que proporciona a detecção, de acordo com processos conhecidos.

Podem ser incluídos vários outros reagentes no ensaio. Estes incluem reagentes, como sais, proteínas neutras, e. g. albumina, detergentes, etc., que são utilizados para facilitar a ligação óptima proteína-proteína e/ou reduzir as interacções não-específicas ou de fundo. Podem ser utilizados reagentes que melhoram a eficiência do ensaio, tais como inibidores de proteases, inibidores da nuclease, agentes antimicrobianos, etc. A mistura de componentes é adicionada em qualquer ordem que 56 proporcione a ligação pretendida. As incubações são realizadas a qualquer temperatura adequada, tipicamente, entre 4 e 40 °C. Os períodos de incubação são seleccionados para a actividade óptima, mas podem ser, também, optimizados para facilitar o rastreio rápido com capacidade de processamento elevada. Tipicamente, serão suficientes entre 0,1 e 1 horas.

Numa forma de realização, o vírus é um vírus da imunodeficiência, como aqui descrito, tal como HIV. Numa outra forma de realização, o contacto ocorre em solução, fase sólida, numa célula intacta ou num animal, tal como um primata não-humano, como aqui descrito. Em formas de realização adicionais, o co-receptor é uma sequência polipeptídica CCR5, CXCR4, CCR-2b, CCR3, CCR8, V28/CX3CR1, US28 (receptor semelhante à quimiocina codificado pelo vírus herpes), STRL33/BOB/TYMSTR, GPR15/Bonzo ou GPR1.

Um agente identificado por um método da invenção aqui descrito pode ser, adicionalmente, testado para a sua capacidade para inibir ligação ou a infecção de uma célula pelo vírus, ín vitro ou in vivo. Deste modo, de acordo com a presente invenção, são proporcionados métodos para identificar um agente que inibe a infecção virai de uma célula. Um método da invenção inclui fazer contactar uma célula susceptível à infecção virai com uma partícula virai infecciosa, na presença e na ausência de um agente de teste e determinar se o agente de teste inibe a ligação ou a infecção da célula pelo vírus, identificando, deste modo, um agente que inibe a infecção virai. Em várias formas de realização, o agente de teste é adicionado antes ou após fazer contactar a célula com a partícula virai infecciosa. O método pode, também, ser realizado em qualquer animal adequado, tal como um primata não-humano. 57

Os polipéptidos quiméricos da invenção são, também, úteis para identificar novos co-receptores ou caracterizar proteínas como co-receptores. Deste modo, a infecção virai e a patogénese subsequente de qualquer vírus podem ser melhor compreendidos, permitindo, deste modo, o tratamento melhorado da infecção. Por exemplo, um método para identificar um novo co-receptor ou para caracterizar a função do co-receptor consiste no sistema de dois híbridos, o qual pode detectar interacções proteína-proteína, através da activação de um repórter, cuja expressão é induzida por polipéptidos interactuantes. Deste modo, pode ser utilizado um polipéptido quimérico apropriado como uma sequência chamariz num sistema de dois híbridos de levedura ou de mamífero, para rastrear uma biblioteca, com o objectivo de identificar proteínas interactuantes, incluindo novos co-receptores. São, também, aplicáveis métodos bioquímicos bem estabelecidos de detecção de interacções proteína-proteína (e. g., cromatografia em coluna, centrifugação em gradiente, análise de co-imunoprecipitação, etc.) na identificação de co-receptores ou na caracterização de proteínas, como tendo função potencial de co-receptor.

Os polipéptidos quiméricos que se ligam a co-receptores são, também, úteis para identificar um local de ligação de um co-receptor. Por exemplo, produzindo fragmentos do polipéptido do co-receptor e fazendo contactar os fragmentos com um polipéptido quimérico apropriado. 0 contacto pode ser realizado em solução, (e. g., co-precipitação) , fase sólida (e. g., coluna de afinidade) ou numa célula intacta (e. g., fazendo contactar fragmentos do co-receptor com uma superfície celular e detectando se o fragmento do co-receptor inibe a ligação do polipéptido quimérico à célula). Um local de ligação do 58 co-receptor, uma vez identificado, pode ser utilizado como um agente antiviral para tratar, por exemplo, uma infecção. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um especialista na técnica à qual esta invenção pertence. Embora possam ser utilizados métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos, na prática ou no teste da presente invenção, são descritos, abaixo, métodos e materiais adequados. No caso de conflito, a presente descrição, incluindo as definições, irá regular. Para além disso, os materiais, os métodos e os exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes. Outras características e vantagens da invenção irão ser evidentes da descrição detalhada e das reivindicações. A invenção é, adicionalmente, descrita nos exemplos seguintes, os quais não limitam o âmbito da(s) invenção (ões) descrita (s) nas reivindicações.

EXEMPLO I

Este Exemplo descreve a construção de um polinucleótido codificando um polipéptido quimérico gpl20-CD4 de cadeia única FLSC ou TcSC. A estratégia para a construção de um complexo de cadeia única é baseada na colocação de uma sequência de ligação com 20 a 30 aminoácidos entre o terminal C da gpl20 e o terminal N da CD4 . As análises da estrutura cristalina da gpl20 modificada ligada à CD4 solúvel e Fab 17b (Dwong, P.D. et al., Nature, 393:648-59 (1998)), utilizando o visualizador Swiss PDB, sugeriu 59 que uma molécula quimérica deve ter capacidade de interacções intramoleculares que oriqinam a formação de um complexo gpl20-CD4.

Foi construído um ácido nucleico de cadeia única, codificando um polipéptido quimérico gpl20-CD4, pelo arranjo das respectivas sequências codificantes na sequinte ordem: (1) na extremidade 5', uma gpl20 do HIV com tropismo para macrófagos, BaL, sintética, codificada por codões; (2) uma sequência codificando um elemento de ligação com 20 aminoácidos, consistindo em glicinas, alanina e serinas; (3) sequências dos domínios solúveis 1 e 2 (D1D2) da CD4; e (4) na extremidade 3', sequências codificando um polipéptido curto derivado do oncogene c-myc. Foi utilizada a sequência gpl20, com codões optimizados, uma vez que esta permite um nível elevado de expressão numa forma independente de rev (Haas, J., et ai., Curr. Biol., 6:315-24 (1996)) . A sequência CD4 humana utilizada foi derivada de T4-pMV7 (Maddon, P. J., et al., Cell, 47:333-48 (1986); NIH AIDS Reagent Repository, Bethesda, MD). A sequência polipeptídica myc permite análises, purificação e outras manipulações, convenientes, do polipéptido quimérico.

Foi produzido um polinucleótido completo por PCR compreendendo estas sequências e foi inserido em pEF6 (Invitrogen) utilizando o promotor forte do factor de alongamento (EF1“) para controlar a expressão. Foram introduzidos locais para enzimas de restrição nesta construção (designados pEF6-SCBaL) , de forma a permitir a troca conveniente com outros genes do invólucro de outros vírus da imunodeficiência.

