PT105239B

PT105239B - SYSTEM AND CULTURE METHOD OF IN VITRO PLANTS FOR ANALYSIS OF METABOLITES DELIVERED BY THE RADICAL SYSTEM

Info

Publication number: PT105239B
Application number: PT10523910A
Authority: PT
Inventors: Mario Rui Da Costa Basilio E Castro; Carla Aparecida Ragonezi Gomes Lopes; Paulo Guilherme Leandro De Oliveira; Maria Amely Zavattieri
Original assignee: Univ Evora
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2010-08-06
Publication date: 2012-10-31
Also published as: PT105239A

Abstract

O PRESENTE INVENTO DIZ RESPEITO AO DESENVOLVIMENTO DE UM SISTEMA E MÉTODO DE CULTURA IN VITRO (1,2) CONSTITUÍDO POR DUAS FASES, UMA SÓLIDA (3,4,5) E UMA LÍQUIDA (6), A PRIMEIRA PARA SUPORTE DA PLANTA (7,8) E A SEGUNDA PARA PERMITIR A ANÁLISE DO MEIO CIRCUNDANTE DAS RAÍZES (9). ESTE SISTEMA FOI DESENHADO PARA PERMITIR UMA FÁCIL EXTRACÇÃO DOS COMPOSTOS METABÓLICOS LIBERTADOS/DIFUNDIDOS NA FASE LÍQUIDA DURANTE O CRESCIMENTO RADICULAR, DE FORMA A FACILITAR O SEU POSTERIOR PROCESSAMENTO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA. TENDO EM CONTA QUE UM CRESCIMENTO RADICULAR CORRECTO É UM DOS FACTORES FUNDAMENTAIS PARA O POSTERIOR FORTALECIMENTO E ESTABELECIMENTO DAS PLANTAS NO CAMPO, A DETERMINAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS BIOQUÍMICAS RESPONSÁVEIS PELO MELHOR DESEMPENHO DA PLANTA PODERÁ CONDUZIR À SUA SÍNTESE ARTIFICIAL E IMPLEMENTAÇÃO COMO ADITIVO PARA ADUBOS ORGÂNICOS. TRATANDO-SE DE UM SISTEMA FECHADO COM VARIÁVEIS CONHECIDAS, ESTE PODERÁ SER APLICADO EM ENSAIOS COM PESTICIDAS, HERBICIDAS E OUTROS PRODUTOS SIMILARES.The present invention relates to the development of a system and method of culture in vitro (1,2) consisting of two phases, a solid (3,4,5) and a liquid (6), the first one to support the plant (7 , 8) and the second one to allow the analysis of the circles surrounding the roots (9). THIS SYSTEM WAS DRAWN TO ENABLE EASY EXTRACTION OF METABOLIC COMPOUNDS RELEASED / DIFFUSED IN THE NET PHASE DURING ROOT GROWTH, TO FACILITATE ITS SUBSEQUENT PROCESSING AND BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION. TAKING INTO ACCOUNT THAT CORRECT RADICULAR GROWTH IS ONE OF THE FUNDAMENTAL FACTORS FOR THE AFTER STRENGTHENING AND ESTABLISHMENT OF THE PLANTS IN THE FIELD, THE DETERMINATION OF THE BIOCHEMICAL SUBSTANCES RESPONSIBLE FOR THE BEST PERFORMANCE OF THE PLANT MAY LEAD TO ITS ARTIFICIAL SYNTHESIS AND IMPLEMENTATION AS AN ADDITIVE FOR ORGANIC FERTILIZERS. TREATING A SYSTEM CLOSED WITH VARIABLES KNOWN, THIS MAY BE APPLIED IN TESTS WITH PESTICIDES, HERBICIDES AND OTHER SIMILAR PRODUCTS.

Description

Descriçãodescription

Sister® e método de cultura ce plantas ia vitro para análise de met aboli, tos libertados polo sistema radioular, uorninio Técnico da invençãoSister® and In vitro Plant Culture Method for Analysis of Metabolites Released by Radioular System, Technique of the Invention

A presente invenção tem como base interna de cultura de .<> de um método de bieteonciogia vegetal, que visa me t. abo 1 i tos s e cnudá rios 1 i b e x t. a do s fácil obtenção de pelo s i. s t am a ra d i cu 1 a r.The present invention is based on the internal culture of a method of plant bieteonciogia, which aims to provide a method. abo 1 i s s and cnudários 1 i b e x t. Easy to obtain at least i. s t am ra d i cu 1 a r.

Sutende-se no âmbito desta Invenção qne poderá ser compre sndi.de por csnie cu raia dado que ambos poderão ser responsáveis peia nutrição e sustentação da planta.It is intended within the scope of this Invention that it may be understood by each member as both may be responsible for plant nutrition and support.

