PT104607A - Derivados triterpenóides úteis como agentes antiproliferativos - Google Patents

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Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AO USO DE NOVOS DERIVADOS LUPANOS DE FÓRMULA GERAL (I) E (II), OU DOS SEUS SAIS, CRISTAIS, COMPLEXOS, HIDRATOS, OU ÉSTERES FARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS POSTERIORMENTE HIDROLISÁVEIS, PARA PREVENIR E/OU INIBIR O CRESCIMENTO DE TUMORES E PARA TRATAR O CANCRO OU OUTRAS DOENÇAS PROLIFERATIVAS, PARTICULARMENTE PARA TRATAR LEUCEMIA, CANCRO DO FÍGADO, DO COLO DO ÚTERO, DO CÓLON E DA PRÓSTATA. A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE AINDA A SÍNTESE DESTES DERIVADOS E AS FÓRMULAS FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM.

Description

1
DESCRIÇÃO "DERIVADOS TRITERPENÓIDES ÚTEIS COMO AGENTES ANTIPROLIFERATIVOS"
Campo da Invenção A presente invenção refere-se à síntese de novos derivados da betulina e do ácido betulínico. Esta invenção refere-se também ao tratamento do cancro, baseando-se na descoberta de que estes novos derivados da betulina e do ácido betulínico são agentes antitumorais potentes.
Antecedentes da Invenção
Actualmente o cancro é a segunda causa de morte nos países desenvolvidos e em fase de desenvolvimento.
Todos os anos, o cancro é responsável pela morte de cerca de seis milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar de importantes avanços no que diz respeito à eficácia da quimioterapia e de outras formas de tratamento, a taxa de mortalidade para a maioria dos tipos de cancro continua a ser muito elevada. Adicionalmente, os efeitos tóxicos que resultam da utilização dos fármacos quimioterapêuticos reduzem severamente a qualidade de vida dos pacientes. Por conseguinte, existe um esforço contínuo, por parte de vários grupos de investigação, para o desenvolvimento de 19 fomentaçâo, inaladores, sprays, aerossóis, enemas, tinturas, detergentes, desinfectantes, gotas nasais e gotas para os ouvidos), cataplasmas, fitas de absorção percutânea, preparações externas para a pele, pomadas (tais como pastas, linimentos e loções). Adicionalmente, exemplos de formas farmacêuticas para administração oral incluem comprimidos para administração interna (comprimidos não revestidos, comprimidos revestido, drageias, comprimidos com revestimento gastroresistente, e comprimidos mastigáveis) , comprimidos para administração na cavidade oral (tais como preparações orais, comprimidos sublinguais e comprimidos adesivos), pós, cápsulas (tais como cápsulas duras e cápsulas moles), grânulos (como os grânulos revestidos, pílulas, preparados líquidos ou formulações de libertação prolongada, farmaceuticamente aceitáveis) . Exemplos específicos de preparações líquidas que podem ser administrados por via oral incluem as soluções para uso interno, misturas, suspensões, emulsões, xaropes, xaropes secos, elixires, infusões, decocções e limonadas. A invenção refere-se também a uma composição farmacêutica compreendendo os compostos acima mencionados e diluentes farmaceuticamente aceitáveis, veículos ou excipientes.
Tal como utilizado aqui, os termos "diluentes farmaceuticamente aceitáveis", "veículos" ou "excipientes", incluem todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, diluentes, 20 lubrificantes, aglutinantes, estabilizadores e agentes reguladores da absorção, e outros fisiologicamente compatíveis. Numa situação espeífica da invenção, o veículo é adequado para a administração parentérica. Alternativamente, o veículo pode ser adequado para administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, sublingual ou oral.
Diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis injectáveis. Os diluentes que podem ser utilizados na composição incluem mas não estão limitados ao fosfato dicálcico, sulfato de cálcio, lactose, celulose, caulino, manitol, cloreto de sódio, amido seco, açúcar em pó e para comprimidos de libertação prolongada a hidroxipropil-metilcelulose (HPMC).
Os aglutinantes que podem ser utilizados na formulação incluem, mas não estão limitados, ao amido, à gelatina e diluentes, tais como sacarose, glicose, dextrose e lactose. Os estabilizadores utilizados são polissaca-rídeos, tais como acácia, agar, ácido algínico, goma guar e tragacanta, e agentes emulsificantes anfotéricos como a gelatina e polímeros sintéticos e semi-sintéticos, tais como resinas carbómero, éteres de celulose, quitina e carboximetilcelulose. Os excipientes que podem ser utilizados na formulação incluem, mas não estão limitados, à celulose microcristalina, sulfato de cálcio, fosfato 21 dicálcico, amido, estearato de magnésio, lactose e sacarose. Os solventes que podem ser usados incluem, mas não estão limitados, à solução de Ringer, água, água destilada, solução de dimetilsulfóxido a 50% em água, propilenoglicol (puro ou em água), tampão fosfato, solução salina balanceada, glicol e outros liquidos convencionais. A utilização destes meios e agentes juntamente com as substâncias farmacologicamente activas é bem conhecida (Rowe, RC et al. Manual de excipientes farmacêuticos, 4 a edição, Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido, 2003) . Compostos activos complementares também podem ser incorporados nas formulações.
As formulações farmacêuticas no âmbito da presente invenção devem conter o agente activo (compostos acima mencionados) numa quantidade efectiva para atingir o efeito terapêutico desejado, evitando os efeitos secundários adversos. A quantidade da formulação terapêutica ou farmacêutica, eficaz no tratamento de uma determinada doença, distúrbio ou condição depende da natureza e gravidade da doença, o local alvo da acção, o peso do indivíduo, dietas especiais, terapêuticas concomitantes, a via de administração e outros fatores que são facilmente reconhecidos pelos especialistas. A dose será adaptada pelo médico de acordo com factores convencionais, tais como extensão da doença e os diferentes parâmetros do indivíduo. As formulações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas 22 em sistemas de libertação controlada. Por exemplo, podem utilizar-se os materiais poliméricos (Smolen, VF e Bali, L., Controlled Drug Biodisponibilidade: Drug design de produto e desempenho, Wiley & Sons, 1984; Ranade W e Hollinger, MA, Drug Delivery Systems (Farmacologia e Toxicologia Series) , 2 a edição, CRRC Press, 2003), ou bombas (Saudek, CD et al., N. Engl. J. Med. 321:574-579, 1989).
Os compostos da presente invenção podem também ser administrados recorrendo à utilização de anticorpos monoclonais, que actuam como transportadores individuais para as moléculas a que estão acoplados. Os compostos da presente invenção podem também ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis, úteis para a realização da libertação controlada do fármaco, por exemplo, o ácido polilático, poliortoésteres, reticulado copolímeros e hidrogéis, ácido butírico e polidi-hidropiranos. Para uso veterinário, um composto da presente invenção ou o sal correspondente, não tóxico, pode ser administrado como uma formulação adequada aceitável, em conformidade com as práticas veterinárias normais. O veterinário pode facilmente determinar a dosagem, regime e via de administração, mais adequados para um determinado animal. A presente invenção fornece também um método para prevenir ou inibir o crescimento de tumores que consiste em estabelecer o contacto entre as células e uma quantidade 23 terapeuticamente eficaz dos compostos acima mencionados. Os tumores nos quais os compostos da presente invenção podem ser aplicados incluem inchaços e tumores verdadeiros, incluindo tumores benignos e malignos. Exemplos específicos destes tumores incluem gliomas, tais como astrocitoma, glioblastoma, meduloblastoma, oligodendrogliomas, ependi-mona e papiloma do plexo coróide, tumores cerebrais, tais como meningioma, adenoma pituitário, neuroma, tumor congénito, tumor cerebral metastático, carcinoma espinocelular, linfoma, uma variedade de adenomas e cancros da faringe resultantes destes adenomas, tais como cancro da epi-faringe, cancro da mesofaringe e cancro da hipofaringe; cancro da laringe, timoma, mesotelioma, como por exemplo mesotelioma pleural, peritoneal e pericardial; cancro da mama, como por exemplo o cancro do dueto toráccico, carcinoma lobular e carcinoma papilar; carcinomas do pulmão, como o carcinoma broncogénico, carcinoma alveolar, adenoma brônquico, carcinoma das células pequenas, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma das células grandes e carcinoma adenoescamoso; carcinoma gástrico; carcinomas do esófago, como por exemplo o carcinoma do colo do útero do esófago, carcinoma toráccico do esófago e carcinoma abdominal do esófago; carcinoma do intestino grosso, tais como carcinoma retal, carcinoma do colón sigmoidal, carcinoma do cólon ascendente, carcinoma do cólon lateral, carcinoma do ceco e carcinoma do cólon descendente; hepatomas, como carcinoma hepatocelular, carcinoma dos duetos intra-hepáticos, blastoma hepatocelular e cistoadenocarcinoma dos duetos hepáticos; carci- 24 noma pancreático; tumores do pâncreas hormono-dependentes , tais como insulinoma,gastrinoma, adenoma produtor de VIP (peptídeo intestinal vasoactivo); carcinoma dos duetos extrahepáticos, carcinoma capsular hepático, carcinoma perianal, carcinoma da pelve renal e uretal; carcinoma uretral; cancros renais, tais como, carcinoma de células renais (tumor Grawitz), tumor de Wilms (nefroblastoma) e angiomiolipoma renal; cancro testicular ou tumores das células germinativas, tais como seminoma, carcinoma embrionário, tumor do saco vitelino, coriocarcinoma e tera- toma; cancro da próstata, cancro da bexiga , carcinoma da vulva; histerocarcinomas, como carcinomas do cólo do útero, cancro do corpo uterino e endometrioma; histeromioma, sarcoma uterino, doenças das vilosidades, carcinoma de vagina, tumores das células germinativas do ovário, tais como disgerminoma, tumor vitelino, teratoma, e tumores ovarianos, tais como o cancro do ovário; melanomas, tais como, nevo nevocítico e melanoma, linfomas cutâneos como a micose fungóide, os cancros da pele, tais como, cancros endoepidermais resultantes de cancros da pele, cancro espinocelular, sarcomas dos tecidos moles, como histio-citoma fibroso, angiossarcoma, lipossarcoma, rabdomios-sarcoma, leiomiossarcoma, sarcoma sinovial, fibrossarcoma, neuroma, hemangiossarcoma, neurofibrossarcoma, hemangiope-ricitoma; linfomas tais como linfoma de Hodgkin e linfoma não-Hodgkin, mieloma, plasmocitoma, leucemia mielóide aguda e crónica, linfoma de células T do adulto e leucemia linfocitica crónica; doenças crónicas mieloproliferativas, como, pletora verdadeira, trombocitemia essencial, mielo- 25 fibrose idiopática, linfadenomegalia (ou inchaço), tumor de derrame pleural, tumor ascítico, outros tipos de adenomas, lipomas, fibromas, hemangeomas, miornas, fibromiornas endo-teliomas.
De acordo com outro aspecto da presente invenção, o contacto das células cancerígenas com um destes compostos é efectivo na indução de paragens do ciclo celular e da apoptose.
Os métodos de preparação dos compostos 14-50, representados nas Tabelas -1 e 2, estão resumidos nos esquemas das FIG. 2-5. Procedimentos convencionais podem ser utilizados na preparação dos diferentes derivados intermediários da betulina e do ácido betulínico, utilizados como substratos. As fórmulas gerais dos compostos da invenção estão representados na FIG. 6. Os compostos da invenção resultam de modificações nas posições C-2, C-3, C-20, C-28 ou C-29 da betulina e ácido betulínico. Estes compostos foram caracterizados com base nos dados espectrais. Os sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis, os isómeros, polimorfos, N-óxidos e metabolitos destes compostos podem ser preparados de acordo com métodos previamente descritos.
Apesar dos vários modelos de realização da invenção estarem divulgados aqui, muitas adaptações e modificações podem ser feitas, no âmbito da invenção, em 26 conformidade com o conhecimento geral dos especialistas. Tais modificações incluem a substituição de qualquer aspecto da invenção por outro equivalente, a fim de se obter o mesmo resultado. Os seguintes exemplos são ilustrativos dos vários aspectos da invenção, e não limitam os aspectos gerais da invenção aqui divulgados. Síntese dos intermediários da betulina e do ácido betulínico
Como a reactividade do grupo hidroxilo da betulina na posição C-28 é muito superior à do hidroxilo em C-3, a 28-acetoxibetulina 4 foi obtida, com um rendimento moderado (78%) utilizando anidrido acético (Ac20) e dois equivalentes de imidazole em CHCI3, durante 2 h a refluxo. A diacetilação da betulina 1 com Ac20 e uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina (DMAP) em CH2CI2 originou o derivado 3β,28-diacetoxibetulina 6, num rendimento elevado (97%). A subsequente hidrólise selectiva do 3β,28-diacetoxibetulina 6 com hidróxido de potássio metanólico em THF, de acordo com um método previamente descrito,(Tietze, L. F. et al., Liebigs Ann. Chem., 12:1245-1249, 1991) originou o composto 3p-acetoxibetulina 3 com um rendimento de 74%. De acordo com a FIG. 3, o éster metílico 5 do ácido betulínico 2, disponível comercialmente foi sintetizado com um bom rendimento (83%) por intermédio da reacção com iodeto de metilo (CH3I) na presença de K2CO3.A metoxilação do grupo isopropenilo da betulina 1 ocorreu em dois passas 27 de acordo com um método previamente descrito (Uzenkova, N. V. et al., Chem. Nat. Compd., 41:692-700, 2005.) No primeiro passo a reacção do derivado 3β,28-diacetoxi-betulina 6 com IV-bromosuccinimida (NBS) em CCI4 originou o derivado 30-bromo que foi posteriormente hidrolisado com NaOH (4M) numa mistura de MeOH:THF,à temperatura ambiente, para originar o derivado 30-metoxi 7 e o derivado 30-bromo 8. A razão entre os compostos 7 e 8 depende das condições reaccionais. Um aumento no tempo da hidrólise origina um aumento na quantidade do derivado 30-metoxi. Para a síntese do composto 9, a betulina 1 foi epoxidada com ácido m-cloroperbenzoico (m-CPBA) , seguido de uma abertura do anel epóxido, catalizada por ácido, para originar os isómeros epiméricos (20R-aldeído) 9 (39%) and (20S-aldeído) 10 (20%) como produtos principais. Os valores mais elevados de desvio químico dos sinais dos protões H-20 e H-30 no espectro de 1H NMR da configuração 20R (δ 9,86 e δ 1,10 ppm) em comparação com os da configuração 20S (δ 9,62 and δ 1,04 ppm) são característicos e são consistentes com os dados reportados na literatura (Okamoto, I. et al., Chem. Pharm. Buli. 48:120-125, 2000). O ácido betulónico 11 foi facilmente obtido por intermédio do método bem conhecido de oxidação com 0 reagente de Jones em acetona (Kim, D . S. H. L. et al., Synth. Commun ., 27: 1607-1612, 1997) . Para a síntese do intermediário 12, 0 ácido betulónico 11 foi desidratado com a 2,3-dicloro-5,6-dicianobenzoquinona (DDQ) em dioxano de acordo com o método já conhecido (Walker, D.; 28
Hiebert, J. D., Chem. Rev., 67:153-195, 1967). 0 procedimento, previamente publicado, que utilize oxigénio na presença de tert-butoxido de potássio (t-BuOK) foi utilizado para a síntese do diosfenol 13 como produto principal (72%) (Urban, M. et al., J. Nat. Prod., 67:1100-1105, 2004). Síntese dos carbamatos e N-acilimidazoles A síntese dos compostos com as fórmulas gerais (I) e (II) foi realizado por intermédio da reacção dos compostos 1-7, 9 e 11-13 com 1,1'-carbonildiimidazole (CDI), 1,1'-carbonilbis(2-metilimidazole) (CBMI) ou 1,1'-carbonildi(1,2,4-triazole) (CDT), a refluxo, em THF anidro e sob atmosfera de N2. A reacção do CDI com alcoóis ou fenóis foi reportada para a obtenção de N-alquilimidazóis ou ésteres carboxílicos do imidazole (carbamatos), dependendo da estrutura do álcool e das condições reaccionais utilizadas (Tang, Y. Q. et al., Synthesis, 15:2540-2544, 2004). No nosso caso a reacção com o CDI, CBMI ou CDT originou os carbamatos 14-29, 33-43 e 50 com bons rendimentos. Por outro lado, a reacção do CDI, CBMI ou CDT com a função ácido carboxílico, dos substratos do tipo lupano, originou os derivados N-acilheterociclicos 30-32 e 44-49 o que está de acordo com resultados previamente obtidos (Rannard, S. P. et al., Org. Lett., 2:2117-2120, 2000). 2 novos agentes anticancerígenos mais potentes e menos tóxicos.
