PT107052A

PT107052A - Sistema e método de medição da resposta da fluorescência da clorofila a a variações da intensidade ou qualidade da luz

Info

Publication number: PT107052A
Application number: PT107052A
Authority: PT
Inventors: Jo O António De Almeida Serôdio; Jo O Paulo Ferreira Ezequiel; Jörg Christian Frommlet; Martin Yann François Laviale
Original assignee: Univ Aveiro
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2015-01-09
Also published as: PT107052B

Abstract

NESTE DOCUMENTO DESCREVE-SE UM SISTEMA E MÉTODO PARA A MEDIÇÃO DA RESPOSTA DA EMISSÃO IN VIVO DA FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA A A VARIAÇÕES DA INTENSIDADE DA LUZ, DESIGNADAS COMO ¿CURVAS DE RESPOSTA À LUZ¿, DE UMA FORMA RÁPIDA E NÃO-SEQUENCIAL. O MÉTODO BASEIA-SE NA COMBINAÇÃO DE PROJECÇÃO NA AMOSTRA DE UM CONJUNTO DE FEIXES DE LUZ SEPARADOS ESPACIALMENTE, DE DIFERENTE INTENSIDADE, DENOMINADO ¿MÁSCARA DE LUZ¿, UTILIZANDO UM PROJECTOR DIGITAL, COM A MEDIÇÃO DA FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA A EMITIDA COMO RESPOSTA A CADA FEIXE DE LUZ, ATRAVÉS DE UM FLUORÓMETRO DE IMAGEM. ESTE MÉTODO PERMITE: A MEDIÇÃO DE CURVAS DE LUZ CONSTITUÍDAS POR MEDIÇÕES NÃO-SEQUENCIAIS E TEMPORALMENTE INDEPENDENTES; UMA ELEVADA RAPIDEZ DE EXECUÇÃO; A POSSIBILIDADE DE DEFINIR E CONTROLAR COM GRANDE FLEXIBILIDADE A GAMA DE INTENSIDADE E COLORAÇÃO DA LUZ A APLICAR.

Description

DESCRIÇÃO "Sistema e método de medição da resposta da fluorescência da clorofila a a variações da intensidade ou qualidade da luz"

Domínio técnico 0 presente pedido descreve um sistema e um método de medição da emissão de fluorescência da clorofila a por parte de organismos fotossintéticos. Técnica Anterior A medição da emissão de fluorescência da clorofila a através do uso de fluorómetros de pulso modulado, designados como 'fluorómetros PAM'; Schreiber et al. 1986, é uma técnica utilizada de forma muito generalizada em estudos fundamentais e aplicados sobre a actividade fotossintética de plantas, líquenes, corais, algas e outros organismos fotossintéticos.

Um dos métodos mais utilizados consiste na quantificação da medição da emissão de fluorescência quando uma mesma amostra ou as suas réplicas são expostas a diferentes níveis de intensidade luminosa actínica, i.e. luz de intensidade suficientemente elevada para induzir uma resposta fotossintética, resultando em 'curvas de resposta à luz', conforme indicado em Serôdio et al., 2006 e Serôdio & Lavaud, 2011.

No documento DE3518527A1 são divulgados fluorómetros PAM que permitem a medição de curvas de saturação luminosa, mas apenas de uma de duas formas: i) aplicando cada intensidade luminosa a uma amostra replicada separadamente, o que resulta num procedimento extremamente moroso; ii) aplicando as diferentes intensidades de luz de forma sequencial, ou seja intensidades crescentes, decrescentes ou outra ordem. Trata-se da forma mais utilizada, devido à economia de tempo e de amostras que permite. Contudo, esta abordagem não permite a independência das medições realizadas durante a construção de uma mesma curva de resposta à luz.

Com a técnica agora apresentada, é divulgada um método de medição de curvas de resposta à luz baseadas na emissão de fluorescência da clorofila a, permitindo a obtenção de curvas constituídas por medições independentes, medidas de uma forma não-sequencial, e muito mais rápida que qualquer dos métodos já conhecidos do estado da técnica. Com esta técnica, uma curva de resposta à luz completa demora aproximadamente o tempo necessário para a realização de uma única medição de uma curva medida sequencialmente, por exemplo considerando uma curva de luz com oito níveis de luz e três réplicas que demora o equivalente a 24 tempos de medida, enquanto com a técnica agora apresentada é possível obter os mesmos resultados com uma única medição.

