PT105029B - Sonda de ácido péptido nucleico, estojo e método para detectar e/ou quantificar salmonella e respectivas aplicações - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AO DESENVOLVIMENTO DE UMA SONDA DE ÁCIDO PÉPTIDO NUCLEICO (PNA) PARA A DETECÇÃO DO GÉNERO SALMONELLA EM DIVERSOS TIPOS DE AMOSTRAS.PNA É UMA MOLÉCULA SINTÉTICA ANÁLOGA AO DNA QUE, DEVIDO ÀS SUAS PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS, PERMITE UMA ANÁLISE MAIS RÁPIDA E SENSÍVEL QUE AS SONDAS DE DNA. ESTAS SONDAS SÃO COMBINADAS COM HIBRIDAÇÃO FLUORESCENTE IN SITU (FISH), UMA TÉCNICA DE BIOLOGIA MOLECULAR QUE PERMITE A VISUALIZAÇÃO DO MICRORGANISMO DIRECTAMENTE NA AMOSTRA. A COMBINAÇÃO DESTAS DUAS TECNOLOGIAS TORNOU O PROCEDIMENTO DO FISH MAIS RÁPIDO, SIMPLES E EFICIENTE.ESTA SONDA PODE SER APLICADA NUMA GRANDE VARIEDADE DE AMOSTRAS TAIS COMO: SANGUE, ALIMENTOS, BIOPSIAS, FEZES, ÁGUA E OUTRAS AMOSTRAS CLÍNICAS, AMBIENTAIS OU PROVENIENTES DA INDÚSTRIA AGRÍCOLA E ALIMENTAR.A PRESENTE INVENÇÃO TAMBÉM INCLUI O DESENVOLVIMENTO DO ESTOJO DE DETECÇÃO E RESPECTIVO PROCEDIMENTO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE SALMONELLA SPP. NOS VARIADOS TIPOS DE AMOSTRAS ACIMA REFERIDOS.

Description

DESCRIÇÃO

SONDAS DE ÁCIDO PÉPTIDO NUCLEICO, ESTOJO E MÉTODO PARA

DETECTAR SALMONELLA E RESPECTIVAS APLICAÇÕES

Campo da Invenção

Esta invenção insere-se no âmbito de um processo de detecção de microrganismos relevantes ao nivel clinico e de segurança alimentar. Para tal, foi desenvolvida uma sonda de PNA capaz de detectar o género Salmonella.

Para além da sonda, esta invenção inclui todo o procedimento de PNA FISH e a sua aplicação a um estojo de detecção e/ou quantificação de Salmonella spp., que poderá ter aplicação no ramo clinico ou alimentar.

Antecedentes da Invenção género Salmonella integra várias bactérias patogénicas que podem causar doenças que variam desde simples gastroenterites até infecções sistémicas. A severidade da doença é geralmente determinada pela virulência da espécie/estirpe de Salmonella, tipo de hospedeiro (humano ou outras espécies animais) e condição de saúde do hospedeiro.

Análises filogenéticas ao divide em duas espécies, género têm mostrado que este se

Salmonella bongori e Salmonella enterica.

No entanto, até à data foram identificados mais de 2500 serótipos diferentes cuja maioria é capaz de infectar humanos e uma grande variedade de espécies animais.

As estirpes de Salmonella são convencionalmente identificadas e classificadas de acordo com o esquema de serotipagem de Kauffmann-White, que se baseia no tipo de antigénios presentes na membrana externa.

Esta bactéria pode ser transmitida directamente de pessoa para pessoa, por via fecal-oral, com reservatórios externos quando ou por contacto directo ocorre contaminação fecal dos solos, alimentos e áqua. Por esta razão, é importante desenvolver um método de detecção robusto que permita identificar a bactéria em todos estes tipos de amostras.

Por exemplo, a Food and drug Administration pretende regular a transmissão de Salmonella enteritidis através da implementação de um programa de teste de contaminação de cascas de ovos em aviários, uma vez que as cascas de ovos foram identificadas como sendo importantes na transmissão do microrganismo.

A detecção de Salmonella é tradicionalmente feita por recurso aos métodos de cultura. No entanto estes métodos são trabalhosos e muito demorados (4 a 6 dias) . Neste sentido, impõem-se o desenvolvimento de novos métodos, mais rápidos e fiáveis, que possam auxiliar no controle da bactéria de forma a reduzir as salmoneloses quer em pessoas quer em animais. Tendo em vista este objectivo, têm sido desenvolvidos diversos métodos moleculares de detecção para diminuir o tempo necessário para a identificação de Salmonella em alimentos, fezes, água e amostras clinicas. Estes métodos incluem testes imunoenzimáticos (ELISA), reacção em cadeia da polimerase (PCR), e FISH. No entanto, alguns estudos mostraram que os métodos baseados em PCR e ELISA não permitem detectar algumas das amostras positivas por método de cultura. Ainda assim os métodos baseados em PCR provaram ser mais precisos que os métodos de ELISA. Por outro lado, quando um enriquecimento selectivo da amostra é efectuado antes do PCR, não só todas as amostras positivas por método de cultura são detectadas, como a presença de Salmonella que não foi detectada em cultura pode ser detectada por PCR. Estes estudos revelam que a etapa de enriquecimento pode aumentar a sensibilidade do método molecular, ao eliminar problemas como o baixo número de bactérias e a presença de substâncias inibitórias em certos tipos de amostras, tais como alimentos e amostras fecais. No entanto, os métodos baseados em PCR geralmente requerem um passo de extracção de DNA, e nenhum dos métodos acima referidos excepto o FISH permite a visualização directa da bactéria na amostra. Isto pode ser importante, por exemplo, ao permitir a avaliação de contaminação por Salmonella em cascas de ovos directamente na amostra.

FISH é um método molecular amplamente aplicado na identificação bacteriana e localização das células na amostra. Este método é baseado na ligação especifica de pequenos oligonucleótidos (sondas) a regiões do rRNA. A sonda é acoplada a um fluorocromo e após a hibridação é possível detectar o sinal de fluorescência graças ao elevado número de cópias de rRNA presentes na célula. Existem já alguns trabalhos que descrevem a detecção de Salmonella utilizados sondas de DNA (Kutter et al., 2006; Nordentoft et al., 1997).