á s t. a do <ia 1 ecu i e as t. that of <ia 1 ecu i and

Meios se1ides baseados em agentes gol1ficaatos são o suporte de cultura mais utilixado a nivel mundial para plantas i.n vitro. existem actual-mente centenas de formulações químicas diferentes, espoei f xcamenr.e desenvolvidas de acordo com a planta ou com o objectivo do trabalho. No entanto, na regeneração a partir de rebentos mi etoproçagados la vitro, a oxganogenese das raives constitui o pritcipal obstáculo ã realinação desta técnica em muitas espécies de plantas, especialmente gimnoepérmioas. ã produção inicial de xaires e ineficiente (poucas plantas enraivadas) ou, pelo menos, não é seguida dum desenvolvimento adequado a uma posterior passagem das plantas para acixmarãção em estufas. Per isso a investigação sobre novas formulações químicas que permitam ultrapassar estas dificuldades assume grande importância.Sodium media based on gumphicate agents are the most widely used crop support worldwide for in vitro plants. There are currently hundreds of different chemical formulations, specifically developed according to the plant or purpose of the work. However, in regeneration from mycogenated shoots in vitro, root oxganogenesis is the main obstacle to the realization of this technique in many plant species, especially gymnepers. The initial production of shavings is inefficient (few rooted plants) or at least not followed by appropriate development for subsequent passage of the plants for acixamination in greenhouses. Therefore research into new chemical formulations to overcome these difficulties is of great importance.

Pane se gue o condioionarmto das raises da planta em meio d® cultura é o principal responsável pelo posterior crescimento radioular, em parte devido ao strsss imposto à planta, querIf the condition of the plant's raises in culture medium is mainly responsible for the later radioular growth, in part due to the strsss imposed on the plant, either

ΗΙΙΙ··Ι|·ΜΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΜΙ ρ© exoesso/detice de nutrientes, ou o qrádiante osmõtlco, ou s. presença. d® normonas © do outros xequladores d® crescimonto, to entanto, fixam ©©a por compreender unais ax respostas metabellcas dada® pele planta coando submeti© aos condixiónamnntas acima desoriros..· ·· Ι | · ΜΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΜΙ ρ © nutrient excess / deficiency, or the osmotic ratio, or s. presence. dÂ® normonasÂ® of other crescimonto xequlators, however, they fixÂ © by understanding the axial metabolic responses givenÂ Â to the skin plant when subjected to the above disorienting conditions.

Em alguns casos, demonstra-se coe este bloqueio do desenvolvimento radioular pode ser ultrapassado ©© a b©t©aç© da cultura, i.s© é, pala introdução na cultora dum. paresir® microbiano cuja natividade promove uma altexaoãc no comportamento da planta ©oca© 19©) No caso d® /©©iro :'©ç abas pinça E© , ® estimulo necessário g©r_{a o} recomeço do crescimento r adi ©lar nas culturas em a©··;© foi consequid® péla introdução da inocules da fuuqcs derivados do eoi®©, corri tas desta espécie (Oliveira et ai, 2003},In some cases, it has been shown that this blockade of radioular development can be overcome by the culture, ie by introduction into the cultivator. microbial pairs whose nativity promotes an alteration in plant behavior. © oca © 19 ©) In the case of ® / © iro: '© çabas E ©, ® tweezers necessary stimuli _to resume resumption of growth in the plants. Cultures in sugarcane were consequently introduced by the inoculation of fuels derived from eai®, derived from such species (Oliveira et al, 2003),

Cantud®, em todos os casos de sucesso no enr©xamento da coniteras in vitxo, o couheclmen© sobra os stuais sxivoi©©s é ainda muito limitado ©anonas© et a©, 2010} < N® sentido da ásclarécar a composxç© q©.miea do mal.® onde se encontram as ralxos, tanto durante o seu normal, créscimo© a com® em biotloaçã© são necessários estudos que dependem da análise d® mexe onda são xealisadas as culturas a com uiveis da sensibilidade muito elavádo© a verdade, porém, é que o uso © aqentes ue 11 ©ca©as, cor© cor exemple o ©ytacei ou o ©ar~©ar, ©adus-us num obstáculo á e©racçã® desses componentes do meio, espaoialments quando estes se encontram © cxacentrações muito baixas, já que os métedas de evtracçã® para n©es agentes gelif toantes implicam elevadas temperaturas cus poderão degradar os mesmos compostas que pretendamos extrair® O recurso unicamente a um melo liquido © qualquer suporta para s planta também se apresenta com® uma solução inviável, ©a© que a planta tenda a afundar-se. A ©©.©ação da uma plataforma de papel ce filtro pode parecer uma solução para um estudo num curto espaço de tempo, mas após totalmeaté embebido, induz a planta a um atroas hídrico qus i n νηχο.ηνοίηοηχ s a alterações morfológicas por hxpaxhi.dr1cidade ou vitxificagàn (Debergh 1988, Debergh et al> 1992;, aiste?®. apresentado nesta patente, substituindo o meio de cultura nabitua imante utilizado ce agente gel ifi cante; por m® combinação de meio de cultura liquido ç uma plataforma de sustentagào da planta, sb® Itaneamuntc facilita a tarefa de extracção de mefabuli.tcs nuvolveuCo as raites, a assegura as fungces de sue tentação da planta,· deste medo ultrapasaan.de as d1f 1 au1da de s até hoje exi s t e nt e s.Cantud®, in all successful cases of coniteras in vitxo curl, the knowledge about sxivoi © © s s is still very limited © anonas © et a ©, 2010} <N® sense of clarifying the composition © When the malfunctions are found, both during their normal growth and with biotechnology, studies are required which depend on the analysis of the wave where the cultures are tested with very high sensitivity levels. The truth, however, is that the use of hot water, for example color or ytacei, or air, addus us to an obstacle to the movement of these middle components, very low when these are very low, since the extraction methods for gelling agents involve high temperatures may degrade the same compounds we intend to extract. The use of only one liquid medium supports any plant. also comes with an invi® solution level, the © © the plant tends to sink. The action of a paper platform and filter may seem like a solution for a study in a short time, but after soaked, induces the plant to a water delay that in morphological changes by hxpaxhi.dr1city or vitrification (Debergh 1988, Debergh et al., 1992), which is disclosed in this patent, replacing the nabituant culture medium used with the gelling agent; with a combination of liquid culture medium is a platform for sustaining the culture. plant, sb® Itaneamuntc facilitates the task of extracting myfabuli.tcs has solved the roots, assures the plant's fungi of temptation, · from this ultra-frightening fear to the present day.