Sumário

Na presente divulgação é descrito um método para a medição da resposta da emissão in vivo da fluorescência da clorofila a a variações da intensidade ou da luz, designadas como 'curvas de resposta à luz', de uma forma rápida e não-sequencial. 0 método apresentado baseia-se na combinação de i) projecção em pelo menos uma amostra de um conjunto de feixes de luz separados espacialmente, de diferente intensidade ou coloração, denominado 'máscara de luz', utilizando um projector de luz de controlo digital, e ii) medição da fluorescência da clorofila a emitida como resposta a cada feixe de luz, através de um fluorómetro de imagem, como por exemplo um Fluorómetro de Pulso Modulado capaz de registar imagens de fluorescência.

Existem documentos sobre a medição de curvas de resposta à luz, mas baseadas em protocolos sequenciais, i.e. em que a intensidade da luz actinica é variada sequencialmente (Zhiguo et ai. 2012). Existem documentos que envolvem a projecção de luz actinica na amostra e a detecção de fluorescência com um fluorómetro de imagem, mas que não aplica diferentes intensidades de luz simultaneamente nem se destina à medição de curvas de resposta à luz (Hendrik et ai. 2006; Hendrik et ai. 2012) .

Esta tecnologia permite a medição de curvas de luz constituídas por medições não-sequenciais e temporalmente independentes; uma elevada rapidez de execução; a possibilidade de definir e controlar com grande flexibilidade a gama de intensidade e coloração da luz a aplicar.

Assim, o presente texto descreve um sistema para a medição da resposta da emissão in vivo da fluorescência da clorofila a a variações da intensidade ou qualidade da luz que compreende: - projector digital; - fluorómetro de pulso modulado; - fontes de luz de medição e pulso saturante separados espacialmente, de diferente intensidade; - amostra.

Numa forma de realização preferencial, o sistema compreende adicionalmente uma lente de focagem.

Numa outra forma de realização preferencial, o projector digital utilizado no sistema de apresenta uma intensidade de luz até 10 ymol m“2 s-1.

Ainda numa outra forma de realização preferencial, o projector digital utilizado no sistema apresenta valores de intensidade de luz saturantes da fotossíntese compreendidos entre 1000 e 2000 ymol m“2 s-1.

Numa forma de realização preferencial, o fluorómetro de pulso modulado utilizado no sistema apresenta uma câmara com capacidade para detectar a emissão de fluorescência da clorofila a em todas as áreas de luz actínica projectadas.

Numa outra forma de realização preferencial, o projector digital utilizado no sistema encontra-se localizado num ponto onde não ocorra obstrução de outras fontes de luz.

Ainda numa outra forma de realização preferencial, o sistema apresenta um ângulo inferior a 10° entre o feixe de luz projectada e a vertical. É ainda divulgado um método de medição, utilizando o sistema descrito, o qual compreende os seguintes passos: - desenho da máscara de luz com n°, dimensão e formas de áreas de luz actínica pretendidas; - colocação da amostra na zona de medição, directamente sob a câmara do fluorómetro de imagem; - ligar o fluorómetro de imagem, fazendo incidir a luz de medição na amostra; - projecção nas amostras da máscara de luz constituída pelas áreas de luz actínica previamente definidas, durante o tempo necessário até se atingir um estado estacionário da emissão de fluorescência; - aplicação de um pulso saturante e registo da cinética da emissão de fluorescência durante um período antecedendo o pulso saturante, cerca de 1 a 2 segundos antes do referido pulso, e durante a aplicação do pulso saturante; - preparação e análise dos dados obtidos, utilizando o software do fluorómetro de imagem ou outro que permita manipulação das imagens de fluorescência obtidas, definir Áreas de Interesse correspondentes a cada área de luz actinica projectada; - em cada Área de Interesse, medição da intensidade da emissão da fluorescência da clorofila a e cálculo dos índices de interesse; - construção da curva de resposta à luz, relacionando os níveis de fluorescência medidos em cada área de interesse com a intensidade da luz actínica aplicada.

Por fim, é divulgada a utilização do sistema na avaliação do estado fisiológico de organismos fotossintéticos, previsão da variação da eficiência fotossintética em diferentes condições de iluminação de plantas ou algas a crescer em condições controladas, identificação e selecção de variedades de plantas ou algas com melhor eficiência fotossintética, detecção e quantificação de efeitos de tóxicos na actividade fotossintética de plantas ou algas.

