PT105345A

PT105345A - METHOD FOR DETECTION AND CONTROL OF FUNGAL INFECTION IN FLAXY PLANTS USING TOMOGRAPHIC IMAGIOLOGY

Info

Publication number: PT105345A
Application number: PT10534510A
Authority: PT
Inventors: Sara Alexandra Valadas Da Silva Monteiro; Nuno Miguel Pereira De Almeida Gomes; Ricardo Manuel De Seixas Boavida Ferreira; Maria Helena Mendes Da Costa Ferreira Cor Oliveira; Ana Teresa De Almeida Vaz
Original assignee: Exatronic Engenharia Electronica Lda; Inst Superior Agronomia
Priority date: 2010-10-21
Filing date: 2010-10-21
Publication date: 2012-04-23

Abstract

SÃO DIVULGADOS MÉTODOS PARA A DETECÇÃO DE INFECÇÃO FÚNGICA NUM ESTÁDIO PRECOCE (E ESPECIALMENTE INJECÇÕES DE ESCA OU DO TIPO ESCA) EM PLANTAS LENHOSAS, UTILIZANDO IMAGIOLOGIA TOMOGRÁFICA. EM CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS, EMPREGA-SE TOMOGRAFIA AXIAL DE RAIOS-X, EM QUE REGIÕES RADIODENSAS DOS TOMOGRAMAS INDICAM A LOCALIZAÇÃO DESTA INFECÇÃO. OS MÉTODOS SÃO PARTICULARMENTE RELEVANTES PARA A DETECÇÃO DE ESCA NA VIDEIRA E NO KIWI. SÃO IGUALMENTE DIVULGADOS MÉTODOS PARA O CONTROLO DESTAS INFECÇÕES UTILIZANDO ESTES MÉTODOS TOMOGRÁFICOS E A INTRODUÇÃO DIRECTA DE FUNGICIDAS.METHODS FOR THE DETECTION OF FUNGAL INFECTION IN AN EARLY STADIUM (AND ESPECIALLY ESCA AND ESCA-TYPE INJECTIONS) ARE DISCLOSED ON FLAXY PLANTS, USING TOMOGRAPHIC IMAGIOLOGY. In preferred embodiments, AXIAL TOMOGRAPHY OF X-RAYS IS EMPLOYED, IN WHICH RADIODESE REGIONS OF THE TOMOGRAMS INDICATE THE LOCATION OF THIS INFECTION. METHODS ARE PARTICULARLY RELEVANT TO ESCA DETECTION IN VINE AND KIWI. METHODS FOR CONTROL OF THESE INFECTIONS USING THESE TOMOGRAPHIC METHODS AND THE DIRECT INTRODUCTION OF FUNGICIDES ARE ALSO DISCLOSED.

Description

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DESCRIÇÃO "Método para detecção e controlo de infecção fúngica em plantas lenhosas utilizando imagiologia tomográfica"Method for detecting and controlling fungal infection in woody plants using tomographic imaging "

Campo da Invenção A invenção refere-se ao diagnóstico e ao tratamento de infecções fúngicas de plantas lenhosas, especialmente de plantas do género Vitis, Actinidia e Citrus e seus hibridos, e especialmente infecções fúngicas compreendendo Esca, Black Dead Arm (fungos Botryosphaeriaceae), ou infecções do tipo Esca, ou infecções com Eutypa lata.Field of the Invention The invention relates to the diagnosis and treatment of fungal infections of woody plants, especially plants of the genus Vitis, Actinidia and Citrus and their hybrids, and especially fungal infections comprising Esca, Black Dead Arm (Botryosphaeriaceae fungi), or Esca-type infections, or infections with Eutypa lata.

Antecedentes e Anterioridade Conhecida dos RequerentesBackground and Known Priority of Applicants

As doenças da madeira causadas por fungos são presentemente a mais grave ameaça à esperança de vida de árvores de fruto comerciais e videiras em todo o mundo. Colocam em risco a rentabilidade e a produção sustentada diminuindo o rendimento e a qualidade dos frutos, principalmente por indução de declínio e morte de plantas infectadas. As espécies chave afectadas por estas doenças incluem a videira (Vitis spp. e os seus híbridos), fruto do kiwi (Actinidia spp. e seus híbridos), embora esteja cada vez mais reconhecido que doenças similares afectam muitos outros hospedeiros, como será discutido adiante.Wood diseases caused by fungi are presently the most serious threat to the life expectancy of commercial fruit trees and vines worldwide. They jeopardize profitability and sustainable production by lowering yield and fruit quality, mainly by inducing decline and death of infected plants. Key species affected by these diseases include vines (Vitis spp. And their hybrids), the fruit of kiwifruit (Actinidia spp. And its hybrids), although it is increasingly recognized that similar diseases affect many other hosts, as will be discussed below .

Na videira (Vitis spp. e seus híbridos), a esca, a doença de Petri, a eutipiose e a Black Dead Arm (BDA) são as principais doenças do lenho que induzem este declínio e morte das videiras (Luque et ai., 2009, "Symptoms and fungi associated with declining mature grapevine plants in northeast Spain", Journal of Plant Pathology 91, 381-390). Como não se encontram disponíveis medidas de controlo eficazes contra estas doenças, elas estão a afectar drasticamente a durabilidade do património vitícola (Larignon et ai., 2009, "Esca et Black Dead Arm: deux acteurs majeurs des maladies du bois chez la vigne", Comptes Rendus Biologies 332, 765-783.). A esca é uma doença complexa do lenho da videira que está a alcançar uma importância mundial crescente e sem 2 precedentes. Inicialmente pensando-se que afectava somente videira madura, a doença encontra-se hoje em níveis elevados em plantas muito mais jovens. Está aceite que a esca compreende várias doenças distintas e que os principais agentes causais (na sua maioria fungos vasculares) invadem as vinhas não apenas através de feridas no campo mas também como resultado de práticas nos viveiros. Quando a infecção se inicia no viveiro, as plantas podem desenvolver diferentes doenças, variando desde o declínio de Petri (também conhecido como "black goo") até à esca completamente desenvolvida, com ou sem declínio branco dos tecidos lenhosos. A esca é causada pela presença de pelo menos três fungos, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum e Fomitiporia mediterrânea, que actuam individualmente, em combinação ou em sucessão. Os dois primeiros fungos são responsáveis por necroses vasculares, que surgem na forma de estrias escuras no lenho, por vezes com algumas áreas de necroses escuras e duras, enquanto o F. mediterrânea (e/ou outros basidiomicetes que apodrecem o lenho) induz podridão branca, ou "amadou".In the grapevine (Vitis spp. And its hybrids), esca, Petri disease, etymiosis and Black Dead Arm (BDA) are the major wood diseases that induce this decline and death of vines (Luque et al., 2009 , " Symptoms and fungi associated with declining mature grapevine plants in northeast Spain ", Journal of Plant Pathology 91, 381-390). As effective control measures against these diseases are not available, they are drastically affecting the durability of the vineyard heritage (Larignon et al., 2009, " Esca et Black Dead Arm: deux acteurs majeurs des bois chez la vigne " , Comptes Rendus Biologies 332, 765-783.). Esca is a complex disease of the vine's wood which is reaching increasing and unprecedented world importance. Initially thinking that it only affected mature vine, the disease today stands at high levels in much younger plants. It is accepted that esca comprises several distinct diseases and that the major causative agents (mostly vascular fungi) invade the vines not only through field wounds but also as a result of practices in the nurseries. When infection starts in the nursery, the plants can develop different diseases, ranging from the decline of Petri (also known as "black goo") to the fully developed stage, with or without white decline of the woody tissues. Esca is caused by the presence of at least three fungi, Phaeomoniella chlamydospora, Phaeoacremonium aleophilum and Fomitiporia mediterrânea, which act individually, in combination or in succession. The first two fungi are responsible for vascular necrosis, which arise in the form of dark striations in the wood, sometimes with some areas of dark and hard necroses, while Mediterranean F. (and / or other basidiomycetes that rot the wood) induces white rot , or " amadou ".