Q recurso a duas fases de meros de cu.1 t®a não é uma ideia nona na biotecnologia de plantas. Paiute?u actualmente dxvsrsas patentes que refereu o recurso a uma fase liquida a ume fase cálida na cultura de plantas c1crcprapagadas.. n.o entanto, o seu uso é intercalado, on seja, nao ocorre no mesmo estágio da pia?® a ®er patentes: WaG129972, KR29ÕX0029349) estando ei?; muito dos oasos limitado a fases celulares e não propriamente a plantas completes. Quanto ao rnoursu da um sistema flutuante com a finalidade de sustentar a planta, a. patente 213604 919 descreva o recurso a bol.au de pollpropileno como bane de sustsútagâa, mas a sua titilimaçáu torna-se limitativa nu sentida em. gse ou á utillxada em um sistema de tubo de ensaio para culturas célulares, ou num aparato mecânica para plantas completas gue poderá. limitar a sxequi.bi lidada em larga escala ao nível financeiru.The use of two phases of cu.1 mere® is not a ninth idea in plant biotechnology. There are currently patents which have referred to the use of a liquid phase to a warm phase in the cultivation of prepaid plants. However, their use is intercalated, ie it does not occur at the same stage as the patent. : WaG129972, KR29ÕX0029349) being ei? much of the oil is limited to cell phases and not to complete plants. As for a floating system for the purpose of supporting the plant, a. Patent No. 213604 919 describes the use of polypropylene bolu as a bane de sustsútagâa, but its titillation becomes limiting as shown in. or used in a cell culture test tube system, or in a mechanical plant limit the large-scale sxequi.bi dealt with at financial level.

sistema e método apresentado nesta patente s de fácil exéquibi,! idade não requerendo materiais ou equipamentos para além do que s. ;.;t i .1 r zado rot ineiramente cm laboratórios de biotecnologia.The system and method disclosed in this patent are readily available! age not requiring materials or equipment other than s. It has been routinely rotated in biotechnology laboratories.

tose r 1 gâ i data 1 ha d a d o 1. a v eu t otose r 1 ga i date 1 ha d a d o 1. a v i t o

1, Esto rnvento nanai toa esssnctolnsntn nun sistena da cultora para: plantas tocrupropagadas, con bana ah o dá par té aérea. cónproendl.da entro i a 5 nn, éunst 1 tal de por daaa fases, una fase líquida e ©tora solida, doravante cto.nado do dupla fase.. As duas fasto pednn. ou não contes igual cuspos©too de nutrientes.1, This is not yet the case in a cultivator's system for: propagated plants, with the same for the aerial. The second phase is a 5-phase phase, a solid and liquid phase, hereafter referred to as a double phase. or do not contain equal spits of nutrients.

lo to cada una das fases o nele do cultura, e constituído por una nlatosa de nacronto riontes, nícronutr lentes, vitaninas, hidrates da carbono s aventestoeste otoros: nosposv.es, respeitando usa tornulatoe gtotoéa espsntoica da planta :.o que ao proòaudu trabalhar, toccaauda-se, que c pH do nto.s de cultura da fase sol toa seja superior a 5,S e inferior a 0,5 de furna a pernitir una toa consniidsçâé do sqstoe gell.f 1 cante seç prejudicar o nérnal dssenvolvinento da planto.All the phases of the crop are in it, and are composed of a rionate nacrosa, a micronutrients, vitanines, carbon hydrates, and adventures in this area: respecting the use of the plant's sputum tornulatoe. It should be noted that the pH of the culture phase of the single phase is greater than 5, S and less than 0.5 of furnace to allow for a consistent development of the soil. I plant.