Mais recentemente, foram desenvolvidas sondas de ácidos péptido nucleicos (PNA) para a detecção de microrganismos. Estas moléculas mimetizam o DNA e são capazes de hibridar especificamente com sequências complementares de ácidos nucleicos obedecendo às regras de Watson-Crick. No entanto, a ligação estabelecida é mais forte graças ao facto de na molécula de PNA a cadeia fosfatada, de carga negativa, estar substituída por unidades repetidas de N -(2aminoetil) glicina, de carácter neutro. A utilização desta molécula na tecnologia de FISH de uma forma adequada, permite tornar o procedimento mais robusto, rápido e eficiente.

Para Salmonella já foi desenvolvido anteriormente um método de PNA FISH (Perry-O' Keefe et al., 2001) . No entanto, a sonda utilizada tem uma sequência complementar a outras espécies tais como Actinobacillus actinomycetemcomitans, Buchnera aphidicola, Haemophilus influenza e Yersinia spp, o que a torna pouco desejável para diagnóstico. Foi por isso considerado relevante desenhar e testar uma nova sonda e desenvolver um novo método para o microrganismo em questão.

De referir que, embora muito robustos após optimizados, o desenvolvimento de métodos de PNA-FISH é, tal como o desenvolvimento de métodos de PCR, extremamente exigente e necessita de um grande conhecimento das caracterlsticas químicas e físicas dos vários parâmetros em causa. Ainda assim, é bem sabido que o facto de se ter um método de PNA FISH a funcionar para um microrganismo não é de forma alguma garantia que outras sequências para o mesmo microrganismo funcionem. De resto, embora os investigadores sintam uma natural falta de interesse em publicar resultados negativos, existem na literatura vários estudos nos quais os autores só conseguiram pôr a funcionar algumas sondas para um mesmo microrganismo.

Sumário da Invenção presente invento refere-se a uma sonda de ácido péptido nucleico (PNA) e método associado, para detectar o género Salmonella (isto é identificar ou quantificar).

A sonda descrita na presente invenção reconhece o 23S rRNA do microrganismo em questão ou as sequências genómicas correspondentes ao rRNA mencionado. As sondas de PNA têm caracteristicas fisico-quimicas inerentes à sua estrutura que, quando aplicadas a um método baseado na tecnologia FISH, permitem uma análise mais rápida, robusta e especifica do que usando uma sonda de DNA.

Uma das vantagens deste método é o facto da sonda funcionar de forma robusta numa grande variedade de amostras biológicas, o que geralmente não acontece para os outros métodos moleculares de detecção.

Outro aspecto relevante é o tempo necessário à detecção. 0 método desenvolvido consegue igualar os melhores tempos descritos para os restantes métodos moleculares, mesmo quando o tipo de amostra exige um passo de enriquecimento anterior à análise. A rapidez, aliada à fiabilidade do método, poderá determinar o tratamento atempado e adequado da contaminação e/ou infecção quer numa perspectiva clinica quer de segurança alimentar.

Outro dos aspectos da presente invenção relaciona-se com o desenvolvimento de um estojo, baseado na aplicação desta sonda à técnica de hibridação fluorescente in situ (FISH), que permite a detecção da Salmonella num variado conjunto de amostras biológicas, de uma forma simples e rápida.

A sonda de PNA, que permite detectar a presença de bactérias do género Salmonella, poderá numa realização preferencial, detectar a sequência alvo no rRNA, no rDNA ou nas sequências complementares do rRNA de Salmonella.

Um das realizações da presente invenção é a descrição de uma sonda de PNA de detecção e/ou quantificação de Salmonella caracterizada por ter pelo menos 86% de semelhança com a sequência SEG ID No. 1 -5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3', de preferência 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de semelhança com a sequência SEG ID No. 1 -5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'.

Numa realização ainda mais preferencial, as sequências anteriormente descritas encontra-se ligada a pelo menos um tipo de fracçâo detectável. Sendo que, o tipo de fracçâo detectável a utilizar poderá ser seleccionado a partir de

um dos seguintes	grupos:	um conjugado,	um	sistema de
detecção ramificado, um	cromóforo,	um	fluoróforo,
radioisótopo, uma	enzima,	um hapteno	ou	um composto
luminescente, entre	outros.

Numa realização ainda mais preferencial o grupo fluoróforo poderá ser pelo menos um dos seguintes: fluoróforos de Alexa series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',7'diclorofluoresceina, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio), entre outros.

É ainda objecto da presente invenção um estojo de detecção da presença ou ausência e/ou quantificação Salmonella em amostras biológicas.

Sendo que numa realização mais preferencial o estojo poderá ainda apresentar pelo menos uma das seguintes soluções: uma solução de fixação, uma solução de hibridação e uma solução de lavagem.

Ora numa realização ainda mais preferencial a solução de fixação poderá compreender paraformaldeido e etanol, nomeadamente 2-8% (peso/vol) de paraformaldeido e 25-90% (vol/vol) de etanol e/ou a solução de hibridação poderá compreender formamida.

É também objecto da presente invenção a descrição de um método de detecção da Salmonella ou de detecção da Salmonella em amostras biológicas, que utiliza a sonda de PNA anteriormente mencionada e que compreende os seguintes passos:

o contacto da sonda de PNA com amostras biológicas;

o hibridação da sonda de PNA com a sequência alvo dos microrganismos presentes nas amostras biológicas;

o detecção da hibridação como indicativo da referida detecção e quantificação nas amostras biológicas, a hibridação poderá

	ser feita fluorescência.	de preferência	por
Ora,	as	referidas amostras	biológicas podem	ser

provenientes de sangue, ar, alimentos, água, biopsias ou fezes, entre outras.

É ainda objecto da presente invenção a utilização das sondas de PNA anteriormente descritas, a utilização dos estojos anteriormente descritos e da metodologia para serem aplicadas numa metodologia de detecção da Salmonella, ou de detecção da Salmonella em amostras biológicas.

Descrição geral da invenção

A presente invenção engloba a sonda de PNA, reagentes, métodos e estojo destinados à detecção ou quantificação de estirpes de Salmonella.

A sonda aqui descrita permite a detecção especifica do qénero Salmonella através da liqação ao rRNA, sequências genómicas correspondentes ao rRNA (r) , ou ainda sequências complementares às mesmas.