Muitos dos compostos naturais derivados das plantas, como por exemplo, os triterpenos (betulina e ácido betulinico) demonstraram actividade anticancerigena efec-tiva (Setzer, W.N. and Setzer, M.C., Mini-Rev. Med. Chem. 3:540-556, 2003 and Kinghorn, A. D. et al., Planta Med., 70:691-705, 2004). A betulina está presente, em grande quantidade, no súber de várias espécies de bétulas. Por exemplo, o súber da Bétula paparifera contem cerca de 5 a 18% de betulina (U.S. Pat. No. 09/371298). O ácido betulinico também pode ser obtido a partir de fontes naturais U.S. Pats. Nos. 6,264,998, 6,175,035 and 6,943,260 and WO 03/066659) ou por via sintética, a partir da betulina. Pezzuto, J.M. e os seus colaboradores, (U.S. Pat. No. 5,804,575) descreveram dois processos de síntese do ácido betulinico a partir da betulina. Krasutsky, P.A. e os seus colaboradores., (U.S. Pat. No. 6,232,481) descreveram um outro processo para a síntese deste triterpenoíde, envolvendo vários passos. Finalmente Menard, H. e os seus colaboradores (WO 2006/063464) reportaram a síntese do ácido betulinico a partir da betulina por intermédio de uma reacção de oxidação electroquímica. Tanto a betulina como o ácido betulinico apresentaram actividade biológica diversificada, incluindo actividade antiinflamatória, antiviral, antimalárica, anticancerigena, anti-séptica, antimicrobiana e antialimentar (Dzubak, P. et al., Nat. Prod. Rep., 23:294-311, 2006 and Tolstikova, T. G. et al., 29
Materiais e Métodos
Química
As reacções sensíveis ao ar e à água foram realizadas sob atmosfera de azoto. Os reagentes sensíveis foram introduzidos por intermédio de uma seringa seca. 0 THF foi destilado de CaH2. Betulina (1), ácido betulínico (2), CDI, CBMI, CDT, NBS, NaOH, m-CPBA, H2S04, DDQ, t-BuOK e álcool tert-butílico (t-BuOH) foram adquiridos à Sigma Aldrich Co., enquanto que os solventes foram comprados à VWR Portugal. Para a realização de cromatografia em camada fina (TLC) utilizou-se Kieselgel 60HF254/Kieselgel 60G e a cromatografia em coluna flash (FCC) foi realizada com Kieselgel 60 (230-400 mesh, Merk). Todos os rendimentos não foram optimizados e representam genericamente a média de duas experiências. Os pontos de fusão foram determinados num aparelho BUCHI melting point Point B-540 e não são corrigidos. Os espectros de IV foram obtidos num espectroftómetro JASCO FT/IR-420. Os espectros de RMN foram registrados num espectroftómetro Bruker Digital NMR-Avance 300 e no Bruker Digital NMR-Avance 400 em CDCI3 utilizando o Me4Si como padrão interno. A elucidação das estruturas químicas foi feita com base nos espectro de XH RMN, 13C RMN, DEPT135, COSY, HMQC e HMBC. Os desvios químicos (δ) estão reportados em partes por milhão (ppm). Os sinais estão reportados como m (multipleto), s (singuleto), d (dubleto), brs (singuleto largo) e as constantes de acoplamentos (J) são apresentadas em hertz (Hz). Os espectros de massa foram 30 obtidos num espectrómetro de massa Finnigan Polaris Q GC/MS Benchtop Ion Trap por injecção directa da amostra.
Exemplos de Preparação Exemplo 1 (Intermediário)
Acetato de 28-hidroxi-lup-20(29)-θη-3β-ί1ο (Composto 3)
Uma mistura de acetato de lup-20(29)-eno-3p,28-diilo (0,32 g; 0,6 mmol) KOH metanólico (66 ml; 0,6 mmol) e em THF (20 ml) foi agitada, à temperatura ambiente, durante 17 horas. Acidificou-se a solução com HC1 aquoso (3%, 50 ml) e extraiu-se com acetato de etilo (3 χ 30 ml) . A fase orgânica total foi lavada com solução saturada de Na2C03 (3 χ 30ml) , água (30 ml) e solução saturada de NaCl (30 ml), seca com Na2S04 anidro, filtrada e evaporada à secura, obtendo-se um sólido branco que foi posteriormente recristalizado de benzeno, obtendo-se o composto 3 (0,26 g, 89 %) : p.f. (benzeno) 259-260 °C; IV (filme): 882, 978, 1246, 1642, 1729, 3070, 3440 cm'1; *Η RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,84; 0,85; 0,97; 1,02 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,69 (s, 3H, 30-H3) ; 2,04 (s, 3H, OCOCH3) ; 2,39 (dt, J= 10,7 Hz e J = 5,9 Hz, 1H, 19-H); 3,33 (d, J= 10,7 Hz, 1H, 28a-H) ; 3,79 (d, J= 10,7 Hz, 1H, 28b-H) ; 4,47 (dd, J = 10,3 Hz e J = 5,7 Hz, 1H, 3a-H); 4,58 (s, 1H, 29a-H); 4,68 (s, 1H, 29b-H) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz) δ 60,5 (C28); 80,9 (C3); 109,7 (C29); 150,5 (C20); 171,1 (OCOCH3) ; EI-MS rn/z (%) : 484 (9) M+, 203 (71), 189 (100), 187 (55); 107 (61), 105 (52), 95 (77), 91 (67), 81 (60), 79 (85). 31
Exemplo 2 (Intermediário)
Acetato de 3p-hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo (Composto 4)
Uma mistura de betulina (0,35 g; 0,8 mmol) anidrido acético (4 ml) e imidazole (0,1lg; 1,6 mmol) em CHCI3 (60 ml) foi aquecida a refluxo durante 2h. Após arrefecimento, diluiu-se a mistura da reacção em CHCI3 (60 ml) , lavou-se com uma mistura de HC1 aquoso (10%, 40 ml) e gelo, com água (30 ml), com solução saturada de NaCl (30 ml) , e secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido branco, que foi seco em estufa de vácuo. O crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merk, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1) obtendo-se o composto 4 (0,32 g, 84 %) : p.f. (benzeno) 275-277 °C; IV (filme): 880, 1102, 1244, 1642, 1734, 3070, 3471 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,76; 0,82; 0,96; 0,97; 1,03 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,68 (s, 3H, 30-H3); 2,07 (s, 3H, OCOCH3) ; 2,45 (dt, J = 10,9 Hz e J = 5,8 Hz, 1H, 19-H) ; 3,18 (dd, J= 11,0 Hz e J= 4,7 Hz, 1H, 3a-H); 3,86 (d, J= 10,9 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,24 (d, J= 10,9 Hz, 1H, 28b-H) ; 4,59 (S, 1H, 29a-H); 4,69 (S, 1H, 29b-H) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz) δ 62,8 (C28); 78,9 (C3); 109,9 (C29) ; 150,2 (C20) ; 171,6 (OCOCH3); EI-MS m/z (%): 484 (12) M+, 203 (54), 189 (100), 187 (71), 145 (49); 133 (67), 119 (62), 107 (49), 105 (69), 91 (56) . 32
Exemplo 3 (Intermediário) 3p-Hidroxilup-20(29)-en-28-oato de metilo (Composto 5) A uma solução de ácido betulínico (0,15 g, 0,3 mmol) e K2CO3 anidro (0,12 g; 0,8 mmol) em DMF seca (2 ml) adicionou-se iodeto de metilo (41 μΐ; 0,7 mmol). A reacção decorreu com agitação magnética e à temperatura ambiente durante 1 h. Diluiu-se a mistura da reacção em acetato de etilo (30 ml), lavou-se com água (3 χ 20 ml) e com solução saturada de NaCl (20 ml). Secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um sólido branco que foi posteriormente recristalizado de metanol, obtendo-se o composto 5 (0,13 g, 83 %) : p.f. (metanol) 220-222 °C; IV (filme): 1643, 1720, 3070, 3320 cm'1; XH RMN (CDCI3, 300 MHz) δ 0,75; 0,82; 0,92; 0,94; 0,96 (todos s, 15H, 23-Hs, 24-H3, 25-Hs, 26-H3, 27-H3); 1,69 (s, 3H, 30-H3) ; 2,43 (m, 1H, 19-H) ; 3,18 (dd, 1H, J = 10,9 Hz e J= 4,5 Hz, 3a-H) ; 3,67 (s, 3H, COOCH3); 4,58 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,71 (s largo, 1H, 29b-H) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz) δ 80,6 (C3); 110,1 (C29); 149,7 (C20); 177,2 (C28); EI-MS m/z (%) : 471 (25) M+, 286 (26), 253 (52), 247 (29), 203 (36), 192 (100), 189 (100), 175 (64), 119 (47), 105 (51).
Exemplo 4 (Intermediário)
Acetato de lup-20(29)-eno-3p,28-diilo (Composto 6)
Uma solução de betulina (0,35 g; 0,8 mmol), anidrido acético (12 ml) e DMAP (0,10 g; 0,8 mmol) em THF (10 ml) foi agitada à temperatura ambiente durante 12 33 horas. Colocou-se a mistura da reacção num matraz contendo HC1 aquoso (10%, 50 ml) e gelo e extraiu-se com acetato de etilo (3 x 30 ml). A fase orgânica total foi lavada com HC1 aquoso (10%, 2 χ 20ml) , água (30 ml) e solução saturada de NaCl (30 ml), seca com Na2S04 anidro, filtrada e evaporada á secura, obtendo-se um sólido branco que foi posteriormente cristalizado de benzeno, obtendo-se o composto 6 (0,37 g, 89 %) : p.f. (benzeno) 224— 226 °C; IV (filme): 880, 1241, 1642, 1735, 3073 cm-1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,83; •vT1 OO O 0,97; 1,03 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3,
27-H3) ; 1,68 (s, 3H, 30-H3) ; 2,04 (s, 3H, OCOCH3); 2,07 (s, 3H, OCOCH3); 2,45 (dt, J = 11,0 Hz e J=5,8 Hz, 1H, 19-H); 3,85 (d, J= 11,0 Hz, 1H, 28a-H); 4,25 (d, J= 11,0 Hz, 1H, 28b-H); 4,47 (dd, J= 10,3 Hz e J= 5,8 Hz, 1H, 3a-H); 4,59 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,69 (s largo, 1H, 29b-H) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz) δ 62,8 (C28); 80,9 (C3); 109,9 (C29); 150,1 (C20); 171,0 (OCOCH3); 171,6 (OCOCH3) ; EI-MS m/z (%) : 526 (5) M+, 466 (72), 216 (46), 203 (47), 202 (44), 190 (53), 189 (100), 187 (68), 119 (47), 91 (51);
Exemplo 5 (Intermediários) 30-Metoxilup-20(29)-βηο-3β,28-diol (Composto 7) e 30-bromolup-20(29)-βηο-3β,28-diol (Composto 8) A solução do composto 6 (2,5 g; 4,8 mmoles) em CCI4 (100 ml) foi tratada com NBS (1,7 g; 9,6 mmoles) e agitada sob refluxo durante 3 horas. A mistura da reacção foi filtrada, para remover o precipitado e concentrada com a ajuda do evaporador rotativo. O resíduo obtido foi 34 novamente dissolvido numa mistura de MeOH/THF (24/12 ml), colocou-se sob atmosfera de árgon, á temperatura de 0 °C e adicionou-se NaOH 4N ( l,2ml, 4,8 mmol) e deixou-se reagir durante 29 horas. Colocou-se a mistura da reacção num matraz contendo gelo e HC1 diluído, filtrou-se o sólido obtido, lavou-se com água (2 χ 100 ml) , secou-se com Na2S04 anidro e purificou-se por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o composto 7 (1,4 g; 64%): p.f. (acetona/n-hexano) 212-214 °C; IV (filme): 1645, 3073, 3347 cm"1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) : δ 0,76; 0,82; 0,97; 0,98; 1,02 ( todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 2,28 (dt, J= 10,8 Hz e J = 5,4 Hz, 1H, 19-H); 3,18 (dd, J = 10,8 Hz e J = 5,2 Hz, 1H, 3a-H); 3,31 (d, J= 10,5
Hz, 1H, 28a-H) ; 3,35 (s, 3H, OCH3) ; 3,78 (d, J= 10,5 Hz, 1H, 28b-H); 3,86 (s largo, 2H, 30-H2) ; 4,91 (s, 1H, 29a-H); 4,92 (s, 1H, 29b-H); 13C RMN (CDC13, 75 MHz): δ 58,3 (OCH3) ; 60,2 (C28); 74,8 (C30) ; 78,9 (C3) ; 109,0 (C29) ; 150,9 (C20); EI-MS m/z (%) : 473 (25) M+, 201 (93), 189 (86), 187 (100), 145 (75), 131 (66), 121 (71), 119 (73), 95 (66), 81 (69). E o composto 8 (0,45 g, 18%): p.f. (acetona/n-hexano) 202-205 °C; IV (filme): 1642, 3075, 3371 cm'1; 3H RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,76; 0,82; 0,97; 0,99; 1,03 ( todos S, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 2,39 (dt, J= 11,0 Hz e J = 5,3 Hz, 1H, 19-H); 3,19 (dd, J = 10,9 Hz e J = 5,1 Hz, 1H, 3a-H) ; 3,33 (d, J = 10,8 Hz, 1H, 28a-H); 3,81 (d, J= 10,8, 1H, 28b-H) ; 3,99 (s, 2H, 30-
H2) ; 5,03 (s, 1H, 29a-H) ; 5,12 (s, 1H, 29b-H) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz): δ 60,3 (C28); 78,9 (C3); 109,8 (C29); 35 151,0 (C20); EI-MS m/z (%): 522 (3) M+, 121 (74), 119 (91), 107 (85), 105 (82), 93 (84), 91 (91), 81 (84), 79 (100), 67 (82) .
Exemplo 6 (Intermediários) 3β, 28-Di-hidroxi-(20R) -lupan-29-al (Composto 9) e do 3β,28-di-hidroxi-(20S)-lupan-29-al (Composto 10) A uma solução de betulina 1 (0,87 g; 1,9 mmol) em CH2CI2 anidro, à temperatura de 0-5°C, adicionou-se ácido m-cloroperbenzoico (0,50 g; 2,9 mmol) e deixou-se sob agitação magnética durante 5 horas. De seguida adicionou-se H2S04 2 M (4 ml), mantendo a temperatura a 0-5 °C e deixou-se sob agitação durante mais 1 hora. Diluiu-se a mistura da reacção em CH2CI2 (100 ml), lavou-se com solução saturada de Na2CC>3 (3 χ 30 ml), com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml). Secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um sólido branco que foi seco em estufa de vácuo. O crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de silica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o composto 9 (0,35 g, 39 %): p.f. (acetona/n-hexano ) 203-205 °C; IV (filme) : 1714, 3393 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,77 ; 0,84; 0,95 ; 0 ,98; 1,03 (todos s, 15H, 23-Hs, 24-H3, 25-H 3, 26-H3, 27- h3) ; 1,10 (d, J = 6, 9 : Hz, 3H , 30-H); 2,60 (m, 1H, 20-H); 3, , 20 (dd, J = 10,9 Hz e J = 5, 1 Hz, 1H, 3a- H) ; 3,26 (d, J = 10, 8 Hz, 1H, 28a-H) ; 3, 77 (d, J = 10,8 Hz, 1H, 28b-H); 9,86 (d, J = 2,0 Hz, 1H, 29 -H) ; 13C RMN (CDCI3, 36 75 ΜΗζ) δ 60,2 (C28); 78,9 (C3) ; 206, 8 (CHO) . EI-MS m/z (%) : 458 (2) Μ+, 369 (100), 207 (43), 192 (51), 189 (72), 161 (67), 133 (31), 121 (31), 107 (36), 95 (33). Ε ο composto 10 (0,18 g, 20 %): p.f. (acetona/n-hexano) 202-206 °C; IV (filme) : 1716, 3340 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 ΜΗζ) δ 0,77; 0,84; 0,98; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,04 (d, J= 7,0 Hz, 3H, 30-H) ; 2,65 (m, 1H, 20-H); 3,20 (dd, J= 10,9 Hz e J= 5,1 Hz, 1H, 3a-H); 3,33 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28a-H) ; 3,80 (d, J= 10,8 Hz, 28b-H); 9,62 (s, 1H, 29-H); 13C RMN (CDC13, 75 ΜΗζ) δ 60,2 (C28); 78,9 (C3); 204,8 (CHO); EI-MS m/z (%) : 458 (4) M+, 369 (76), 207 (48), 190 (46), 189 (100), 161 (70), 119 (51), 105 (46), 95 (47), 91 (59) .