ò. toii.i.totos to; substrato flutuante, to textura granular de baixa danaidade, autoslatovai e totou.ee e©tende-se ludeuu coou nao Itoertands qualquer cipo de substância que passa lotarferir, hon con a tis1elegia da planta nSn pún © caopesv.çae gaito ca d© fasú liquida. Este substrato cotos tosi ainda par© conferir natos regidos à fase sólida, que cunstitto. una pratofuroa de suporte à planta,O. toii.i.totos to; floating substrate, low-density granular texture, autoslatovai, and totou.ee tended to be ludicum or not to produce any type of substance that passes through the plant, according to the tis1elegia of the plant nsn. . This substrate cotos tosi still seems to give births governed by the solid phase, which is certain. a plant support pratofuroa,

4. Ma fase sólida toi.llus© nulo dá cultura geli.finado, tosturade coo substrato fiutuatoe. Deve-se preparar a fase sei loa no f undo du próprio frasco onde se realtoara a cultura, gua nau devera ultrapassar q un de drtoetro. Pelas caraater 1toicas du substrato de baixa densidade.4. A solid solid phase gives a gelatin culture, toasting with the fiutuatoe substrate. The phase must be prepared in the bottom of the flask where the culture is enhanced, water must not exceed one of the drometers. By the face characteristics of the low density substrate.

®ts prc-Bd®·©® preliminar leve a gue ®te se slf·® Junto a sugeri®® superior ainda antes da geidf inação, A fase sólida deve então ser invertida ®m a ajuda de ue instrumento de tlpe espátula metálica. devidamente esteràliaado. Isso permitirá colocar a planta sobre a supsrfi.nie oposta ao substrato flutuante.®ts prc-Bd® · © ® Preliminary Take the next step before geidfining The solid phase must then be reversed with the aid of a metal spatula tool. properly sterilized. This will allow the plant to be placed on the surface opposite the floating substrate.

S, 0 mela inferior, gó fane liquida, a camposto por >xm meio dé nnltura líquido que ap®santa a. função dç nutrição da planta, a aoua de difusão de xestabclilós em contanto coo. o sistema radiou lar. A fasa liquida é vertida sé.b® a fase sólida e da® passar espontaneame® e para baixo desta última. Assim, o substrato flutuante flua dl rec temeu ta ® contacto com a fase liquida.The lower molar is liquid gans, which are exposed to> a half of the net width which the spawn is. nutrition function of the plant, the diffusion rate of xestabclilós as long as. the system radiated home. The liquid phase is poured into the solid phase and spontaneously passed and below it. Thus, the floating floating substrate had contact with the liquid phase.

® dom um ubiéoto ®rf®an.® Gsterillaado e aquecido, até atingir cerca ® 200far-se ·.·”<, pequena perfuração no centre da fase solidei para perm.itir a inserção do caule ou raia da planta, A mesma ficará assim cem o sistema rsdicular mergulhado na fase liquida s a parta aérea acima da fase sólida.® with a heated and greased ®rf®an.® ubiotic, until it reaches about 200 °. ·. · ”<, Small perforation in the center of the solid phase to allow the insertion of the stem or streak of the plant. thus, the root system immersed in the liquid phase and the aerial part above the solid phase.

Aedo de realisação da invençãoEmbodiment of the invention

Ac tento qúe segue, os números entre parêntesis dizém respeito à legenda das figuras 1 e 2,As follows, the numbers in parentheses refer to the caption in figures 1 and 2,

Todo n método deve real Irar-® de modo a assegurar a assepsia das culturas, Q substrato flutuante lã; é estarilleado por autççl.avagem à temperaiu®. as 121 ^<:C já dentro do frasco {2} escolhido para a sx®uçãc do método, de seguida, o melo liquido e sólido (este últix® coxa o agente gex.ifIcantej , são astenia vades separadamente, 2® v® devidamante esterilizados, todos cs materiais são tranapnrtadca para uma câmara de fluxo laminar, onde se procede ac seu mouuseamentò em ambiente estéril. Eave-ae verter a soluçãc de meia válido paca dentro do frasco dd: a verificar que o substrato ascende na tora: imante ao meio, ocupando a posição superior da fane Sólida (31 . Deixa-se solldi ficar env.ro 1 a 3 torno,, com o iracoo (x) devidamunts velado, de forma a garantir que a matriz sólida. não tem fissuras. A Figura 1 eaqaematiaa u áspeoto final da fase sólida. (3) em que dentro do frasou íz? devidamento velado com a respectiva tampa (li, o sós trato flst caule (41 as ancoro.·, r a sobre o nalo de cultora geilficado (ti .Every method must be real Irar-® so as to ensure asepsis of the crops, Q floating wool substrate; it will be trimmed by temperaiu® self-cleaning. to 121 ^<C already inside the bottle {2} sx®uçãc chosen for the method, then the solid and liquid melo (this últix® the thigh gex.ifIcantej agent are asthenia should go separately 2® V® devidamante All materials are sterilized and transferred to a laminar flow chamber, where they are mulled in a sterile environment, and pour the valid stocking solution into the vial dd: verifying that the substrate rises in the log: iMore to the middle position, occupying the upper position of the Solid Fane (31. It is allowed to be wrapped around 1 to 3 lathe, with the iration (x) properly veiled, to ensure that the solid matrix has no cracks. 1 is the final stage of the solid phase (3) in which the veil is properly veiled with its lid (li, the only tract flst stem (41 as anchor.) On the geilified cultivator's tail (ti.