A maior especificidade das sondas de PNA (relativamente às sondas de DNA) permite uma melhor discriminação de sequências de nucleótidos relacionadas.

Isto tem particular importância para esta sonda uma vez que existem alquns microrqanismos filoqeneticamente relacionados com a Salmonella que apresentam apenas um nucleótido de diferença (nucleótido na posição 14 da sonda descrita nesta invenção) na reqião alvo seleccionda. São exemplos desta situação as espécies de Shigella, a espécie Yerslnla enterocolltlca e a estirpe Escherlchla coll K12.

A sonda de PNA descrita nesta invenção tem 15 nucleótidos com a sequinte sequência nucleotidica:

SEQ ID No. 1 - 5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'.

No entanto, a sonda a usar na detecção por ser até 86% idêntica à sequência acima mencionada.

Esta sonda é aplicada à análise por hibridação in situ fluorescente (FISH), que, no caso de amostras positivas para Salmonella, resulta na emissão de um sinal fluorescente detectável quer através de microscopia de fluorescência quer através de citometria de fluxo.

desenvolvimento da nova sonda de PNA-FISH foi realizado de forma empírica com recurso a softwares específicos. A selecção da sequência da sonda foi feita inicialmente através do alinhamento de sequências de rDNA do microrganismo alvo, com sequências de microrganismos muito relacionados.

Isto permitiu identificar as regiões potencialmente úteis que depois serão avaliadas com base em outros parâmetros como: especificidade, temperatura de hibridação, percentagem de guanina/citosina, energia livre de ligação e estrutura secundária.

Após o desenho e sintese da sonda, as 3 etapas do procedimento de FISH, fixação/permeabilização, hibridação e lavagem, têm que ser desenvolvidos e optimizados para a sonda seleccionada. Este processo geralmente envolve os seguintes parâmetros: temperatura, concentração de formamida e etanol, e tempo de hibridação e lavagem. De referir que, devido à complexidade do processo e ao grande número de variáveis existentes, nem sempre é possível desenvolver um método para cada sequência e como tal, muitas vezes várias alternativas e sequências são testadas.

Uma hibridação bem sucedida permite depois aferir da presença/ausência e mesmo concentração de um microrganismo, por microscopia de fluorescência, citometria de fluxo ou PCR em tempo real. 0 sinal fluorescente detectado é geralmente o resultado da ligação especifica das pequenas sondas às dezenas ou centenas de cópias de rRNA existentes no citoplasma da bactéria. Essa fracção detectável da sonda, que reporta a existência de um complexo estável formado pela sonda e o alvo, é seleccionada a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de detecção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente.

método descrito na presente invenção compreende o contacto de uma amostra com pelo menos uma sonda de PNA com sequência semelhante à anteriormente descrita. Consequentemente, a análise é baseada num único ensaio com um parecer definitivo contrariamente aos métodos convencionais de detecção de Salmonella que se baseiam em caracteristicas fenotipicas e requerem vários dias a fornecer o resultado.

É ainda objecto da presente invenção um estojo adequado à execução do ensaio para detectar, isto é encontrar, identificar ou quantificar, a Salmonella presente em amostras biolóqicas. 0 estojo da invenção inclui a sonda de PNA e outros reagentes ou compostos seleccionados para a realização dos ensaios de hibridação in situ.

Numa realização ainda mais preferencial, o de um estojo adequado à execução do ensaio para detectar, identificar ou quantificar Salmonella contém ainda uma solução de fixação, hibridação e lavagem.

Preferivelmente, o método pretende ser um meio de diagnóstico coadjuvante para a decisão terapêutica e controlo de qualidade. A implementação deste método na identificação de Salmonella permitirá deste modo, adequar o tratamento clinico à bactéria em causa e identificar prematuramente focos de contaminação.

As sondas de PNA podem ser aplicadas directamente na amostra preparada em lâmina, já que a aplicação destas sondas não envolve o uso de reagentes ou enzimas para a permeabilização das membranas celulares antes da hibridação. No entanto, necessita de alguns dos compostos mais utilizados nas hibridações. Assim, as sondas são normalmente incluídas em estojos que permitam um mais fácil manuseamento por parte dos utilizadores.

Se a abordagem pretendida envolver a análise do PNA-FISH por citometria de fluxo, a sonda poderá ser aplicada na amostra em suspensão, utilizando os mesmos compostos para a hibridação.

Descrição detalhada da invenção

I - Definições

a) Como usado neste documento, termo nucleótido inclui moléculas naturais e não naturais normalmente conhecidas por quem utiliza tecnologia relacionada com ácidos nucleicos, para desse modo gerar polímeros que se ligam especificamente a ácidos nucleicos.

b) Quando usado o termo sequência de nucleótidos, é o mesmo que referir um segmento de um polímero que contém subunidades,

c) 0 termo sequência neste caso os nucleótidos.

alvo significa uma sequência de nucleótidos da Salmonella que se pretende que seja detectada no ensaio, onde a porção de nucleótidos da sonda é desenhada para hibridar.

d) 0 termo sonda de PNA significa um polímero de subunidades de PNA que apresenta uma sequência de nucleótidos e é especifica para hibridar com uma sequência alvo do microrganismo de interesse. As moléculas de PNA são mimicas das de DNA, na qual a estrutura carregada negativamente de açúcar-fosfato é substituída por uma aquiral e electricamente neutra formada por unidades repetidas de N -(2-aminoetil) glicina.

e) Quando é usado o termo fracção detectável, este refere-se a moléculas que podem ser ligadas à sonda, para, assim, tornar a sonda detectável por um instrumento ou método.

f) 0 termo amostra refere-se a qualquer amostra biológica que pode conter o microrganismo ou sequência alvo para a detecção. As amostras poderão ser clinicas (por exemplo: sangue, urina, fezes, etc...), alimentares (carne, ovos, formulas infantis, leite, etc...) ou ambientais (por exemplo: água).

II - Breve Descrição das figuras

A figura 1 representa o alinhamento parcial da sequências de RNA 23S para a selecção da sonda. A sequência complementar da sonda SalPNA1873 é apresentada por cima do alinhamento e as posições polimórficas estão também assinaladas.

