PT103720A - Consórcio microbiano de leveduras, processo para a sua preparação e sua utilização na produção de vinhos brancos - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM NOVO CONSÓRCIO MICROBIANO DE TRÊS LEVEDURAS CONSTITUÍDO POR 30 A 60% DE LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE NCYC 3388, 30 A 60% DE LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE NCYC 3389 E 30 A 60% DE LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE NCYC 3390, DEVIDAMENTE DIFERENCIADAS E CARACTERIZADAS POR TIPAGEM MOLECULAR COM O INICIADOR AB1-12 (5'-CCTTGACGCA-3'). A INVENÇÃO REFERE-SE AINDA AO SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO E À SUA UTILIZAÇÃO NA FERMENTAÇÃO CONTROLADA DE MOSTO DE UVA (VINIFICAÇÃO) QUE PERMITE ESTABELECER UM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE VINHOS BRANCOS COM MELHORES QUALIDADES ORGANOLÉPTICAS AS QUAIS SE ASSEMELHAM ÀS DOS VINHOS BRANCOS DA REGIÃO DEMARCADA DO ALENTEJO.

Description

DESCRIÇÃO "CONSÓRCIO MICROBIANO DE LEVEDURAS, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO NA PRODUÇÃO DE VINHOS BRANCOS"

OBJECTIVOS DA INVENÇÃO 0 objectivo da presente invenção é um novo consórcio microbiano, constituído por três leveduras seleccionadas, que utilizadas durante a fermentação controlada de mosto de uva (vinificação), permite estabelecer um processo de produção de vinhos brancos com melhores qualidades orqanolépticas que se assemelham às dos vinhos brancos da região demarcada do Alentejo.

ESTADO DA TÉCNICA

As leveduras têm vindo a ser objecto de investigação e selecção na tentativa de obter uma melhor qualidade do vinho ou controlar a tecnologia para conseguir produtos tipificados por regiões, com uma pequena variabilidade anual. Têm sido seleccionadas estirpes de leveduras com elevado rendimento em etanol, com uma capacidade fermentativa rápida e regular, resistentes ao S02, para vinificação contínua, para elaboração de vinhos doces de baixo teor alcoólico (Lepe e Leal, 1990) . Fundamentais e determinantes são as características organolépticas que as estirpes imprimem aos vinhos.

Actualmente, diversos autores aconselham a inoculação dos mostos com estirpes de leveduras que se encontram distribuídas 1 em cada região ou área vitícola, pelo facto da sua inoculação nos mostos favorecer a obtenção de uniformidade na qualidade, no decurso das campanhas vitícolas bem como a tipicidade característica dos mostos de cada zona (Kunkee,R.E., 1984; Parish, e Carrol, 1987). A selecção tem sido realizada, de um modo preferido, entre as leveduras indígenas da microflora da uva e tem sido dirigida para a obtenção de leveduras com características influentes na qualidade do vinho (Oliveira-Martins, 1988). 0 processo de selecção deve efectuar-se partindo de um número elevado de culturas puras, previamente isoladas e que demonstraram as melhores características enológicas: obtenção de índices máximos característicos e genuínos (típicos) do vinho da zona considerada; máximo rendimento em etanol por unidade de açúcar metabolizado (conceito sujeito a controvérsia); produção mínima de acidez volátil, actividade fermentativa regular (Lepe e Leal, 1990).