Q: próximo passo consista na inversão da fase sólida (3J . Sogurando o frasco ubi.iquamantá, insere-se no rebordo da fase sólida. {3} um instrumento do tipo espátula metálica davl.damánte asrerili.nado, rodando e frasco para descola-ia do vidro , Quando tal aconteoe, a fase sólida (3) tomba snavemente sobra a espátula, permitindo recolooá-la no fundo do frasco, mas invertida. O substrato flutuante (4) cocori estar agora em contacto com. o fundo do frasco.. Esta inversão da fase solida (3} vai permitir uma separação eficaa entre a superfície em contacto ocm o ar u a face liquida (e); assim, permito-ss assegurar um. meio de crescimento adeguado a eventuais organismos em caso de bíotiaagão da cultura, gue seja diferente do da fase liquida (3}, além de qua se melhora a eventual distinção entre as composições químicas das duasQ: The next step is the inversion of the solid phase (3J. With the ubi.iquamantá vial in place, it fits into the rim of the solid phase. {3} a metal spatula instrument davl.damánte asrerili.nado, rotating and take-off vial When this happens, the solid phase (3) tumbles gently over the spatula, allowing it to be replaced at the bottom of the vial but inverted The floating substrate (4) is now in contact with the bottom of the vial. This inversion of the solid phase (3) will allow an effective separation between the surface in contact with the air and the liquid face (e), thus allowing a growth medium suitable for eventual organisms in case of biotype of the surface. different from that of the liquid phase (3}, in addition to improving the possible distinction between the chemical compositions of the two

fases, e também a flutuabil phases, and also the buoyancy ..idade da fase sólida (31 .· ..solid phase quality (31. · ã fase seguinte to the next phase ; consisto ; I agree em verter o meio in pouring the middle líquido sobre a net over fase sólida. 0 solid phase. 0 meio 11 quis half 11 wanted ào irá natoralméòte para, baixo as. will not natoralméôte to, under the. favá sólida ( solid honeycomb ( tú, devido because of you às propriedades to properties flutuantes do floating aubszrato.. É c aubszrato .. It's c uaveniente uaveniente tentar remover o try to remove the ar aprisionado trapped air entre a fase 1 between phase 1 iquida (ã) liquid e a fase sólida and the solid phase (3), levantando (3) raising ligulramente o slightly bordo da board rass voi.iaa (.>> rass voi.iaa (. >> cu a ajuda da ass the help of espátula.. spatula..

Para a culocaoãc da planta no rcspéut ivo frasco {2), é ueoassáric produzir, rr m objecto pariurante esterilizado e aquecida, uma abertura ha fase sólida {33 . Através desta abertura, deve ser passado, o caulé ou a raiz {3} para que o mesmo esteja em contacto com o meio de nutrição, a fase liquida (6). A parte superior do caule (8, deverá ficsr presa na fase solida (3) permitindo que a parte aérea da planta {7} não entre em eontaeèo com a fase liquida (fj deste método. A Figura z representa assim o esquema geral deste método.For the cultivation of the plant in the next flask (2), it is necessary to produce a heated sterile opening in a solid phase (33). Through this opening, the stem or root {3} must be passed so that it is in contact with the medium, the liquid phase (6). The upper part of the stem (8) should be attached to the solid phase (3) allowing the aerial part of the plant {7} not to come into contact with the liquid phase (fj of this method. Figure z thus represents the general scheme of this method). .

A etapa final do novo método objecto da presente invenção envolve ainda que, uç final do tempo pretendido de cultura, se transporte o sistema (frasoc, fase líquido, fase sólido s planta;, para uma câmara de fluxo laminar, onde se procede â inserção de um instrumento do tipo espátula metálica uevidamente esterilizado no rebordo da fase sólida ó), segiitands-a juntamsntn com a planta enquanto se verte a fase liquida {£) para um recipiente de recolha.. Esta fase líquida íé) pode por fim ser analisada bioquimicamente cu em alternativa, conservada a 30 ^cC para posterior análise.The final step of the novel method object of the present invention further involves that, at the end of the desired culture time, the system (frasoc, liquid phase, solid phase to plant) is transported to a laminar flow chamber, where it is inserted. a sterilized metal spatula-like instrument on the edge of the solid phase (), then join it with the plant while pouring the liquid phase (1) into a collection vessel. This liquid phase (1) can finally be analyzed. cu biochemically alternatively, stored at 30 ^c C for later analysis.

Este sis·..uma permite ainda que seja possível renovar a fase liquide para eventual continuação da cultura e estudos bioquímicos que envolvam, uma componente temporal, por exemplo uma análise de sã em 32 horas dos compostos libertados pelo s.isteoa t adi colar da planta»This system also allows the liquid phase to be renewed for possible further cultivation and biochemical studies involving a temporal component, for example a 32-hour sound analysis of the compounds released by the system. plant"

A fase solida (3) tem. duran.il idade ate 25 dias após a sua formaçain, permitindo que uma panóplia de testes possa ser realizada ser?:, a sua renovação., desde que em condições to t aloés te assépticas, sara tal, deve retirar -se a fase liquida, utilizando a técnioa. já descrita acima;, é com. uma pipeta volumétrica dsvídamçnàe esterilizada, iuseru-sa culdadosamente uma neva fase liquida aproveitando a zona de euntaoto entre a fase sólida e o frasco.The solid phase (3) has. up to 25 days after its formation, allowing a panoply of tests to be carried out will be renewed, provided that under all aseptic conditions, however, the liquid phase should be removed. using the technique. already described above ;, is with. A sterile, sterile volumetric pipette culminately used a new liquid phase by taking advantage of the euntaoto zone between the solid phase and the flask.