III - Descrição

Concepção das sondas de PNA:

Para identificar oligonucleótidos potencialmente úteis para usar como sonda, foram escolhidas dezassete sequências de rDNA 23S disponíveis no sítio do National Centre for

Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Esta selecção contemplou dez sequências de Salmonella, incluindo estirpes representativas de cada uma das sete subespécies, e sete outras estirpes de espécies relacionadas pertencentes à família Enterobacteriaceae (Figura 1). As sequências foram alinhadas usando o programa ClustalW disponível no European Bioinformatics Institute (EBI) e foram seleccionadas as regiões de interesse. Foram identificadas seis regiões potencialmente úteis que foram posteriormente testadas no NCBI (programa BLAST) e no SILVA rRNA database project (programa ProbeCheck), de forma a encontrar a sonda com o maior número de sequências de Salmonella detectadas e com o menor número de sequências não-Salmonella detectadas. Foram utilizados também outros critérios para a selecção da sonda como: a percentagem de Guanina/Citusina; o tipo de estruturas secundárias e a temperatura de hibridação. Apenas uma região com 18 pb se mostrou capaz de detectar todas as estirpes de Salmonella existentes na base de dados do NCBI. Para esta região foram concebidas quatro sondas possíveis. Uma dessas sondas foi selecionada por não hibridar com qualquer sequência não-Salmonella e por conter 60% de bases GC. De acordo com os critérios de selecção referidos, a sequência escolhida foi: 5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'. Esta sequência hibrida nas posições 1873 a 1887 do RNA 23S da estirpe S. enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium LT2 (ATCC 43971), número de acesso U77920. A sonda foi chamada de SalPNA1873 devido à posição inicial da sequência alvo na estirpe LT2.

Posteriormente, a sequência seleccionada foi sintetizada e os oligonucleótidos acoplados, no terminal amina, ao fluorocromo Alexa Fluor 594.

Avaliação teórica do desempenho da sonda de PNA:

Após a concepção da sonda, o seu desempenho foi avaliado através da determinação dos valores teóricos da sensibilidade e da especificidade. Estes parâmetros foram avaliados com recursos ao programa acima mencionado, ProbeCheck disponíveis na base de dados SILVA de rRNA. Para esta estimativa teórica todas as 101 sequências de Salmonella presentes na base de dados foram consideradas (incluindo apenas as sequências de boa qualidade com mais de 1900 pb) . A sonda foi alinhado com um total de 11.124 sequências presentes na base de dados para a subunidade grande do RNA (23S/28S, LSU). Também foi testado contra a base de dados para a subunidade pequena (16S/18S, SSU) para avaliar a existência de uma possível hibridação com as sequências de 16S rRNA. A especificidade foi calculada como nSs / (TnS) xlOO, onde nSs representa o número de estirpes não-Salmonella que não reagiu com a sonda e TnS o número total de estirpes não-Salmonella examinadas. A sensibilidade foi calculada como Ss / (TSs) x 100, onde o Ss é o número de estirpes de Salmonella detectados pela sonda e TSs é o número total de estirpes de Salmonella existentes na base de dados.

A pesquisa confirmou que a sonda SalPNA1873 apenas detectou as 101 sequências de Salmonella spp. existentes na base de dados. Portanto, ambos os valores de especificidade e sensibilidade teóricos foram de 100% (Tabela 1).

A fim de comparar a sonda desenvolvida neste estudo com aquelas anteriormente desenvolvidos, testaram-se a especificidade e sensibilidade teóricas das sondas

Sal23S10 (Perry-O' Keef e et al., 2001), - SEQ ID No. 6 ;

Salm63 (Kutter et al., 2006) - SEQ ID No. 7;

Sal3 (Nordentoft et al., 1997) - SEQ ID No. 8 foram também avaliadas com o programa ProbeCheck(Tabela 1).

A avaliação teórica destas sequências mostrou que as sondas Seq. ID N° 6, Seq. ID N° 7 e Seq. ID N°8, detectam respectivamente, 95, 73 e 96 sequências de Salmonella das 101 estirpes existentes na base de dados, que correspondem a valores de sensibilidade de 94%, 72% e 95%. Relativamente ao número de sequências não-Salmonella detectadas, a Seq ID N° 1 e Seq. ID N° 8 não detectam nenhuma sequência, ao contrário das Seq. ID N° 6 e Seq. ID N° 7. Estes valores permitem estimar especificidades de 100% (Seq. ID N° 1 e Seq. ID N° 8), 98.13% (Seq. ID N° 6) e 99.97% (Seq. ID N° 7) .

A avaliação teórica efectuada mostra que a sonda SalPNA1873 melhora a detecção de Salmonella principalmente devido a dois aspectos: as vantagens da molécula PNA e os valores de especificidade e sensibilidade da sonda descrita neste documento. A molécula PNA torna o procedimento de FISH mais fácil e rápido em comparação com o procedimento de DNA FISH para as sondas sal3 e Salm63, enquanto que nenhuma das sondas de PNA existentes supera os valores teóricos de especificidade e sensibilidade obtidos para a sonda

SalPNA1873.

Tabela 1. Especificidades e sensibilidades teóricas para as sondas existentes para detecção de Salmonella spp.

Sonda	Sal3 SEQ No.8	Salm63 SEQ No.7	Sal23S10 SEQ No.6	SalPNA1873 SEQ No. 1
Tipo	DNA	DNA	PNA	PNA
Sequencia (5' .	AATCACTTCACC	TCGACTGACTTC	TAAGCCGGGAT	AGGAGCTTCG
3' )	TACGTG	AGCTCC	GGC	CTTGC
N° de estirpes
de Salmonella	9 6 *	73*	95*	101*
detectadas
N° de estirpes
não-Salmonella	0#	3#	206#	0#
detectadas
Especificidade( %)	100	99, 97	98,13	100
Sensibilidade(% )	95,05	72,23	94,06	100
Referencia	Nordentoft	Kutter et	0' Keefe et	Presente
	et ai., 1997	al., 2006	al., 2001	invenção

* Estirpes de Salmonella detectadas num total de 101 sequências presentes na base de dados.

#Estirpes não-Salmonella detectadas num total de 11 023 sequências não-Salmonella depositadas na base de dados.