Em adegas, de zonas determinadas, o isolamento das leveduras faz-se a partir de mosto recém-obtido, sem que se lhe tenha adicionado SO2 ou que tenha sido sujeito a alguma manipulação estranha ao processo natural de elaboração. As análises microbiológicas fazem-se em momentos distintos da fermentação, de forma a detectar a cinética dos microrganismos ao longo do processo. A identificação e classificação das estirpes decorrem segundo metodologia adequada. A detecção de estirpes contaminantes nesta fase é ainda diminuta, mas a utilização de meios selectivos para leveduras vínicas pode auxiliar o isolamento das estirpes desejadas de uma forma rápida (Kish et al., 1983) . 2 A selecção das melhores estirpes tem sido baseada em caracteres fisiológicos e bioquímicos, dando especial atenção às características enológicas das leveduras. A cinética microbiana é convenientemente analisada, assim como a produção de compostos com influência nas características organolépticas do vinho. 0 recurso a microvinificações para posterior análise do vinho obtido, do ponto de vista físico-químico e organoléptico é fundamental. A análise sensorial é um teste de importância fundamental para avaliar as diversas qualidades do vinho, uma vez que permite uma análise global das suas características, as quais ditam no conjunto um determinado "bouquet" do vinho. A posterior comercialização das estirpes de melhor desempenho enológico tem como base de suporte os bons resultados apresentados pelas estirpes já seleccionadas, quando empregues em processos de vinificação (Oliveira-Martins, 1983; 1988) e pela possibilidade que lhes é inerente na optimização do emprego de novas tecnologias associadas ao desenrolar da vinificação. Uma melhoria das condições higiénicas do vinho através do emprego de estirpes de leveduras convenientemente seleccionadas é igualmente referida (Zimmerman, 1984). A função das leveduras na produção de vinho deve-se à sua capacidade de fermentar carbo-hidratos fazendo acumular etanol no meio e excretar compostos orgânicos geralmente designados por aromas e que são responsáveis por algumas das características organolépticas do vinho (Rose, 1980). A capacidade fermentativa e as características que imprimem ao produto final variam de estirpe para estirpe dentro da mesma espécie, devido a condicionalismos ambientais. Adiciona-se a este factor a utilização industrial de culturas conhecidas, simples ou mistas, 3 perfeitamente controladas como fermento de um processo destinado a obter um produto de qualidade controlada e caracteristicas típicas. 0 processo de obtenção de leveduras para vinificação e a transformação que oriqina o vinho são sectores complementares que se baseiam no controlo do metabolismo das leveduras (Rose, 1980). O primeiro requer condições completamente aeróbias, nas quais a reoxidação dos nucleótidos de piridina (NADH), durante o catabolismo dos açúcares, ocorre por transferência electrónica, via o sistema de citocromos, tendo o oxigénio como aceitador final de electrões. Nestas condições, grande parte do carbono é direccionado a vários níveis das vias metabólicas para a síntese de monómeros utilizados na formação de células. O segundo requer condições anaeróbias através das quais a reocupação de NADH está associada à redução de um composto orgânico, no caso da fermentação vínica o NADH é regenerado por redução do ácido pirúvico a etanol, o qual é acumulado e, nestas circunstâncias, a síntese celular é bastante condicionada. A tecnologia de fermentação para produção de biomassa de leveduras entra, portanto, em linha de conta com o fornecimento de oxigénio às culturas, de modo a obter um rendimento celular máximo. Contudo, a levedura Saccharomyces cereviseae possui taxas específicas de crescimento acima de 0,2 1Γ1 e constantes de afinidade para hexoxes de tal forma adequadas que o nível de biomassa, formada em fermentação descontínua, é alto, as capacidades do sistema de fornecimento de oxigénio dos vasos de fermentação são facilmente ultrapassadas e a cultura entra em condições de deficiência de oxigénio acumulando etanol (Atkinson e Mavituna (1983). A técnica de manutenção da cultura em zonas de crescimento aeróbio é conhecida há várias décadas e consiste 4 em adicionar à cultura descontinua, a fonte de nutriente limitante do crescimento a uma taxa inferior à que as leveduras podem utilizar esse nutriente. Esta técnica, designada fermentação semi-descontinua permite obter conversões elevadas (acima de 80%) sem acumulação de etanol e foi adoptada pela maior parte das companhias produtoras de levedura (Whitaker, 1980) .