Exemplo 7 (Intermediário) Ácido 3-oxo-lup-20(29)-en-28-óico (Composto 11) A uma solução de betulina 1 (1,0 g; 2,3 mmoles) em acetona (50 ml) , arrefecida a 0 °C e adicionou-se o reagente de Jones (3,2 ml), gota a gota. A reacção decorreu durante 1 hora e meia a 0°C e com agitação magnética. Parou-se a reacção adicionando metanol (50 ml), obtendo-se uma solução de coloração verde que se deixou sob agitação durante 30 minutos, ao fim dos quais se adicionou água (50ml). Evaporou-se a acetona e parte do metanol e extraiu-se a fase aquosa com acetato de etilo (3 χ 40 ml). Lavou-se a fase orgânica com água (2 χ 30 ml) e com solução saturada de cloreto de sódio (2 χ 30 ml), secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se 37 um resíduo sólido branco, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1) obtendo-se o composto 11 (1,2 g; 56%): p.f. (acetona/n- hexano) 247-249 °C; IV (filme): 1642, 1686, 1703, 3070 cm“ XH RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,95; 0,99; 1,02; 1,04; 1,09 (todos S, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,72 (s, 3H, 30-H3); 3,04 (dt, J= 10,7 Hz e J = 4,3 Hz, 1H, 19-H); 4,64 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,77 (d, J= 1,5 Hz, 1H, 29b-H) ; 13C RMN (CDCI3, 75 MHz): δ 109,7 (C29); 150,3 (C20) ; 182,2 (C28); 218,2 (C3) ; EI-MS m/z (%) : 454 (19) M+, 408 (24), 393 (20), 248 (85), 189 (100), 175 (61), 133 (55), 119 (76), 105 (54), 79 (52) .
Exemplo 8 (Intermediário) Ácido 3-oxolup-l, 20 (29)-dien-28-óico (Composto 12)
Uma solução do composto 11 (0,40 g; 0,9 mmol) e DDQ (0,60 g; 2,6 mmol) em dioxano anidro (18 ml) foi aquecida a refluxo e sob atmosfera de N2 durante 15 h. Diluiu-se a mistura da reacção em acetato de etilo (60 ml) e removeu-se a matéria insolúvel por filtração. Lavou-se o filtrado com solução saturada de Na2C03 (3 χ 30 ml), com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml). Secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se com a ajuda do evaporador rotativo, obtendo-se um sólido amarelo que foi seco em estufa de vácuo. O produto bruto da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de 38 sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1) obtendo-se o composto 12 (0,18 g, 45 %): p.f. (acetona/n-hexano ) 221-223 °C; IV (filme): 1645, 1689, 1730, 3070 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,99; 1,02; 1,06; 1,07; 1,13 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,70 (s, 3H, 30-H) ; 3,03 (m, 1H, 19-H) ; 4,63 (s, 1H, 29a-H) ; 4,76 (s, 1H, 29b-H) ; 5,80 (d, J= 10,3 Hz, 1H, 2-H) ; 7,11 (d, J= 10,3 Hz, 1H, 1-H) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz) δ 109,9 (C29); 125,1 (C2) ; 150,2 (C20) ; 160,1 (Cl); 181,7 (C28); 205, 9 (C3) ; EI-MS m/z (%) : 452 (17) M+, 213 (100), 150 (39), 137 (34), 95 (31), 91 (42), 81 (36), 79 (41) , 77 (29), 67 (34) .
Exemplo 9 (Intermediário) Ácido 2-hidroxi-3-oxolup-l,20(29)-dien-28-óico (Composto 13) O composto 11 foi dissolvido (0,36g; 0,8 mmol) numa mistura de terc-butóxido de potássio (3 g; 26,7 mmol) em álcool terc-butílico (32 ml). A reacção decorreu durante 2 horas a 40 °C, com agitação magnética e sob atmosfera de (¾. Transferiu-se a mistura da reacção para um matraz contendo HC1 diluído (3 %, 10 ml) e extraiu-se com acetato de etilo (2 χ 40 ml) e lavou-se a fase orgânica total com solução saturada de Na3C03 (3 χ 30 ml), água (30 ml) e solução saturada de NaCl (30 ml) . Secou-se com Na3S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se á secura obtendo-se um resíduo sólido de cor amarelada. O crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40- 3
Russ. J. Bioorg. Chem., 32:37-49, 2006). Entre todas as actividades referidas, o ácido betulinico, apresentou particularmente actividade anticancerigena e antiviral (WO 98/51294, U.S. Pat. No. 5,869,535, US 2006/0159783, WO 96/39033 and U.S. Pat. No. 5,679,828).
Inicialmente o ácido betulinico foi considerado como um agente citotóxico especifico para o melanoma. Pisha, E. e seus colaboradores., (Nat. Med., 1:1046-1051, 1995) reportaram a actividade antitumoral selectiva do ácido betulinico em células de melanoma humano MEL-1, MEL-2, e MEL-4 e confirmaram esta actividade realizando estudos in vivo em ratos atimicos. DasGupta, T. K. e os seus colaboradores e Pezzuto, J. M e seus colaboradores, (WO 96/29068 and U.S. Pat. No. 5,962,527) também descreveram a utilidade do ácido betulinico e dos seus derivados para o controlo selectivo no tratamento de melanoma humano. No entanto, estudos mais recentes indicaram que o ácido betulinico possui um largo espectro de actividade anticancerigena contra outras linhas celulares de cancro. Ramadoss, S. e os seus colaboradores (U.S. Pat. No. 6,048,847) reportaram, pela primeira vez, a actividade do ácido betulinico e dos seus derivados no tratamento da leucemia, de linfomas, de cancro da próstata e do pulmão. Debatin, K. M. e os seus colaboradores. (U.S. Pat. No. 6,369,109) descreveram a actividade antiproliferativa do ácido betulinico e derivados em células de neuroblastoma e finalmente Mukherjee, R. e seus colaboradores (US 2006/0159783) reportaram a actividade anticancerigena do 39 60°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o composto 13 (0,27 g, 73 %) : p.f. (acetona/n-hexano) 202-204 °C; IV (filme): 1645, 1669, 1698, 1730, 3073, 3389 cm"1; ΧΗ RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,98; 1,00; 1,10; 1,13; 1,20 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,70 (s, 3H, 30-H3); 3,02 (m, 1H, 19-H) ; 4,64 (s, 1H, 29a-H) ; 4,75 (s, 1H, 29b-H) ; 6,45 (s, 1H, 1-H) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz) δ 109,9 (C29) ; 128,9 (Cl); 143,9 (C2); 150,1 (C20); 182,4 (C28); 201,2 (C3); EI-MS m/z (%): 469 (11) M+, 321 (43), 213 (100), 189 (32), 150 (45), 136 (29), 91 (63), 80 (34), 75 (54), 69 (65).
Exemplo 10 (líf-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-lup-20 (29)-en-28-ilo (Composto 14) e (lfí-imidazol-l-il) -carboxilato de lup-20(29)-βηο-3β,28-diilo (Composto 17) A uma solução de betulina (0,20 g; 0,5 mmoles) em tetrahidrofurano (THF) anidro (8 ml) adicionou-se 1,1'-carbonildimidazole (CDI) (0,29 g; 1,8 mmoles). Após 7 horas de agitação magnética, à temperatura de refluxo e sob atmosfera de azoto a reacção estava completa como verificado por TLC. Transferiu-se o conteúdo do balão reaccional para uma matraz contendo água destilada (20 ml) e extraiu-se com éter dietilico (3 χ 30 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, branco, que foi seco em estufa de vácuo. O crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia 40 flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o
composto 14 (0,15 g; 63%) : p.f.(acetona) 202-204 °C; IV (filme) : 880, 1645, 1751, 3078, 3570 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,76; 0,83; 0,97; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23- H3, 24-H3, 25-H3, 26- -h3, 27-H3) ; 1,70 (s, 3H, 30-H3) ; 2,47 (dt, J = 10,7 Hz e J = 5,6 Hz, 1H, 19-H) ; 3 ,19 (dd, J = 10,8 Hz e J= 5,2 Hz, 1H, 3a-H); 4,21 (d, J = 10,7 Hz, 1H, 28a-H); 4,63 - 4,67 (m, 2H, 28b-H e 29a-H) ; 4,72 (d, J= 1,4 Hz, 1H, 29b-H); 7,13 (s largo, 1H, 4'-H); 7,46 (s largo, 1H, 5' -H) ; 8,26 (s, 1H, 2'-H). 13C RMN (CDC13, 75 MHz): δ 67,5 (C28); 78,9 (C3) ; 110,3 (C29) ; 117,2 (C5') ; 129,6 (C4'); 136,8 (C20') ; 148,7 (OCO); 149,5 (C20); EI-MS m/z (%) : 536 (12) M+, 207 (36), 189 (39), 187 (54), 119 (44), 107 (34), 105 (34), 91 (46), 79 (38), 69 (100). E o composto 17 (0,56 g; 20 %) : p.f. (acetona/n-hexano)
161-163 °C; IV (filme): 880, 1642, 1757, 3070 cm'1; 3H RMN (CDCls, 300 MHz) δ 0,91; 0,96; 1,02; 1,08 (todos s, 15H, 23-Hs, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,71 (s, 3H, 30-H3) ; 2,48
(m, 1H, 19-H) ; 4,20 (d, J = 10,7 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,64 -4,73 (m, 4H, 3a-H, 28b-H, 29a-H e 29b-H) ; 7,12 (s, 2H, 4'-H e 4" -H) ; 7,45 (s, 2H, 5'-H e 5"-H) ; 8,22 (s, 1H, 2"-H); 8,23 (s, 1H, 2'-H); 13C RMN (CDC13, 75 MHz): δ 67,3 (C28); 86,8 (C3); 110,3 (C29); 117,1 (C5"); 117,2 (C5') ; 129,5 (C4 ' ') ; 130,0 (C4 ') ; 136,7 (C2"); 136,8 (C2 ' ) ; 148,2 (OCO); 148,9 (OCO); 149,4 (C20); EI-MS m/z (%): 630 (2) M+, 189 (67), 187 (73), 119 (72), 105 (80) 95 (65), 93 (56), 91 (84), 79 (60), 69 (100) . 41
Exemplo 11 (2'-metil-lií-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-lup- 20 (29) -en-28-ilo (Composto 15) e (2 '-metil-líí-imidazol-l-il)-carboxilato de lup-20 (29)-βηο-3β,28-diilo (Composto 18) A uma solução de betulina (0,20 g; 0,5 mmoles) em tetrahidrofurano (THF) anidro (8 ml) adicionou-se 1,1'-carbonilbis(2-metilimidazol) (CBMI) (0,24 g; 1,4 mmoles). Após 9 horas de agitação magnética, à temperatura de refluxo e sob atmosfera de azoto a reacção estava completa como verificado por TLC. Transferiu-se o conteúdo do balão reaccional para uma matraz contendo água destilada (30 ml) e extraiu-se com éter dietilico (3 χ 30 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, branco, que foi seco em estufa de vácuo. O crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1) obtendo-se o
composto 15 (0,14 g; 57%) : p. f. (benzeno) 163-165 °C; IV (filme) : 884, 1642, 1758, 3073, 3313 cm-1; 1H RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,77; 0,83; 0,97; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,70 (s, 3H, 30-H3); 2,47 (m, 1H, 19-H); 2,71 (s, 3H, 2'-CH3); 3,19 (dd, J = 10,8 Hz e J = 5,2 Hz, 1H, 3a-H); 4,17 (d, J = 10,9 Hz, 1H, 28a-H); 4,59 - 4,62 (m, 2H, 28b-H e 29a-H); 4,72 (s largo, 1H, 29b-H) ; 6,91 (d, J = 1,7 Hz, 1H, 4'-H); 7,38 (d, J = 1,7 Hz, 1H, 5' -H) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz): δ 67,3 (C28) ; 78,8 42 (C3); 110,2 (C29); 118,1 (C5'); 126,5 (C4'); 147,9 (C2'); 149,5 (OCO); 149,6 (C20); EI-MS m/z (%): 550 (10) M+, 189 (26), 187 (26), 133 (25), 119 (37), 107 (28), 91 (30), 83 (100) , 81 (27) , 79 (26) . E o composto 18 (0,11 g; 38%): p.f. (acetona/n-hexano) 127-129 °C; IV (filme) 1645, 1753, 3070 cm-1; 1H RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,90; 0,95; 0,96; 1,02; 1,08 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,71 (s, 3H, 30-H3); 2,48 (m, 1H, 19-H) ; 2,65 (s, 3H, 2'-CH3); 2,66 (s, 3H, 2"-CH3); 4,15 (d, J = 10,8 Hz, 1H, 28a-H); 4,58 - 4,67 (s, 3H, 3a-H, 28b-H e 29a-H); 4,73 (s, 1H, 29b-H) ; 6,85 (s, 1H, 4' -H); 6,86 (s, 1H, H-4"); 7,34 (s, 1H, H-5'); 7,36 (s, 1H, H-5"); 13CRMN (CDC13, 75 MHz): δ 66,7 (C28) ; 85,9 (C3) ; 110,3 (C29); 118,0 (05' e C5"); 127,8 e 127,9 (C4', C4 " ) ; 147,9 (02' e 02''); 149,5 (OCO); 149,6 (OCO); 150,0 (020); EI-MS m/z (%): 658 (2) M+, 127 (13), 119 (12), 105 (10), 95 (19); 93 (13), 91 (16), 83 (100), 81 (19), 79 (11).
Exemplo 12 (lH-Triazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo (Composto 16) e (ΙΗ-triazol-l-il)-carboxilato de lup-20 (29)-θηο-3β,28-diilo (Composto 19) A uma solução de betulina (0,20 g; 0,5 mmoles) em tetrahidrofurano (THF) anidro (8 ml) adicionou-se 1,1'— carbonil-di-(1,2,4-triazole) (CDT) (0,30 g; 1,8 mmoles). Após 9 horas de agitação magnética, à temperatura de refluxo e sob atmosfera de azoto a reacção estava completa como verificado por TLC. Transferiu-se o conteúdo do balão 43 reaccional para uma matraz contendo água destilada (30 ml) e extraiu-se com éter dietilico (3 χ 30 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, amarelo, que foi seco em estufa de vácuo. O crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2) obtendo-se o composto 16 (0,18 g; 72%) : p. f. (acetone/n-hexane) 200-203 °C; IV (filme) : 882, 1642, 1762, 1791, 3070, 3389 cm'1; XH RMN (CDCls, 300 MHz) : δ 0,77; 0,84; 0,97; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,70 (s, 3H, 30-H3) ; 2,49 (dt, J = 10,7 Hz e J = 6,0 Hz, 1H, 19-H) ; 3,19 (dd, J= 10,8 Hz e J = 5,2 Hz, 1H, 3a-H); 4,30 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,63 (s largo, 1H, 29a-H); 4,72 - 4,74 (m, 2H, 28b-H e 29b-H) ; 8,09 (s largo, 1H, 3'-H); 8,83 (s largo, 1H, 5'-H); 13C RMN (CDC13, 75 MHz): δ 68,4 (C28); 78,9 (C3); 110,3 (C29); 145,4 (C5'); 147,9 (OCO); 149,5 (C20); 153,6 (C3'); EI-MS m/z (%) : 537 (4) M+, 190 (74), 189 (100), 187 (89), 133 (72), 119 (98), 107 (75), 105 (82), 91 (93), 79 (89) . E o composto 19 (0,07 g; 24%) : p.f. (acetona/n-hexano) 157-159 °C; IV (filme) 882, 1642, 1763, 1787, 3070 cm'1; XH RMN (CDCls, 400 MHz) δ 0,92; 0,98; 1,00; 1,02; 1,09 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,72 (s, 3H, 30-H3) ; 2,50 (m, 1H, 19-H); 4,30 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,64 (s largo, 1H, 29a-H); 4,73 - 4,82 (m, 3H, 3a-H, 28b-H e 29b-H) ; 8,08 (s largo, 1H, 3'-H); 8,09 (s largo, 1H, 3''-H); 44
8,80 (s largo, 1H, 5'-H); 8,83 (s largo, 1H, 5''-H); 13C RMN (CDC13, 100 MHz) : δ; 69,3 (C28) ; 87,7 (C3) ; 110,3 (C29); 145,3 (C5') ; 145,4 (C5"); 147,2 (OCO); 147,9 (OCO); 149,4 (C20); 153,5 e 153,6 (C3', C3"); EI-MS m/z (%) : 632 (4) M+, 189 (86), 187 (62), 133 (67), 119 (79), 107 (60), 105 (83), 95 (67), 93 (74), 91 (100).