Descrição geral A técnica divulgada diz respeito a um método para a medição da resposta da emissão in vivo da fluorescência da clorofila a a variações da intensidade, designadas como 'curvas de resposta à luz', de uma forma rápida e não-sequencial . 0 método é baseado na combinação de i) projecção em pelo menos uma amostra de um conjunto de feixes de luz separados espacialmente, de diferente intensidade ou qualidade, denominado 'máscara de luz', utilizando um projector de luz de controlo digital, e ii) medição da fluorescência da clorofila a emitida como resposta a cada feixe de luz, através de um fluorómetro de imagem, como por exemplo um fluorómetro PAM capaz de registar imagens do sinal de fluorescência, como o ilustrado na Figura 1. A máscara de luz é constituída por um conjunto de 'áreas de luz actínica' (ALA), cada uma correspondendo a um feixe de luz independente e de intensidade diferente. A curva de resposta à luz é obtida pela aplicação ao conjunto das ALA do protocolo correntemente utilizado em fluorometria PAM para a realização de uma única medição: aplicação simultânea de 'luz de medição', i.e. luz modulada, de baixa intensidade, sem efeitos actínicos e de 'pulsos saturantes', i.e. pulsos curtos, normalmente com menos de 1 s de duração, de intensidade muito elevada (Schreiber et ai. 1986). A curva é construída fazendo corresponder a emissão de fluorescência medida em cada ALA ao nível de intensidade de luz actínica aplicada.

Breve Descrição das Figuras

Para uma mais fácil compreensão da técnica juntam-se em anexo as figuras, as quais, representam realizações preferenciais que, contudo, não pretendem limitar o objeto da presente técnica. A Figura 1 ilustra um esquema genérico da disposição dos diversos componentes do sistema de medição de curvas de resposta à luz de fluorescência da clorofila a, em que os números de referência correspondem aos seguintes elementos: 1 - projector digital; 2 - câmara do fluorómetro de pulso modulado; 3 - lente de focagem; 4 - fontes de luz de medição e pulso saturante; 5 - amostra; 6 - ângulo de incidência da projecção da máscara de luz. Descrição detalhada

Seguidamente será descrita detalhadamente a tecnologia agora divulgada, com referência às figuras anexas e alguns casos particulares, os quais contudo não pretendem limitar o âmbito da presente divulgação.

Para levar a cabo o método agora divulgado, será necessária a montagem de um sistema compreendido pelos seguintes elementos: - projector digital; - fluorómetro de pulso modulado; - fontes de luz de medição e pulso saturante; - amostra.

Adicionalmente poderá haver o interesse de montar uma lente de focagem que permita a focagem da imagem projectada no plano da amostra.

Para que seja possível o funcionamento do método é necessário que previamente às medições sejam efectuados os seguintes passos: - desenhar a máscara de luz com n°, dimensão e formas de ALAs pretendidas; - se necessário, medir a intensidade e o espectro da luz em cada ALA, e efectuar as correcções necessárias para se atingir o valor de intensidade e o espectro desejado.

Numa fase posterior ao desenho da máscara de luz, são realizados os seguintes passos de medição: - colocação da amostra, por exemplo uma folha, na zona de medição, directamente sob a câmara do fluorómetro de imagem; - ligar o fluorómetro de imagem, fazendo incidir a luz de medição na amostra; - projecção nas amostras da máscara de luz constituída pelas ALAs previamente definidas, durante o tempo desejado, o qual normalmente está compreendido entre 5 e 10 minutos até se atingir um estado estacionário da emissão de fluorescência; aplicação de um pulso saturante e registo da cinética da emissão de fluorescência durante um período antecedendo o pulso saturante, cerca de 1 a 2 segundos antes do referido pulso, e durante a aplicação do pulso saturante.

Após as medições, são efectuadas as seguintes operações: - utilizando o software do fluorómetro de imagem ou outro que permita manipulação das imagens de fluorescência obtidas, definição de Áreas de Interesse correspondentes a cada ALA projectada; - em cada Área de Interesse, medição da intensidade da emissão da fluorescência da clorofila a e cálculo dos indices de interesse; - construção da curva de resposta à luz, relacionando os níveis de fluorescência medidos em cada área de interesse com a intensidade da luz actínica aplicada.