Resumidamente, a molécula FLSC foi construída através de PCR, utilizando os plasmídeos pMRlWl-9 e t4-pMV7 como moldes. 0 60 iniciador directo da gpl20 foi GGG-GGT-ACC-ATG-CCC-ATG-GGG-TCT-CTG-CAA-CCG-CTG-GCC (SEQ ID N°. 2) e o iniciador inverso foi GGG-TCC-GGA-GCC-CGA-GCC-ACC-GCC-ACC-AGA-GGA-TCC-ACG-CTT-CTC-GCG-CTG-CAC-CAC-GCG-GCG-CTT (SEQ ID N° . 3). 0 iniciador directo da CD4 foi GGG-TCC-GGA-GGA-GGT-GGG-TCG-GGT-GGC-GGC-GCG-GCC-GCT-AAG-AAA-GTG-GTG-CTG-GGC-AAA-AAA-GGG-GAT (SEQ ID N°. 4) e o iniciador inverso foi GGG-GTT-TAA-AC-TTA-TTA-CAG-ATC-CTC-TTC-TGA-GAT-GAG-TTT-TTG-TTC-AGC-TAG-CAC-CAC-GAT-GTC-TAT-TTT-GAA-CTC (SEQ ID N°. 5). 0 produto da PCR foi subclonado em pEF6 (Invitrogen,

Carlsbad, CA) utilizando os locais de restrição Kpnl e Pme 1. Para construir o plasmideo pEF6-TcSC, a sequência completa expressando gpl20 no pEF6-FLSC foi permutada por uma versão truncada da sequência da gpl20 (DC1DCSDV1V2). A gpl20 truncada foi produzida, utilizando GGG-GGT-ACC-ATG-CCC-ATG-GGG-TCT-CTG-CAA-CCG-CTG-GCC-ACC-TTG-TAC-CTG-CTG-GGG-ATG-CTG-GTC-GCT-TCC-TGC-CTC-GGA-AAG-AAC-GTG-ACC-GAG-AAC-TTC-AAC-ATG-TGG (SEQ ID N°. 6) como um iniciador directo e GGG-GGA-TCC-GAT-CTT-CAC-CAC-CTT-GAT-CTT-GTA-CAG-CTC (SEQ ID N°. 7) como um iniciador inverso. As regiões V e V2 foram eliminadas, utilizando CTG-TGC-GTG-ACC-CTG-GGC-GCG-GGC-GAG-ATG-AAG-AAC-TGC-AGC-TTC-AAC-ATC-GGC-GCG-GGC-CGC-CTG-ATC-AGC-TGC (SEQ ID N°. 8) como um iniciador directo e GCA-GCT-GAT-CAG-GCG-GCC-CGC-GCC-GAT-GTT-GAA-GCT-GCA-GTT-CTT-CAT-CTC-GCC-CGC-GCC-CAG-GGT-CAC-GCA-CAG (SEQ ID N°. 9) como um iniciador inverso.

As construções recombinantes são apresentadas na FIG. 1. 0 recombinante quimérico que continha a sequência completa da gpl20 da BaL foi designado como cadeia única completa (FLSC). Foi concebida uma segunda construção para produzir complexos que se assemelham mais proximamente com as moléculas utilizadas para resolver a estrutura cristalina da gpl20. Esta construção foi designada cadeia única truncada (TcSC) e foi construída como 61 para FLSC, excepto por ter sido utilizada uma sequência codificando gpl20 AC1AC5AV1V2 em vez da sequência codificante completa. A sequência de aminoácidos da região espaçadora é GSSGGGGSGSGGGGSGGGAAA (SEQ ID N°. 10)

EXEMPLO II

Este Exemplo descreve a transfecção de células com o polinucleótido codificando o polipéptido quimérico gpl20-CD4 e a caracterização do polipéptido solúvel expresso.

Foi transfectado pEF6-FLSC ou pEF6-TcSC recombinante em células 293, utilizando Fugene, de acordo com o protocolo do fabricante (Boehringer-Manheim). Foram obtidos tranfectantes estáveis por selecção com blasticidina 5 pg/mL. Foi cultivada uma linha celular estável (293—SC), sob diferentes condições e a produção do polipéptido quimérico foi avaliada por análise de imunotransferência, utilizando uma mistura dos anticorpos monoclonais anti-gpl20 dos requerentes (Y.H. Abacioglu et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 10:371-81 (1994)) ou soros policlonais humanos anti-CD4 (T4-4) (K. C. Deen et al., Nature, 331:82-4 (1998); R. L. Willey et al., J. Virol., 66:226-34 (1992); NIH AIDS Reagent Repository) .

Resumidamente, os sobrenadantes de cultura celular contendo o polipéptido quimérico foram reunidos e sujeitos a ebulição em tampão de aplicação de SDS-PAGE (Tris 75 mM, SDS a 2%, glicerol a 10%, azul de bromofenol a 0,001%, pH 8,3). As amostras foram, então, submetidas a electroforese num gel de gradiente de poliacrilamida 4-20% com SDS. As proteínas fraccionadas em gel foram, então, transferidas para uma membrana de nitrocelulose. 62

Os locais de ligação não-específica na membrana foram, então, bloqueados, durante 30 minutos, com leite em pó magro a 2% em soro fisiológico tamponado com tris, pH 7. A membrana foi, então, sondada, quer com soro policlonal de coelho anti-CD4 (T4-4; NIH AIDS Reagent Repository, Bethesda, MD) ou uma mistura de anticorpo monoclonal murino contra a gpl20 do HIV.

Como apresentado na FIG. 2, as células transfectadas expressaram uma proteína solúvel do tamanho esperado (150 kD) . Este polipéptido era reactivo, tanto com anticorpos anti-gpl20, como com anti-CD4 e, deste modo, correspondia ao polipéptido quimérico intacto. Foi detectada reactividade com o anticorpo anti-myc em outros estudos, confirmando, adicionalmente, a identidade das espécies com 150 kD como o polipéptido quimérico. Para além deste polipéptido, foram observadas bandas correspondentes aos tamanhos esperados para gpl20 e CD4 DlD2/marcação myc, indicando que uma porção do polipéptido quimérico tinha sido quebrada no espaçador. A adição de um inibidor de proteases biologicamente compatíveis (Pefabloc; Boerhinger-Mannhiem) produziu, essencialmente, moléculas polipeptídicas quiméricas não quebradas. Isto sugere que a quebra da gpl20-CD4 ocorra através de uma protease de serina. A quantidade de polipéptido quimérico gpl20-CD4 produzido pela linha celular 293-SC foi determinada utilizando uma ELISA de captura anti-gpl20, com anticorpo D7324 de ovelha anti-gpl20 (International Enzymes), uma IgG policlonal de ovelha contra um epitopo altamente conservado na região gpl20C5 (J.P. Moore, AIDS, 4:297-305 (1990); J.P. Moore et al., J. Virol., 67:863-75 (1992); J. P. Moore et al., AIDS, 4:307-15 (1990)) e uma curva padrão da gpl20. Resumidamente, foi absorvido D7324 2 ug/mL, em tampão fosfato salino, numa placa de plástico. Os locais de 63 ligação não-específica foram bloqueados com leite em pó magro a 2%, em soro fisiológico tamponado com tris. Foram, então, adicionadas concentrações saturantes do sobrenadante da cultura da linha de células 293-SC à placa. 0 polipéptido quimérico capturado foi detectado, utilizando soros humanos inactivados de doentes infectados com HIV e IgG anti-humana, conjugada com peroxidase de rábano. É estimado que a linha de células 293-SC segregue, aproximadamente, 3 ug/mL de polipéptido quimérico gpl20-CD4. A linha de células 293-SC foi adaptada para crescer em condições isentas de soro.