Contudo, o padrão de sintomas e o despoletar inicial da sua expressão são altamente variáveis: plantas gravemente infectadas podem permanecer assintomáticas em anos sucessivos durante vários anos sem sintomas visíveis (folha) de esca (esca “escondida") . Este padrão intermitente de expressão de sintomas faz com que as plantas infectadas sejam indistinguíveis das saudáveis. É de importância fundamental assegurar a propagação saudável da videira no viveiro, onde somente material sem estrias no lenho deverá ser seleccionado. Uma vez plantado na vinha, o material de propagação infectado desenvolve declínio ou doença de Petri, também caracterizado por estrias escuras no lenho, declínio apical lento ("dieback") e "black goo". Como estes fungos crescem no interior do lenho do tronco e grandes ramos lenhosos, não se consegue atingi-los através de pulverização foliar com fungicidas. 0 melhor remédio é ainda arrancar a videira infectada e queimá-la. 3 0 maior problema da esca deriva dos seus estádios iniciais: as plantas são usualmente externamente assintomáticas, embora ocasionalmente possam estar presentes corpos de frutificação e esporos. Contudo, são capazes de disseminar a doença através da prática vitícola comum, tal como a poda. Por outras palavras, uma máquina vitícola típica pode passar a doença de uma videira infectada, mas assintomática, para as seguintes. Os esporos são também disseminados pelo vento e pela chuva. Assim, embora os utensílios de poda e o equipamento vitícola especializado não sejam importantes na disseminação de esporos, podem desempenhar um papel na disseminação de micélios fúngicos de plantas doentes para as saudáveis. Contudo, no que se refere à disseminação e penetração de esporos, as feridas de poda e outras feridas causadas pelo equipamento vitícola especializado são particularmente importantes. Por todas estas razões, é de importância fundamental desenvolver metodologias capazes de um rastreio e uma detecção não destrutivos dos estádios iniciais de esca, quer nos viveiros quer nas vinhas. São igualmente necessárias estratégias e métodos melhorados para o tratamento destas infecções fúngicas num estádio precoce enquanto a erradicação da doença é ainda possível.However, the pattern of symptoms and the initial triggering of its expression are highly variable: severely infected plants can remain asymptomatic in successive years for several years without visible symptoms (leaf) of esca ("hidden"). This intermittent pattern of symptom expression makes the infected plants indistinguishable from healthy plants. It is of fundamental importance to ensure the healthy propagation of the vine in the nursery where only streakless material in the wood should be selected. Once planted in the vine, infected propagating material develops decline or Petri disease, also characterized by dark streaks in the wood, slow apical decline (" dieback ") and " black goo ". As these fungi grow inside the wood of the trunk and large woody branches, they can not be reached by foliar spraying with fungicides. The best remedy is still to pluck the infected vine and burn it. The major problem of esca derives from its initial stages: the plants are usually externally asymptomatic, although occasionally fruiting bodies and spores may be present. However, they are able to spread the disease through common viticultural practice, such as pruning. In other words, a typical wine-growing machine can pass disease from one infected but asymptomatic vine to the next. Spores are also spread by wind and rain. Thus, although pruning utensils and specialized viticultural equipment are not important in spreading spores, they may play a role in the spread of fungal mycelia from diseased to healthy plants. However, as regards the spread and penetration of spores, pruning wounds and other wounds caused by specialized viticultural equipment are particularly important. For all these reasons, it is of fundamental importance to develop methodologies capable of non-destructive screening and detection of the early stages of esca, both in nurseries and in vines. Improved strategies and methods are also necessary for the treatment of these fungal infections at an early stage while the eradication of the disease is still possible.

Outras espécies de plantas para além da videira podem também ser afectadas por doenças do tipo esca que afectam o lenho. Em 1999, notou-se um declínio lenhoso de plantações de kiwi (Actinidia) pela primeira vez em pomares italianos. Uma doença similar foi subsequentemente reportada na Grécia e na Nova Zelândia. Estas doenças foram descritas com os nomes de "tipo esca" em França e "Elefantíase" em Itália. A análise de pomares de kiwi que exibiam sintomas visuais de doença do tipo esca revelou a presença de dois tipos de necrose no lenho: a) declínio castanho, duro, com inicio nos tecidos medulares e expandindo-se gradualmente para todo o tronco ou ramos, e b) declínio branco e macio do tipo "madeira amadou" da videira. Isolamentos de partes necróticas de lenho revelaram vários fungos, incluindo Fomitiporia mediterrânea, Phaeoacremonium aleophilum, Phaeoacremonium parasiticum e Cadophora malorum. Pelo menos duas das espécies fúngicas anteriores (F. mediterrânea e P. aleophilum) estão também envolvidas na doença esca da videira, e pode colocar-se a 4 hipótese de haver aspectos em comum entre o declínio do kiwi e a esca da videira.Other plant species other than the vine may also be affected by sparse-type diseases affecting the wood. In 1999, a woody decline of kiwi plantations (Actinidia) was noticed for the first time in Italian orchards. A similar disease was subsequently reported in Greece and New Zealand. These diseases have been described as " type esca " in France and " Elephantiasis " in Italy. The analysis of kiwi orchards that showed visual symptoms of esca type disease revealed the presence of two types of necrosis in the wood: a) brown hard decline, beginning in the spinal tissues and gradually expanding to the whole trunk or branches, and b) white and soft decline of the type " wood amadou " of the vine. Isolates from necrotic woody parts have revealed several fungi, including Mediterranean Fomitiporia, Phaeoacremonium aleophilum, Phaeoacremonium parasiticum and Cadophora malorum. At least two of the previous fungal species (F. mediterrâneo and P. aleophilum) are also involved in the disease esca of the grapevine, and there may be four hypotheses that there are aspects in common between the decline of the kiwi and the grapevine.

Espécies de Citrus (tais como a laranja de umbigo cv. Washington, limão e a tangerina comum enxertada sobre laranja azeda) estão a experimentar um grave declínio causado por F. mediterrânea, em pomares do sul da Grécia. As árvores afectadas exibem clorose foliar, desfoliação, e morte de brotos e ramos. Cortes transversais dos troncos e grandes ramos revelam uma podridão de cor clara no centro, que é rodeada por lenho necrótico castanho duro. Os sintomas começam a partir de feridas de poda e estendem-se até ao lenho dos porta-enxertos, assemelhando-se aos sintomas de lenhos com esca da videira.Citrus species (such as Washington navel orange, lemon and common tangerine grafted on sour orange) are experiencing a severe decline caused by F. mediterranus in orchards in southern Greece. The affected trees exhibit foliar chlorosis, defoliation, and death of shoots and branches. Transverse cuts of the trunks and large branches reveal a light-colored rot in the center, which is surrounded by hard brown necrotic wood. Symptoms begin with pruning wounds and extend to the rootstocks' wood, resembling the symptoms of woody leaves.