A sonda de PNA desta invenção contém preferencialmente 15 nucleótidos e poderá ser pelo menos 86% idêntica à sequência SEQ ID No. 1 - 5'- AGG AGC TTC GCT TGC-3', de preferência 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,

96%, 97%, 98%, 99%, 100% de semelhança com a sequência SEQ

ID No. 1 -5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'.

Alternativamente, esta invenção contempla também variações nas sequências nucleotidicas das sondas. Tais variações podem incluir delecções, inserções entre outras. Como por exemplo uma das seguintes sequências:

SEQ	ID	No .	2	- 5'-TCA	GGA	GCT	TCG	CTT-3';
SEQ	ID	No .	3	- 5'-GGA	GCT	TCG	CTT	GCG-3';
SEQ	ID	No.	4	- 5'-TCA	GGA	GCT	TCG	CTT GC-3';
SEQ	ID	No .	5	- 5'-AGG	AGC	TCC	GCT	TGC-3'.

Fracção detectável da sonda de PNA:

Não limitado aos seguintes exemplos, a fracção detectável da sonda de PNA pode incluir diferentes tipos de moléculas, como conjugados de dextrano, cromóforos, fluoróforos, radioisótopos, enzimas, hapteno, composto quimioluminescente entre outros.

Como exemplo, entre a classe dos fluoróforos são preferíveis para utilização (mas não limitados a) : fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',7'-diclorofluoresceína, o 5-ROX (5carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio).

Método:

A presente invenção apresenta um método para a determinação de Salmonella usando uma sequência de nucleótidos com pelo menos 86% de homologia com a região de 15 nucleótidos aqui descrita - SEQ ID No. 1.

método pode contemplar o contacto de uma amostra com a sonda de PNA descrita neste documento com a sequência alvo da bactéria sob condições de hibridação adequadas ou condições de hibridação in situ adequadas (como apresentado no EXEMPLO 1).

método pode ser dividido em: preparação das amostras (que contempla o passo enriquecimento, quando necessário), fixação, hibridação, lavagem e visualização dos resultados (ver EXEMPLO 1).

método pode ser realizado em células aderidas ou em suspensão.

Condições de Hibridação - Optimização:

Os seguintes passos é uma optimização possível das condições de optimização, sem ter a intenção de ser limitativo:

Existem vários factores que influenciam a hibridação da sonda de PNA e a sequência alvo.

Estes incluem a percentagem de formamida (ou outro reagente quimico força iónica, a concentração salina e percentagem de etanol, consequentemente a a temperatura de hibridação e lavagem, a concentração de detergente, o pH entre outros.

Para identificar as condições óptimas de hibridação, pode ser necessário fixar os diferentes factores e variar cada factor isoladamente até se encontrar um grau de discriminação desejado.

Quanto mais próxima se encontra uma sequência alvo de outra não-alvo na amostra, maior terá que ser o grau de rigor na definição dos diferentes factores que influenciam a hibridação. Nesta invenção sequências não-alvo, como por exemplo as espécies de Shigella, podem ter apenas um nucleótido de diferença em relação às sequências alvo, sendo necessário um elevado nivel de descriminação de forma a evitar hibridações não especificas.

Para as sondas descritas neste documento foram detectadas as seguintes condições:

temperaturas de hibridação, entre 53 °C e 59 °C. 0 sinal de fluorescência mais forte foi obtido a 57 ° C, independentemente da realização da hibridação em lâminas ou em suspensão.

concentrações de etanol, entre 50% e 80%, na etapa de fixação, mas não foi encontrada qualquer diferença na intensidade do sinal.

tempo de hibridação foi testado (30, 45, 60 e 90 min) mas os tempos mais curtos mostraram-se tão eficientes quanto os mais longos.

Depois da optimização de todos os parâmetros acima referidos, verificamos que o procedimento que proporcionou o melhor sinal de fluorescência foi:

Foram preparados esfregaços de cada cultura bacteriana em lâminas adequadas à visualização em microscópio de fluorescência.

Os esfregaços foram:

paraformaldeido (Sigma) durante 10 minutos, (vol /vol) etanol, também durante 10 minutos.

Depois de secas ao ar, as amostras foram então cobertas com 2 0 μΐ de solução de hibridação contendo:

(Sigma);

mM de NaCl (Sigma); 30% de formamida (Sigma);

(peso/vol) pirofosfato de polivinilpirrolidona (Sigma); 0,2% (peso/vol)

Ficol (Sigma), 5 mM de

EDTA dissódico (Sigma);

X-100 (Sigma); 50 mM

Tris-HCl (pH

7,5; Sigma) e 200nM de sonda PNA;

as amostras foram cobertas com lamelas, colocados em pequenas caixas húmida protegidas da luz e incubadas por minutos a 57 ° C;

Posteriormente, as lamelas foram retiradas e as lâminas foram submersas numa solução de lavagem previamente aquecida (57°C) contendo 5 mM Tris

Base (Sigma), 15 mM de NaCl (Sigma) e passo de lavagem foi também realizado a 57

C durante 30 minutos.

Posteriormente, as lâminas foram removidas da solução de lavagem e secas a 57°C na mesma incubadora durante aproximadamente 5 minutos.

Antes da visualização ao microscópio, foi colocada uma gota de óleo de imersão nãofluorescente (Merck) e lamela.

As lâminas foram armazenadas no escuro por um periodo máximo de horas antes da microscopia.

A hibridação pode ser também realizada em suspensão.

Em alguns casos este procedimento ajuda a eliminar quase na totalidade autofluorescência, nomeadamente autofluorescência dos eritrócitos, no caso de amostras sanguíneas, e a autofluorescência das proteínas das fórmulas infantis.

Neste caso a cultura homogeneizada em água estéril é centrifugada (10.000 o precipitado homogeneizado em 500μ1 de paraformaldeido.

Após hora, as células são novamente centrifugadas, para remover o paraformaldeido, e o precipitado é homogeneizado em 500μ1 de 50% etanol. Após 30 minutos de incubação a -20°C, as células são novamente homogeneizadas em ΙΟΟμΙ de solução de hibridação com 200nM de sonda de PNA e incubadas a 57°C por 30 minutos. Após a hibridação, as células são centrifugadas e homogeneizadas em 500μ1 de solução de lavagem (como descrito acima) e incubadas a 57°C por 30 minutos. Finalmente as células são centrifugadas para remover a solução de lavagem e homogeneizadas em 500μ1 de água estéril. Seguidamente são colocados 20μ1 da suspensão em lâminas adequadas para fluorescência ou filtrados cerca de 200μ1 em membrana negras (porosidade 0,2 Hm, Nitrato de celulose, Whatman).