Uma vez que os estudos de imunotransferência indicaram que ocorria alguma quebra do polipéptido quimérico gpl20-CD4, foi reticulada uma amostra da cadeia única purificada e a amostra reticulada foi analisada, para determinar se as moléculas gpl20 e CD4 permaneciam associadas. Resumidamente, o gpl20-CD4 de cadeia única, proveniente de sobrenadantes produzidos pela linha de células 293-SC, foi purificado, utilizando uma coluna de imunoafinidade. A coluna foi construída pela ligação de anticorpo monoclonal humano A32 anti-gpl20m a sepharose 4B activada com CNBr (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . 0 A32 é específico para um epitopo altamente descontínuo na gpl20 e, de um modo preferido, reconhece invólucro ligado à CD4. 0 gpl20-CD4 ligado foi eluído com ácido acético 0,1 M, pH 2,5, liofilizado e dializado contra PBS. A concentração de proteína foi determinada por um ensaio BCA (Bio-Rad, Hercules, CA), utilizando o protocolo do fabricante. Uma alíquota de 20 uL de gpl20-CD4 purificado foi, então, reticulada com uma solução do reticulador BS3 homo-bifunctional 1 mM e foi submetida a electroforese, juntamente com gpl20-CD4 não-reticulado num gel de poliacrilamida de 4-20%. As proteínas fraccionadas foram transferidas para nitrocelulose, imunotransferidas com uma 64 mistura de anticorpos monoclonais anti-gpl20, seguidos por uma IgG anti-murganho marcada com fosfatase alcalina e foram visualizadas com uma mistura comercial de BCIP/NBT (KPL). A FIG. 3 mostra os resultados destes estudos; o gpl20-CD4 não-reticulado encontra-se na faixa 1 e o gpl20-CD4 reticulado encontra-se na faixa 2. A faixa 1 mostra que a coluna de imunoafinidade purifica o gpl20-CD4 de cadeia única, tanto quebrado como não quebrado. A reticulação, como apresentado na faixa 2, produz duas bandas amplas a 150 kDa e 300 kDa, um padrão sugerindo que o gpl20-CD4 de cadeia única esteja presente na solução, sob a forma de uma molécula associada com 150 kDa. As subunidades gpl20 e CD4 permanecem associadas, mesmo após o evento de quebra. A banda com 300 kDa indica que uma porção do gpl20-CD4 é dimérica em solução e pode representar moléculas de cadeia simples que se associam por interacções intermoleculares entre os domínios do invólucro e da CD4, em moléculas distintas. A quebra aparente das moléculas de cadeia única nas partes gpl20 e CD4, sob determinadas condições (FIG. 2), poderia constituir uma preocupação para as vacinas de ADN, uma vez que esse processamento poderá ocorrer, potencialmente, in vivo. No entanto, estes estudos demonstram que, apesar da quebra, as moléculas de cadeia única permaneceram associadas sob a forma de complexos gpl20-CD4 (FIG. 3).

Para examinar as propriedades estruturais do FLSC nativo, com maior detalhe, foram reticuladas covalentemente em PBS, concentrações diferentes (1 μΜ-0,03 μΜ) da mesma preparação de proteína examinada acima, para fixar quaisquer estruturas multiméricas existente em solução. O material reticulado foi, 65 então, analisado pelo ensaio de imunotransferência com anticorpo anti-CD4.

Como apresentado na FIG. 4, foi consistentemente visível uma banda de proteína maioritária (inserção; banda A) com 172 kD, juntamente com duas bandas minoritárias de peso molecular mais elevado. Uma das bandas minoritárias (inserção; banda B) tinha um tamanho aparente de, aproximadamente, 302 kD, enquanto que a outra (inserção; banda C) não migrou uma distância suficiente no gel para permitir uma avaliação exacta do tamanho por SDS-PAGE. A aparência e as proporções das diferentes bandas de proteína não eram dependentes da concentração do FLSC antes da reticulação. As análises densitométricas indicaram, deste modo, que as bandas A, B e C representaram, consistentemente, aproximadamente, 65%, 25% e 10% da proteína total, respectivamente.

Em comparação com o FLSC, o perfil cromatográfico do TcSC reticulado foi mais complexo. Sob condições não-desnaturantes, o TcSC eluíu sob a forma de uma série ampla de picos variando entre 166 kD e 353 kD. Esse perfil indicou que o polipéptido TcSC mais curto forma estruturas múltiplas de ordem mais elevada, após expressão e/ou purificação. Este comportamento indica que o TcSC existe, principalmente, sob a forma de cadeias de polipéptidos de tamanhos variáveis, ligadas por interacções entre as sequências gpl20 e as sequências CD4 em moléculas distintas. Uma vez que o TcSC foi criado por eliminação de 20 aminoácidos do terminal C da gpl20, a distância entre a estrutura nuclear da CD4 e o CD4bd da gpl20 foi encurtada, o que pode impedir a capacidade do TcSC para alcançar uma interacção intramolecular gpl20-CD4, favorecendo, deste modo, a formação de complexos intercadeia. No entanto, o TcSC apresenta, também, as 66 características antigénicas e funcionais de um complexo gpl20- CD4 . É possível que devido às interacções intermoleculares que envolvem múltiplas moléculas de TcSC, uma menor proporção de proteína total expressasse um local de ligação do co-receptor com capacidade de interacção com os co-receptores de superfície. Alternativamente, a eliminação das regiões V1/V2 no TcSC pode reduzir a afinidade relativa do invólucro da BaL para CCR5. Uma modificação adicional do TcSC, de forma a alongar o elemento de ligação entre as partes gpl20 e CD4, poderá permitir a formação de uma proporção mais elevada de complexos intracadeia. Permanece uma questão em aberto, se a natureza multimérica do TcSC coloca esta molécula em desvantagem em relação ao FLSC, uma vez que os estudos com outras moléculas multiméricas sugerem que estas sejam imunogénios mais potentes do que os seus equivalentes monoméricos (A.L. DeVico et al., AIDS Rev., 1:4-14 (1999); S.A. Jeffs et al., J general Virol., 77:1403-1410 (1996); R.A. LaCasse et al., Science, 283:357-62 (1999)).