Exemplo 13 (1/í-Imidazol-l-il)-carboxilato de 28-hidroxi-lup-20 (29) -en- 3β-ί1ο (Composto 20)
Uma solução de betulina 1 (0,2 g, 0,45 mmol) e CDI (0,37 g, 2,25 mmol) em THF anidro (8 ml) foi submetida a refluxo durante 9 h para obter o composto 17. Adicionou-se o gel de sílica (0,2 g) que se deixou sob agitação, à temperatura ambiente, durante 18 h. Removeu-se o gel de sílica por filtração, colocando o filtrado num matraz contendo água destilada (20 ml) que se extraiu com éter dietílico (3 x 50 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secou- se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, branco, que foi seco em estufa de vácuo. 0 crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 20 (0,17 g; 68%): p.f.(acetona/n-hexano) 198-199 °C; IV (filme): 882, 1645, 1758, 3070, 3327 cm'1; RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,89; 0,95; 0,96; 0,99; 1,04 (s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 45 26-Η3, 27-Η3) ; 1,69 (s, 3Η, 30-Η3) ; 2,40 (dt, J= 10,7 Hz e J = 5,7 Hz, 1H, 19-H); 3,34 (d, J = 10,9 Hz, 1H, 28a-H) ; 3,80 (d, J= 10,0 Hz, 1H, 28b-H); 4,59 (m, 1H, 29a-H) ; 4,69 - 4,73 (m, 2H, 3a-H e 29b-H) ; 7,15 (s, 1H, 4'"H); 7,47 (m, 1H, 5'-H); 8,21 (s, 1H, 2'-H). 13C RMN (CDC13, 75 MHz) : δ 60,4 (C28); 87,1 (C3); 109,7 (C29); 117,4 (C5') ; 128,9 (C4'); 136,6 (C2') ; 147,9 (OCO); 150,4 (C20); EI-MS m/z (%) : 536 (6) M+, 203 (37), 189 (35), 119 (41), 105 (37), 95 (35), 91 (30), 81 (29), 79 (32), 69 (100).
Exemplo 14 (ltf-Triazol-l-il)-carboxilato de 28-hidroxi-lup-20(29)-en- 3β-ί1ο (Composto 21)
Uma solução de betulina 1 (200 mg, 0,45 mmol) e CDT (443 mg, 2,7 mmol) em THF anidro (8 ml) foi submetida a refluxo durante 10 h para obter o composto 19. A dicionou-se o gel de silica (0,2 mg) que se deixou sob agitação, à temperatura ambiente, durante 15 h. Removeu-se o gel de silica por filtração, colocando o filtrado num matraz contendo água destilada (20 ml) que se extraiu com éter dietilico (3 χ 30 ml) . Lavou-se a fase orgânica total com água (30 ml) e com solução saturada de NaCl (30 ml), secou-se com Na2S04 anidro, filtrou-se e evaporou-se em evaporador rotativo, obtendo-se um resíduo sólido, amarelo, que foi seco em estufa de vácuo. O crude da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 21 (0,15 46 g; 63%) : p.f.(acetona/n-hexano) 221-224 °C; IV (filme): 886, 1642, 1764, 3070, 3406 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,90; 0,98; 0,99; 1,04 (s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,69 (s, 3H, 30-H3) ; 2,40 (dt, J = 10,5 Hz e J = 5,8 Hz, 1H, 19-H); 3,34 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28a-H) ; 3,80 (d, J = 10,8 Hz, 1H, 28b-H) ; 4,59 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,69 (s largo, 1H, 29b-H) ; 4,79 (dd, J = 9,1 e 7,5 Hz, 1H,
3α-H) ; 8,08 (s, 1H, 3'-H); 8,79 (s, 1H, 5'-H); 13C RMN
(CDC13, 75 MHz): δ 60,4 (C28) ; 87,8 (C3) ; 109,7 (C29) ; 145,3 (C5'); 147,2 (OCO); 150,4 (C20); 153,4 (03'); EI-MS m/z (%): 537 (6) M+, 119 (49), 107 (46), 105 (60), 93 (55), 91 (100), 81 (46), 79 (53), 77 (51), 70 (38).
Exemplo 15 (lV-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-acetoxilup-(20)29-en- 28-ilo (Composto 22) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14, mas usando o acetato de 28-hidroxi-lup-20(29)-θη-3β-ί1ο 3 (0,24 g; 0,5 mmol) e CDI (0,16 g; 1,0 mmol) em THF anidro (10 ml), a refluxo durante 5 horas. O resíduo sólido branco resultante da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1), obtendo-se o composto 22 (0,25 g; 85%) : p.f.(acetona/n-hexano) 101-103 °C ; IV (filme): 882, 1240, 1642, 1730, 1760, 3073 cm-1; XH RMN (CDCls, 300 MHz): δ 0,84; 0,85; 0,86; 1,00; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,71 (s, 3H, 30- 47 H3); 2,05 (s, 3H, OCOCH3) ; 2,48 (m, 1H, 19-H) ; 4,20 (d, J = 10,6 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,47 (dd, J = 10,2 Hz e J = 5,8 Hz, 1H, 3a-H) ; 4,63 - 4,67 (m, 2H, 28b-H e 29a-H) ; 4,72 (s largo, 1H, 29b-H) ; 7,12 (s, 1H, 4'-H); 7,45 (s, 1H, 5'-H); 8,22 (s, 1H, 2' -H) ; 13CRMN (CDC13, 75 MHz) : δ 67,4 (C28) ; 80,8 (C3); 110,3 (C29); 117,2 (C5'); 129,9 (C 4'); 136,8 (C2'); 148,8 (OCO); 149,5 (C20); 170,9 (OCOCH3); EI-MS m/z (%) : 578 (19) M+, 189 (24), 187 (26), 133 (20), 119 (35), 105 (36), 93 (19), 91 (42), 79 (26), 69 (100).
Exemplo 16 (2 ' -Metil-lií-imidazol-l-il) -carboxilato de 3p-acetoxilup-(20)29-en-28-ilo (Composto 23) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15, mas usando o acetato de 28-hidroxi-lup-20(29)-en-3p-ilo 3 (0,24 g; 0,5 mmol) e CBMI (0,18 g; 1,0 mmol) em THF anidro (10 ml), a refluxo durante 7 h. O residuo sólido branco resultante da reacção foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de silica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:2), obtendo-se o composto 23 (0,25 g; 86%) : p. f. (acetona/n-hexano) 99-102 °C ; IV (filme): 882, 1245, 1642, 1731, 1757, 3073 cm'1; XH RMN (CDCI3, 300 MHz): δ 0,84; 0,85; 0,86; 0,99; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,71 (s, 3H, 30-H3) ; 2,05 (s, 3H, OCOCH3) ; 2,48 (dt, J = 10,7 Hz e J = 5,7 Hz, 1H, 19-H); 2,70 (s, 3H, 2'- CH3) ; 4,16 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28a-H); 4,47 (dd, J= 10,2 Hz e J = 5,8 Hz, 1H, 3a-H); 4,58 48 - 4,62 (m, 2H, 28b-H e 29a-H) ; 4,72 (s largo, 1H, 29b-H) ; 6,90 (d, J = 1,8 Hz, 1H, 4' -H) ; 7,38 (d, J = 1,8 Hz, 1H, 5' -H) ; 13CRMN (CDC13, 75 MHz) : δ 67,0 (C28) ; 80,8 (C3) ; 110,2 (C29); 118,1 (C5') ; 127,1 (C4'); 147,9 (C2') ; 149,5 (OCO); 149,7 (C20); 170,9 (OCOCH3) ; EI-MS m/z (%) : 592 (14) M+, 189 (20), 187 (16), 145 (15), 119 (22), 107 (19), 105 (25), 91 (28), 83 (100), 79 (16).
Exemplo 17 (lfl-Triazol-l-il)-carboxilato de 3p-acetoxilup-(20)29-en- 28-ilo (Composto 24) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 16, mas usando o acetato de 28-hidroxi-lup-20(29)-βη-3β-ί1ο 3 (0,24 g; 0,5 mmol) e CDT (0,25 g; 1,5 mmol) em THF anidro (10 ml) a refluxo durante 6 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:2), obtendo-se o composto 24 (0,21 g; 74%) : p.f.(acetona/n-hexano) 111-114 °C ; IV (filme): 882, 1247, 1642, 1729, 1770, 1795, 3070 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,84; 0,85; 0,86; 1,00; 1,06 (todos s, 15H, 23- H3, 24- -H3, 25-H 3, 26-H3, 27-H3) ; 1,71 (s, 3H, 30- -h3) ; 2,05 (s, 3H, , OCOCH3) ; 2,49 (dt, J = 10,6 Hz e J = = 6, 0 Hz, 1H, 19-H); 4,30 (d, J = 10,7 Hz, 1H, 28a-H); 4, 47 (dd, J = 10,2 Hz e J = 5,8 Hz , 1H, 3a-H); 4,63 (s largo, 1H, 29; a-H) ; 4,72 - 4,75 (m, 2H, 28b-H e 29b-H); 8, 09 (s, 1H, 3' -H) ; 8,82 (s, 4 ácido betulínico contra células do cancro do colón, estômago, mama, pulmão, colo do útero, ovário, próstata, cavidade oral, laringe, fígado, rim, bexiga, células endoteliais, glioblastoma, leucemia e mieloma, usando um extracto vegetal com uma elevada percentagem deste triterpenoide. 0 mecanismo molecular de acção do ácido betulínico nas células cancerígenas continua sob investigação. No entanto, este triterpenoide parece actuar por indução da apoptose via activação de caspases, de um modo independente do estado do gene p53 e da activação do receptor CD95, (Fulda, S. et al., Câncer Res., 57:4956-4964, 1997 and Wick, W. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 289:1306-1312, 1999), originando um efeito directo na mitocôndria (Fulda, S. et al., J. Biol. Chem., 273:33942-33948, 1998). A capacidade de induzir apoptose, a aparente ausência de actividade citotóxica nas células normais (Zuco, V. et al., Câncer Lett., 175:17-25, 2002), e o índice terapêutico favorável, fazem do ácido betulínico um agente anticancerígeno atractivo e promissor (Eiznhamer, D. A. and Xu, Z.-Q., IDrugs, 7:359-373, 2004).
Nos últimos anos, verificou-se um grande interesse da síntese e avaliação biológica de novos derivados da betulina e do ácido betulínico. A estrutura base destes triterpenoides é constituída por um esqueleto de 30 carbonos, com três posições susceptíveis de sofrerem modificações químicas simples, C-3, C-20 e C-28. 49 1Η, 5' -Η) ; 13C RMN (CDC13, 75 MHz) δ 68,4 (C28) ; 80,8 (C3) ; 110,3 (C29); 145,4 (C 5'); 147,9 (OCO); 149,5 (C 2 0); 153,6 (C3') ; 171,0 (OCOCH3); EI-MS m/z (%) : 579 (6) M+, 202 (58), 189 (88), 187 (78), 145 (59), 119 (78), 107 (62), 105 (77), 91 (100), 79 (58) .
Exemplo 18 (líf-Imidazol-l-il) -carboxilato de 28-acetoxilup-(20)29-en- 3β-ί1ο (Composto 25) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para 0 composto 14 mas usando o composto 3p-hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo 4 (0,24 mg; 0,5 mmol) e CDI (0,16 mg; 1 mmol) em THF anidro (10 ml) a refluxo durantes 7 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1), obtendo-se o composto 25 (0,24 g; 81%) : p.f.(acetona/n-hexano) 194-195 °C ; IV (filme): 882, 1239, 1642, 1733, 1756, 3070 cm’1; 3H RMN (CDC13, 400 MHz): δ 0,89; 0,95; 0,99; 1,05 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-Hs, 26-H3, 27-H3); 1,69 (s, 3H, 30-H3); 2,07 (s, 3H, OCOCH3) ; 2,45 (dt, J = 10,8 Hz e J = 5,9 Hz, 1H, 19-H) ; 3,85 (d, J= 11,0 Hz, 1H, 28a-H); 4,26 (d, J= 11,0 Hz, 1H, 28b-H); 4,60 (s, 1H, 29a-H) ; 4,66 - 4,70 (m, 2H, 3a-H e 29b-H); 7,07 (s, 1H, 4'-H); 7,41 (s, 1H, 5'-H); 8,12 (s, 1H, 2' -H) ; 13CRMN (CDCI3, 100 MHz): δ 62,8 (C28) ; 86,3 (C 3) ; 109,9 (C29); 117,0 (C5'); 130,5 (C4'); 137,0 (C2'); 148,5 50 (OCO); 150,0 (C20); 171,6 (OCOCH3) ; EI-MS m/z (%) : 578 (5), M+, 189 (64), 187 (56), 145 (44), 133 (43), 119 (51), 105 (66), 95 (50), 91 (71), 69 (100) .