Muitas companhias possuem capacidade de produzir levedura tanto para fonte de proteína como para fermento de panificação. As escalas de produção variam da demonstração ao nível comercial e os meios de cultura são constituídos por fontes, economicamente viáveis, de carbono e sais minerais (hidrocarbonetos, metanol, soro de leite, melaços, extractos amiláceos, etc.). As razões carbono/azoto situam-se entre 7:1 e 10:1 e em culturas descontínuas a concentração de carbo-hidratos situa-se geralmente entre 1 e 5% (Atkinson e Mavituna, 1983) . O mosto puro ou clarificado tem características que permitem uma boa proliferação celular (Mora e Mulet, 1991) podendo ser utilizado na produção de fermento para vinificação. A levedura Saccharomyces cerevisiae seca e activa já se encontra comercialmente disponível como fermento para panificação. O produto possui geralmente 67 a 73% de água e tem capacidade de reactivar completamente o metabolismo microbiano se as condições de cultura forem repostas (Josiac, 1982). Pode, no entanto ser armazenado, durante um período de tempo limitado, a temperaturas baixas. Tecnicamente, o produto é desidratado de forma suave separando as células do meio de cultura por intermédio de um filtro de rotação sob um ligeiro vácuo (Atkinson e Mavituna, 1983). O processo retira água extracelular até aos níveis indicados. A água intracelular pode ser retirada 5 por intermédio do aumento da pressão osmótica, adicionando açúcares ou sais nesta fase de separação. Segue-se a prensagem e imediatamente o empacotamento.

Contudo, as leveduras utilizadas tradicionalmente na produção de vinho branco não conseguem, até ao presente, proporcionar vinhos com uma uniformidade de características agradáveis do ponto de vista organoléptico, independentemente do tipo de uvas de partida.

Descrição da invenção

Os requerentes da presente invenção verificaram, após laboriosos estudos experimentais, que a utilização do consórcio microbiano específico de leveduras de acordo com a reivindicação 1, permite resolver este problema e obter vinhos de qualidade boa e uniforme.

Deste modo, a presente invenção revela um consórcio microbiano, o processo para o obter e a sua utilização na produção de vinho. 0 consórcio microbiano da presente invenção é caracterizado por ser constituído por 30 a 99% de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3388 (depositada na National Collection of Yeast

Cultures, Institute of Food Research, Norwick Research Park,

Colney Norwick, Norfolk, Reino Unido, em 26 de Maio de 2006, com o número NCYC 3388), 20 a 70% de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3389 (depositada na National Collection of Yeast

Cultures, Institute of Food Research, Norwick Research Park,

Colney Norwick, Norfolk, Reino Unido, em 26 de Maio de 2006, com 6 o número NCYC 3389) e 20 a 70% de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3390 (depositada na National Collection of Yeast Cultures, Institute of Food Research, Norwick Research Park, Colney Norwick, Norfolk, Reino Unido, em 26 de Maio de 2006, com o número NCYC 3390) . Nas figuras 1 e 2 estas leveduras apresentam-se com as referências 885, 888 e 890 respectivamente,

De acordo com a presente invenção, foram isoladas leveduras a partir de castas típicas e submetidas a um processo de selecção tendo em vista os melhores valores no que respeita ao rendimento alcoólico, velocidade de arranque de fermentação e qualidade do aroma, velocidade de fermentação, poder alcoogénico, tolerância ao etanol, resistência à temperatura e ao SO2, produção de SH2, formação de véu, turvação e sedimento, assim como análise sensorial realizada por painel especializado. O processo de selecção de acordo com a presente invenção elegeu uma associação microbiana constituída por 30 a 99% de levedura

Saccharomyces cerevisiae NCYC 3388, 20 a 70% de levedura

Saccharomyces cerevisiae NCYC 3389 e 20 a 70% de levedura

Saccharomyces cerevisiae NCYC 3390, devidamente diferenciadas e caracterizadas por tipagem molecular com o iniciador AB1-12 (5 '-CCTTGACGCA-3') .