Tal como na videira, no kiwi e nos citrinos, as doenças do tipo esca também foram identificadas em várias outras espécies. 0 Phaeoacremonium aleophilum foi reportado em espécies de Prunus apresentando sintomas de declínio no Western Cape, África do Sul. Graves sintomas de declínio, causados por Pm. parasiticum, foram observados em cerejeiras na Grécia. Mostrou-se que o Phaeoacremonium mortoniae causa coloração castanha no lenho de Fraxinus pennsylvanica e Salix spp.Like vine, kiwi and citrus, esca-type diseases have also been identified in several other species. Phaeoacremonium aleophilum was reported in Prunus species exhibiting symptoms of decline in the Western Cape, South Africa. Severe decline symptoms, caused by Pm. parasiticum, were observed in cherry trees in Greece. It has been shown that Phaeoacremonium mortoniae causes brown coloration in the wood of Fraxinus pennsylvanica and Salix spp.

Um dos agentes causais chave, o Fomitiporia mediterrânea, é também encontrado em Corylus avellinus, Olea europaea, Lagerstroemia indica, Actinidia sinensis, Acer negundo, Olea europaea, Quercus sp., Quercus ilex, Ligustrum vulgare e Robinia pseudoacacia.One of the key causal agents, Mediterranean Fomitiporia, is also found in Corylus avellinus, Olea europaea, Lagerstroemia indica, Actinidia sinensis, Acer negundo, Olea europaea, Quercus sp., Quercus ilex, Ligustrum vulgare and Robinia pseudoacacia.

Uma outra doença de plantas, e que similarmente afecta espécies lenhosas, é a Eutipiose, também conhecida como "Eutypa dieback", é causada pelo fungo Eutypa lata. 0 E. lata é um patogénio vascular e ocorre em pelo menos 88 espécies de dicotiledóneas lenhosas (Cárter, 1991. "The status of Eutypa lata as pathogen", Phytopathological Paper 32) e é responsável por prejuízos económicos significativos principalmente na vinha e no damasco.Another plant disease, and which similarly affects woody species, is the Eurypia, also known as " Eutypa dieback ", is caused by the fungus Eutypa lata. E. lata is a vascular pathogen and occurs in at least 88 species of woody dicotyledons (Carter, 1991. " The status of Eutypa lata pathogen ", Phytopathological Paper 32) and is responsible for significant economic losses mainly in vines and Damascus.

Muitas espécies florestais e ornamentais são também hospedeiros do patogénio, mas não é certo se todos os isolados 5 são patogénicos, embora a patogenicidade de E. lata tenha sido confirmada na videira, no damasqueiro, na cerejeira (Prunus avium L.) , cerejeira da Virgínia (Prunus virginiana L. var. demissa), ginjeira (Prunus cerasus L.), amendoeira (Prunus dulcis), macieira (Malus domestica Borkh.), pereira (Pyrus communis L.), nogueira (Juglans regia L.), oliveira (Olea europaea L.), e Ceanothus L. spp.Many forest and ornamental species are also hosts of the pathogen, but it is not certain whether all 5 isolates are pathogenic, although the pathogenicity of E. lata has been confirmed in the vine, apricot, cherry (Prunus avium L.), cherry (Prunus cerasus L.), almond (Prunus dulcis), apple tree (Malus domestica Borkh.), Pear (Pyrus communis L.), walnut (Juglans regia L.), olive tree (Prunus virginiana L. var. (Olea europaea L.), and Ceanothus L. spp.

Na videira, o sintoma mais reconhecido da eutipiose é a aparência atrofiada de rebentos no início da estação de crescimento, com folhas pequenas, cloróticas e distorcidas, e entre-nós curtos. Contudo, a expressão sintomática flutua marcadamente de ano para ano. Técnicas não destrutivas para o diagnóstico de eutipiose ainda não estão disponíveis. Adicionalmente, não está disponível nenhum tratamento eficiente, e as plantas infectadas morrerão em poucos anos.In the vine, the most recognized symptom of eutipiosis is the atrophied appearance of shoots at the beginning of the growing season, with small, chlorotic and distorted leaves, and short inter-nodes. However, the symptomatic expression fluctuates markedly from year to year. Non-destructive techniques for the diagnosis of eutipiosis are not yet available. In addition, no effective treatment is available, and infected plants will die within a few years.

Uma outra doença preocupante, especialmente na videira (Vitis) está associada com a infecção por fungos Botryosphaeriaceae. Estes apresentam uma ampla distribuição e estão vulgarmente associados com declínio ("dieback”) e cancros de plantas hospedeiras lenhosas e não lenhosas, incluindo árvores florestais, e.g. Pinus spp., Eucalyptus spp., Quercus spp., Olea, árvores de fruto de caroço, Protea e videira.Another worrying disease, especially in grapevine (Vitis) is associated with fungal infection Botryosphaeriaceae. These have a broad distribution and are commonly associated with "dieback" and cancers of woody and non-woody host plants, including forest trees, eg Pinus spp., Eucalyptus spp., Quercus spp., Olea, lump, Protea and vine.

Na videira, várias espécies de Botryosphaeriaceae estão associadas com necrose do lenho e são também capazes de infectar tecidos jovens e maduros assim como rebentos verdes causando cancros, descoloração vascular e/ou outro estriamento negro do lenho.In the vine, several species of Botryosphaeriaceae are associated with wood necrosis and are also capable of infecting young and mature tissues as well as green shoots causing cancers, vascular discoloration and / or other black striations of the wood.

Algumas espécies de Botryosphaericaeae são responsáveis pela doença "Black Dead Arm" (BDA) , em que os sintomas no lenho incluem necroses em forma de V, similares aos causados por Eutypa lata, e estrias castanhas longitudinais ao longo dos tecidos afectados. São frequentemente observados outros sintomas semelhantes aos da eutipiose, tais como rebentos cloróticos atrofiados, folhas deformadas com áreas necróticas.Some species of Botryosphaericaeae are responsible for the disease " Black Dead Arm " (BDA), wherein the symptoms in the wood include V-shaped necroses, similar to those caused by Eutypa lata, and longitudinal brown streaks along the affected tissues. Other symptoms are similar to those of eutipiosis, such as atrophied chlorotic shoots, deformed leaves with necrotic areas.

Entender-se-á que todas estas doenças partilham características comuns: (1) são predominantemente doenças de 6 plantas lenhosas, e especialmente plantas lenhosas portadoras de frutos de importância comercial; (2) são de origem fúngica, e (3) os patogénios invariavelmente colonizam a vasculatura da planta, especialmente o xilema. Adicionalmente, como (4) os sintomas da doença estão frequentemente localizados - pelo menos nos estádios iniciais - no interior das partes lenhosas da planta, é dificil um diagnóstico não invasivo das condições, se não impossível. Em adição, uma vez detectada (5), é difícil o tratamento da doença, porque a internalização da infecção fúngica torna-a muito pouco susceptível à aplicação externa de fungicidas.It will be understood that all these diseases share common characteristics: (1) predominantly diseases of 6 woody plants, and especially woody plants bearing fruit of commercial importance; (2) are of fungal origin, and (3) pathogens invariably colonize the plant vasculature, especially the xylem. In addition, since (4) the symptoms of the disease are often located - at least in the early stages - within the woody parts of the plant, a noninvasive diagnosis of the conditions is difficult, if not impossible. In addition, once detected (5), the treatment of the disease is difficult because the internalization of the fungal infection makes it very unlikely to be applied externally by fungicides.

No contexto mais amplo das doenças das partes lenhosas de plantas com importância comercial, um dos maiores problemas que enfrenta a agricultura é a luta contra patogénios e insectos que se desenvolvem no interior do lenho e portanto numa localização que os fungicidas/insecticidas convencionais não atingem. Tem portanto grande importância desenvolver métodos para detectar a existência, e a localização, no interior de plantas infectadas, de doenças do lenho durante as fases iniciais, mas assintomáticas e contagiosas, da infecção (e assim, durante uma fase potencialmente tratável) e desenvolver regimes de tratamento que sejam eficazes contra estas doenças.In the broader context of the diseases of woody parts of plants of commercial importance, one of the major problems facing agriculture is the fight against pathogens and insects that develop inside the wood and therefore in a location that the conventional fungicides / insecticides do not reach. It is therefore of great importance to develop methods for detecting the existence and location, within infected plants, of diseases of the wood during the initial but asymptomatic and contagious stages of infection (and thus during a potentially treatable phase) and to develop regimens that are effective against these diseases.