Para comprovar que o sinal obtido não estava relacionado para autofluorescência, todas as amostras foram visualizadas com os outros filtros disponíveis. As amostras foram também coradas simultaneamente com DAPI para confirmar que todas as células presentes estavam marcadas com a sonda SalPNA1873 - SEQ ID No. 1(descrita na presente invenção) . Além disso, foi realizado um controlo negativo para cada ensaio, seguindo todas as etapas do procedimento mas sem adição da sonda na solução de hibridação.

Avaliação da especificidade e sensibilidade experimentais da sonda:

Após a optimização das condições de hibridação, foram avaliados os valores da especificidade e sensibilidade experimentais da sonda de PNA.

Para isso, o procedimento foi aplicado a 61 estirpes representantes do género Salmonella (pertencentes às duas espécies de Salmonella e às seis subespécies S. entérica), e a outras 46 estirpes. Essas estirpes incluíram 25 estirpes taxonomicamente relacionados que pertencem à mesma família (Shigella, Klebsiella, Citrobacter, Pantoea, Yersinia, Enterobacter, Escherichia coli e Serratia) e 21 estirpes pertencentes a diferentes ordens (Pseudomonas), classe (Helicobacter e Campylobacter) ou até mesmo filo (Listeria e Staphylococcus aureus). Com a excepção da S. enterica subsp. VI que não foi detectada pelo SalPNA1873 SEQ ID No. 1, todas as restantes 59 estirpes de Salmonella foram detectados, ao mesmo tempo que não foi observada qualquer hibridação para as demais espécies utilizadas.

Não foi possível avaliar o resultado de PNA FISH para três espécies de Shigella, por causa do forte sinal de autofluorescência dessas estirpes tanto nas amostras positivas como negativas (sem sonda). Este resultado não está relacionado com a diferença de um único nucleotido entre a sonda e as espécies de Shigella uma vez que a Shigella flexneri, que tem uma sequência de RNA similar, não hibridou com a sonda. Além disso, outras espécies, como Yersinia enterocolitica e Escherichia coli K12 também têm apenas um polimorfismo, exactamente na mesma posição, e nenhuma reacção cruzada foi observada. Este resultado corrobora a observação de outros autores que afirmam que as sondas de PNA permitem distinguir as sequências com apenas um nucleotido de diferença (Petersen et al., 2004) . Com base nestes resultados foi obtida uma especificidade experimental de 100% e sensibilidade de 96.7%.

Enriquecimento:

As amostras a analisar podem ser provenientes de alimentos, biopsias, sangue, água, fezes entre outros.

As amostras contendo Salmonella baixos níveis de contaminação.

apresentam

Por geralmente este motivo recomendado um passo de enriquecimento da amostra que facilita o processo de detecção. Este passo de enriquecimento pode ser feito em vários tipos de meio de cultura, desde meios ricos complexos até meios selectivos para Enterobacteriaceas e/ou Salmonella. A temperatura de incubação poderá variar consoante o meio escolhido e o tempo de incubação recomendado deverá ser de 8 a 24 horas.

A sonda de PNA descrita nesta invenção, foi testada em quatro tipos diferentes de amostras: água, fezes, fórmula infantil e sangue. As amostras foram enriquecidas de acordo com o procedimento comummente usado na análise dos diferentes tipos de amostras. Para o caso da água e das fezes, foi feito o primeiro passo de pré-enriquecimento em água peptonada tamponada (BPW) (16 a 18 horas) recomendado pela International Organization for Standardization (ISO). Após este enriquecimento, a sonda permitiu a detecção da Salmonella em todas as amostras testadas e os resultados foram concordantes com os obtidos pelos métodos ISO aconselhados para estas amostras, ISO 6579:2002 (Detecção de Salmonella em alimentos e rações para animais) e ISO 6340:1995 (Qualidade da água - detecção e enumeração de Salmonella), para fezes e água, respectivamente.

No caso da fórmula infantil, esta foi dissolvida em água (1:10) e incubada durante 8 horas a 37°C, como anteriormente sugerido para a detecção de Enterobacter sakazakii no mesmo tipo de amostras. Para o caso do sangue, foi feito um enriquecimento de 16-18 horas a 37°C no meio comummente usado nas culturas de sangue (TSB - Trypitcase Soy Broth). Após o enriquecimento, a detecção da bactéria foi realizada em lâmina ou suspensão. Antes da hibridação, as amostras podem ser diluídas 1 para 10 em água destilada estéril, de forma a minimizar a interferência da autofluorescência de alguns componentes (como por exemplo das proteínas da formula infantil ou dos eritrócitos). Todas as amostras contendo Salmonella foram positivas usando a sonda de PNA descrita nesta invenção.

Estes ensaios mostraram que, de uma forma geral a detecção usando a sonda de PNA foi capaz de detectar Salmonella em diferentes amostras em menos de 20 horas. Além disso, vimos que amostras contendo apenas 1 UFC podem ser detectada usando uma etapa de enriquecimento de apenas 8 horas.

Apesar de terem sido testados os meios de enriquecimento aconselhados para cada tipo de amostra, é possível fazer a uniformização da etapa de enriquecimento. Vários autores têm demonstrado que a água tamponada peptonada (BPW) pode ser usada como meio de cultura universal no enriquecimento se amostras com Salmonella, mesmo para amostras com elevados niveis de microrganismos concorrentes.

A comparação deste método com os métodos convencionais utilizados para as amostras anteriormente referidas, mostrou que a implementação da sonda de PNA permite poupar pelo menos 3 dias na detecção de bactérias do género Salmonella.

Para o caso de amostras sólidas compactas, estas deverão ser submetidas a um processo mecânico de batimento de pás planas, que vai desagregando a amostra, libertando a bactéria para a água tamponada peptonada. No caso das biopsias, as amostras são cortadas em tiras de 3 a 5 μιη, colocadas em lâminas e submetidas ao processo de hibridação directamente sem a necessidade de qualquer passo de enriquecimento.