EXEMPLO III

Este Exemplo descreve dados que demonstram a ligação do polipéptido quimérico gpl20-CD4 a vários anticorpos diferentes reactivos com gpl20 e CD4. A ligação da gpl20 à CD4 provoca modificações conformacionais na molécula originando a exposição do domínio de ligação do co-receptor. Consequentemente, os anticorpos dirigidos contra epitopos neste domínio devem reagir fortemente com moléculas de cadeia única adequadamente enroladas. 67

De forma a determinar epitopos expostos em moléculas quiméricas, foram comparadas as propriedades antigénicas das moléculas FLSC e TcSC. Foram submetidos FLSC e TcSC purificados a análises imunoquimicas, por ELISA de captura de antigénio. Resumidamente, foram capturados complexos BaLgpl20, gpl20-rsCD4 ou moléculas quiméricas de cadeia única, utilizando um anticorpo policlonal de ovelha purificado (International Enzymes, Fallbrook, CA) produzidos contra um péptido derivado dos 15 aminoácidos do terminal C da gpl20, D7324 (J. P. Moore et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 4:369-79 (1988)), adsorvido à matriz. 0 D7324 foi diluído em PBS até 2 ug/mL e foi adsorvido a placas de 96 poços (placas Maxisorb, VWR Scientific, St. Louis, MO), por incubação, durante a noite, à temperatura ambiente. As placas foram tratadas com BLOTTO (leite em pó magro a 5% em soro fisiológico tamponado com tris), de forma a impedir a ligação não-específica aos poços. Após a lavagem das placas com TBS, as amostras foram diluídas em BLOTTO e foram incubadas alíquotas de 200 pL em poços revestidos com d7324 em duplicado, durante 1 hora à temperatura ambiente. O antigénio ligado foi detectado utilizando uma recolha de soros de HIV-1+ inactivados, diluídos 1:1000 em BLOTTO, seguido por IgG de cabra anti-humana marcada com peroxidase de rábano (KPL, Gaithersburg, MD). A detecção foi, também, realizada utilizando anticorpos monoclonais (Mabs A32, 17b e 48d), que demonstraram, anteriormente, ligação, de um modo preferido, à gpl20 após o envolvimento da CD4 (M. Thali et al., J. Virol., 67:3978-86 (1993)), seguidos pelo segundo anticorpo marcado de um modo apropriado. Dois dos anticorpos, 17b e 48d, ligam-se no interior do local de ligação do co-receptor que é induzido pela ligação da CD4 (N. Sullivan et al., J. Virol., 72:4694-703 (1998); A. 68

Trkola et al., Nature, 384:184-6 (1996); L. Wu et al., Nature, 384:179-183 (1996)). Foi, também, testado o anticorpo Cll, o qual reconhece um epitopo conservado na região C1-C5 da gpl20 livre. Os anticorpos foram diluídos em BLOTTO e foram incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com TBS entre cada passo de incubação. As quantidades das sequências gpl20 presentes em amostras foram determinadas com base numa curva padrão produzida com gpl20 IIIB do HIV recombinante comercial (Bartels, Issaquah, WA). Em estudos comparativos envolvendo complexos BaLgpl20-rsCD4, foram tratadas placas revestidas com d7324, com concentrações saturantes da gpl20. Após a lavagem dos poços, foi, então, adicionada uma concentração em excesso de rsCD4 (1 pg/mL) aos poços e foram incubados durante 1 hora, para formar os complexos. Foi desenvolvido um formato de ELISA alternativo, utilizando Mab anti-CD4 45 (Bartels, Issaquah, WA) na captura, de forma a avaliar o antigénio TcSC, que não possui o epitopo D7324. 0 anticorpo foi adsorvido a plástico, a 1 ug/mL e os poços foram bloqueados com BLOTTO. Os ensaios foram, então, realizados como acima, utilizando os soros humanos ou os anticorpos monoclonais humanos indicados.

Como apresentado na FIG. 5A, todos os anticorpos reagiram fortemente com o FLSC. No entanto, as concentrações de ligação metade das máximas dos anticorpos 17b, 48d e A32 foram consistentemente mais elevadas com FLSC do que com gpl20 isolada e equivalentes ao que foi observado com complexos BaLgpl20-rsCD4 não-covalentes, solúveis. A imunorreactividade mais elevada do FLSC foi específica para os anticorpos dirigidos contra epitopos induzidos pela CD4, assim como não foram verificadas quaisquer diferenças significativas nas concentrações de ligação metade das máximas do anticorpo Cl, com FLSC em relação a gpl20 livre. 69

Como apresentado na FIG. 5B, o nível de reactividade de 17b e 48d com TcSC foi equivalente ao que foi observado com FLSC analisado paralelamente. Como esperado, os anticorpos Cll e A32 não reagiram com o TcSC, uma vez que a maior parte dos seus respectivos epitopos foi eliminada da construção TcSC. A ligação das sequências gp 120 e CD4 nas moléculas de cadeia única deve, também, bloquear a exposição de epitopos no local de ligação à CD4 da gpl20. Para confirmar que essa ligação tinha ocorrido, que os locais de ligação à CD4 da gp 120 já não se encontravam disponíveis para a ligação, os FLSC e TcSC foram avaliados, utilizando o formato de captura Mab45 e uma série de anticorpos monoclonais (IgG 1 b 12, F91 e 205-469) dirigidos contra o domínio de ligação à CD4 (CD4bd) da gpl20.

Como apresentado na FIG. 5C, nenhum destes anticorpos reagiu, quer com FLSC, quer com TcSC, embora fosse observada reactividade positiva com uma recolha de soros de HIV-1+ testados paralelamente. Estes dados indicam uma interacção entre as sequências da CD4 e o domínio de ligação à CD4 da gpl20 presente no interior das moléculas FLSC e TcSC.

Em suma, estes resultados demonstram que a reactividade do polipéptido quimérico gpl20-CD4 foi comparável com a observada com complexos produzidos por combinação de gp 120 e CD4 (não-reticulada) solúveis e superiores à da gpl20 isolada. Estes dados indicam que as moléculas gpl20-CD4 de cadeia única formaram complexos interactuantes, semelhantes ao complexo do estado de transição invólucro do HIV-CD4. O gpl20-CD4 capturado foi, também, reactivo com anti-soro anti-CD4 e anticorpo anti-myc em outros estudos de ELISA, consistentes com as 70 análises de transferência de Western. No seu conjunto, estes dados indicam que uma maioria das moléculas de gpl20-CD4 de cadeia única representam complexos gpl20-CD4 adequadamente enrolados.

EXEMPLO IV

Este moléculas invólucro

Exemplo descreve dados demonstrando a ligação das quiméricas gpl20-CD4, contendo uma sequência do do HIV especifica para CCR5, a células expressando CCR5. A formação do complexo gpl20-CD4 expõe, normalmente, os dominios do invólucro que interagem com um co-receptor apropriado (M. Thali et al., J. Virol., 67:3978-86 (1993); M.A. Vodicka et al., Virol., 233:193-8 (1997)). Consequentemente, uma outra medida dos complexos gpl20-CD4 adequadamente enrolados e da sua capacidade para inibir a infecção virai de uma célula consiste na capacidade de ligação a um co-receptor de CCR5.