Está entre os objectos da presente invenção abordar estes problemas.It is among the objects of the present invention to address these problems.

Sumário da InvençãoSummary of the Invention

Deste modo, os inventores proporcionam um método de detecção de infecção fúngica em plantas lenhosas compreendendo a utilização de imagiologia tomográfica. Estão disponíveis uma ampla gama de metodologias de imagiologia tomográfica, incluindo raios-x, PET (tomografia por emissão de positrões), tomografia de resistência eléctrica e tomografia acústica (incluindo ultra-sónica). Os inventores verificaram que a utilização de técnicas tomográficas permite que plantas externamente assintomáticas sejam diagnosticadas com uma ampla gama de infecções fúngicas. Embora a imagiologia tomográfica tenha sido utilizada para obter a imagem de podridão em madeira causada por declínio fúngico do material lenhoso 7 morto, e também os estádios tardios de podridão em áreas mortas de material lenhoso nos troncos de árvores em desenvolvimento, em contraste, a presente invenção refere-se à detecção precoce de infecção fúngica em plantas vias, em desenvolvimento, susceptiveis a esta infecção por patogénios fúngicos de plantas.Accordingly, the inventors provide a method of detecting fungal infection in woody plants comprising the use of tomographic imaging. A wide range of tomographic imaging methodologies including x-rays, PET (positron emission tomography), electrical resistance tomography and acoustic tomography (including ultrasound) are available. The inventors have found that the use of tomography techniques allows externally asymptomatic plants to be diagnosed with a wide range of fungal infections. Although tomographic imaging has been used to obtain the image of wood rot caused by fungal decline of dead woody material 7, and also the late stages of rotting in dead areas of woody material in the trunks of developing trees, in contrast, the present invention relates to the early detection of fungal infection in developing plants susceptible to this infection by fungal pathogens of plants.

Desta maneira, o método proporciona a possibilidade de detectar uma infecção fúngica no interior de uma tal planta, num estádio onde é possível aplicar uma metodologia de tratamento num estádio precoce, i.e. onde é possível o tratamento. Se estas doenças não forem detectadas, e portanto não forem tratadas, a planta usualmente irá morrer, e será uma fonte de infecção que se pode espalhar para outras plantas.In this manner, the method provides the possibility of detecting a fungal infection within such a plant, in a stage where it is possible to apply a treatment methodology at an early stage, i.e. where treatment is possible. If these diseases are not detected, and therefore are not treated, the plant will usually die, and will be a source of infection that can spread to other plants.

Em concretizações particularmente preferidas da invenção a referida planta lenhosa é uma planta do género Vitis ou um seu híbrido, uma planta do género Actinidia ou um seu híbrido ou uma planta do género Citrus ou um seu híbrido.In particularly preferred embodiments of the invention said woody plant is a plant of the genus Vitis or a hybrid thereof, a plant of the genus Actinidia or a hybrid thereof or a plant of the genus Citrus or a hybrid thereof.

Em qualquer aspecto da invenção, é também preferido que a referida infecção fúngica seja uma infecção fúngica que causa acumulação ou modificação de fluido no xilema da referida planta. Este fluido, tal como o "black goo" observado na infecção de esca, conduz a uma resposta característica particular na imagem tomográfica, permitindo que seja diferenciada de outros aspectos internos tais como a podridão fúngica.In any aspect of the invention, it is also preferred that said fungal infection is a fungal infection which causes accumulation or modification of fluid in the xylem of said plant. This fluid, such as " black goo " observed in the esca infection, leads to a particular characteristic response in the tomographic image, allowing it to be differentiated from other internal aspects such as fungal rot.

Deste modo, é particularmente preferido que a referida infecção fúngica inclua Esca ou uma doença do tipo Esca.Accordingly, it is particularly preferred that said fungal infection includes Esca or a Esca-like disease.

Em outros aspectos preferidos da invenção a referida infecção fúngica compreende infecção com Eutypa lata, ou cancro associado a Botryosphaeria (ou genericamente infecção com fungos da família Botryosphaeriaceae), ou infecção com Phoma tracheiphila.In other preferred aspects of the invention said fungal infection comprises infection with Eutypa lata, or Cancer associated with Botryosphaeria (or generically infection with fungi of the family Botryosphaeriaceae), or infection with Phoma tracheiphila.

Em qualquer aspecto da invenção prefere-se particularmente que a referida imagiologia tomográfica compreenda tomografia de raios-x, e mais preferivelmente tomografia axial de raios-x. Foi mostrado pelos inventores que a tomografia de raios-x é particularmente eficaz na identificação de regiões de material da planta, especialmente regiões não visíveis no exterior da planta, que estão colonizadas por fungos patogénicos para a planta.In any aspect of the invention it is particularly preferred that said tomographic imaging comprises x-ray tomography, and more preferably x-ray axial tomography. It has been shown by the inventors that x-ray tomography is particularly effective in identifying regions of plant material, especially regions not visible on the outside of the plant, which are colonized by fungi pathogenic to the plant.

Em aspectos particularmente preferidos da invenção, os inventores proporcionam um destes métodos utilizando tomografia de raios-x, e especialmente tomografia axial de raios-x em que o referido método compreende os passos de: obtenção de uma imagem tomográfica de um caule da referida planta lenhosa, em que a referida imagem tomográfica compreende medições espacialmente distribuídas de radiodensidade; determinação da presença ou ausência de regiões no interior da referida imagem possuindo uma radiodensidade maior do que uma primeira radiodensidade predeterminada; sendo a presença destas regiões de elevada radiodensidade indicativa da presença da referida infecção fúngica.In particularly preferred aspects of the invention, the inventors provide one of these methods using x-ray tomography, and especially x-ray axial tomography, wherein said method comprises the steps of: obtaining a tomographic image of a stem of said woody plant , wherein said tomographic image comprises spatially distributed measurements of radiodensity; determining the presence or absence of regions within said image having a radiodensity greater than a first predetermined radiodensity; being the presence of these regions of high radiodensity indicative of the presence of said fungal infection.

Surpreendentemente, os inventores verificaram que estas imagens tomográficas de raios-x revelam regiões de material de plantas vivas que estão colonizadas por patogénios fúngicos e, especialmente no caso em que os patogénios fúngicos colonizam a vasculatura da planta com subsequente produção de fluido no interior da vasculatura ou modificação química de fluido no interior do xilema (e.g. por produção de material polifenólico ou gomas), isto é revelado por regiões de radiodensidade aumentada. Os patogénios fúngicos são propensos a produzir material radiodenso no interior da vasculatura (i.e., mais radiodenso do que o fluido usualmente encontrado e.g. no xilema da planta) que conduz a uma indicação positiva de uma tal infecção. Pelo contrário, a utilização anterior de tomografia de raios-x para obter imagens de declínio em madeira morta (e.g. em materiais de construção ou em árvores vivas em áreas urbanas) detecta a área de podridão na forma de regiões de radiodensidade muito baixa, de facto produzindo pouco ou nenhum sinal em comparação com o sinal produzido na ausência de madeira. Frequentemente não é possível, portanto, diferenciar a presença de declínio em madeira morta (e.g. por fungos de podridão mole) dos orifícios no interior da própria madeira. 9Surprisingly, the inventors have found that these tomographic x-ray images reveal regions of live plant material that are colonized by fungal pathogens and especially in the case where fungal pathogens colonize the plant vasculature with subsequent production of fluid within the vasculature or chemical modification of fluid within the xylem (eg by production of polyphenolic material or gums), i.e. revealed by regions of increased radiodensity. Fungal pathogens are prone to produce radiodense material within the vasculature (i.e., more radiodense than the fluid usually found e.g. in the plant xylem) leading to a positive indication of such infection. In contrast, previous use of x-ray tomography to obtain images of decline in dead wood (eg in construction materials or live trees in urban areas) detects the area of rot in the form of regions of very low radiodensity, de facto producing little or no signal compared to the signal produced in the absence of wood. It is often therefore not possible to differentiate the presence of decay in dead wood (e.g. by soft rot fungi) from the holes within the wood itself. 9