Exemplo 19 (2'-Metil-ltf-imidazol-l-il)-carboxilato de 28-acetoxilup-(20)29-en-3p-ilo (Composto 26) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 3p-hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo 4 (0,24 g; 0,5 mmol) e CBMI (0,18 g; 1,0 mmol) em THF anidro (10 ml) a refluxo durante 9 h. O residuo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de silica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1), obtendo-se o composto 26 (0,24 g; 82%) : p.f. (acetona/n-hexano) 173-175 °C ; IV (filme): 882, 1642, 1740, 3070 cm'1; RMN (CDC13, 300 MHz) : δ 0,89; 0,95; 0,96; 0,99; 1,05 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,69 (s, 3H, 30-H3) ; 2,08 (s, 3H, OCOCH3) ; 2,45 (dt, J= 10,7 Hz e J = 5,7 Hz, 1H, 19-H); 2,69 (s, 3H, 2' -CH3) ; 3,85 (d, J = 11,0 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,26 (d, J = 11,0 Hz, 1H, 28b-H); 4,60 (s largo, 1H, 29a-H); 4,64 - 4,69 (m, 2H, 3oí-H e 29b-H) ; 6,90 (d, J= 1,5 Hz, 1H, 4'-H); 7,36 (d, J = 1,5 Hz, 1H, 5' -H) ; 13CRMN (CDC13, 100 MHz): 62,7 (C28); 86,4 (C3); 109,9 (C29); 118,1 (C5'); 126,8 (C4') ; 147,9 (C2'); 149,1 (OCO); 150,0 (020) ; 171,6 (OCOCH3); EI-MS m/z (%): 592 (6) M+, 467 (100), 407 (58), 107 (45), 105 (56), 95 (70), 91 (52), 83 (40), 81 (61), 67 (53). 51
Exemplo 20 (lH-Triazol-l-il)-carboxilato de 28-acetoxilup-(20)29-en- 3β-ί1ο (Composto 27) A reacção foi realizada de acordo com 0 procedimento descrito para 0 composto 16 mas usando 0 composto 3β- -hidroxi-lup-20(29)-en-28-ilo 4 (0,24 g; 0,5 mmol) e CDT (0,25 g; 1,5 mmol) em THF anidro (10 ml) a refluxo durante 8 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 4:1), obtendo-se o composto 27 (0,26 g; 88%) : p.f. (acetona/n-hexano) 221-224 °C ; IV (filme): 1733, 1766, 1787, 3070 cm'1; RMN (CDC13, 400 MHz) : δ 0,90; 0, 97,-0, 98,- 0, 99; 1,05 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,69 (s, 3H, 30-H3) ; 2,07 (s, 3H, OCOCH3) ; 2,45 (dt, J = 10,9 Hz e J = 5,8 Hz, 1H, 19-H) ; 3,85 (d, J= 10,9 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,26 (d, J=10,9 Hz, 1H, 28b-H); 4,60 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,69 (s largo, 1H, 29b-H); 4,79 (dd, J= 9,0 Hz e J= 7,5 Hz, 1H, 3a-H); 8,08 (s, 1H, 3' -H) ; 8,79 (s, 1H, 5'-H); 13C RMN (CDC13, 100 MHz): δ 62,8 (C28); 87,9 (C3); 109,9 (C29); 145,3 (C5') ; 147,3 (OCO); 150,1 (C20); 153,5 (C3'); 171,6 (OCOCH3) ; EI-MS m/z (%) : 579 (4) M+, 203 (51), 189 (84), 187 (69), 159 (47), 119 (56), 107 (57), 105 (75), 91 (100), 79 (54). 52
Exemplo 21 Ácido 3β-(lH-imidazol-l-carboxiloxi)-lup-20(29)-en-28-óico (Composto 28) e (ltf-imidazol-l-il)-carboxilato de 28-(1 íí— imidazol-l-il)-28-oxo-lup-20(29)-en-3p-ilo (Composto 30) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o ácido betulinico 2 (0,30 g; 0,65 mmol) e CDI (0,53 g; 3,25 mmol) em THF anidro (12 ml) a refluxo durante 7 h. O sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de silica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 2:3), obtendo-se o composto 28 (0,25 g; 70%) : p.f. (acetona/n- hexano) 228-230 °C; IV (filme): 1642, 1699, 1762, 3070 cm” 1; XH RMN (CDCls, 300 MHz) δ 0,89; 0,95; 0,96; 0,99 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,70 (s, 3H, 30-H3) ; 3,04 (dt, J= 10,7 Hz e J = 4,1 Hz, 1H, 19-H) ; 4,62 (s largo, 1H, 29a-H); 4,69 (dd, J= 10,1 Hz e J = 6,2 Hz, 1H, 3a-H); 4,75 (s largo, 1H, 29b-H); 7,12 (s, 1H, 4'-H); 7,43 (s, 1H, 5'-H); 8,21 (s, 1H, 2'-H); 13CRMN (CDC13, 75 MHz): δ 86,6 (C3); 109,7 (C29) ; 117,2 (C 5') ; 129,8 (C4') ;
136,9 (C2') ; 148,3 (OCO); 150,5 (C20); 181,5 (C28); EI-MS m/z (%) : 550 (4) M+, 203 (41), 189 (50), 187 (40), 175
(42), 159 (37), 119 (47), 91 (41), 79 (36), 69 (100). E o composto 30 (0, 09 g; 23%): p. f. (acetona/n-hexano) 150-1510C; IV (filme) : 1642, 1722, 1757, 3073 cm'1; XH RMN (CDC13, 400 MHz) δ 0,91; 0,95; 1,01 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,72 (s, 3H, 30-H3) ; 2,97 (dt,
J= 10,9 Hz e J= 4,5 Hz, 1H, 19-H); 4,66-4,69 (m, 2H, 3a-H 53 e 29a-H); 4,78 (s largo, 1H, 29b-H) ; 7,05 (s, 1H, 4'-H); 7,07 (s, 1H, 4"-H); 7,41 (s, 1H, 5"-H) ; 7,53 (s, 1H, 5'-H); 8,13 (s, 1H, 2"-H); 8,28 (s, 1H, 2'-H); 13CRMN (CDC13, 100 MHz) : δ 86,3 (C3) ; 110,2 (C29) ; 117,0 (C5' ') ; 117,4 (C5 ') ; 129,6 (C4'); 130,5 (C4' '); 137,0 (C2' ') ; 137,3 (C 2' ') ; 148,5 (OCO); 149,7 (C20), 172, 9 (C28) ; EI-MS rn/z (%) : 600 (4) M+, 393 (33), 203 (22), 189 (31), 107 (27), 105 (27), 95 (38), 91 (28), 81 (24), 69 (100).
Exemplo 22 Ácido 3β-(2'-metil-lH-imidazol-l-carboxiloxi)-lup-20(29)— en-28-oic (Composto 29) e (2'-metil-ltf-imidazol-l-il)-carboxilato de 28-(2'-metil-ltf-imidazol-l-il)-28-oxo-lup-20(29)-θη-3β-ί1ο (Composto 31) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o ácido betulinico 2 (0,30 g; 0,65 mmol) e CBMI (0,57g; 3,25 mmol) em THF anidro (12 ml) a refluxo durante 8 h. O sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de silica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 29 (0,28 g; 77%) : p.f.(acetona/n- hexano) 170-174 °C; IV (filme): 883, 1642, 1703, 1756, 3070 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,89; 0,94; 0,95; 0,96; 0,99 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,70 (s, 3H, 30-H3) ; 2,67 (s, 3H, 2'-CH3); 3,05 (dt, J = 10,7 Hz e J = 4,3 Hz, 1H, 19-H) ; 4,61 - 4,68 (m, 2H, 3a-H e 29a-H) ; 4,75 (s largo, 1H, 29b-H) ; 6,88 (d, J= 1,6 Hz, 1H, 4'-H); 54 7,35 (d, J = 1,6 Hz, 1H, 5'-H); 13CRMN (CDC13, 75 MHz) : δ 86,2 (C 3); 109,6 (C29); 118,0 (C5'); 127,3 (C4'); 147,9 (C2') ; 149,3 (OCO); 150,6 (C20); 180,6 (C28); EI-MS m/z
(%) : 564 (10) M+, 439 (100), 393 (61), 203 (58), 123 (50), 121 (50), 109 (57), 95 (74), 83 (66), 81 (97) .E o composto 31 (0,09 g; 22%) : p.f.(acetato de etilo/n-hexano) 164-166 °C; IV (filme) : 1642, 1722, 1752, 3070 cm'1; XH RMN (CDC13, 400 MHz) δ 0,89; 0,94; 0,96; 1,01 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,73 (s, 3H, 30-H3) ; 2,63 (s, 3H, 2' -CH3) ; 2,65 (s, 3H, 2"-CH3); 3,06 (dt, J= 11,0 Hz e J = 4,3 Hz, 1H, 19-H); 4,62-4, 66 (m, 1H, 3a-H, 29a-H) ; 4,79 (s largo, 1H, 29b-H) ; 6,86 (s largo, 2H, 4'-H e 4"-H); 7,34 (s largo, 1H, 5'-H); 7,39 (s largo, 1H, 5"-H); 13CRMN (CDC13, 100 MHz): δ 85,9 (C3); 110,1 (C29); 118,0 (C5T e 05' ') ; 127,1 e 127,7 (C4', C4"); 147,9 e 148,9 (C2', 02' ') ; 149,5 (OCO); 150,0 (C20) ; 175,2 (C28); EI-MS m/z (%) : 628 (2) M+, 519 (18), 127 (30), 119 (17), 105 (20), 95 (22), 93 (18), 91 (19), 83 (100), 81 (24).
Exemplo 23 (lH-Triazol-l-il)-carboxilato de 28-(lH-triazol-l-il)-28-oxo-lup-20(29)-θη-3β-ί1ο (Composto 32) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 16 mas usando o ácido betulinico 2 (0,30 g; 0,7 mmol) e CDT (0,64g; 3,9 mmol) em THF anidro (12 ml) a refluxo durante 7 h. O sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de silica 230-400 Mesh, Merk, eluente: éter de petróleo 40- 55 60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 32 (0,32 g; 82%) : p.f.(acetona/n-hexano) 253-256 °C; IV (filme): 1642, 1734, 1762, 1787, 3070 cm-1; RMN (CDC13, 400 MHz) δ 0,92; 0,95; 0,97; 0,99; 1,02 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,73 (s, 3H, 30-H3) ; 2,96 (m, 1H, 19- H) ; 4,66 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,78 - 4,81(m, 2H, 3a-H e 29b-H); 8,00 (s, 1H, 3' -H) ; 8,07 (s, 1H, H-3"); 8,79 (s, 1H, H—5' ' ) ; 8,93 (s, 1H, H-5'); 13CRMN (CDC13, 100 MHz): δ 87,8 (C3); 110,1 (C29) ; 145,1 (C 5' ) ; 145,3 (C5"); 147,3 (OCO); 149,9 (C20) ; 152,1 (03'); 153,6 (C3"); 173,4 (C28) ; EI-MS m/z (%) : 602 (10) M+, 202 (70), 190 (86), 189 (93), 188 (100), 187 (65), 173 (72), 105 (62), 91 (85), 70 (84).
Exemplo 24 3β-(lH-imidazol-l-carboniloxi)-lup-20(29)-en-28-oato de metilo (Composto 33) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 5 (0,10 g; 0,2 mmol) e CDI (0,06 g; 0,4 mmol) em THF anidro (4 ml) a refluxo durante 6 h. O residuo sólido branco obtifo foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 33 (0,11 g; 88%): p.f.(acetona/n- hexano) 220-224 °C ; IV (filme) : 1240, 1642, 1725, 1758, 3070 cm-1; RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,98; 0,93; 0,95; 0,97 (todos s, 15H, 23-Hs, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,69 (s, 3H, 30-H3) ; 3,00 (dt, J= 10,3 Hz e J = 3,7 Hz, 1H, 19-H) ; 56 3,67 (s, 3H, COOCH3); 4,61 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,67 -4,74 (m, 2H, 3a-H, 29b-H) ; 7,13 (s, 1H, 4'-H); 7,45 (s, 1H, 5' -H) ; 8,24 (s, 1H, 2'-H); 13CRMN (CDC13, 75 MHz) : δ 86,9 (C3); 109,6 (C29); 117,2 (C5'); 129,3 (C4'); 136,6 (C2') ; 148,1 (OCO); 150,5 (C20); 176,6 (C28); EI-MS m/z (%): 564 (4) M+, 203 (35), 190 (28), 189 (71), 187 (38), 175 (35), 119 (43), 105(33), 91 (37), 79(33) 69 (100).
Exemplo 25 3β-(2'-Metil-lH-imidazol-l-carboniloxi)-lup-20(29)-en-28-oato de metilo (Composto 34) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 5 (0,10 g; 0,2 mmol) e CBMI (0,07 g; 0,4 mmol) em THF anidro (4 ml), a refluxo durante 9 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 34 (0,12 g; 93%) : p.f.(acetona/n-hexano) 205-207 °C ; IV (filme): 1642, 1728, 1752, 3073 cm' XH RMN (CDCI3, 400 MHz): δ 0,88; 0,93; 0,94; 0,95; 0,98 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,69 (s, 3H, 30-H3); 2,65 (s, 3H, 2' -CH3); 3,00 (dt, J= 10,4 Hz, J = 3,8 Hz, 1H, 19-H); 3,67 (s, 3H, COOCH3) ; 4,61 (s, 1H, 29a-H); 4,65 (dd, J= 11,2 Hz e J = 5,1 Hz, 1H, 3a-H); 4,74 (s, 1H, 29b-H); 6,85 (s largo, 1H, 4' -H) ; 7,34 (s largo, 1H, 5' -H) ; 13CRMN (CDC13, 100 MHz): δ 86,0 (C3) ; 109,7 (C29); 118,0 (C5'); 127,7 (04'); 147,9 (C 2'); 149,5 (OCO); 57 150,5 (C20); 176,6 (C28) ; EI-MS m/z (%) : 578 (13) M+, 393 (100), 189 (68), 119 (56), 105 (64), 95 (71), 91 (75), 83 (87) , 81 (70), 79 (52) .
Exemplo 26 (líf-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-30-metoxi-lup-20 (29)-en-28-ilo (Composto 35) e (lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 30-metoxilup-20(29)-βηο-3β,28-diilo (Composto 38) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 7 (0,21g; 0,4 mmol) e CDI (0,22 g; 1,4 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 8 h. O sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 1:1), obtendo-se o composto 35 (0,17 g; 68%) : p.f.(acetona/n-hexano) 136-138 °C ; IV (filme): 1239, 1645, 1760, 3078, 3406 cm"1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) : δ 0, 78; 00 0 0, 98; ] CM O 1,07 (todos s 1 15H, 23 -H 3, 24 -h3, 25-H3, 26-h3, 27- -H3); 2,39 (dt, J - 11, 0 Hz e J = 5 ,3 Hz, 1H, 19- H); 3, 20 (dd, J = 10,8 Hz e J = 5,1Hz r 1H 3a -H); 3,89 (s , 2H, 30- h2) ; 3,38 (s, 3H, OCH3) r 4,21 (d t j = 10,8 Hz, 1H, 28a-H); 4,65 (d, . J = 10,8 hz, : 1H, , 28b- H) r 4, 95 (s, 1H, 29a -H), 4 ,98 (s, 1H, 29b-H) , 7,13 (S , 1H, 4 1 _ H) r 7,47 (s, 1H, 5' -H) ; 8,23 (s, 1H, 2'-H); 13CRMN (CDC13, 75 MHz): δ 58.3 (OCH3); 67,2 (C28) ; 74,9 (C30) ; 78,8 (C3) ; 109,7 (C29); 117,2 (C5') ; 129,9 (C4'); 136,8 (C2·); 148,8 (OCO); 150.3 (C20); EI-MS m/z (%): 566 (7) M+, 187 (30), 119 (34), 105 (32), 93 (32), 91 (46), 81 (33), 79 (39), 69 (100), 67 58 (29). Ε ο composto 38 (0, 08 g; 28%) : p.f. (acetona/n- hexano) 174-176 °C; IV (filme): 1239, 1645, 1757, 3078 cm" RMN (CDC13, 400 MHz) δ 0,91; 0,96; 1,03; 1,09 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 2,40 (dt, J = 11.0 Hz e J= 5,3 Hz, 1H, 19-H); 3,37 (s, 3H, OCH3); 3,89 (s, 2H, 30-H2); 4,18 (d, J = 10,7 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,62 -4,70 (m, 2H, 3a-H, 28b-H) ; 4,95 (s, 1H, 29a-H) ; 4,98 (s, 1H, 29b-H); 7,07 (s, 1H, 4'-H); 7,08 (s, 1H, 4"-H); 7,41 (s, 1H, 5' -H) ; 7,43 (s, 1H, 5"-H); 8,13 (s, 1H, 2'-H); 8,15 (s, 1H, 2"-H); 13C RMN (CDC13, 100 MHz): δ 58,4 (OCH3); 66,9 (C28); 75,1 (C30); 86,2 (C3); 109,9 (C29) ; 117.0 (C5', C5' ') ; 130,6 e 130,7 (C4 ', C4 " ) ; 137,0 (C2 ', C2"); 148,5 (OCO); 149,1 (OCO); 150,4 (C20) ; EI-MS m/z (%) : 660 (11) M+, 199 (23), 189 (25), 187 (30), 145 (28), 143 (20), 119 (22), 105 (21), 91 (34), 69 (100).
Exemplo 27 (2'-Metil-lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-30-metoxi-lup-20 (29)-en-28-ilo (Composto 36) e (2 ' -metil-líf-imidazol-l-il)-carboxilato de 30-metoxilup-20(29)-eno-36,28-diilo (Composto 39) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando 0 composto 7 (0,21 g; 0,4 mmol) e CBMI (0,24 g; l,4mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 7h. O sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de silica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 2:1), obtendo-se o composto 36 (0,19 5
As modificações da estrutura base destes compostos, nestas posições, podem originar derivados potencialmente mais activos que os substratos de partida e que poderão ser desenvolvidos como fármacos antitumorais. 0 uso da betulina, do ácido betulinico e dos seus derivados na prevenção e tratamento do cancro, encontra-se descrito nas patentes US 2002/0652352, US 2006/0194774, WO 2007/101873, WO 2007/ 112043, WO 2008/063318, US 2008/ 0293682, US 2008/0167254, entre outras.
Apesar de todas as patentes acima referidas, no seu conjunto, descreverem um grande número de derivados da betulina e do ácido betulinico, continua a existir a necessidade de se obterem novos derivados mais activos, clinicamente mais seguros e com propriedades farmacoci-néticas melhoradas. Assim, um dos objectivos desta invenção é a sintese de novos derivados da betulina e do ácido betulinico para o tratamento, prevenção, inibição, regulação e/ou modulação do cancro.