As estirpes de acordo com a reivindicação da presente invenção foram caracterizadas utilizando um método de biologia molecular ADN Polimórfico Amplificado ao Acaso ou RAPD. A baixa semelhança genética observada entre as estirpes permitiu considerar que as mesmas representam estirpes distintas entre si, embora pertencentes ao mesmo género Saccharomyces. As três estirpes foram ainda submetidas a tipagem molecular por uma segunda técnica molecular independente baseada em microssatélites, tendo sido igualmente obtida uma diferenciação 7 entre as estirpes que permite afirmar a natureza distinta e única das mesmas em relação a quaisquer outras estirpes conhecidas.

As três estirpes de leveduras foram cultivadas em meio de mosto num fermentador através da aplicação de um regime semi-descontinuo. 0 reactor foi inoculado com a associação microbiana previamente crescida, a partir de um tubo em rampa, em Erlenmeyer de 1 litro. Após crescimento em descontinuo iniciou-se a alimentação do reactor com uma solução de mosto diluído impondo uma taxa de crescimento entre 0,01 th1 e 0,30 h-1, de um modo preferido entre 0,08 h_1 e 0,20 h-1; durante um período entre 12 e 30 horas, de um modo preferido entre 16 e 22 horas.

Após o fim do processo fermentativo, o caldo de cultura foi filtrado e a pasta de levedura obtida, foi extrudida utilizando métodos conhecidos de pessoas competentes na matéria, podendo-se apresentar a pasta extrudida sob qualquer forma adequada à utilização posterior das leveduras. Numa forma de realização da presente invenção, a pasta extrudida foi seca num secador a uma temperatura de secagem entre 25 °C e 38 °C, de um modo preferido entre 30 °C e 36 °C, de um modo mais preferido 34 °C. O tempo de secagem foi de 10 a 60 minutos, de um modo preferido de 10 a 20 minutos, de forma a atingir cerca de 90% de matéria seca e dar origem à forma de levedura seca activa (LSA). A qualidade da LSA foi expressa, tendo em consideração os seguintes parâmetros tecnológicos: matéria seca, número de células viáveis, número de células totais, percentagem de viabilidade celular e poder fermentativo. 0 inoculo de leveduras foi utilizado em microvinificações em mosto de uvas brancas da região do Alentejo e o vinho produzido comparado em relação a um controlo, tendo por base a análise cromatográfica das concentrações em glicerol, etanol, ácidos orgânicos, ésteres, álcoois superiores e ácidos gordos, tendo o vinho obtido por inoculação apresentado um perfil químico vantajoso, em termos enológicos.

Os vinhos foram ainda sujeitos a análises sensoriais efectuadas por um painel de provadores, que avaliou seis parâmetros: cor, aspecto, gosto, aroma, gosto de boca e uma avaliação global. 0 tratamento estatístico dos resultados, revelou que o vinho obtido por inoculação foi nitidamente o preferido pelos provadores.

As microvinificações provaram ainda que o consórcio microbiano de acordo com a presente invenção assegura um arranque mais rápido da microvinificação por comparação com uma fermentação não inoculada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Para melhor compreensão da invenção, a descrição é acompanhada de um conjunto de figuras ilustrativas, nas quais: A Figura 1 mostra perfis de amplificação obtidos com o iniciador AB1-12 (5'-CCTTGACGCA-3') para seis estirpes de leveduras nas quais se incluem três estirpes constituintes do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção, (Faixa 1 -M-100 pb (Fermentas); Faixa 2 - Cl, controlo negativo sem ADN;

Faixa 3 - C2, controlo positivo sem Taq polimerase; Leveduras do 9 consórcio microbiano de leveduras da presente invenção: Faixa 4 - S. cerevisiae NCYC 3388; Faixa 7 - S. cerevisiae NCYC 3389 e Faixa 9 - S. cerevisiae NCYC 3390; Outras leveduras: Faixa 5 -S. capensis CCMI 886; Faixa 6- S. montuliensis CCMI 887 e Faixa 8 - S. bayanus CCMI 889) . A Figura 2 mostra um dendograma das três leveduras constituintes do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção: S. cerevisiae NCYC 3388; S. cerevisiae NCYC 3389; S. cerevisiae NCYC 3390. A Figura 3 é um perfil cinético optimizado de produção do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção em reactor de 6 litros. A Figura 4 apresenta esquematicamente um processo de produção do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção na forma de LSA. A Figura 5 refere-se a uma análise dos Componentes

Principais. A Figura 6 mostra a cinética de duas microvinificações realizadas na presença e na ausência do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção.