Nestes métodos, prefere-se particularmente que a referida primeira radiodensidade predeterminada seja a radiodensidade média de uma região correspondente numa planta de controlo não infectada. Deste modo, o método pode ser prontamente adaptado para aplicação numa gama de espécies lenhosas por calibração das imagens tomográficas contra imagens obtidas de plantas saudáveis.In these methods, it is particularly preferred that said first predetermined radiodensity is the average radiodensity of a corresponding region in an uninfected control plant. Thus, the method can be readily adapted for application in a range of woody species by calibration of tomographic images against images obtained from healthy plants.

Preferivelmente, em qualquer destes métodos, e especialmente no caso da videira, a referida primeira radiodensidade predeterminada compreende 100, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 unidades Hounsfield.Preferably, in any of these methods, and especially in the case of the vine, said first predetermined radiodensity comprises 100, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, or 200 Hounsfield units.

As unidades Hounsfield são bem conhecidas no campo da tomografia de raios-x, e são uma transformação linear do coeficiente de rádio-atenuação no interior do material, uma escala relativa à atenuação correspondente no ar e na água, como se segue: R = 1000* (μχ - pw)/(p« - Pa) onde: R é a radiodensidade em Unidades Hounsfield px é o coeficiente de atenuação linear na amostra pw é o coeficiente de atenuação linear da água pa é o coeficiente de atenuação linear do arHounsfield units are well known in the field of x-ray tomography, and are a linear transformation of the radio-attenuation coefficient within the material, a scale relative to the corresponding attenuation in air and water, as follows: R = 1000 where: R is the radiodensity in units Hounsfield px is the linear attenuation coefficient in the sample pw is the linear attenuation coefficient of the water pa is the coefficient of linear attenuation of the air

Noutras concretizações preferidas, os inventores proporcionam um destes métodos compreendendo adicionalmente o passo de: determinação da presença ou ausência de regiões no interior da referida imagem possuindo uma radiodensidade inferior a uma segunda radiodensidade predeterminada; sendo a presença de ambas estas regiões, de radiodensidade alta e baixa, indicativas da presença de um estádio avançado da referida infecção fúngica. Preferivelmente, a referida segunda radiodensidade predeterminada compreende -200, -300, -400, -500, -600, -700, ou -800 unidades Hounsfield.In other preferred embodiments, the inventors provide one of these methods further comprising the step of: determining the presence or absence of regions within said image having a radiodensity less than a second predetermined radiodensity; being the presence of both these regions, high and low radiodensity, indicative of the presence of an advanced stage of said fungal infection. Preferably, said second predetermined radiodensity comprises -200, -300, -400, -500, -600, -700, or -800 Hounsfield units.

Este método é particularmente aplicável a infecções fúngicas como esca ou infecções do tipo esca onde a acumulação de material radiodenso na vasculatura da planta é seguida, durante o desenvolvimento da infecção, pelo surgimento de regiões de podridão de tecido morto no interior da estrutura 10 da planta, tais como as referidas como "Amadou" na esca na videira. Desta maneira, a presença de ambas as regiões, de relativamente alta e relativamente baixa radiodensidades, pode detectar um estádio particularmente avançado de uma tal infecção fúngica. Isto pode ajudar na decisão relativamente às medidas reparadoras a tomar, tal como tratamento da planta infectada, ou uma decisão de arrancar e substituir a planta. A disponibilidade destes métodos para diagnosticar estas doenças devastadoras em espécies comercialmente importantes leva os inventores a serem capazes de proporcionar estratégias e métodos até agora indisponíveis para a gestão destas doenças em espécies lenhosas.This method is particularly applicable to fungal infections such as esca or esca type infections where the accumulation of radiodense material in the plant vasculature is followed during the development of infection by the emergence of dead tissue rot regions within plant structure 10 , such as those referred to as " Amadou " on the vine. In this way, the presence of both relatively high and relatively low radiodensities can detect a particularly advanced stage of such a fungal infection. This can help in deciding on remedial measures to take, such as treatment of the infected plant, or a decision to tear and replace the plant. The availability of these methods to diagnose these devastating diseases in commercially important species causes the inventors to be able to provide strategies and methods hitherto unavailable for the management of these diseases in woody species.

Deste modo, os inventores proporcionam um método de controlo de infecção fúngica em plantas lenhosas compreendendo os passos de: determinação da presença ou ausência da referida infecção fúngica utilizando um método de acordo com qualquer dos métodos aqui divulgados; e tratamento da referida planta lenhosa com um fungicida, e preferivelmente um fungicida sistémico se a referida infecção fúngica for detectada.Accordingly, the inventors provide a method of controlling fungal infection in woody plants comprising the steps of: determining the presence or absence of said fungal infection using a method according to any of the methods disclosed herein; and treating said woody plant with a fungicide, and preferably a systemic fungicide if said fungal infection is detected.

Em qualquer aspecto da invenção, estão contemplados uma gama de fungicidas, e podem ser seleccionados pelos peritos destinatários com base na sua eficácia contra o patogénio fúngico particular a tratar. Entre as famílias de fungicidas disponíveis ao perito destinatário encontram-se produtos à base de cobre; Anilinopirimidinas, Azoles e não Azoles (inibidores da biossíntese de ergosterol); Carboxamidas; Fenilpirroles; Fosfonatos; piridiniletilbenzamidas e Qol Estrobilurinas.In any aspect of the invention, a range of fungicides are contemplated, and may be selected by the skilled artisan on the basis of its efficacy against the particular fungal pathogen to be treated. Among the families of fungicides available to the recipient expert are copper-based products; Anilinopyrimidines, Azoles and non Azoles (inhibitors of ergosterol biosynthesis); Carboxamides; Phenylpyrroles; Phosphonates; pyridinylethylbenzamides and Qol Strobilurins.

Os exemplos particulares destes fungicidas incluem ciprodinil, fludioxonil, piraclostrobina, boscalide e suas misturas (ciprodinil+fludioxonil e piraclostrobina+boscalide), tebuconazole, fosfonatos.Particular examples of these fungicides include cyprodinil, fludioxonil, pyraclostrobin, boscalide and mixtures thereof (cyprodinil + fludioxonil and pyraclostrobin + boscalide), tebuconazole, phosphonates.

Existem também outros compostos possuindo actividade fungicida, mas não especificamente registados como fungicidas, tais como: bicarbonato de sódio (NaHCCn) e bicarbonato de potássio (KHCO3) e dióxido de hidrogénio (peróxido de hidrogénio). 11There are also other compounds having fungicidal activity, but not specifically registered as fungicides, such as: sodium bicarbonate (NaHCO3) and potassium bicarbonate (KHCO3) and hydrogen peroxide (hydrogen peroxide). 11

Os fungicidas possuindo actividade promotora do crescimento de plantas são particularmente preferidos, tais como o Blad. O Blad é um polipéptido que pode ser extraído dos cotilédones de Lupinus albus, ou pode ser produzido por utilização de tecnologias de ADN recombinante. São apresentados detalhes do Blad no Pedido Internacional de Patente co-pendente W02007010459.Fungicides having plant growth promoting activity are particularly preferred, such as Blad. Blad is a polypeptide that can be extracted from cotyledons of Lupinus albus, or can be produced using recombinant DNA technologies. Blad details are shown in co-pending co-pending International Patent Application W02007010459.