Os derivados da betulina e do ácido betulinico contendo azoto na sua estrutura, como por exemplo, os derivados contendo funções amina, oxima, amida, hidrazina e hidrazona, os conjugados com aminoácidos e os derivados com grupos imidazole ou outros N-heterociclicos, foram reportados como possuindo actividade antiproliferativa em linhas celulares tumorais (U.S. Pat. No. 5,869,535, WO 2007/ 59 g; 74%) : p.f.(acetona/n-hexano) 109-112 °C ; IV (filme): 1645, 1759, 3070, 3389 cm'1; 2H RMN (CDC13, 300 MHz) : δ 0,76; 0,83; 0,97; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25- H3, 26-H3, 27-H3); 2, 38 (dt, J = 11,1 Hz e J -- = 5,3 Hz, 1H, 19· -H); 2,68 (s, 3H, 2'- -ch3) ; 3,19 (dd, J = 10 ,8 Hz e J = 5 ,1 Hz, 1H, 3a-H); 3, 36 (s, 3H, OCH3) ; 3,88 (s , 2H, 30- h2) , : 4( 0 \—1 II \—1 Hz , 1H, 28a-H) ; 4,58 (d, J = 10,4 Hz, 1H , 28b-H) ; 4,94 (s largo, 1H, 29a-H); 4, 96 (s largo, 1H, 29 b-H) ; 6,88 (d, J = 1, 7Hz , 1H, 4'-H); / ',37 (d, J = 1,7Hz, 1H, 5' -H) ; 13CRMN (CDC13, 75 MHz): δ 58,3 (OCH3) ; 66,7 (C28); 74,9 (C30) ; 78,8 (C3) ; 109,6 (C29) ; 118,0 (C5 ') ; 127,4 (C4 ') ; 147,9 (C2'); 149,8 (OCO); 150,4 (C20) ; EI-MS m/z (%):580 (9) M+, 189 (25), 187 (28), 119 (27), 107 (23), 105 (25), 91 (24), 83 (100), 81 (27), 79 (25). E o composto 39 (0,07g; 21%): p.f. (acetona/n-hexano) 116-118 °C; IV (filme): 1642, 1754, 3070 cm'1; XH RMN (CDC13, 400 MHz) δ 0,90; 0,95; 0,96; 1,03; 1,08 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 2, 39 (dt, J = 11,3 Hz e J = 5,5 Hz, 1H, 19-H); 2,65 E 2,66 (ambos s, 3H cada, 2'-CH3, 2' ' -CH3) ; 3,37 (s, 3H, OCH3) ; 3,89 (s, 2H, 30-H2) ; 4,14 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28a-H); 4,58 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28b-H); 4,65 (dd, J= 11,1 Hz e J = 4,8 Hz, 1H, 3a-H); 4,95 (s, 1H, 29a-H) ; 4,98 (s, 1H, 29b-H) ; 6,86 (s, 1H, 4'-H); 6,87 (s largo, 1H, 4'-H); 7,34 (s largo, 1H, 5'-H); 7,36 (s largo, 1H, 5' ' —H) ; 13C RMN (CDC13, 100 MHz): δ 58,4 (OCH3) ; 66,5 (C28); 75,1 (C30); 85,9 (C3) ; 109,8 (C29); 118,0 (05' e 05' ') ; 127,7 e 127,9 (C4', C4 " ); 147,9 (02' e C2 " ); 149,5 (OCO); 149,9 (OCO); 150,4 (C20); EI-MS m/z (%) : 688 (11) M+, 187 (23), 185 (22), 145 (32), 119 (22), 105 (26), 95 (26), 91 (46), 83 (100), 81 (27). 60
Exemplo 28 (ΙΗ-Triazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-30-metoxi-lup-20 (29)-en-28-ilo (Composto 37) e do (lH-triazol-l-il)-carboxilato de 30-metoxilup-20(29)-βηο-3β,28-diilo (Composto 40) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 16 mas usando o composto 7 (0,21 g; 0,4 mmol) e CDT (0,30 g; 1,8 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 7 h. O sólido amarelo obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de silica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 1:1), obtendo-se o composto 37 (0,15 g; 57%) : p.f.(acetona/n-hexano) 137-140 °C ; IV (filme) : 1645, 1766, 1782, 3070, 3414 cm"1; XH RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,76; 0,83; 0,97; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23-Hs, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 2,39 (dt, J= 11,2
Hz e J= 5,3 Hz, 1H, 19-H) ; 3,19 (dd, J = 10,8 Hz e J = 5,0
Hz, 3a-H); 3,36 (s, 3H, OCH3); 3, 88 (s, 2H, 30-H2) ; 4,29 (d, J= 10,6 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,72 (d, J= 10,6 Hz, 1H, 28b-H) ; 4,94 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,97 (s largo, 1H, 29b-H) ;
8.09 (s largo, 1H, 3'-H); 8,82 (s largo, 1H, 5'-H); 13CRMN (CDCI3, 75 MHz): δ 58,3 (OCH3) ; 68,1 (C28); 74,9 (C30); 78.9 (C 3); 109,7 (C29); 145,4 (C 5') ; 147,9 (OCO); 150,3 (C20); 153,6 (C3'); EI-MS m/z (%) : 567 (13) M+, 201 (71), 189 (78), 187 (70), 145 (72), 131 (61), 119 (71), 105 (82), 91 (100), 79 (57). E o composto 40 (0,05 g; 17%) : p.f. (acetona/n-hexano) 172-175 °C; IV (filme): 1646, 1763, 61 1782, 3070 cm'1; 1R RMN (CDC13, 400 MHz) δ 0,91; 0,98; 0,99; 1,03; 1,09 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 2,40 (dt, J = 11,1 Hz e J = 5,4 Hz, 1H, 19-H) ; 3,37 (s, 3H, OCH3) ; 3,89 (s, 2H, 30-H2) ; 4,29 (d, J= 10,8 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,71 - 4,82 (m, 2H, 3a-H e 28b-H) ; 4,96 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,98 (s largo, 1H, 29b-H) ; 8,08 e 8,09 (ambos s, 1H cada, 3'-H, 3''—H); 8,79 e 8,83 (ambos s, 1H cada, 5' -H, 5"-H); 13C RMN (CDC13, 100 MHz): δ 58,3 (OCH3) ; 68,1 (C28); 74,9 (C30); 87,7 (C3); 109,8 (C29); 145,3 e 145.4 (C5', C5' ') ; 147,2 (OCO); 147,9 (OCO); 150,3 (C20) ; 153.5 e 153,6 (C3', C3"); EI-MS m/z (%) : 663 (15) M+, 201 (70), 119 (81), 107 (66), 105 (80), 95 (75), 91 (100), 81 (94), 79 (82), 67 (74) .
Exemplo 29 (líf-Imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-(20R)-lupan-29-oxo-28-ilo (Composto 41) e (lH-imidazol-l-il)-carboxilato de (20R)-lupan-29-oxo-3p,28-diilo (Composto 43) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 9 (0,29 g; 0,6 mmol) e CDI (0,32 g; 1,9 mmol) em THE anidro (12 ml), a refluxo durante 7 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 2:3), obtendo-se o composto 41 (0,23 g; 67%) : p.f.(acetona/n- hexano) 175-177 °C ; IV (filme) : 1239, 1722, 1762, 3414 cm"1; 3Η RMN (CDC13, 400 MHz): δ 0,77; 0,85; 0,98; 1,07 62 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,15 (d, J= 7,0 Hz, 3H, 3O-H3); 2,64 (m, 1H, 20-H); 3,21 (dd, J= 10,8 Hz e J = 5,1 Hz, 1H, 3oí-H) ; 4,13 (d, J= 10,9 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,60 (d, J = 10,9 Hz, 1H, 28b-H) ; 7,09 (s largo, 1H, 4'-H) ; 7,42 (s largo, 1H, 5'-H); 8,15 (s largo, 1H, 2'-H); 9,85 (d, J= 1,9 Hz, 1H, 29-H) ; 13CRMN (CDCI3, 100 MHz) : δ 14,4 (C30); 48,8 (C20) ; 66,4 (C28) ; 78,8 (C3) ; 117,1 (C5'); 130,6 (C4'); 137,0 (C2'); 149,1 (OCO); 206, 3 (C29); EI-MS m/z (%) : 552 (18) M+, 207 (46), 189 (58), 187 (47), 145 (49), 119 (45), 105 (51), 91 (58), 79 (48), 69 (100). E o composto 43 (0,13 g; 30%): p.f. (acetona/n-hexano) 145-146 °C ; IV (filme) : 1239, 1716, 1758 cm-1; XH RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,92; 0,97; 0,99; 1,09 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25- h3, 26- h3, 27- -h3) ; 1, 16 (d, J = 7, , 0 Hz, 3H, 30- h3) ; 2,64 (m, 1H, , 20 -H) ; 4 ,13 (d, J = 10,9 Hz, 1H, 28a-H) ; 4 ,61 (d, J = 10,9 Hz, 1H , 28b- H); 4, 69 (dd, J = = 10,9 Hz e ! J = 5 ,4 Hz, 1H, 3a- -H) ; 7, 09 (s largo, 2H, 4' -H, 4''-H) ; 7, 43 (s largo, 2H, 5'- -H, 5' ' -H) ; 8 ,15 (s largo, 2H, 2' -H, 2' H) ; 9, 85 (d, J= 1,9 Hz, 1H, 29-H); 13CRMN (CDC13, 75 MHz): δ 66,3 (C28) ; 86,2 (C3); 117,0 (C5', C5"); 130,6 (C4', C4") ; 136,9 (C2', C2"); 148,4 (OCO); 148,9 (OCO); 206,1 (C29); EI-MS m/z (%) : 646 (6) M+, 187 (23), 159 (23), 119 (23), 105 (29), 93 (20), 91 (34), 81 (19), 79 (22), 69 (100).
Exemplo 30 (2'-Metil-lH-imidazol-l-il)-carboxilato de 3p-hidroxi-(20R)-lupan-29-oxo-28-ilo (Composto 42) A reacção foi realizada de acordo com o proce- 63 dimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 9 (0,19 g; 0,4 mmol) e CBMI (0,15 g; 0,8 mmol) em THF anidro (8 ml) , a refluxo durante 6 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 42 (0,18 g; 75%) : p.f.(acetona/n-hexano) 132-134 °C ; IV (filme) : 1716, 1759, 3365 cm"1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) : δ 0,77; 0,85; 0,98; 1,07 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,16 (d, J= 7,0 Hz, 3H, 30-H3) ; 2,66 (s, 3H, 2'-CH3) ; 3,21 (dd, J= 10,4 Hz, J= 4,6 Hz, 1H, 3a-H); 4,09 (d, J= 10,9 Hz, 1H, 28a-H) ; 4,55 (d, J= 10,9 Hz,
1H, 28b-H); 6, 87 (d, J = 1,7 Hz, 1H, 4'—H) ; 7, 35 (d, J = 1,7 Hz, 1H, 5' -H) ; 9,85 (d, J = 1,8 Hz, 1H, 29-H) ; 13CRMN (CDC13, 100 MHz) : δ 66,0 (C28) ; 78,9 (C3); 118,1 (C5 ' ) ; 130,1 (C4 ' ) ; 144, 3 (C2'); 149,2 (OCO); 206,3 (C 2 9) ; EI-MS m/z (%) : 566 (8) M+, 189 (67), 161 (72), 147 (72), 133 (83), 105 (80), 91 (93), 83 (68), 81 (100), 79 (62).
Exemplo 31 Ácido 28- (lH-imidazol-l-il)-lup-20(29)-eno-3,28-diona (Composto 44)
A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 11 (0,20 g; 0,4 mmol) e CDI (0,22 g; 1,4 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 9 h. O sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de 64
petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 44 (0,20 g; 89%): p.f.(benzeno) 189-190 °C; IV (filme) : 1642, 1703, 1721, 3073 cm-1; 1H RMN (CDC13, 400 MHz) δ 0,94; 0,96; 1,01; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,71 (s, 3H, 30-H3) ; 2,97 (dt, J = 10,7 Hz e J = 4,8 Hz, 19-H), 4,65 (s, 1H, 29a-H); 4,78 (s, 1H, 29b-H) ; 7,05 (s, 1H, 4'-H); 7,54 (s, 1H, 5'-H); 8,28 (s, 1H, 2' -H) 13C RMN (CDC13, 100 MHz): δ 110,2 (C29) ; 117,4 (C5'); 129,6 (C4'), 137,3 (C2'), 149,7 (C20); 172,9 (C28); 217,9 (C3); EI-MS m/z (%): 504(4) M+, 410 (30), 409 (100), 245 (46), 203 (49), 189 (58), 147 (25), 107 (31), 105 (27) , 91 (24) .
Exemplo 32 Ácido 28-(2'-metil-lH-imidazol-l-il)-lup-20 (29)-eno-3,28- diona (Composto 45) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 11 (0,20 g; 0,4 mmol) e CBMI (0,24 g; 1,4 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 8 h. O sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 45 (0,20 g; 84%): p. f. (acetona/n-hexano) 196-198 °C; IV (filme) : 1642, 1703, 1721, 3073 cm-1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) δ 0,94; 0,98;1,00; 1,02; 1,06 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,72 (s, 3H, 30-H3) ; 2,63 (s, 3H, 2'-CH3) ; 3,06 (dt, J= 11,1 Hz, J= 4,6 Hz, 1H, 19- 65 Η) ; 4,65 (s largo, 1H, 29a-H) ; 4,78 (s largo, 1H, 29b-H) ; 6,86 (d, J = 1,5 Hz, 1H, 4 ' -H) ; 7,40 (d, J = 1,5 Hz, 1H, 5' -H) ; 13C RMN (CDC13, 100 MHz) : δ 110,0 (C29) ; 117,9 (C5') ; 126,9 (C4'); 148,9 (C2'); 149,9 (C20); 175,2 (C28); 218,0 (C3); EI-MS m/z (%) : 518 (2) M+, 409 (100), 245 (54), 203 (50), 189 (76), 119 (50), 105 (58), 91 (71), 81 (72), 79 (49) .
Exemplo 33 Ácido 28-(lH-imidazol-l-il)-lup-1,20(29)-dieno-3, 28-diona (Composto 46) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 12 (0,20 g, 0,5 mmol) e CDI (0,22 g; 1,4 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 9 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merk, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:2), obtendo-se o composto 46 (0,19 g; 82%) : p.f.(acetona/n- hexano) 95-96 °C ; IV (filme): 1645, 1668, 1720, 1762, 3070 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz): δ 1,00; 1,01; 1,07; 1,12 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,72 (s, 3H, 30-H3); 2,98 (dt, J= 11,0 Hz e J = 4,6 Hz, 1H, 19-H); 4,67 (s, 1H, 2 9a-H) ; 4,79 (s, 1H, 29b-H); 5,80 (d, J= 10,1 Hz, 1H, 2-H); 7,05 (s, 1H, 4'-H); 7,12 (d, J= 10,1 Hz, 1H, 1-H) ; 7,54 (s, 1H, 5'-H); 8,29 (s, 1H, 2'-H); 13CRMN (CDCl3, 75 MHz): δ 110,3 (C29); 117,5 (C 5') ; 125,2 (C2); 128,8 (C4') ; 137,1 (C2') ; 149,5 (C20); 159,6 (Cl); 172,6 (C28); 66 205,4 (C3); EI-MS m/z (%): 502 (4) M+, 408 (32), 407 (100), 243 (43), 205 (30), 203 (26), 189 (34), 135 (25), 105 (28), 91 (29) .