Características técnicas do projector digital 0 projector digital a utilizar apresenta uma gama de intensidades de luz suficiente para cobrir níveis próximos de escuro absoluto, considerando-se aceitáveis valores até 10 ymol m~2 s-1, preferencialmente de 5 ymol m~2 s_1 e ainda mais preferencialmente próximos de 0 pmol m“2 s-1, e de valores saturantes da fotossíntese, dependendo do estado fisiológico da amostra, mas considera-se 1000 ymol m“2 s_1 como uma referência aceitável, preferencialmente de 1500 ymol m“2 s_1 e ainda mais preferencialmente de 2000 ymol m“2 s-1. O projector deverá igualmente garantir que o espectro da luz actínica é constante, não variando com a intensidade aplicada. Para atingir estes resultados o projector pode actuar com uma de duas formas possíveis: 1) ajustando por software o espectro da luz emitida para cada intensidade a aplicar; 2) usar um projector com uma fonte de luz e o respectivo controlo electrónico de forma a que o espectro seja constante. O projector deverá ainda garantir que haja a ausência de flutuações de alta frequência na intensidade de luz, causadoras de interferências substanciais na medição da emissão de fluorescência. Neste contexto, projectores utilizando a tecnologia LCD são preferíveis, relativamente a projectores utilizando a tecnologia DLP.

Características técnicas do fluorómetro de pulso modulado de imagem 0 fluorómetro apresenta uma câmara com capacidade para detectar a emissão de fluorescência da clorofila a em todas as ALA projectadas na(s) amostra(s). 0 fluorómetro utilizado apresenta igualmente um controlo por 'software' com capacidade de definição de 'áreas de interesse' correspondentes às ALA projectadas na(s) amostra(s) e a possibilidade de análise da cinética da emissão através do registo contínuo do sinal de fluorescência antes e durante a aplicação dos pulsos saturantes.

Desenho da máscara de luz. 0 desenho da máscara de luz deve obedecer a um compromisso entre: - Dimensão, em que uma menor área corresponde a um campo de luz mais homogéneo e uma maior área permite acomodar um maior número de ALAs; - Número de ALAs, em que um número maior permite aplicar mais níveis de intensidade luminosa, i.e. mais pontos na curva de resposta à luz, mas um número demasiado elevado pode causar que as medições não sejam independentes. A máscara de luz deve ainda compreender uma dimensão e forma das ALAs, em que uma maior dimensão permite um maior número de pixéis e menor variabilidade nas medições. Menor dimensão permite acomodar mais ALAs numa máscara de luz. Tanto o número como a dimensão das ALAs pode ser determinado à partida pelo tipo de amostra a utilizar. Por exemplo, no caso particular de se utilizarem amostras em placas multipoços, estes parâmetros são definidos pelo número e dimensão dos poços.

Posicionamento relativo dos diversos componentes do sistema de medição.

Para que o método seja aplicado de forma totalmente eficiente é necessário que sejam respeitadas as seguintes condições: - A projecção de máscara de luz não deve interferir com a exposição da(s) amostra(s) à luz de medição e aos pulsos saturantes, pelo que o projector deve ser posicionado de forma a não obstruir as outras fontes de luz, como ilustrado na Fig. 1, mas o mais perto da amostra possível de forma a maximizar a intensidade de luz passível de ser proj ectada; - A máscara de luz deve ser projectada no centro do campo de visão da câmara do fluorómetro; - É necessário que a imagem projectada seja focada no plano da amostra, pelo que pode ser necessário utilizar uma lente de focagem;

Considerando a câmara do fluorómetro posicionada verticalmente sobre a amostra, o ângulo entre o feixe de luz projectada e a vertical deve ser o menor possível, preferencialmente inferior a 10°, de forma a minimizar assimetrias no campo de luz projectado.

Exemplos de aplicação O sistema e método agora divulgado é especialmente útil, embora não limitado a, quando utilizado em: - Avaliação do estado fisiológico de plantas, algas ou quaisquer outros organismos fotossintéticos;

Previsão da variação da eficiência fotossintética em diferentes condições de iluminação de plantas ou algas a crescer em condições controladas;

Identificação e selecção de variedades de plantas ou algas com melhor eficiência fotossintética;

Detecção e quantificação de efeitos de tóxicos na actividade fotossintética de plantas ou algas.