Fungicidas com uma actividade indutora das defesas do hospedeiro, tais como quitosano, são também particularmente preferidos.Fungicides with a host defense-inducing activity, such as chitosan, are also particularly preferred.

Igualmente, são particularmente preferidos fungicidas possuindo uma actividade indutora das defesas do hospedeiro, em adição a alguns efeitos directos sobre os fungos, tais como ácido hialurónico (um eliciador para indução de resistência sistémica. Veja-se World J Microbiol Biotechnol (2008) 24:1153-1158) ou acibenzolar-S-metilo.Also, particularly preferred are fungicides having a host defense-inducing activity, in addition to some direct effects on fungi, such as hyaluronic acid (an elicitor for induction of systemic resistance. See World J Microbiol Biotechnol (2008) 24: 1153-1158) or acibenzolar-S-methyl.

Preferivelmente, o referido fungicida é injectado na referida planta. Por "injectado", entenda-se que este fungicida é introduzido directamente na região interna da planta onde a imagiologia tomográfica detectou a infecção fúngica. Assim como literalmente injectar este fungicida, podem ser empregues outros meios, tais como perfurar um orifício no caule ou no tronco da planta, e dispensar aí o fungicida. Um tampão de libertação lenta do fungicida é contemplado e considerado como particularmente vantajoso.Preferably, said fungicide is injected into said plant. By " injected ", it is meant that this fungicide is introduced directly into the internal region of the plant where the tomographic imaging has detected the fungal infection. As well as literally injecting this fungicide, other means may be employed, such as drilling a hole in the stem or trunk of the plant, and dispensing therein the fungicide. A slow release buffer of the fungicide is contemplated and considered to be particularly advantageous.

Em concretizações particularmente preferidas da invenção, a imagem tomográfica é utilizada para identificar a região da planta em que a infecção está localizada (pelas reqiões de relativamente alta radiodensidade), e o fungicida é introduzido directamente nestas regiões.In particularly preferred embodiments of the invention, the tomographic image is used to identify the region of the plant where the infection is located (by the relatively high radiodensity regions), and the fungicide is introduced directly into these regions.

Breve Descrição dos Desenhos A invenção será descrita com referência aos desenhos anexos, em que: 12 a Figura 1 mostra fotografias de secções transversais de caules de videira infectados com esca; a Figura 2 é uma micrografia óptica de uma videira infectada com esca; a Figura 3 mostra fotografias de "black goo" na vasculatura de videira infectada com esca; a Figura 4 mostra uma fotografia e a correspondente tomografia de raios-x de uma videira infectada com esca; a Figura 5 mostra fotografias e correspondentes tomografias de raios-x de caules de videira em vários estádios de infecção de esca; a Figura 6 é uma série de tomografias e gráficos de radiodensidade em caules de videira saudáveis; e a Figura 7 é uma série de tomografias e gráficos de radiodensidade de caules de videira infectados com esca.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The invention will be described with reference to the accompanying drawings, in which: Figure 1 shows photographs of transverse sections of infected vine stems; Figure 2 is an optical micrograph of a vine infected with esca; Figure 3 shows photographs of " black goo " in the vasculature of infected vine with esca; Figure 4 shows a photograph and the corresponding x-ray tomography of a vine infected with esca; Figure 5 shows photographs and corresponding x-ray tomographies of grapevine stems at various stages of esca infection; Figure 6 is a series of radiodensity tomographies and charts on healthy vine stems; and Figure 7 is a series of tomographies and radiodensity graphs of esca infected vine stems.

Descrição de Concretizações Preferidas A Figura 1 ilustra, fotograficamente, uma progressão típica (de A a D) de infecção de esca em lenho de videira juntamente com alguns aspectos estruturais característicos do lenho no seu estado doente. A Figura IA mostra uma secção através de uma videira nos seus estádios iniciais de infecção, apresentando pontuações negras (a) num fundo de lenho aparentemente saudável. As Figuras 1B, e 1C mostram estádios intermediários de infecção de esca, possuindo pontuações negras (a) e lenho castanho afectado (Jb) assim como cicatrizes (c) e orifícios (d) que são aspectos normais do lenho. A Figura 1D mostra estádios finais de infecção de esca com lenho morto (e) e "Amadou" (fj . Pode ver-se claramente que, nos estádios iniciais de infecção (Fig. IA e 1B), a infecção está localizada no interior das partes lenhosas da videira. Não estão presentes sintomas externos no sentido da periferia do lenho, e portanto não são evidentes na planta sinais visíveis de infecção. 13 A microscopia óptica de uma secção de uma videira infectada com esca assintomática revela (na Figura 2) a presença de "black goo" no interior do lúmen de traqueides e vasos do xilema da planta (setas pretas) . É a presença deste material comparativamente radiodenso que pode ser detectada utilizando imagiologia tomográfica, e especialmente imagiologia tomográfica de raios-x. A Figura 3 mostra a presença de "black goo" no interior, e exsudando dos vasos do xilema num corte transversal de lenho de videira infectado com esca. Na Figura 3 (a) uma região periférica do caule (Bl) apresenta lenho de videira saudável, não infectado, enquanto a região escura (B2) apresenta "black goo" no interior do xilema. Na Figura 3(b) , observa-se "black goo" exsudando (B3) dos vasos do xilema. A Figura 4A é uma fotografia de uma secção transversal de um tronco de videira infectado com esca num estádio intermédio de infecção, obtida após análise prévia por TAC (Tomografia Assistida por Computador) de um tronco de videira infectado com esca intacto. A Figura 4B é uma imagem tomográfica obtida por tomografia axial de raios-x de acordo com a presente invenção. A imagem tomográfica (4B) mostra a radiodensidade de acordo com a escala apresentada do lado direito da Figura 5D. As cores escuras são indicativas de regiões de baixa radiodensidade, e as áreas mais claras indicam niveis crescentes de material radiodenso. 0 preto na imagem representa uma radiodensidade de aproximadamente -135 unidades Hounsfield, e o branco representa aproximadamente +215 unidades Hounsfield. As imagens foram obtidas utilizando um aparelho de tomografia axial computadorizada Phillips TOMOSCAN AV. As imagens foram obtidas com os parâmetros seguintes:DESCRIPTION OF PREFERRED EMBODIMENTS Figure 1 shows, photographically, a typical progression (from A to D) of vine shoot infection along with some structural features characteristic of the wood in its diseased state. Figure 1A shows a section through a vine in its early stages of infection, showing black scores (a) on a background of apparently healthy wood. Figures 1B and 1C show intermediate stages of infection of scca, having black scoring (a) and affected brown wood (Jb) as well as scars (c) and orifices (d) which are normal aspects of the wood. Figure 1D shows final stages of infection with dead wood (e) and " Amadou " It is clear that at the initial stages of infection (Fig. 1A and 1B), the infection is located within the woody parts of the vine. No external symptoms are present in the direction of the wood periphery, and therefore (Figure 2) shows the presence of " black goo " within the tracheid lumen and xylem vessels of the plant (Figure 2). the presence of black goo in the interior, and exuding of the xylem vessels in an x-ray image of the xylem in a In Figure 3 (a) a stem peripheral region (Bl) presents healthy, uninfected grape vine, while the ura (B2) has " black goo " inside the xylem. In Figure 3 (b), " black goo " exuding (B3) from the xylem vessels. Figure 4A is a cross-sectional photograph of a grapevine infected with an esca infection at an intermediate stage of infection obtained after CT-scan of an intact, intact vine trunk. Figure 4B is a tomographic image obtained by axial tomography of x-rays in accordance with the present invention. The tomographic image 4B shows the radiodensity according to the scale shown on the right side of Figure 5D. Dark colors are indicative of regions of low radiodensity, and lighter areas indicate increasing levels of radiodense material. The black in the image represents a radiodensity of approximately -135 Hounsfield units, and the white represents approximately +215 Hounsfield units. The images were obtained using a Phillips TOMOSCAN AV computerized axial tomography device. The images were obtained with the following parameters:

Varrimento: 120 kV, 90 mA, 2 sScanning: 120 kV, 90 mA, 2 s

Tilt: 0,0°Tilt: 0.0 °

Dependendo da dimensão do tronco de que se ia obter a imagem, utilizaram-se as seguintes aberturas: 250mm/1,2 2 7 Omm/1,1 160mm/l,9 14 A Figura 4B ilustra graficamente a capacidade da tomografia axial de raios-x detectar sinais de infecção de esca no interior do núcleo de material lenhoso, em virtude do material radiodenso "black goo" no interior do sistema vascular da planta. São dados valores de radiodensidade de dois pontos no interior da imagem (184 e 246 unidades Hounsfield), indicativos de regiões possuindo vasculatura cheia com a "black goo" caracteristica de infecção de esca. A Figura 5 (A-D) ilustra fotografias de secções transversais (coluna da esguerda) de lenho de videira com vários graus de infecção de esca, juntamente com imagens de tomografia axial de raios-x computadorizada (coluna da direita) obtida antes de o lenho ser seccionado para a fotografia. As imagens tomográficas mostram mapas de radiodensidade do lenho, de acordo com a escala adjacente à Figura 5D, em gue as regiões escuras representam baixa radiodensidade e as regiões claras correspondem a alta radiodensidade. As regiões a preto têm uma radiodensidade de -135 unidades Hounsfield ou inferior, e as regiões a branco possuem uma radiodensidade de 215 unidades Hounsfield ou superior. A Figura 5A mostra imagens de um caule saudável, não infectado; a Figura 5B é de um caule durante os estádios iniciais assintomáticos de infecção. São particularmente evidentes as regiões de alta radiodensidade (áreas brancas no mapa de radiodensidade da Figura 5B) que correspondem às áreas pretas na fotografia correspondente, e compreendendo regiões de tecido vascular possuindo “black goo" no interior do xilema, assim como as áreas de lenho castanho afectado que as circundam.Depending on the size of the trunk from which the image was to be obtained, the following apertures were used: 250mm / 1.2 2 7mm / 1.1 160mm / 1, 9 14 Figure 4B graphically illustrates the ability of axial tomography -x detecting signs of infection on the inside of the core of woody material, by virtue of the radiodenso material " black goo " within the vascular system of the plant. Two-point radiodensity values are given within the image (184 and 246 Hounsfield units), indicative of regions having vasculature filled with " black goo " characteristic of esca infection. Figure 5 (AD) shows photographs of cross-sections (spindle column) of vine wood with various degrees of esca infection, along with computerized x-ray computed tomography (right column) images obtained before the wood is section for the photograph. The tomographic images show maps of wood radiodensity, according to the scale adjacent to Figure 5D, in which the dark regions represent low radiodensity and the light regions correspond to high radiodensity. Black regions have a radiodensity of -135 Hounsfield units or lower, and the white regions have a radiodensity of 215 Hounsfield units or higher. Figure 5A shows images of a healthy, uninfected stem; Figure 5B is from a stem during the early asymptomatic stages of infection. Particularly evident are regions of high radiodensity (white areas in the map of radiodensity of Figure 5B) corresponding to the black areas in the corresponding photograph, and comprising regions of vascular tissue having "black goo " within the xylem, as well as the areas of affected brown wood that surround them.

As imagens da Figura 5C correspondem a um caule de um estádio intermédio de infecção de esca. Novamente, as áreas de alta radiodensidade mostradas como regiões de cor clara correspondem às regiões escuras radiodensas compreendendo regiões preenchidas com "black-goo" dos caules lenhosos mostrados na fotografia.The images of Figure 5C correspond to a stem of an intermediate stage of infection of the esca. Again, the areas of high radiodensity shown as light-colored regions correspond to the dark radiodense regions comprising regions filled with " black-goo " of the woody stems shown in the photograph.

Finalmente, as imagens da Figura 5D correspondem a um caule de um estádio avançado de infecção de esca. Assim como 15 as regiões de alta radiodensidade (as manchas de cor clara na tomografia) correspondentes a vasculatura preenchida, as imagens também mostram (do lado esquerdo) regiões de baixa radiodensidade (as regiões escuras ou pretas na tomografia) que correspondem a áreas afectadas por podridão branca ou "amadou" mostradas na fotografia.Finally, the images of Figure 5D correspond to a stem from an advanced stage of infection of the esca. As well as 15 regions of high radiodensity (the light-colored spots on the tomography) corresponding to the filled vasculature, the images also show (on the left side) regions of low radiodensity (the dark or black regions on the tomography) corresponding to areas affected by white rot or " amadou " shown in the photograph.

As imagens demonstram a capacidade da tomografia axial de raios-x computadorizada para identificar de forma não invasiva estádios iniciais de infecção de esca através da detecção de regiões de alta radiodensidade, assim como de identificar estádios mais tardios de infecção através de detecções de regiões de baixa radiodensidade, correspondentes a "amadou". A Figura 6 (a)-(e) mostra padrões de radiodensidade obtidos por tomografia axial computadorizada de raios-x de um caule de videira saudável intacto. A representação gráfica da radiodensidade corresponde à secção ilustrada na imagem tomográfica em 2-D ilustrada por uma linha de cor clara. 0 ponto na imagem em 2-D é representado pela linha de referência vertical em cada gráfico, com a correspondente linha horizontal dando a medição de radiodensidade no ponto expressa em unidades Hounsfield.The images demonstrate the ability of computerized x-ray tomography to noninvasively identify early stages of infection by detecting regions of high radiodensity, as well as to identify later stages of infection by detecting regions of low radiodensity, corresponding to " amadou ". Figure 6 (a) - (e) shows radiodensity patterns obtained by x-ray computed tomography of an intact healthy grapevine. The graphical representation of radiodensity corresponds to the section shown in the 2-D tomographic image illustrated by a light colored line. The point in the 2-D image is represented by the vertical reference line on each graph, with the corresponding horizontal line giving the radiodensity measurement at the point expressed in Hounsfield units.