Para avaliar a capacidade dos complexos de cadeia única se ligarem ao co-receptor, foi permitida a interacção de moléculas gpl20-CD4 de cadeia única, purificadas, com células que expressam, CCR5 ou CXCR4. Resumidamente, foram produzidos sobrenadantes contendo gpl20-CD4 de cadeia única, por transfecção transiente de células 293 com pEF6-SC. Os sobrenadantes foram, então, adicionados a uma coluna de imunoafinidade de A32 e a cadeia única purificada foi eluida com ácido acético 0.2 M pH 2,5 e foi analisada por ELISA de captura com d7324 e por imunotransferência, como descrito. As fracções 71 contendo a cadeia única, foram recolhidas, equilibradas a pH 7 e concentradas.

Para a ligação, foi permitida a interacção da preparação da cadeia única purificada, com células L1.2 que expressam CCR5 (L. Wu et al., Nature, 384:179-183 (1996); L. Wu et al., J. Exp. Med., 186:1373-81 (1997)). As células L1.2, L 1.2/X4 e L1.2/R5, as linhas de células B murinas que não expressam co-receptor, CXCR4 ou CCR5 foram misturados em concentrações decrescentes de proteína de cadeia única purificada. Após incubação a 37 °C, durante 1 hora, as células foram lavadas. As moléculas de cadeia única ligadas foram detectadas com 1 pg/mL de Mab Cll (J.E. Robinson et al., J. Cell. Bilchem. Suppl., 16E:71 (1992); M. Thali et al., J. Virol., 67:3978-86 (1993), um Mab anti gpl20, seguido por uma IgG anti-humana que foi marcada com uma molécula fluorescente, ficoeritrina. 0 Cll reconhece um determinante conformacional formado pelas regiões C1-C4. 0 nível da fluorescência ligada foi determinado por análise de triagem de células activada por fluorescência (FACS) com um instrumento FACS Calibur (Beckton Dickinson) . A intensidade média da fluorescência para cada amostra foi calculada, utilizando o programa Cell Quest3.1.3 (Becton Dickinson).

Como apresentado na FIG. 6, ambos os complexos gpl20-CD4 de cadeia única (FLSC e TcSC) se ligaram a células Ll.2 expressando de CCRS, mas não expressando cXCR4. A ligação máxima foi observada com FLSC, em concentrações (10 ug/mL) equivalentes à que foi observada em complexos BaLgpl20-rsCD4 solúveis testados como controlos. Em comparação foram necessárias concentrações, aproximadamente, 10 vezes mais elevadas de TcSC para atingir a saturação da ligação. Deste modo, o polipéptido quimérico gpl20-CD4 apresenta local(ais) de ligação ao co-receptor 72 funcionais para CCR5, como esperado para uma molécula contendo uma gp 120 com tropismo para macrófagos. A ausência de ligação a CXCR4 nestes estudos não foi inteiramente inesperada tendo em conta a especificidade aparente para a CD4, do polipéptido do invólucro do HIV na quimera gpl20-CD4. Deste modo, pela construção de quimeras polipeptidicas que se ligam a CXCR4 ou a outros co-receptores ou pela modificação de um polipéptido do invólucro do vírus, como aqui descrito, para obter um polipéptido quimérico que se liga a um outro co-receptor, podem ser obtidas outras quimeras polipéptido do invólucro-polipéptido do receptor de virus que se ligam a outros co-receptores.

Para demonstrar que o gpl20-CD4 de cadeia única se liga a CCR5, através do seu local de ligação ao co-receptor, foram realizados estudos de competição pela ligação os anticorpos 17b e 48d, os quais demonstraram interagir com o local de ligação ao co-receptor da gpl20 e impedir a interacção dos complexos gpl20/sCD4 com células expressando co-receptores. Foi utilizado outro anticorpo, Cll, contra gpl20 e um anticorpo, F240, contra gp41, nos controlos. Todos estes anticorpos são derivados de doentes infectados com HIV-1. Cada anticorpo foi utilizado a 10 ug/mL e adicionado em conjunto com 3 ug/mL de molécula de cadeia única purificada, a células Ll.2 que expressam, quer CCR5, quer CXCR4. 0 gpl20-CD4 ligado foi detectado com Cll, seguido pela IgG anti-humana marcada com PE. A quantidade de gpl20-CD4 foi determinada por FACS e expressa como percentagem do total ligado nos poços do controlo sem anticorpo competidor.

Como apresentado na FIG. 7, 17b e 48d inibiram fortemente a ligação de ambos os complexos de cadeia única às células. Na 73 presença destes anticorpos, o sinal de ligação nas células expressando CCR5 foi igual ao fundo de ligação observado para as células parentais L1.2/CXCR4 e L1.2. De uma forma interessante, o 2G12, um anticorpo neutralizante potente reduziu, também, a interacção de todas as formas de complexo com CCR5. Em comparação, todos os anticorpos anti-gpl20 reconhecendo epitopos fora do domínio de ligação do co-receptor, Cll, A32 e um anticorpo anti-gp41, F240, não conseguiram reduzir a ligação de FLSC ou TcSC às células L1.2 expressando CCR5.

Estes resultados indicam que o local de ligação ao co-receptor da gpl20 é importante para ligação ao co-receptor. Estes resultados indicam que podem ser, também, identificados agentes que inibem a ligação/interacção entre gpl20-CD4 e o co-receptor, utilizando esse ensaio. Esses agentes podem ter um valor potencial como agentes terapêuticos.

Em suma, os dados demonstram a expressão bem sucedida de um polipéptido quimérico, solúvel, o qual reproduz a conformação do estado de transição de um complexo invólucro-receptor de vírus. Considerando esta realização, é, presentemente, possível utilizar o polipéptido ou os polinucleótidos quiméricos codificando o polipéptido para a imunização de um indivíduo, para produzir uma resposta imunitária contra um vírus ou vírus tendo epitopos do polipéptido do invólucro semelhantes. A resposta imunitária produzida pode ser um anticorpo (humoral) ou uma resposta CTL. Para além disso, dado o facto do polipéptido quimérico se ligar a um co-receptor apropriado na superfície das células vivas, o polipéptido pode ser administrado a indivíduos expostos de um modo agudo a um vírus da imunodeficiência, de forma a proteger passivamente as células que expressam o co-receptor, da infecção virai. 74

EXEMPLO V

Este exemplo descreve dados demonstrando que uma molécula quimérica gpl20-CD4 pode neutralizar a infecção por estirpes de HIV, utilizando o mesmo co-receptor.