Referências HENDRIK J. [NL] ; VAN DER SCHOOR, R. et al. 2006. “Method and a device for making images of the quantum efficiency of the photosynthetic system with the purpose of determining the quality of plant material and a method and a device for measuring, classifying and sorting plant material", US2006102851 (Al) - 2006-05-18 HENDRIK J.[NL]; VAN DER SCHOOR, R. et al. 2012. "METHOD AND DEVICE FOR DETERMINING PLANT MATERIAL QUALITY USING IMAGES CONTAINING INFORMATION ABOUT THE QUANTUM EFFICIENCY AND THE TIME RESPONSE OF THE PHOTOSYNTHTIC SYSTEM", US2012018356 (Al) - 2012-01-26

Schreiber, U., Schliwa, U., & Bilger, W. 1986. Continuous recording of photochemical and nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynthesis Research 10:51-62. SCHREIBER, U; SCHLIWA, U. 1986. "Pulse-based fluorometer". DE3518527 (Al).

Serôdio, J., J. Lavaud. 2011. A model for describing the light response of the nonphotochemical quenching of chlorophyll fluorescence. Photosynthesis Research 108:61-76.

Serôdio, J., S. Vieira, S. Cruz, H. Coelho. 2006. Rapid light-response curves of chlorophyll fluorescence in microalgae: relationship to steady-state light curves and non-photochemical quenching in benthic diatom-dominated assemblages. Photosynthesis Research 90: 29-43 ZHIGUO, H.; JING H.; QUN G. 2012. "Method for confirming actinic light intensity in chlorophyll fluorescence induction curve measurement", CN102435590 (A) — 2012-05-02 A presente realização não é, naturalmente, de modo algum restrita às realizações descritas neste documento e uma pessoa com conhecimentos médios da área poderá prever muitas possibilidades de modificação da mesma sem se afastar da ideia geral, tal como definido nas reivindicações.

As realizações preferenciais acima descritas são obviamente combináveis entre si. As seguintes reivindicações definem adicionalmente realizações preferenciais.

Lisboa, 30 de Junho de 2014

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Sistema para a medição da resposta da emissão in vivo da fluorescência da clorofila a a variações da intensidade ou da luz caracterizado por compreender: - projector digital; - fluorómetro de pulso modulado; - fontes de luz de medição e pulso saturante separados espacialmente, de diferente intensidade; - amostra.
2. Sistema de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por compreender adicionalmente uma lente de focagem.
3. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o projector digital apresentar uma intensidade de luz até 10 ymol rrf2 s-1.
4. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o projector digital apresentar valores de intensidade de luz saturantes da fotossintese compreendidos entre 1000 e 2000 ymol m“2 s~ 1
5. Sistema de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fluorómetro de pulso modulado apresentar uma câmara com capacidade para detectar a emissão de fluorescência da clorofila a em todas as áreas de luz actinica projectadas.
6. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o projector se encontrar localizado num ponto onde não ocorra obstrução de outras fontes de luz.
7. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o ângulo entre o feixe de luz projectada e a vertical ser inferior a 10°.
8. Método de medição utilizando o sistema descrito na reivindicação anterior, caracterizado por compreender os seguintes passos: - desenho da máscara de luz com n°, dimensão e formas de áreas de luz actínica pretendidas; - colocação da amostra na zona de medição, directamente sob a câmara do fluorómetro de imagem; - ligação do fluorómetro de imagem, fazendo incidir a luz de medição na amostra; - projecção nas amostras da máscara de luz constituída pelas áreas de luz actínica previamente definidas, durante o tempo necessário até se atingir um estado estacionário da emissão de fluorescência; - aplicação de um pulso saturante e registo da cinética da emissão de fluorescência durante um período antecedendo o pulso saturante, cerca de 1 a 2 segundos antes do referido pulso, e durante a aplicação do pulso saturante; - preparação e análise dos dados obtidos, utilizando o software do fluorómetro de imagem ou outro que permita manipulação das imagens de fluorescência obtidas, definir Áreas de Interesse correspondentes a cada área de luz actínica projectada; - em cada Área de Interesse, medição da intensidade da emissão da fluorescência da clorofila a e cálculo dos índices de interesse; - construção da curva de resposta à luz, relacionando os níveis de fluorescência medidos em cada área de interesse com a intensidade da luz actínica aplicada.
9. Utilização do sistema descrito nas reivindicações 1 a 6 caracterizado por ser utilização na avaliação do estado fisiológico de organismos fotossintéticos, previsão da variação da eficiência fotossintética em diferentes condições de iluminação de plantas ou algas a crescer em condições controladas, identificação e selecção de variedades de plantas ou algas com melhor eficiência fotossintética, detecção e quantificação de efeitos de tóxicos na actividade fotossintética de plantas ou algas. Lisboa, 30 de Junho de 2014