Em cada gráfico, a gama de radiodensidades ilustrada é representada numa escala de -478 a +173 unidades Hounsfield, e os "valores nos pontos" são os seguintes:In each graph, the radiodensity range shown is represented on a scale from -478 to +173 Hounsfield units, and the " values at " are as follows:

Figura Valor no Ponto (Unidades Hounsfield) 6 (a) + 119 6 (b) -46 6 (c) -478 6 (d) + 125 6 (e) + 25 A muito baixa radiodensidade do valor no ponto da Fig. 6 (c) corresponde a um orifício no centro do caule. Os valores maiores (e.g. +119 e +125) correspondem a valores de radiodensidade típicos observados em regiões altamente hidratadas de tecido lenhoso saudável. 16 A Figura 7 (a)-(1) mostra padrões de radiodensidade obtidos por tomografia axial computadorizada de raios-x em três secções de um caule de videira infectado com esca. A representação gráfica da radiodensidade corresponde à secção ilustrada na imagem tomográfica em 2-D ilustrada por uma linha de cor clara. Novamente, o ponto na imagem em 2-D é representado pela linha de referência vertical em cada gráfico, onde a correspondente linha horizontal dá a medição de radiodensidade no ponto expressa em unidades Hounsfield.Figure 6 Point Value (Hounsfield Units) 6 (a) + 119 6 (b) -46 6 (c) -478 6 (d) + 125 6 (e) + 25 The very low radiodensity of the value at the point of Fig. 6 (c) corresponds to a hole in the center of the stem. Higher values (e.g. +119 and +125) correspond to typical radiodensity values observed in highly hydrated regions of healthy woody tissue. Figure 7 (a) - (1) shows radiodensity patterns obtained by computed x-ray computed tomography in three sections of a vine infected with esca. The graphical representation of radiodensity corresponds to the section shown in the 2-D tomographic image illustrated by a light colored line. Again, the point in the 2-D image is represented by the vertical reference line in each graph, where the corresponding horizontal line gives the radiodensity measurement at the point expressed in Hounsfield units.

Em cada gráfico, a gama de radiodensidades ilustrada, e os “valores nos pontos" são os seguintes:In each graph, the range of radiodensities illustrated, and the values in " are as follows:

Figura mínimo no máximo no Valor no eixo dos YY eixo dos YY Ponto (Hounsfield) (Hounsfield) (Hounsfield) 7 (a) -274 + 277 -265 7 (b) -274 + 277 + 277 7(0 -274 + 277 + 263 7 (d) -998 + 333 -170 7 (e) -998 + 333 +308 7 (f) -998 + 333 -998 7 (g) -998 + 333 +333 7 (h) -998 + 333 + 255 7 (i) + 153 + 266 + 265 7 (j ) + 153 + 266 + 162 7 (k) + 153 + 266 + 153 7(1) + 153 + 266 + 233Minimum minimum figure in YY axis value YY axis Hounsfield (Hounsfield) (Hounsfield) 7 (a) -274 + 277 -265 7 (b) -274 +277 +277 7 (0 -274 + 277 + 263 7 (d) -998 + 333 -170 7 (e) -998 + 333 +308 7 (f) -998 + 333 -998 7 (g) -998 +333 +333 7 (h) -998 + 333 + 255 7 (i) + 153 + 266 + 265 7 (j) + 153 + 266 + 162 7 (k) + 153 + 266 + 153 7 (1) + 153 + 266 + 233

Os níveis muito elevados de radiodensidade (tipicamente acima de +250 Hounsfield neste exemplo particular) correspondem a regiões onde se acumulou "black goo" na vasculatura da planta. Níveis muito baixos (tipicamente os valores negativos neste exemplo) correspondem a regiões correspondentes a um "amadou", ou a um orifício no caule. A análise da radiodensidade de um grande número de amostras de lenho de videira em que os aspectos foram identificados por subsequente seccionamento revelou as gamas típicas de radiodensidade observadas nesta espécie para vários 17 aspectos botânicos, ou aspectos de infecção de esca. Estes valores são dados na Tabela 1.Very high levels of radiodensity (typically above +250 Hounsfield in this particular example) correspond to regions where " black goo " in the vasculature of the plant. Very low levels (typically the negative values in this example) correspond to regions corresponding to an " amadou ", or a hole in the stem. Radiodensity analysis of a large number of grapewood samples in which aspects were identified by subsequent sectioning revealed the typical ranges of radiodensity observed in this species for various botanical aspects, or aspects of sparse infection. These values are given in Table 1.

Tabela 1Table 1

Radiodensidade Típica de Aspectos na VideiraTypical Radiodensity of Aspects on the Vine

Aspecto Radiodensidade (média +/- D.P.) Unidades Hounsfield Medula e Orifício -900 ± 50 "Amadou" -840 ± 70 Lenho morto afectado -450 ± 123 Vasos vazios -109 ± 48 Lenho saudável 80 ± 32 Nós 195 ± 77 Pontuações negras 234 ± 56 Lenho castanho afectado 294 ± 71Appearance Radiodensity (mean +/- D.P.) Hounsfield Spindle and Orifice Units -900 ± 50 "Amadou " -840 ± 70 Affected deadwood -450 ± 123 Empty pots -109 ± 48 Healthy wood 80 ± 32 Knots 195 ± 77 Scores black 234 ± 56 Affected brown wood 294 ± 71

Utilizando imagiologia tomográfica de raios-x, seguida de subsequente seccionamento e identificação de aspectos, o perito destinatário pode prontamente determinar a gama típica de densidades para aspectos noutras espécies lenhosas, e para outras infecções fúngicas. Desta maneira, as técnicas aqui divulgadas podem ser aplicadas a uma ampla gama de espécies e infecções fúngicas.Using x-ray tomographic imaging, followed by subsequent sectioning and identification of aspects, the recipient expert can readily determine the typical range of densities for aspects in other woody species, and for other fungal infections. In this manner, the techniques disclosed herein can be applied to a wide range of species and fungal infections.

Lisboa, 2011-04-19Lisbon, 2011-04-19

Claims

A method of detecting fungal infection in woody plants characterized by comprising the use of tomographic imaging.

A method according to claim 1, characterized in that said woody plant is a plant of the genus Vitis or a hybrid thereof.

A method according to claim 1 wherein said woody plant is a plant of the genus Actinidia or a hybrid thereof.

A method according to claim 1 wherein said woody plant is a plant of the genus Citrus or a hybrid thereof.

A method according to any preceding claim characterized in that said fungal infection causes accumulation of fluid in the xylem of said plant.

A method according to any of claims 2 or 3 characterized in that said fungal infection comprises Esca or a Esca-like disease.

A method according to any of claims 1 to 4 wherein said fungal infection comprises infection with Eutypa lata.

The method of any of claims 1 to 3 wherein said fungal infection comprises Cancer associated with Botryosphaeria.

A method according to claim 4 characterized in that said fungal infection comprises infection with Phoma tracheiphila.

A method according to any preceding claim characterized in that said tomographic imaging is x-ray tomography. 2/3

The method of claim 10 wherein said tomography is x-ray axial tomography.

A method according to claim 10 or claim 11 wherein said method comprises the steps of: obtaining a tomographic image of a stem of said woody plant, said tomographic image comprising spatially distributed radiodiational measurements; determining the presence or absence of regions within said image having a radiodensity greater than a first predetermined radiodensity; being the presence of these regions of high radiodensity indicative of the presence of said fungal infection.

A method according to claim 12 wherein said first predetermined radiodensity is the average radiodensity of a corresponding region in an uninfected control plant.

A method according to claim 12 wherein said predetermined first radiodensity is 100, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 or 200 Hounsfield units.

A method according to any one of claims 12 to 14 further comprising the step of: determining the presence or absence of regions within said image having a radiodensity less than a second predetermined radiodensity; being the presence of both these regions, high and low radiodensity, indicative of the presence of an advanced stage of said fungal infection.

A method according to claim 15 wherein said second predetermined radiodensity is -200, -300, -400, -500, -600, -700 or -800 Hounsfield units.

A method of controlling fungal infection in woody plants characterized by comprising the steps of: determining the presence or absence of said fungal infection using a method according to any of claims 1 to 16; and treating said woody plant with a fungicide, preferably a systemic fungicide, if said fungal infection is thus detected.

A method according to claim 17 wherein said fungicide is injected into said plant.

A method as claimed in claim 17 or claim 18 wherein said tomographic imaging is used to identify the location on the plant where said fungal infection is present, and said fungicide is introduced at said location. Lisbon, 2011-04-19