A eventual biutização da cultura poderá programar-'·se seguindo ο mesmo método, colocando-se ο inoculo sobre a superfície da face cólica (3; corriaetc com o at > desta forma, o inoculo tara naia superfície de sustentação a nutripão imdépeôdents, e caso soja aéòaoeáaío, uma formulação especifica, que deva ser ajustada em. função da espécie do inoculo.Eventual biutization of the culture may be programmed by the same method, by placing the inoculum on the surface of the colic face (3; correcting with at this time, the inoculum to be sustained by the nutrient imdépeôdents, and In the case of soybeans, a specific formulation must be adjusted according to the species of inoculum.

Exemplo rara a confirmarão da exequibi 1 idade deste método, foram, uti11 aedos frascos da vidro específicos para cultura de tecidos vegetais (Sigma, ref* v8Í3u/B8f43) com 6 cm de diâmetro de base, adequados à cultura de rebentos eurareados de ri n us pinas (pi abe iro-manso), cem quatro meses de reqçaaxaçâo a partir de cotilédones., Em onda frasco, ter colocados 0,â g de pcrlite (Europerl) s adicionados if ml da maio solide WPM (Lloyd and McCouu, 1331). Após arrefecimento da fase sólida, esta foi invertida, e adaclonaram-se 33 ml dá meio liquido 11'1 aem nidratos de carbono, ficando a parlite direotamaute em contacto com a fase liquida. Foi realiaadc um pequeno -rIfíoio no centro da fase sólida, com a ajuda de uma pinça esterilisada a aquecida a prooaden-se a colocação do rebento enraivado de Pinas pinea.A rare example confirming the feasibility of this method, 6 cm of base tissue-specific glass culture-specific glass vials (Sigma, ref * v8i3u / B8f43) were used, suitable for the cultivation of rhinous euryed shoots. pines (Piper-tame), one hundred four months re-coaxing from cotyledons., In a vial wave, have placed 0 µg of pcrlite (Europerl) added if ml of the May WPM solid (Lloyd and McCouu, 1331 ). After cooling of the solid phase, it was inverted, and 33 ml of 11'1 carbohydrate liquid medium were added, with the right-mastic parlite in contact with the liquid phase. A small hole was made in the center of the solid phase, with the help of sterilized and heated tweezers to support the placement of the pinas pinea's rooted shoot.

lactações e limitaçõeslactations and limitations

Bate Invento distingas-sn por:Beat Invention Distinguish-sn by:

1, Permitir uma mais fico.), a rápida extracção do meio de cultora líquido para análise doa componentes quim.ioos libertados pelo sistema radicuiar,. sem e interferência de materiais sólidos que tendam a dificultar a sua purificação..1, Allow a more physical.), The rapid extraction of the liquid culture medium for analysis of the chemical components released by the root system. without and interference from solid materials that tend to hinder their purification.

2.1 Permiti r: a «fl li seção de diferentes espécies de plantas devido ã. poesibllidada de ajustar a composição quimica da fase l.vquica. em função dos requisitos específicos do meio de crescimento de cada planta.2.1 Allow: a section of different plant species due to. It may be prohibited from adjusting the chemical composition of the chemical phase. depending on the specific growth medium requirements of each plant.

3- Apresentar a necessária versatilidade à intredução de diferentes parceiros da biotiração, nomeadamante pala formulação química da rasa solida, do entanto, devora tér-se em cor® idarapão que diferentes formulações qulmloas dos maios podarão implicar um reajuste da quaútldade de agente gali.fmente ou substrato flutuante na fase solida, pelo que assas variações devem, ser testa das p raviamem e.3- To present the necessary versatility to the introduction of different biotiration partners, namely for the chemical formulation of the solid surface, however, it should be concluded that different chemical formulations of the Mays may imply a readjustment of the quantity of gali.f. or floating substrate in the solid phase, whereby variations should be forehead and.