A maioria dos métodos desenvolvidos para detectar Salmonella são baseados em técnicas de PCR ou meios de cultura selectivos/diferênciais. Enquanto os primeiros são tecnicamente mais exigentes e geralmente envolvem também uma etapa de enriquecimento para melhorar o limite de detecção, os segundos são demorados e podem fornecer resultados ambíguos. 0 procedimento de PNA FISH descrito neste documento é tecnicamente menos exigente que os métodos de PCR e mais rápidos e precisos que os meios de cultura. Embora o passo de enriquecimento seja necessário, o tempo total necessário para a obtenção do resultado é inferior a 20 horas (excepto para PIF que demora apenas 12 horas), um valor semelhante ou até melhor do que os descritos para os métodos baseados em PCR.

O método aqui descrito demonstrou ser uma alternativa viável para as técnicas de cultura actualmente utilizadas, para as sondas de Salmonella existentes e até mesmo para os protocolos de ELISA e PCR. Foi demonstrado que a sonda de PNA descrita neste documento: permite poupar 3 dias na detecção quando comparada com as técnicas de cultura convencionais, apresentam maior especificidade do que as sondas previamente descritas quer sejam de DNA ou PNA (ver Tabela 1), e não é afectada pela presença de substâncias que actuam como inibidoras em algumas abordagens moleculares, nomeadamente a PCR.

Visualização dos resultados.

Esta etapa pode ser realizada em qualquer microscópio de epifluorescência com um filtro sensível ao fluoróforo em questão. Outros filtros presentes no microscópio, que não são capazes de detectar o sinal fluorescente da sonda, foram utilizados a fim de confirmar a inexistência de autofluorescência.

Estojo:

A presente invenção contempla ainda um estojo que permite a realização do ensaio que determina a presença de bactérias do género Salmonella.

estojo nesta invenção compreende uma sonda PNA semelhante pelo menos 86% à sequência SEQ ID No 1 e outros reagentes ou composições que são seleccionados para a realização do ensaio.

As sondas de PNA, as suas caracteristicas, os métodos e estojo desta invenção são apropriados à análise de ácidos nucleicos presentes, ou não, internamente no organismo de interesse. Assim, esta invenção pode ser usada para ambas, análise do organismo ou análise dos ácidos nucleicos extraídos ou derivados do organismo de interesse, fazendo com que a fonte da sequência alvo não seja uma limitação nesta invenção.

Os seguintes exemplos ilustram diferentes situações e diversos passos de aplicação da invenção, são realizações preferências da presente invenção, sem ter a intenção de ser limitativo em qualquer um deles:

EXEMPLO 1: Detecção de bactérias do género Salmonella em diferentes tipos de amostras (clinicas, alimentares ou ambientais)

Sequência:

SEQ ID No. 1 - 5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3' (acoplada ao Alexa

Fluor 594)

Preparação das amostras:

As amostras clinicas, alimentares ou ambientais, foram submetidas a um passo de enriquecimento antes da aplicação da sonda de PNA. Isto deve-se ao facto de a Salmonella apresentar geralmente baixos niveis de contaminação.

Este passo de enriquecimento pode ser feito no meio recomendado pelo método convencional de análise para cada amostra. No caso de alimentos, rações animais, fezes ou água, foi utilizada a BPW. Para o caso do leite em pó ou fórmulas infantis, foi usada água estéril para dissolver o pó na razão 1/10 (peso/vol). Para o sangue foi usado o meio complexo TSB comummente utilizado nas culturas de sangue. Os tempos de incubação variaram entre 8 (leite em pó e formulas infantis) e 16-18 horas (fezes, água, sangue, etc.), a 37°C e agitação de 120 rpm.

Para a análise de diferentes tipos de amostras em simultâneo é recomendada a uniformização do método realizando um enriquecimento em BPW durante 8 horas a 37°C, 120 rpm. No caso de o resultado ser negativo para as 8 horas de incubação, a análise por PNA FISH deve ser repetida após o enriquecimento overnight (16 a 18 horas).

Após o enriquecimento, foi colocada uma gota do meio de cultura em lâmina adequada para fluorescência. A lâmina foi colocada cerca de 5 minutos na estufa a 57°C ou deixada ao ar para secar.

As amostras que não precisam de uma etapa de enriquecimento passam directamente para a etapa de fixação.

Fixação:

Com o objectivo de prevenir a perda de 23S rRNA durante o processo de hibridação, a amostra foi imersa numa solução de 4% (peso/vol) de paraf ormaldeido e de 50% (vol/vol) etanol durante dez minutos cada.

Hibridação:

Após a fixação, as amostras foram então cobertas com uma gota de solução de hibridização contendo: 10% (peso/vol)de sulfato dextran (Sigma) ; lOmM de NaCl (Sigma) ; 30% (vol/vol)de formamida (Sigma); 0,1% (peso/vol) pirofosfato de sódio (Sigma); 0,2% (peso/vol) polivinilpirrolidona (Sigma); 0,2% (peso/vol) Ficol (Sigma), 5 mM de EDTA dissódico (Sigma); 0,1% (vol/vol) Triton X-100 (Sigma); 50 mM Tris-HCl (pH 7,5; Sigma) e 200nM de sonda PNA. As amostras foram cobertas com lamelas (para garantir o espalhamento uniforme da sonda), colocados em pequenas caixas húmida (para impedir a evaporação da solução de hibridação) protegidas da luz e incubadas por 30 minutos a 57°C.

Lavagem:

Após o tempo de hibridação as lamelas foram removidas e as lâminas imersas numa solução de lavagem pré-aquecida a 57°C contendo 5mM de Tris Base, 15mM de NaCl e 1% (vol/vol) de Triton X (pH 10) . As amostras foram então colocadas na estufa à temperatura de hibridação durante 30 minutos. Posteriormente, as lâminas foram removidas da solução de lavagem e secas a 57°C, na mesma incubadora, durante aproximadamente 5 minutos. Antes da visualização ao microscópio, foi colocada uma gota de óleo de imersão nãofluorescente (Merck) e lamela. As lâminas foram armazenadas no escuro por um periodo máximo de 24 horas antes da microscopia.

Resultados:

Os resultados são obtidos através de observação ao microscópio de fluorescência com filtro adequado à detecção do fluorocrómo Alexa Fluor 594 ligado à sonda de PNA.