As moléculas de cadeia única foram, adicionalmente, examinadas para a sua capacidade para neutralizar os vírus R5 e X4. Foi permitida a ligação de um total de 104 células U373/CD4/MAGI (M.A. Vodicka et al., Virology, 233:193-8-(1997)) expressando, quer CCR5, quer CXCR4, durante a noite, a poços de cultura de tecidos de fundo plano. 0 meio de cultura foi, então, removido e substituído por 100 pL de meio fresco, contendo várias concentrações da proteína quimérica. Foram, então, adicionados 100 pL adicionais de meio contendo 50 TCID50 de vírus, à cultura. A totalidade da mistura foi, então, incubada a 37 °C até serem visíveis sincícios, tipicamente, ao fim de 3-5 dias. Os poços de cultura foram, então, tratados com o reagente β-galactosidase quimioluminescente, Galatostar (Tropix, Bedford, MA), de acordo com o protocolo do fabricante. A infecção virai foi determinada como uma função da quimioluminescência, quantificada utilizando um leitor de placas de fluorescência Victor2 (EG&G Wallac, Gaithersburg, MD) . O sinal de fundo foi determinado em ensaios realizados na ausência do vírus. Os sinais obtidos para os ensaios de teste foram, então, corrigidos, pela subtracção do valor do fundo. A percentagem de infecção foi calculada, pela divisão das unidades relativas de luz corrigidas para cada poço experimental, pelas unidades de luz corrigidas para os poços de controlo, contendo apenas células e vírus. Os valores da dose inibitória a 90% (ID90) foram 75 determinados a partir de representações gráficas da concentração de proteína de teste versus a percentagem de inibição da infecção. Todas as condições de teste foram realizadas em triplicado.

Como apresentado na FIG. 8, tanto FLSC como TcSC, neutralizaram de um modo potente e selectivamente o isolado HIV R5-lBaL, enquanto se verificou apenas uma inibição leve (ID90 > 10 ug/mL) do isolado 2044. Em comparação, a BaLgpl20 não-complexada inibiu a entrada de ambos os virus HIV-lBaL e X4 (HIV-I2044), como esperado, devido as suas interacções directas com a CD4.

Deste modo, os dados demonstram que uma molécula quimérica polipéptido do invólucro-receptor de virus se pode ligar a um co-receptor celular bloqueando, deste modo, a ligação ou a infecção das células pelo virus que utiliza o co-receptor para a ligação ou a infecção.

EXEMPLO VI

Este Exemplo descreve a construção e a expressão de um polipéptido quimérico gpl20-CD4 modificado, tendo uma sequência polipeptidica de imunoglobulina, gpl20-CD4-IgGI. Este domínio heterólogo modelar adiciona funcionalidade ao polipéptido quimérico gpl20-CD4, incluindo funções de adesina e imunopotenciadoras, prolongando a estabilidade, aumentando a meia-vida em circulação e a capacidade de atravessar a barreira placentária. Este exemplo mostra, também, que a quimera gpl20-CD4-IgGl se liga ao co-receptor expresso na superfície de células intactas e neutraliza o vírus HIV. 76 A gp-120, uma subunidade da proteína do invólucro do HIV-1, liga-se à CD4 e sofre uma modificação conformacional que permite ao complexo interagir com um co-receptor, tal como CCR5. Esta interacção permite a infecção de células alvo CD4+ pelo HIV-1. Os anticorpos ou outros agentes que interferem com a interacção do HIV-1 com o co-receptor podem prevenir a infecção.

Para identificar esses agentes, o gpl20-CD4 de cadeia única foi modificado, por fusão com as regiões constantes que formam a cadeia pesada da IgGl, Cl, C2 e C3 (FIG. 9) . 0 gpl20-CD4-IgGl pode ser utilizado para identificar agentes que bloqueiam, inibem ou interrompem a interacção do HIV-1 com o co-receptor, identificando, deste modo, agentes que inibem a infecção pelo o HIV. 0 gpl20-CD4-IgGl pode ser, também, utilizado como um agente imunoterapêutico passivo, para prevenir a infecção pelo HIV, após uma exposição aguda, tal como uma lesão por uma agulha de seringa.

Foram transfectadas duzentas e noventa e três células com o plasmídeo contendo gpl20-CD4-IgGI, de um modo transiente e a proteína expressa foi caracterizada por imunotransferência dos sobrenadantes de cultura. Resumidamente, as amostras de sobrenadante recolhidas foram submetidas a electroforese num gel de PAGE com um gradiente de 4-20%. As proteínas fraccionadas foram transferidas para nitrocelulose e foram detectadas com uma mistura de anticorpos monoclonais anti-gpl20. Como apresentado na FIG. 10, as células transfectadas de um modo transiente expressaram gpl20-CD4-IgGl (faixa 1) . O sobrenadante de células expressando gpl20 purificada derivada de HIV-lBa1' (faixa 2) foi submetido a electroforese para a comparação do tamanho relativo. O polinucleótido gpl20-CD4-IgGl codifica uma proteína tendo o 77 tamanho previsto para uma quimera gpl20-CD4-IgGl de cadeia pesada. Como no gpl20-CD4 original, é quebrada uma porção do gpl20-CD4-IgGl, produzindo um fragmento de proteína com 120 kDa que é, muito provavelmente, a gpl20 ("gpl20 quebrada"). O tamanho deste fragmento sugere que o gpl20-CD4-IgGl seja quebrado no interior do espaçador.

Para assegurar que o gpl20-CD4-IgGl é enrolado numa conformação que permita a ligação ao co-receptor, foram adicionadas diluições do sobrenadante, a células Ll.2 que expressam um dos co-receptores CCR5 ou CXCR4. O gpl20-CD4-IgGl ligado foi detectado com IgG anti-humana que foi marcada com Európio, um reagente fluorescente. A quantidade de fluorescência está directamente relacionada com a quantidade do material ligado.

Como apresentado na FIG. 11, o gpl20-CD4-IgGl liga-se, especificamente, às células Ll.2 que expressam CCR5. Novamente, foi detectada pouca ligação a CXCR4 utilizando este ensaio, o que é consistente com os resultados da gpl20-CD4. Estes estudos indicam que podem ser adicionados domínios heterólogos conferindo funcionalidade adicional ou intensificada, a moléculas quiméricas, sem afectar a sua capacidade de formar um complexo que se liga ao co-receptor celular.

Foi estudada a ligação na presença de anticorpo bloqueante 17b, para confirmar que a ligação do gpl20-CD4-IgGl de cadeia pesada quimérico a células expressando CCR5 foi mediada pelo local de ligação da gpl20 ao co-receptor. Resumidamente, para os estudos de competição Mab/FLSC-IgG 1, foram adicionadas células Ll.2 activadas com butirato de sódio expressando o co-receptor, a placas de fundo em V a 105/poço. Foram adicionados FLSC-IgGl 78 10 ug/mL e Mabs 1 ug/mL às células. As células e a proteína foram incubadas, em conjunto, durante 1 hora a 37 °C. As células foram sedimentadas e lavadas com TBS, três vezes. O material ligado foi detectado com IgG anti-humana marcada com fitoeriterina, a 5 ug/mL durante 1 hora a 4 °C. As células foram lavadas três vezes com TBS e, seguidamente, analisadas por triagem de células activada por fluorescência (FACS).

Como apresentado na FIG. 12, o anticorpo 17b, que reconhece o domínio de ligação a CCR5 na gpl20, bloqueia a interacção do FLSC-IgG com as células L1.2/R5, enquanto o anticorpo F240 de controlo não o faz. Estes dados demonstram que o FLSC-IgG interage com o co-receptor R5 através do domínio de ligação ao R5 na gpl20.