A Apresentar uma grande versatilidade no que respeita à salecção de materiais, sejam eles o agente gelifioante, o substrato flutuante ou os reoipieutas a utli irar.Presenting great versatility with regard to the salection of materials, be they the gelling agent, the floating substrate or the reoipieutas to be used.

em aõdtã gue 0 aumento do diâmetro do frasco comprometer frascos ecm no svem.pl o.in aõdtã gue 0 increasing the diameter of the vial compromise ecm vials in svem.pl o.

testes maior f raq11Idade da: fase solida, podendo todo um diâmetro para os ensaio.tests greater frequency: solid phase, with a whole diameter for the tests.

até 6 qua l.s de consistência oa i recomendável ideutíoas aos referidosup to 6 wt.% of consistency or ideal for those

d. 1 versos utiliração de d e ma i. o r d 1 â ma t r o de volumes malotes de fase solida e liquida, proporção da área do fundo dod. 1 verses use of d e ma i. o r d 1 â ma r r of volumes of solid and liquid phase pouches, proportion of the bottom area of the

5. Sar fácil de implementar.5. Sar easy to implement.

rotinairamanca pelo menos na frasco.routinely stain at least in the vial.

r a queveudo o amponante s disponíveisAnything on the amp is available

B1. s te c no 1 -o g 1 a de t 1 ao tas, n f r a e s r r u taras especiais.B1 s te c no 1 -o g 1 a from t 1 ao tas, n f r a and s r r u tare.

num.on one.

nauship

1. abo ratar lo necessitando de de1. Approve it needing to

6. ãer fácil, de suecátar. Mesmo a Inversão da fase solida e um. passo que se domina rapidamente apõe alguma prática. As dificuldades técnicas prendem· se unicamente com a eventual quebra da fase sólida urnv« a Inversão. Estima-sa, com os frascos referidos no exemplo, que guando muito 1% das fases sólidas se partem aquando do seu manuseamento com a espátula. Se os valores assumirem proporções superiores, é rsósmendával verificar sa os vai.ores de pn sá encontram no intervalo entre 5,S e 6,5.6. Easy to clean. Even the solid phase inversion is one. quickly dominated by some practice. The technical difficulties relate only to the possible breakdown of the solid phase due to inversion. It is estimated, with the vials referred to in the example, that much 1% of the solid phases break when handled with the spatula. If the values assume higher proportions, it is always necessary to check if the values of pn s are in the range between 5, S and 6.5.

7, Fermítir qu© seja possível renovar a fase 'iiqua.Ua para, eventual continuação da cultura e estudos bioquísdc® que envolvam uma cumpuns<>tu temporal,7, Fermítir that it is possible to renew the 'iiqua.Ua' phase for possible continuation of culture and biochemical studies involving a temporal cohort,

A p 1 ® a c® 1 u du s t r 3 a 1.A p 1 ® a c® 1 u s t r 3 to 1.

Esta sistema permite a fácil extracção para estudo de me t a® i 11 ® se ou® ár 1 o libertados pelo sistema radíoular das plantas aquando do seu normal dexuuto.lvimautu ou come resultado das Interseções que r. Pum dsseuvclvlmThis system allows for easy extraction for study of metalla 11a whether they are released by the root system of the plants at their normal dexuuto.lvimautu or as a result of the intersections that r. Pum dsseuvclvlm

X.X.

la.:;· á fundamental para o for t a 1 e c 1 me®: o hS.la.:;; is fundamental to the force 1 and c 1 me®: the hS.

o a st a to das plantas no campo, * determinação de qual,* aa substância* responsáveis pelo melhor desempenho da planta poderá oonduaix e .1 ,mp lamentação cm aditiva par* a ® bo s o r gá ® o* . Esta* adubos podem ser utilizados paca ajudar a. planta * ter acesso e ao mesmo tampo promover o seu cr a saimento radioular e o fortalecimento das sua* defesa* contra vulgares ataque* Piológicos, 1ratando™se de um sistema fechado com variáveis conhecidas, o sistema apresentado poderá *er aplleadé cm ensaies com pesticidas, herbicidas e outros pred ® o a sl.mi la r es >In addition, the determination of which * substance * responsible for the best performance of the plant will be able to reduce the amount of additive lamentation for the plant. These * fertilizers can be used to help. plant * to have access and at the same time to promote its radioular growth and the strengthening of its * defense * against vulgar attack * Biological, and if it is a closed system with known variables, the presented system may be applied in tests with pesticides, herbicides and other pred ection o sl.mi la r es>

® s ar1çã o da s E1g ura s® ar lation of the E1g s

Figura Figure 1: Esquema 1: Scheme ilustrativo illustrative do aspecto final of the final aspect da gives preparação preparation da ias- from ias- j sólida do solid j si*tem* num si * has * num frasco de cultura culture flask de in plantas in plants in vit ro. vit ro. Figura Figure 1Esquema: 1Schema: ilustrativo illustrative de aspecto f.;.r;*l of aspect f .; r; * l do of método com. method with.

inolusao de planta enraizada.root plant inolusions.

tagenda das FigurasTagenda of the Figures

1 1 Tampa Cover te you Frasco Bottle si si Casa sólida Solid house 4 4 ate te. ra t a fite rates See you. ra t a fite rates 8 8th Melo de cultura gé te. ficado Melo of hot culture. stayed Ό Ό lasa liquida liquid chip 7 7th Parta aurea da planta Depart aurea da plant S· S· L.te te..ter Have you 1 1 Raízes Roots