EXEMPLO 2: Detecção de bactérias dos géneros Salmonella e Cronobacter em fórmulas infantis.

Este exemplo pretende ilustrar a possibilidade de utilizar a sonda de Salmonella spp. em conjunto com a sonda de Cronobacter spp. previamente desenvolvida no trabalho de Almeida et al., 2009. Estes dois géneros foram recentemente indicados como os contaminantes mais frequentes de fórmulas infantis, que são por sua vez a maior causa de bacteremia, meningite e enterocolite necrótica em recém-nascidos. Estas duas sondas têm temperaturas de hibridação muito próximas e podem ser usadas facilmente num ensaio multiplex (utilização simultânea de várias sondas).

Sequências:

SEG ID No. 1 - 5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3' (acoplada ao Alexa Fluor 594)

SEG ID No. 6 - 5'-TGC AGG ATT CTC TGG-3'(acoplada ao Alexa Fluor 488)

Preparação das amostras:

Foram pesadas lOg de cada fórmula infantil e hidratadas com 90ml de água estéril. Podem ser usadas quantidades superiores de fórmula infantil, mas mantendo a razão de

1/10 (peso/vol). Seguidamente, as amostras hidratadas foram incubadas durante 8 horas a 37°C e 120 rpm. Após o enriquecimento, retiraram-se amostras que foram diluídas 1/10 para minimizar a interferência da autofluorescência das proteínas da fórmula infantil. Finalmente colocou-se uma gota da amostra diluída numa lâmina adequada e deixouse secar ao ar ou na estufa a 57°C durante cerca de 5 minutos.

Hibridação:

A hibridação foi realizada como descrito anteriormente no Exemplo 1 com uma pequena diferença. A solução de hibridação continha duas sondas: sonda de PNA para detectar Salmonella e sonda de PNA para detectar Cronobacter), cada uma na concentração de 200nM.

Lavagem:

A lavagem foi realizada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 1.

Resultados:

Os resultados foram obtidos através da observação ao microscópio de fluorescência com filtro adequados detecção do fluorocromos Alexa

Fluor 594 e 488 ligados às sondas de PNA.

Referências:

Almeida, C. ,

N. F. Azevedo,

C.

Iversen,

S. Fanning,

C.

W. Keevil, and M. J. Vieira,

2009.

Development and application of a novel peptide nucleic acid probe for the specific (Enterobacter detection of Cronobacter genomospecies sakazakii) in powdered infant formula.

Appl Environ Microbiol 75:2925-30.

Perry-0'Keefe, H., S. Rigby, K. Oliveira, D. Sorensen, H. Slender, J. Coull, and J. J. Hyldig-Nielsen, 2001. Identification of indicator microorganisms using a standardized PNA FISH method. Journal of Microbiological Methods 47:281-292.

Kutter, S., A. Hartmann, and M. Schmid. 2006. Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp. Fems Microbiology Ecology 56:262-271.

Nordentoft, S., H. Christensen, and H. C. Wegener. 1997. Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide tide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears. Journal of Clinicai Microbiology 35:2642-2648.

WO 02/27036 A2 - Probes, probe sets, methods and kits pertaining for the detection, identification and/or enumeration of bactéria.

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Sonda de PNA para a detecção e/ou quantificação de Salmonella caracterizada por compreender pelo menos uma sequência com 8 6% de semelhança com a sequência SEG ID No. 1 -5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3'.
2. 2. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender pelo menos uma sequência das seguintes sequências SEG ID No. 1 -5'-AGG AGC TTC GCT TGC-3';

   SEQ ID No . 2 - 5'-TCA GGA GCT TCG CTT-3'; SEQ ID No . 3 - 5'-GGA GCT TCG CTT GCG-3'; SEQ ID No. 4 - 5'-TCA GGA GCT TCG CTT GC-3'; SEQ ID No . 5 - 5'-AGG AGC TCC GCT TGC-3'.
3. 3. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por detectar a sequência alvo no rRNA, no rDNA ou nas sequências complementares do rRNA de Salmonella.
4. 4. Sonda de PNA, de acordo com as reivindicações 1-3, caracterizada por se encontrar ligada a pelo menos um tipo de fracçâo detectável.
5. 5. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por o tipo de fracçâo detectável da sonda ser seleccionada a partir de um dos seguintes grupos: um conjugado, um sistema de detecção ramificado, um cromóforo, um fluoróforo, radioisótopo, uma enzima, um hapteno ou um composto luminescente.
6. 6. Sonda de PNA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o grupo fluoróforo ser pelo menos um dos seguintes: fluoróforos de Alexa series, Alexa Fluor series, cianinas, 5-(e -6) Carboxi-2',7'diclorofluoresceína, o 5-ROX (5-carboxi-X-rodamina, sal trietilamónio).
7. 7. Estojo para a detecção da Salmonella caracterizado por compreender pelo menos uma das sondas descritas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.
8. 8. Estojo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender ainda pelo menos uma das seguintes soluções: uma solução de fixação, uma solução de hibridação e uma solução de lavagem.
9. 9. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a solução de fixação compreender paraformaldeido e etanol, nomeadamente 2-8% (peso/vol) de paraformaldeido e 25-90% (vol/vol) de etanol.
10. 10. Estojo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a solução de hibridação compreender formamida.
11. 11.

    Método de detecção da

    Salmonella caracterizado por utilizar as sondas de PNA descritas nas reivindicações

    6 e por compreender os seguintes passos:

    a. contacto da sonda de

    PNA com as amostras biológicas;

    b. hibridação da sonda de PNA com a sequência alvo dos microrganismos presentes nas referidas amostras;

    c. detecção da hibridação como indicativo da referida detecção e quantificação nas referidas amostras.

    12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a referida amostra biológica ser proveniente de sangue, ar, alimentos, água ou biopsias. 13. Método de acordo com a reivindicação 11,

    caracterizado por a hibridação ser por fluorescência.
12. 14. Utilização das sondas de PNA como descritas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada por ser aplicada numa metodologia de detecção da Salmonella spp. em amostras biológicas.
13. 15. Utilização do estojo descrito em qualquer uma das reivindicações de 7 a 10, caracterizado por ser aplicado na detecção de Salmonella spp. em amostras biológicas.