Para confirmar que o gpl20-CD4-IgGl de cadeia pesada quimérico pode bloquear a entrada do vírus nas células, foram, então, realizados ensaios de neutralização. Resumidamente, foi permitida a ligação de células U373/CD4/MAGI que expressam quer CCR5, quer CXCR4, a tabuleiros de cultura de tecidos de fundo plano, durante a noite, a 104 células/poço. O meio foi removido e foram, então, adicionadas concentrações variáveis de mAbs e imunoadesinas às células em 100 pL de meio. Foram, então, adicionados vírus (50 TCID50/poço em 100 uL de meio) e a mistura foi incubada a 37 °C até os sincicios serem visíveis, tipicamente 3-5 dias. As placas foram lidas utilizando um reagente β-galactosidase quimioluminescente, Galatostar, de acordo com o protocolo do fabricante e a quimioluminescência produzida foi quantificada, utilizando um Victor2, como anteriormente descrito. O crescimento virai em percentagem foi calculado pela utilização das unidades de luz relativas para (poço experimental) - poços de fundo sem vírus)/(poços com vírus 79 mas sem proteína) - (poços de fundo) (Tabela 2) . A ID50 e a ID90 foram determinadas graficamente. TABELA 2

Neutralização de HIV X4, R5 e X4/R5 por FLSC-IgGl U373/CD4/CCR5 FLSC-IgGl 2G12 2F5 lgGlbl2 lgG de Controlo ID9C (pg/mL) BaL 3,1 >10 >10 1,57 >10 ADA 4,58 >10 >10 >10 >10 89.6 3, 56 8,07 >10 3,39 >10 U373/CD4/CXCR4 SClg 2G12 2F5 lgGlbl2 lgG de Controlo ID9C (pg/mL) 2044 >10 >10 >10 1,57 >10 2005 >10 >10 >10 >10 >10 89.6 >10 >10 >10 5,34 >10

Os dados na Tabela 2 indicam que o FLSC-IgG bloqueia vírus que utilizam R5 para a entrada na célula. 0 FLSC-IgG neutraliza o vírus de um modo tão eficaz como os anticorpos 2G12, 2F5 e IgGlbl2, que estão a ser presentemente avaliados em ensaios de imunoterapia passiva. Consequentemente, estes dados afirmam, adicionalmente, a utilidade das quimeras gpl20-CD4 para a inibição da infecção por HIV, em particular e a aplicabilidade das quimeras proteína do invólucro-receptor de vírus como inibidores de outros vírus que utilizam o co-receptor para ligação ou a penetração celular em geral. 80

EXEMPLO VII

Este Exemplo descreve dados demonstrando que a mutação do local de quebra da furina melhora a estabilidade do complexo FLSC. A posição do local de quebra que separa os fragmentos do FLSC está, provavelmente, localizada no interior do terminal C das sequências da gpl20, presentes, apenas no FLSC, uma vez que o TcSC, mais curto, não apresenta degradação. De um modo notável, estas sequências abrangem a junção gpl20/gp41 normalmente quebrada pela protease furina (M. Girard et al.r CR Acad Sei III, 322:959-66 (1999)). A quebra do FLSC no local da furina natural será consistente com o comportamento dos fragmentos do FLSC, uma vez que esta teria um impacto minimo sobre as estruturas das partes gpl20 e CD4 e a sua capacidade para interagir.

Para determinar se este local putativo da furina corresponde a quebra, BaLgpl20, BaLgpl20 complexada com uma molécula sCD4, consistindo nos dois primeiros domínios (VIV2) da CD4, FLSC e FLSC R/T, foram capturadas em plástico através de um anticorpo específico para o terminal C da gpl20 (a ligação do anticorpo não foi afectada pela mutação R/T). Foram titulados VI-V4 sCD4 com quatro domínios nos complexos capturados, iniciando a 30 ug/mL. A sCD4 com quatro domínio tem uma maior afinidade para a gp 120 do que a V1V2 com dois domínios e irão, consequentemente, remover por competição a unidade mais pequena dos complexos. A CD4 com quatro domínios ligada foi detectada com o anticorpo OKT4, o qual se liga, apenas, à CD4 com quatro domínios. Os resultados na FIG. 13 demonstram que a mutação do local de quebra da furina impede a dissociação do V1V2 que se 81 encontra no FLSC R/T, tão facilmente como o FLSC quebrado, melhorando, deste modo, a estabilidade do complexo FLSC R/T.

Deve ser entendido que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a sua descrição detalhada, a descrição anterior pretende ilustrar e não limitar o âmbito da invenção, o qual é definido pelo âmbito das reivindicações em anexo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> University of Maryland Biotechnology Institute et al.

<120> QUIMERAS DE PROTEÍNA DO INVÓLUCRO/RECEPTOR DE VÍRUS E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO <130> 11076-002001 <140> PCT/US00/27546 <141> 2000-10-06 <150> 60/158321 <151> 1999-10-08 <160> 10 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 10

<212> PRT <213> Sequência Artificial 82 <2 2 Ο > <223> Sequência Artificial - polipéptido <4 OCO 1

Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 15 10

<210> 2 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência Artificial - iniciador <400> 2

gggggtacca tgcccatggg gtctctgcaa ccgctggcc 39 <210> 3 <211> 66 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência Artificial - iniciador < 4 0 0 > 3 gggtccggag cccgagccac cgccaccaga ggatccacgc ttctcgcgct gcaccacgcg 60 gcgctt 66 83 <210> 4

<211> 69 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência Artificial - iniciador <400> 4 60 69 gggtccggag gaggtgggtc gggtggcggc gcggccgcta agaaagtggt gctgggcaaa aaaggggat

<210> 5 <211> 77 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência Artificial - iniciador < 4 0 0 > 5 60 77 ggggtttaaa cttattacag atcctcttct gagatgagtt tttgttcagc tagcaccacg atgtctattt tgaactc

<210> 6 <211> 111 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência Artificial - iniciador <4 00> 6 60 111 gggggtacca tgcccatggg gtctctgcaa ccgctggcca ccttgtacct gctggggatg ctggtcgctt cctgcctcgg aaagaacgtg accgagaact tcaacatgtg g

<210> 7 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 Ο > <223> Sequência Artificial - iniciador < 4 0 0 > 7 gggggatccg atcttcacca ccttgatctt gtacagctc 39

<210> 8 <211> 75 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência Artificial - iniciador < 4 0 0 > 8 ctgtgcgtga ccctgggcgc gggcgagatg aagaactgca gcttcaacat cggcgcgggc 60 cgcctgatca gctgc 75

<210> 9 <211> 75 <212> ADN <213> Sequência Artificial 85 <2 2 Ο > <223> Sequência Artificial - iniciador <4 00> 9 gcagctgatc aggcggcccg cgccgatgtt gaagctgcag ttcttcatct cgcccgcgcc 60 cagggtcacg cacag 75

<210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de Artifical - aminoácido < 4 0 0 > 10

Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15

Gly Gly Ala Ala Ala 20

Lisboa, 3 de Julho de 2007 86

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido quimérico, compreendendo: uma sequência polipeptidica do invólucro do virus e uma sequência polipeptidica do receptor virai, que tem uma afinidade de ligação para a sequência polipeptidica do invólucro do virus, em que o polipéptido do invólucro do vírus é a gpl20 do HIV ou os seus fragmentos e o polipéptido do receptor virai é CD4 ou os seus fragmentos, em que a sequência polipeptidica do invólucro do vírus e a sequência polipeptidica do receptor virai se encontram ligadas por um espaçador de aminoácido e o espaçador de aminoácido está posicionado entre estas, para formar um polipéptido de cadeia única e em que o espaçador de aminoácido consiste em resíduos de aminoácido com comprimento suficiente para permitir o enrolamento do polipéptido de cadeia única, permitindo, deste modo, que a sequência polipeptidica do invólucro do virus e a sequência polipeptidica do receptor virai formem um complexo intramolecular interactuante.
2. Polipéptido quimérico da reivindicação 1, em que o HIV é HIV-1 ou HIV-2.
3. Polipéptido quimérico da reivindicação 1, em que o HIV é um um HIV com tropismo para macrófagos ou com tropismo para linfócitos.
4. Polipéptido quimérico da reivindicação 1, em que o polipéptido do invólucro do vírus compreende uma mutação no 1 local de quebra da furina no terminal C do polipéptido da gpl20 do HIV.
5. Polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 3, em que faltam 60 aminoácidos do terminal amina e 20 aminoácidos do terminal carboxilo ao polipéptido da gpl20 do HIV.
6. Polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o polipéptido da CD4 compreende os domínios Dl e D2.
7. Polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o espaçador tem desde 5 a 200 aminoácidos.
8. Polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o espaçador tem desde 10 a 100 aminoácidos.
9. Polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o espaçador tem desde 15 a 50 aminoácidos.
10. Polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o espaçador tem desde 20 a 40 aminoácidos.
11. Polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 6, em que o espaçador compreende uma sequência peptidomimética.
12. Polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 11 compreendendo, adicionalmente, um domínio heterólogo. 2
13. Polipéptido quimérico da reivindicação 12, em que o domínio heterólogo é seleccionado do grupo consistindo em: uma marcação, uma adesina e um agente imunopotenciador.
14. Polipéptido quimérico da reivindicação 12 ou 13, em que o domínio heterólogo compreende uma sequência de aminoácidos.
15. Polipéptido quimérico da reivindicação 14, em que a referida sequência de aminoácidos é uma sequência polipeptídica c-myc.
16. Polipéptido quimérico da reivindicação 13 ou 14, em que o referido agente imunopotenciador é uma sequência polipeptídica de imunoglobulina.
17. Polipéptido quimérico da reivindicação 16, em que a referida sequência polipeptídica de imunoglobulina é uma sequência polipeptídica de cadeia pesada.
18. Polipéptido quimérico da reivindicação 4, compreendendo, adicionalmente, um domínio heterólogo, em que o referido domínio heterólogo é uma sequência polipeptídica de imunoglobulina.
19. Composição compreendendo o polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 18 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
20. Sequência polinucleotídica compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos codificando o polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 10. 3
21. Sequência polinucleotídica da reivindicação 20, incluída num vector de expressão.
22. Célula hospedeira contendo o vector de expressão da reivindicação 21.
23. Composição compreendendo um polinucleótido e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o referido polinucleótido tem a sequência polinucleotídica da reivindicação 20.
24. Utilização do polipéptido quimérico de qualquer das reivindicações 1 a 18, a composição da reivindicação 19 ou um polinucleótido que codifica o referido polipéptido quimérico, para a produção de um medicamento para o tratamento ou inibição de uma doença infecciosa seleccionada do grupo consistindo em Vírus da Imunodeficiência Humana, SIV, FIV, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) e Sarcoma de Kaposi, num indivíduo.
25. Utilização de acordo com a reivindicação 24, em que o tratamento ou a inibição do Vírus da Imunodeficiência Humana, compreende a prevenção ou melhoria do Vírus da Imunodeficiência Humana num indivíduo.
26. Utilização de qualquer das reivindicações 24 a 25, em que o indivíduo é um humano.
27. Utilização de qualquer das reivindicações 25 a 26, em que o vírus é o HIV-1. 4
28. Utilização das reivindicações 25 ou 26, em que o virus é o HIV-2.
29. Método para identificar um agente que inibe uma interacção entre um virus e um co-receptor de virus, em que o referido método não é realizado num ser humano, compreendendo os passos de: (a) fazer contactar o polipéptido quimérico da reivindicação 1 com um co-receptor de virus sob condições que permitam a ligação do polipéptido quimérico e do co-receptor, na presença e na ausência de um agente de teste; e (b) a detecção da ligação na presença e na ausência do agente de teste, em que a diminuição da ligação na presença do agente de teste identifica, deste modo, um agente que inibe a ligação entre o virus e o co-receptor do virus.
30. Método da reivindicação 29, em que o agente de teste é adicionado após fazer contactar o polipéptido quimérico com o co-receptor do virus.
31. Método da reivindicação 29, em que o agente de teste é adicionado antes de fazer contactar o polipéptido quimérico com o co-receptor do virus.
32. Método da reivindicação 29, em que o agente de teste é uma biblioteca de agentes. 5
33. Método de qualquer das reivindicações 29 a 31, em que o agente de teste é seleccionado do grupo consistindo em um péptido, uma molécula orgânica, um anticorpo, um antiviral, um co-receptor de virus da imunodeficiência ou seu fragmento funcional.
34. Método de qualquer das reivindicações 29 a 31, em que o co-receptor do virus da imunodeficiência é uma sequência polipeptidica CCR5 ou CXCR4.
35. Método de qualquer das reivindicações 29 a 31, em que o co-receptor do virus está presente na superfície de uma célula intacta.
36. Método da reivindicação 35, em que a célula intacta está presente num animal não-humano.
37. Método da reivindicação 36, em que o animal é um primata não-humano.
38. Método para identificar uma sequência polipeptidica quimérica que inibe a infecção virai de uma célula, em que o referido método não é realizado num ser humano, compreendendo os passos de: (a) fazer contactar uma célula susceptível a infecção virai com uma partícula virai infecciosa, na presença e na ausência da sequência polipeptidica quimérica da reivindicação 1; e (b) a determinação se o polipéptido quimérico inibe a infecção virai da célula identificando, deste modo, uma 6 sequência polipeptídica quimérica que inibe a infecção virai.
39. Método da reivindicação 38, em que a sequência polipeptídica quimérica é adicionada após fazer contactar a célula com a partícula virai infecciosa.
40. Método da reivindicação 38, em que a sequência polipeptídica quimérica é adicionada antes de fazer contactar a célula com a partícula virai infecciosa.
41. Método de qualquer das reivindicações 38 a 40, em que o método é realizado num animal não-humano.
42. Método da reivindicação 41, em que o animal é um primata não-humano Lisboa, 3 de Julho de 2007 7