Exemplo 34 Ácido 28-(2'-metil-lH-imidazol-l-il)-lup-1,20(29)-dieno-3,28-diona (Composto 47) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 12 (0,20 g; 0,5 mmol) e CBMI (0,24 g; 1,4 mmol) em THF anidro (8 ml) , a refluxo durante 9 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 3:1), obtendo-se o composto 47 (0,20 g; 87%) : p.f.(acetona/n- hexano) 99-103 °C ; IV (filme) : 1642 , 1668, 1721, 1760, 3073 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz) : δ 1,01; 1,07; 1,12 (todos s, 15H, 23-Hs, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3); 1,73 (s, 3H, 30-H3); 2,67 (s, 3H, 2'-CH3); 3,06 (dt, J= 10,8 Hz e J = 4,3 Hz, 1H, 19-H); 4,67 (s, 1H, 29a-H) ; 4,80 (s, 1H, 29b- H); 5,80 (d, J= 10,3 Hz, 1H, 2-H); 6,90 (s largo, 1H, 4'- H); 7,12 (d, J= 10,3 Hz, 1H, 1-H); 7,42 (s largo, 1H, 5'- H) ; 13CRMN (CDCI3, 75 MHz): δ 110,1 (C29) ; 118,0 (C5') ; 125,1 (C2); 126,4 (C4'); 148,9 (C2 ') ; 149,6 (C20); 159,6 (Cl); 175,0 (C28); 205, 4 (C3) ; EI-MS m/z (%) : 516 (3) M+, 408 (37), 407 (100), 243 (56), 205 (37), 189 (42), 135 (43), 105 (37), 91 (44), 81 (36) . 67
Exemplo 35 Ácido 2-hidroxi-28-(ltf-imidazol-l-il)-lup-1,20(29)-dieno-3,28-diona (Composto 48) e (ltf-imidazol-l-il)-carboxilato de 28-(lH-imidazol-l-il)-3,28-dioxo-lup-l,20(29)-dien-2-ilo (Composto 49)
A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 14 mas usando o composto 13 (0,30 g, 0,65 mmol) e CDI (0,52 g, 3,25 mmol) em THF anidro (12 ml), a refluxo durante 8 h. O resíduo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 1:4), obtendo-se o composto 48 (0,24 g; 70%): p.f. (acetona/n- hexano) 145-148 °C ; IV (filme): 1645, 1667, 1724, 1762, 3078, 3448 cm-1; XH RMN (CDC13, 400 MHz) : δ 0,99; 1,10; 1,14; 1,19 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,72 (s, 3H, 30-H3) ; 2,97 (dt, J= 10,6 Hz e J = 4,0 Hz, 1H, 19-H) ; 4,67 (s, 1H, 29a-H); 4,79 (s, 1H, 29b-H) ; 6,45 (s, 1H, 1-H); 7,09 (s, 1H, 4'-H); 7,56 (s, 1H, 5'-H); 8,43 (s, 1H, 2' -H) ; 13CRMN (CDC13, 100 MHz): δ 110,4 (C29) ; 117,4 (C5'); 128,8 (Cl); 129,6 (C4'); 137,3 (C2'); 143,9 (C2); 149,5 (C20); 172,9 (C28); 201,1 (C3); EI-MS m/z (%) : 518 (22) M+, 423 (100), 215 (94), 213 (65), 189 (57), 119 (55), 105 (54), 91 (89), 79 (54), 69 (55). E o composto 49 (0,11 g; 27%): p.f.(acetona/n-hexano) 211-213 °C ; IV (filme) : 1642, 1721, 1757, 1826, 3070 cm'1; XH RMN (CDC13, 300 MHz): δ 0,89; 1,00; 1,16; 1,17; 1,36 (todos s, 15H, 23- 68 H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,73 (s, 3H, 30-H3) : 2,92 (dt, J = 10,9 Hz e J = 4,6 Hz, 1H, 19-H) ; 4,67 (s largo, 1H, 2 9a-H) ; 4,74 (s largo, 1H, 29b-H); 6, 97 (s, 1H, 1-H) ; 7,04 e 7, 21 (ambos s, 1H cada, 4'-H, 4'' -H); 7,51 e 7,79 (ambos s, 1H cada, 5'-H, 5''-H); 8, 27 e 8,42 (ambos s, 1H cada, 2' -H, 2"-H); 13CRMN (CDC13, 75 MHz) : δ 110,6 (C29); 117,3 (C 5' e C5"); 129,6 (C4' e C4" ) ; 132,6 (Cl); 137,2 (C2' e C2"); 146,5 (C2) ; 149,1 (OCO); 152,2 (C20); 172,8 (C28); 202,3 (C3); EI-MS m/z (%): 612 (9) M+, 518 (35), 517 (100), 449 (19), 405 (14), 295 (15), 189 (27), 105 (18), 91 (21) , 69 (16) .
Exemplo 36 Ácido 2-(2'-metil-ltf-imidazol-l-carboniloxi)-3-oxolup-1,20(29)-dien-28-óico (Composto 50) A reacção foi realizada de acordo com o procedimento descrito para o composto 15 mas usando o composto 13 (0,21 g; 0,45 mmol) e CBMI (0,40 g; 2,3 mmol) em THF anidro (8 ml), a refluxo durante 7 h. O residuo sólido branco obtido foi posteriormente purificado por cromatografia flash (gel de sílica 230-400 Mesh, Merck, eluente: éter de petróleo 40-60°C-acetato de etilo 2:3), obtendo-se o composto 50 (0,22 g; 83%): p.f.(acetona/n- hexano) 141-143 °C ; IV (filme): 1645, 1687, 1770, 1824, 3070, 3394 cm'1; XH RMN (CDC13, 400 MHz): δ 1,01; 1,05; 1,16; 1,21; 1,24 (todos s, 15H, 23-H3, 24-H3, 25-H3, 26-H3, 27-H3) ; 1,69 (s, 3H, 30-H3) ; 2,66 (s, 3H, 2'-CH3); 3,04 (dt, 6 101873, WO 2007/112043 and US 2008/0293682). Com o objec-tivo de obter moléculas não só mais potentes do ponto de vista terapêutico, como também clinicamente aceitáveis, descobrimos que a introdução nas posições C-3 e/ou C-28 da betulina, do ácido betulinico e de outros derivados, de um anel imidazole, 2'-metilimidazole ou triazole, confere aos novos derivados as caracteristicas desejáveis que constituem a base da presente invenção.
Breve descrição das figuras FIG. 1 representa a estrutura química da betulina e do ácido betulinico. FIG. 2 representa a síntese e estrutura dos triterpenos e derivados (3, 4, 14-27) . Condições reac-cionais: (a) CDI, CBMI ou CDT, THF anidro, N2, refluxo durante 5-10 h; (b) CDI ou CDT, THF anidro, N2, refluxo durante 9-10 h; (c) Sílica gel; (d) Anidrido acético, DMAP, THF, temperatura ambiente (rt) durante 12 h; (e) KOH, MeOH, THF, rt durante 17 h; (f) Anidrido acético, imidazole, CHCI3, refluxo durante 2 h. FIG. 3 representa a síntese e estrutura de outros triterpenos e derivados (5, 28-34). Condições reaccionais: (a) CDI, CBMI ou CDT, THF anidro, N2, refluxo durante 6-9 h; (b) CH3I, K2CO3, DMF anidro, rt durante 1 h. 69 J= 10,9 Hz e J = 4,0 Hz, 1H, 19-H); 4,62 (s, 1H, 29a-H) ; 4,75 (s, 1H, 29b-H); 6,92 (d, J= 1,7 Hz, 1H, 4'-H); 6,99 (s, 1H, 1-H) ; 7,41 (d, J = 1,7 Hz, 1H, 5' -H) ; 13CRMN (CDC13, 100 MHz) : δ 109,8 (C29) ; 118,4 (C5') ; 127,6 (C4') ; 142,0 (Cl); 145,7 (C 2'); 147,4 (C2); 148,6 (OCO); 150,2 (C20); 180,7 (C28); 196,9 (C3) ; EI-MS m/z (%) : 576 (3) M+, 215 (100), 213 (62), 107 (35), 105 (46), 93 (35), 91 (62), 81 (34) , 79 (40) , 67 (34) .
Estudo preliminar da actividade citotóxica: A actividade antiproliferativa dos compostos 14, 28, 35, 41 e 48 foi avaliada nas seguintes linhas celulares cancerígenas: MCF-7 (adenocarcinoma humano da mama), HepG2 (carcinoma hepatocelular humano), A-375 (melanoma humano), HT-29 (adenocarcinoma humano do cólon), HeLa (adenocarcinoma humano do cólo do útero), MIA-PaCa-2 (adenocarcinoma humano do pâncreas), SH-SY5Y (neuroblastoma humano), e Jurkat (leucemia humana) (FIG. 7). Para a realização deste ensaio, as suspensões celulares foram preparadas e diluídas de acordo com o tipo de célula e com a densidade celular pretendida (1χ103 - 30 χ 103 células/ poço baseado nas características de crescimento). As células foram semeadas em placas de 96-poços e a viabilidade celular foi determinada pelo método do MTT (MCF-7, HepG2, A-375, HT-29, HeLa and MIA-PaCa-2) ou do XTT (SH-SY5Y and Jurkat) após 72 h de incubação com os compostos, na concentração de 20 μΜ, em triplicado. 70
Actividade citotóxica nas linhas celulares HepG2, HeLa,
Jurkat e Chang liver A citotoxicidade dos compostos com as fórmulas gerais (I) e (II) 14-50 foi determinada nas linhas celulares humanas (HepG2, HeLa e Jurkat) (Tabela 3) . Os compostos apresentados na Tabela 4 foram também testados na linha celular não tumoral (Chang liver). A viabilidade celular das células HeLa, HepG2 e Chang liver foi determinada pelo método do MTT. Resumidamente, as células em crescimento exponencial foram semeadas em placas de 96-poços, na densidade de 1 χ 103, 8 χ 103 e 5 χ 103 célu-las/poço, respectivamente e incubadas durante 24 h antes do tratamento. O meio de crescimento foi substituído por meio contendo os compostos a testar dissolvidos em DMSO (concentração final de DMSO < 0,1%) a diferentes concentrações, em triplicado e incubaram-se as células durante 72 h. Após incubação com os compostos, o meio foi removido e adicionou-se uma solução de MTT (0,5 mg/ml, 100 μΐ) a cada poço e incubou-se novamente as placas durante 1 h. Adicionou-se DMSO (100 μΐ) para dissolver os cristais de formazana e leu-se a absorvância a 550 nm num leitor de placas ELISA (Tecan Sunrise MR20-301, TECAN, Áustria). Nas células Jurkat, a viabilidade celular foi determinada pelo método do XTT. Resumidamente, as células em crescimento exponencial foram semeadas em placas de 96-poços na densidade de 5,5 χ 103 células/poço, tratadas com os 71 diferentes compostos em triplicado e incubadas durante 72 h. Após incubação com os compostos adicionou-se a mistura de XTT (100 μΐ) e após 4 h de incubação leu-se a absor-vância 450 nm, no leitor de placas ELISA. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 3 e 4 expressos como a concentração que inibe 50% do crescimento celular (IC50) . Conhecido pela sua actividade citotóxica, o ácido betulinico 2 foi utilizado como controlo positivo. Com base nos valores de IC5o, os compostos foram classificados em muito activos (IC 50 < 10 μΜ), moderadamente activos (10 μΜ > IC5o < 30 Mm) e fracamente activos (IC50 > 30 μΜ) . Todos os valores de IC50 representam a média de pelo menos três experiências e estão expressos como a média ± desvio padrão (DP) .
Tabela 3
Actividade citotóxica in vitro dos derivados do tipo lupano IC50 (μΜ ±DP) a
Composto _HepG2 b_Jurkat c_HeLa d 2 36,4 ± 1,5 26, 9 ± 2,2 26,0 ± 2,1 14 4,2 ± 0,3 16,3 ± 1,2 7,6 ± 0,6 15 8,1 ± 0,4 15,8 ± 2,4 11,0 ± 1,7 16 - - 15,2 ± 2,1 17 > 30 > 30 > 30 18 > 30 > 30 > 30 19 - - > 30 20 2,0 ± 0,4 11,1 ± 1,3 3,0 ± 0,2 21 - - 11,3 ± 1,9 22 > 30 > 30 > 30 23 > 30 > 30 > 30 72 72 Composto _HepG2 b_Jurkat e_HeLa d 24 - - 23,2 ± 2,1 25 > 30 > 30 > 30 26 > 30 > 30 > 30 27 - - > 30 28 6,2 ± 0,2 5,2 ± 0,7 5,1 ± 0,3 29 7,3 ± 1,0 16,1 ± 3,3 7,5 ± 1,5 30 2,9 ± 0,4 6,0 ± 1,2 8,2 ± 0,4 31 11,6 ± 0,8 20,1 ± 3,2 12,4 ± 1,7 32 - - 14,5 ± 3,2 33 4,3 ± 0,1 9, 9 ± 0,6 8,2 ± 0,5 34 13,4 ± 1,7 16, 4 ± 2,4 13, 4 ± 1,7 35 8,3 ± 0,4 12,2 ± 1,3 9,8 ± 0,6 36 14,4 ± 1,3 24,8 ± 4,7 8,9 ± 2,1 37 - - 13, 8 ± 2,3 38 19,6 ± 1,6 16,2 ± 1,0 > 30 39 28,2 + 2,5 > 30 13,4 ± 0,6 40 - - > 30 41 11,5 ± 1,1 13, 7 ± 1,4 11,1 ± 1,4 42 14,3 ± 2,4 21,3 ± 4,1 16, 6 ± 1,5 43 26,1 ± 1,1 20,2 ± 1,6 19,2 ± 1,5 44 0,8 + 0,05 1,4 ± 0,2 2,0 ± 0,3 45 5,5 ± 1,1 9,3 ± 2,2 4,2 ± 1,2 46 1,7 ± 0,2 2,3 ± 0,3 3,0 ± 0,2 47 12,7 ± 1,2 9, 4 ± 0,8 6,4 ± 0,8 48 6,5 ± 0,4 7,0 ± 1,6 4,6 ± 0,7 49 4,0 ± 0,3 8,1 ± 0,6 3,9 ± 0,3 50 6,8 ± 1,5 12,5 ± 1,2 10,6 ± 0,7 (continuação) _IC50 (μΜ ±DP) a a Os resultados correspondem á média (+DP) de três experiências independentes feitas em triplicado b Carcinoma hepatocelular humano c Leucemia humana d Adenocarcinoma humano do colo do útero 73 _Tabela 4_
Actividade citotóxica in vitro dos derivados lupano numa linha celular não-tumoral IC50 (μΜ ±DP) a
Composto _Chang liver b 2 92,3 + 4,1 14 79,7 ± 6,4 20 60,7 ± 3,8 28 56,8 ± 2,2 30 149,9 ± 13,6 33 73,9 ± 3,6 35 96,4 ± 7,5 38 170,4 ± 17, 7 41 145,7 ± 4,5 43 156,2 ± 12,5 44 48,8 ± 2,8 46 55,9 ± 4,6 48 62,8 + 10,3 49 71,6 ± 4,9 a Os resultados correspondem á média (±DP) de três experiências independentes feitas em triplicado b Células humanas de fígado normais
Análise do ciclo celular das células HepG2, HeLa, Jurkat e Chang liver tratadas com os compostos.
Os efeitos de alguns destes compostos no ciclo celular foram determinados por citometria de fluxo (Tabela 5). Para este ensaio semearam-se 2,3 χ 105 HepG2 células/poço, 2,9 χ 104 HeLa células/poço, 1,6 χ 105 Jurkat células/poço e 1,4 χ 105 Chang liver células/poço em placas de 6 poços com 2 ml de meio. 0 número de células a semear foi determinado pela relação células/área do poço, considerando o número de células semeado em placas de 96-poços. Após 24 h de 74 incubação a 37°C com 5% de CO2, os compostos 20, 44, 46 e o ácido betulinico 2 foram adicionados nas concentrações correspondentes aos seus valores de IC50. As células Chang liver foram incubadas com os compostos 20, 44 e 46 a concentrações equivalentes aos respectivos valores de ICso determinados nas células HepG2, a 72 h. Após 72 h de incubação as células foram tripsinizadas, centrifugadas e mantidas em tampão TBS contendo 1 mg/ml PI, 10 mg/ml RNAse livre de DNAase e 0,1% Igepal CA-630. Após um período de incubação de 1 hora, a 4°C, na ausência de luz, as amostras foram analisadas por FACS, utilizando um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um citómetro de fluxo Epics XL (Coulter Corporation, Hialeah, FL). Todos os resultados representam a média de pelo menos 3 poços diferentes. Para calcular a percentagem de células em cada fase do ciclo celular utilizou-se o programa Multicycle [Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, (EUA)]. Todas as experiências foram realizadas 3 vezes com três replicados por experiência. Como demonstrado na Tabela 5 todos os compostos induzem um significativo aumento da população de células na fase S (aumento de 17 % para o composto 20, 20 % para o composto 44 e 12 % para o composto 46 nas células HepG2) com uma diminuição concominantes da percentagem de células na fase G0/G1 (diminuição de 12 % para o composto 20, 16 % para o composto 44 e 7 % para o composto 46 na linha celular HepG2) relativamente às células não tratadas, sugerindo que a inibição da proliferação celular pelos compostos testados está associada a uma paragem na fase S, do ciclo celular. Para avaliar a selectividade do efeito nas células tumorais, testámos os compostos 20, 44 e 46 numa linha 75 celular não-tumoral. As células Chang liver foram tratadas com os compostos, a uma concentração equivalente ao seus valores de IC8o determinados nas células HepG2, após 72 h de incubação e não se verificou qualquer efeito (Tabela 5).