BibllograriaBibllograria

Psbnxgh PC (1988) Micrapxspagat loa of woody species: st ate of thu art un in vitro aspecra. Ao ta noxt 227:297-295 oebarqh FC, artken-Chxiteia 1, Cohen D, Cxout 8, voa. Axaold 8y termo P, te v M {1092} Raconsider ati au of the taxo teitrif ioation” as ussd. la mlcrupropagatiun. Plant Gte.1 T1 ssua Otga:a ^: , Cu 1t 30: 135 -14 8Psbnxgh PC (1988) Micrapxspagat loa of woody species: from to thu art an in vitro aspecra. At night 227: 297-295 oebarqh FC, artken-Chxiteia 1, Cohen D, Cxout 8, fly. Axaold 8y term P, te v M {1092} Raconsider at the time of the taxation ”as ussd. la crupropagatiun. Plant Gte.1 T1 ssua Otga: ^a: Cu 1t 30: 135 -14 8

L1. a y d C., MuC asa B. (19 8 te .. Cosam: ta i a 11 y f e a a .1 b 1 a miotepropagation of scunttec lacxsl, Ralmia .latífella, by the ase of utente tip culture.. Proa Plant Prap bua 30:421917 stetete J, te-cte; Penalíts af in vitxa tetexte rateou' of plant tissue culturas te. th micrabite. 1 acate.ate. s. In Vitro Csll. Itete Pite.. PI ate. M, 123-130..L1. ayd C., MuC wing B. (19 8 te .. Cosam: ta ia 11 yfeaa .1 b 1 a miotepropagation of scunttec lacxsl, Ralmia .latifella, by the ase of wearer tip culture .. Bow Plant Prap bua 30: 421917 stetete J, te-cte; Penalits af in vitxa tetexte rate 'of plant tissue cultures te th micrabite. 1 acate.ate. s. In Vitro Csll. Itete Pite .. PI to. M, 123-130 ..

Cteste.ua P, Partias. J, Cavaleiro C, Peite A, Potes Af. {2083}. 3ustsinad in te.ten xunt dsrélapmete abtaàned in Pinas pines inoculated. te.th ate. um.y curte:.:. zal.Cteste.ua P, Partias. J, Knight C, Brite A, Pots Af. {2083}. 3ustsinad in te.ten xunt dsrélapmete abtaàned in Pinas pines inoculated. te.th until. um.y likes:.:. zal.

Raganete. C, Castra MA, lima M, te.yoaszeuska 1, da Oltetera P, fartei 1 a. te MA, (2010} , «Rteting conte te te. REtell ARTICteteRaganete. C, Castra MA, lime M, te.yoaszeuska 1, from Oltetera P, fed 1 a. te MA, (2010}, «Rteting tell ya.

Patente 12.20020029200 ·· Msthnd fnr sorratlc artbryoganosis and assa prcpagation from smhryngsnle oell cultuxsa of ale u t h e r oco acu s oh 1 1 s a η s n s i s.Patent 12.20020029200 ·· Msthnd fnr sorratlc artbryoganosis and assa prcpagation from smhryngsnle oell cultuxsa of ale u t h and r hollow acu s oh 1 1 s a η s n s i s.

batente 000120972 - Metono for maturatios of conlfer aometio em torvou..jamb 000120972 - Metono for maturatios of conference aometio in torvou ..

I η:: Troe s, 3 ρ r 1η g e r. ; η ρ r ο s οI η :: Troe s, 3 ρ r 1η g and r. ; η ρ r ο sο

Pa t e ; t s WO 0 6 0 2 21.9 - Ma th o d a nd. device for the 1 :n v ©. t. r c sal tuxe of plant anile and orgaroá, ao ssl 1 as for the mioropropagation and regenerarion. of oornpl.ats planta.Pa t e; t s WO 0 6 0 2 21.9 - Ma th o d a nd. device for the 1: n v ©. t. r c tux salt of plant anile and orgaroá, at ssl 1 as for the mioropropagation and regenerarion. of oornpl.ats plant.

Claims

Divert and *

1. system. of in-plant plant culture for analysis of metubolics released into the root system by simultaneously comprising two ml media, one solid and the other not liquid. arranged in a layer called dupia-casa.

A system as claimed in claim 1 comprising a solid phase (3) comprising a delirium culture medium (5) and a floating substrate (4),

A system according to claim 1 characterized in that it comprises a liquid phase comprising more than one of the liquid culture.

A system according to claim 1, characterized by a free liquid and solid two-phase chemical formulation _. to adapt to the special needs of plants.

i. In vitro plant culture method for the analysis of metabolites released by the root system, characterized by a two-phase system comprising the following steps:

The. Preparation of culture media, liquid solid;

B. Preparing the solid phase (3) by mixing the solid culture may with a floating substrate (4) in an In nitro plant culture flask (z);

no solid phase inversion (3);

d. Pour the liquid culture medium onto the solid phase (11, giving rise to the liquid phase).

and. Drilling of the solid phase O) for insertion of the radicnlar system (3j and the stem stem} of the plant;

f. Cúitur * of the plant;

q. Extraction of the liquid phase m for further analysis.

Method according to Claim 5, characterized in that the solid phase is reused (3j with the same plant Π, 3 and r r) by introducing a liquid phase (tj for studies and analysis with temporal component).

7, Method according to clause 5, characterized by theory of solid phase (3) by introduction of a new liquid phase (6) and new plant (7, 3 and 3 ;.