Tabela 5
Análise do ciclo celular das células tratadas com os derivados lupano Linha Fase do Ciclo celular (% de células) a Celular 1L LjJ L G0/G1 S G2/M
HepG2 b
Controlo AB 20 44 46 61.3 ± 2,2 59,7 ± 2,0 49.4 ± 1,2 45.6 ± 2,1 54.7 + 1,5 19.1 ± 0,5 25,9 ± 1,3 36.1 ± 0,8 39.6 ± 3,6 30.7 + 0,6 19.5 ± 2,4 14.3 ± 0,9 14.5 ± 0,8 14,9 ± 1,4 14.3 ± 1,0
Controlo 69,8 ± AB 66,8 +
HeLa c 20 50,6 ± 44 53,1 ± _ 46 _64,6 + 0,7 12,9 + 0,9 17,2 ± 0,7 1,2 21,4 + 0,9 11,7 ±1,1 1,3 36,4 + 2,4 13,0 ± 1,4 1,1 33,1 + 0,9 13,8 ± 1,1 CM 25,6 + 1,5 9,7 ± 1,3
Controlo 61,7 ± AB 56,8 ±
Jurkat d 20 48,6 ± 44 52,7 ± _ 46 49,6 + 4,4 13,2 + 1,9 25,1 ± 2,7 5, 0 18,9 + 1,2 24,1 + 4,7 4,4 35,6 ± 3,1 15,8 ± 2,1 0,5 26,6 ± 0,9 20,8 ± 1,1 2,6 29,8 ± 0,8 20,7 ± 2,4
Chang liver e
Controlo 20 44 46 68.2 ± 2,3 68,6 ± 4,2 68.2 ± 2,9 68.2 ± 4,9 22,0 ± 1,8 22,0 ± 3,0 23,2 ± 2,5 22,6 ± 3,8 9.1 ± 1,4 9,3 + 1,3 8,6 ± 0,8 9.2 ± 1,4 (+DP) de três experiências a Os resultados correspondem à média independentes feitos em triplicado b Carcinoma hepatocelular humano c Leucemia humana d Adenocarcinoma humano do colo do útero e Células humanas de fígado normais 76
Indução da apoptose pelos compostos 20, 44 e 46 A percentagem de células apoptóticas foi determinada 72 h após o tratamento das células com os derivados, a concentrações equivalents aos seus valores de IC50. Resumidamente, o mesmo número de células HepG2, HeLa, Jurkat e Chang liver utilizado na análise do ciclo celular, foi tratado com os derivados 20, 44, 46 e ácido betulinico 2, como descrito anteriormente. As células foram recolhidas, lavadas com tampão de ligação, arrefecido em gelo (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) e ressuspendidas neste mesmo tampão (95 μΐ) numa concentração máxima de 8 χ 105 células/ml. Adicionou-se anexina V-FITC (1 pg/ml) e incubou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente e na ausência de luz. Imediatamente antes da análise por FACS adicionaram-se 20 μΐ da solução de IP a 1 mg/ml.
Em cada histograma foram analisadas aproximada-mente 1 χ 104 células. As experiências foram realizadas três vezes, com triplicados para cada experiência. A análise por FACS usando anexina V-FITC e IP foi utilizada para diferenciar as células em apoptose inicial (annexin V+ e IP~) das células necróticas ou em apoptose tardia (annexin V+ e IP+) . Os novos derivados do tipo lupano foram extremamente potentes a induzir apoptose nas células HepG2, HeLa e Jurkat células apresentando uma actividade marcadamente superior à do ácido betulinico 2 77 (FIG. 8) . 0 composto 44 foi o mais efectivo a induzir apoptose, em todas as linhas celulares, apesar dos compostos 20 e 46 também serem extremamente efectivos (FIG. 8) . Em comparação com as células não tratadas, o tratamento das células HepG2 com o composto 44 induziu apoptose em 53 % das células (42% de apoptose inicial e 11% de apoptose tardia) , o composto 46 originou apoptose em 38% das células (28% de apoptose inicial e 10% de apoptose tardia) e o composto 20 induziu apoptose em 29% das células (22% de apoptose inicial e 7% de apoptose tardia) (FIG. 8) . Na concentração correspondente aos valores de ICso determinados nas células HepG2, não se observou nenhum efeito na indução de apoptose nas células normais de figado, Chang liver (Fig. 8) . Estes resultados estão em concordância com a incapacidade demonstrada pelos três derivados em inibir a proliferação destas células (Tabela 4). A introdução da função imidazolilo demonstrou ser importante para a capacidade de induzir apoptose e paragem do ciclo celular, uma vez que estes compostos exibem uma actividade superior à do ácido betulinico 2.
Citotoxicidade noutras linhas celulares cancerígenas
Os compostos apresentados na Tabela 6 também foram testados nas seguintes linhas celulares: PC-3 (adenocarcinoma humano da próstata) , LNCaP (adenocarcinoma humano da próstata), LAPC4 (adenocarcinoma humano da próstata) and HT-29 (adenocarcinoma humano do cólon). 78
Tabela 6
Actividade citotóxica in vitro dos derivados lupano IC50 (μΜ ±DP) a Composto LAPC4 b LNCaP c PC-3 d HT-29 e 14 10,3 ± 1,6 13,0 ± 1,5 21,0 ± 2,0 - 15 - - - 16,2 ± 2,1 17 12,9 ± 1,1 14,4 + 1,3 >30 - 20 16,4 ± 2,1 15,0 ± 1,8 9,2 ± 0,7 - 28 11,8 ± 0,9 15,6 ± 0,8 5,6 ± 0,4 - 29 - - - 5,7 + 0,6 30 4,4 ± 0,2 1,9 + 0,2 1,1 ± 0,1 - 31 - - - 7,8 + 1,6 34 - - - 12,9 ± 0,5 35 9,5 ± 0,7 7,7 + 0,9 11,4 ± 1,3 - 36 - - - 10,4 + 1,6 38 7,3 ± 1,1 8,1 ± 1,0 2,0 ± 0,3 - 41 >30 15,6 + 2,4 16,7 ± 2,4 - 42 - - - 15,8 + 1,7 43 7,9 ± 1,3 6, 9 + 0,3 6,2 ± 0,7 - 44 17,2 ± 2,3 13,7 ± 0,5 6,9 ± 1,1 - 45 - - - 4,7 + 1,1 47 - - - 5,9 + 0,3 50 - - - 9,0 ± 1,7 a Os resultados correspondem à média (±DP) de três experiências independentes feitos em triplicado b Adenocarcinoma humano da próstata c Adenocarcinoma humano da próstata d Adenocarcinoma humano da próstata e Adenocarcinoma humano do cólon
Lisboa, 20 de Maio de 2010 7 FIG. 4 representa a síntese e a estrutura de outros triterpenos e derivados (1, 6-10, 35-43). Condições reaccionais: (a) NBS, CC14, refluxo durante 3 h; (b) NaOH aq. (4N), MeOH, THF, rt durante 29 h; (c) CDI, CBMI ou CDT, THF anidro, N2, refluxo durante 7-8 h; (d) m-CPBA, CH2CI2, 0-5°C durante 5 h; (e) H2S04 (2M), 0-5°C, durante 1 h; (f) CDI ou CBMI, THF anidro, N2, refluxo durante 6-7 h. FIG. 5 representa a síntese e estructura de outros triterpenos e derivados (11-13, 44-50) Condições reaccionais: (a) CDI ou CBMI, THF anidro, N2, refluxo durante 7-9 h; (b) DDQ, dioxano, N2, refluxo durante 15 h; (c) 02, t-BuOK, t-BuOH, 40°C durante 2 h. FIG. 6 representa o esqueleto básico das fórmulas gerais dos derivados da presente invenção. FIG. 7 representa um estudo preliminar da acti-vidade antiproliferativa dos diferentes derivados triterpé-nicos, da presente invenção, em linhas celulares cancerígenas . FIG. 8 representa os resultados da quantificação, por citometria de fluxo, das células apoptóticas após 72 horas de incubação com os derivados triterpénicos 20, 40 and 46 a concentrações correspondentes ao seu valor de IC50. A percentagem de células em apoptose inicial (barras

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto, caracterizado por apresentar a fórmula (I) ou (II) :
    ou a um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, em que Ri é seleccionado a partir do grupo constituído por OH, OAc ou OCOR6; R2 é seleccionado a partir de CH2OH, CH2OAc, COOH, COOMe, CH2OCOR6 ou CORê,· R3 é seleccionado a partir de CH2=CCH3, CH2=CCH2OMe ou CH(CH3)CH0; rrrr^ é uma ligação simples ou dupla; R4 é H, OH or OCOR6; R5 é seleccionado a partir de COOH ou CORg; R6 é um anel heterocíclico aromático de cinco membros seleccionado a partir de imidazolilo, 2'-metilimidazolilo ou triazolilo; com a condição do composto de fórmula (I) não ser um composto em que: Ri é OH, R2 é CH2OH e R3 é CH2=CCH3; ou Ri é OH, R2 é CH2OH e R3 é CH2=CCH2OMe; OU Ri é OH, R2 é CH2OH e R3 2 é CH (CH3) CHO; ou Ri é OH, R2 é COOH e R3 é CH2=CCH3; ou Ri é OH, R2 é COOH e R3 é CH2=CCH2OMe; OU R4 é OH, R2 é COOH e R3 é CH(CH3)CHO; ou Ri é OAc, R2 é COOH e R3 é CH2=CCH3; ou Ri é OAc, R2 é COOH e R3 é CH2=CCH2OMe; ou Rx é OAc, R2 é COOH e R3 é CH(CH3)CHO; quando R3 é OH, R2 é COOMe e R3 é CH2=CCH3; ou Ri é OH, R2 é COOMe e R3 é CH2=CCH2OMe; ou R3 é OH, R2 é COOMe e R3 é CH(CH3)CHO; ou Ri é OAc, R2 é COOMe e R3 é CH2=CCH3; ou Ri é OAc, R2 é COOMe e R3 é CH2=CCH2OMe; ou R4 é OAc, R2 é COOMe e R3 é CH(CH3)CHO; ou Ri é OH, R2 é CH2OAc e R3 é CH2=CCH3; ou Ri é OH, R2 é CH2OAc e R3 é CH2=CCH2OMe; ou Ri é OH, R2 é CH2OAc e R3 é CH(CH3)CHO; ou Ri é OAc, R2 é CH2OH e R3 é CH2=CCH3; ou Ri é OAc, R2 é CH2OH e R3 é CH2=CCH2OMe; ou Ri é OAc, R2 é CH2OH e R3 é CH(CH3)CHO; ou Ri é OAc, R2 é CH2OAc e R3 é CH2=CCH3; ou Ri é OAc, R2 é CH2OAc e R3 é CH2=CCH2OMe; ou Ri é OAc, R2 é CH2OAc e R3 é CH(CH3)CHO, ou um sal farmaceuticamente aceitável; e com a condição do composto de fórmula (I) não ser um composto em que: = é uma ligação simples, R4 é H e R5 é COOH; ou é uma ligação dupla, R4 é H e R5 é COOH; ou = é uma ligação dupla, R4 é OH e R5 é COOH, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  2. 2. Composto de fórmula (I) , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser seleccionado a partir dos compostos 14 a 43, em que R4, R2 e R3 têm os significados seguintes: 3 Ri r2 r3 0 OH cHjP^n^n \=J ch2=cch3 OH 0 çh3 υ λ CH20 N SN \=J ch2=cch3 OH 0 Λ ,N. CH20 N ^ ^=N ch2=cch3 0 \=J 0 X /N CH20 N SN \=J ch2=cch3 o çh3 cAA \=J 0 ÇH3 X X CH20 N nN \=J ch2=cch3 0 Λ A W 0 Λ A CH20 N ^ ^=N ch2=cch3 0 O^N^N \=J CHjOH ch2=cch3 0 Λ ,N. O^N ^ \=N CH^H ch2=cch3 0 OAc CHjO^N^N \=J ch2=cch3 OAc 0 çh3 u I CH20 N VN \=J ch2=cch3 OAc 0 Λ A CH20 N ^ ^=N ch2=cch3 0 O^N^N \=J CH2OAc ch2=cch3 0 çh3 oAA CH2OAc ch2=cch3 \=J 0 Λ ,N. O^N -¾) w CH2OAc ch2=cch3 ο Ο^Ι'Λν \=J COOH 0 çh3 O^N nN \=J COOH 0 O^N^N \=J 0 \=J o çh3 cAA \=J o çh3 \=J 0 A A Ο'Α -¾) \=N 0 l A N \=N ch2=cch3 ch2=cch3 ch2=cch3 ch2=cch3 ch2=cch: 4 (continuação) Compounds Ri r2 R3 0 O^N^N \=J 33 COOMe ch2=cch3 34 0 CH3 cAA \=J COOMe 0 X CH20 N VN \=J ch2=cch3 35 OH CH2=CCH2OMe 36 OH 0 çh3 U I CH,0 N N N \=J 0 Λ A CH20 N ^ ^=N CH2=CCH2OMe 37 OH CH2=CCH2OM9 38 0 O^N^N \=J 0 X /X CH20 N nN \=J CH2=CCH2OMe 39 0 çh3 cAA \=J 0 çh3 x X CH20 N nN \=J CH2=CCH2OMe 0 0 40 Λ a Ο'Α ^ \=N ^=N 0 X /X CH20 N SN \=J CH2=CCH2OMe 41 OH CH(CH3)CHO 42 OH 0 ch3 X X CH20 N s N \=J CH(CH3)CHO 0 0 43 O^N^N \=J U - CH20 N A \=J CH(CH3)CHO
  3. 3. Composto de fórmula (II), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser seleccionado a partir dos compostos 44 a 50, em que R4, R5 e = têm os significados seguintes: Compostos_R4_R5_—_ o v=/ 0 çh3 5A C. \=/ 0 ÇH3 \=/ 44 H 45 H 46 H 47 H 5 (continuação) Compounds r4 r5 — 0 48 OH _ w 0 0 49 O^N^N \=J \=J 0 ch3 50 ΛΛ, COOH _ \=J
  4. 4. Processo para a preparação de um composto reivindicação 1, caracterizado por se fazer reagir composto de fórmula (III)
    em que é uma ligação simples ou dupla; R7 é H ou OH; R8 é OH, OAc ou =0; R9 é CH20H, CH20Ac, COOH ou COOMe e Rio é CH2=CCH3, CH2=CCH2OMe ou CH(CH3)CH0, com CDI, CDMI ou CDT ao refluxo num solvente anidro sob atmosfera inerte.
  5. 5. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da reivindicação 1 e um diluente, veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. 6
  6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se destinar ao tratamento do cancro num paciente com necessidade de tal tratamento.
  7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o cancro ser seleccionado a partir do grupo constituído por carcinoma hepatocelular, adenocar-cinoma do colo do útero, leucemia, adenocarcinoma do cólon e adenocarcinoma da próstata.
  8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se destinar à inibição da progressão do ciclo celular numa célula associada com uma doença neoplástica.
  9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a doença neoplástica ser carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do cólo do útero ou leucemia.
  10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se destinar à apoptose numa célula associada com uma doença neoplástica.
  11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a doença neoplástica ser carcinoma hepatocelular, adenocarcinoma do cólo do útero ou leucemia. 7
  12. 12. Método para a identificação de um tumor susceptivel de ser tratado com um composto da reivindicação 1, caracterizado por compreender o contacto de uma amostra de células com o referido composto, em que uma IC50 do composto para a amostra de células, inferior ou igual a 30 μΜ é indicativa de que o tumor é susceptivel de ser tratado com o referido composto. Lisboa, 20 de Maio de 2010
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