EXEMPLOS as diversas formas de contudo, limitar a sua sem

Os exemplos seguintes ilustram realização da presente invenção, aplicação. 10

Exemplo 1

Neste exemplo descreve-se o procedimento conducente ao isolamento das leveduras utilizadas como inóculos microbianos na produção de vinhos brancos. Uvas brancas de castas típicas do Alentejo (nomeadamente Roupeiro, Galego, Olho de lebre e outras) foram colhidas para frascos de microvinificação esterilizados onde se procedeu ao esmagamento manual em condições assépticas. 0 mosto resultante foi fermentado naturalmente durante um período de três ou quatro semanas, de um modo preferido 21 dias, à temperatura controlada de 15 a 25 °C, de um modo preferido entre 18 a 20 °C. Pequenos volumes de mosto em fases diferentes de fermentação (maior incidência no meio e final da fermentação) foram retirados através de uma pipeta esterilizada do interior da cultura e diluidos em soro fisiológico esterilizado, seguindo o método das diluições sucessivas. A suspensão diluída foi cultivada por espalhamento em placa de Petri contendo meio de gelose de mosto (mosto de uva, 1 L, agar-agar, 20 g, peptona, 10 g, pH neutro) obtendo-se um elevado número de colónias isoladas. Das placas com colónias diferenciadas procedeu-se a repicagens sucessivas para novas placas contendo o mesmo meio de cultura até à purificação de cada estirpe. Isolaram-se cerca de 500 estirpes de leveduras de acordo com o procedimento descrito. Destas estirpes, oitenta formaram véus no final da fermentação alcoólica após inoculação de 2% de uma cultura fresca em 80 mL de mosto esterilizado em frascos de 120 mL, incubação a 22 °C. A selecção de estirpes decorreu em duas fases: inicialmente escolheram-se estirpes de acordo com o rendimento alcoólico, velocidade de arranque de fermentação e qualidade do aroma. Numa segunda fase, ensaiou-se a velocidade de fermentação, poder 11 alcoogénico, tolerância ao etanol, resistência à temperatura e ao S02, produção de SH2, formação de véu, turvação e sedimento, análise sensorial. A conjugação destas duas fases analíticas conduziu à selecção de uma associação de três leveduras depositadas na National Collection of Yeast Cultures, Institute of Food Research, Norwick Research Park, Colney Norwick, Norfolk, Reino Unido, em 26 de Maio de 2006, de acordo com o Tratado de Budapeste, constituída pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae NCYC 3388, Saccharomyces cerevisiae NCYC 3389 e Saccharomyces cerevisiae NCYC 3390.

Exemplo 2

Este exemplo descreve a tipagem molecular realizada para as três estirpes de leveduras. Foi utilizado um método de biologia molecular baseado na "Polymerase Chain Reaction" (PCR), denominado ADN Polimórfico Amplificado ao Acaso ou RAPD. Esta técnica consiste na utilização de pequenos iniciadores de 10 a 15 meros (oligonucleótidos) de sequência arbitrária que, para baixas temperaturas, hibridam com uma região distribuída aleatoriamente no genoma da levedura, permitindo a amplificação de fragmentos de ADN polimórfico. Esta técnica permite a diferenciação ao nível de estirpe uma vez que se existirem diferenças no genoma, essas diferenças serão traduzidas em perfis de amplificação diferentes.

Os resultados obtidos com o iniciador AB1-12 (5'-CCTTGACGCA-3') estão apresentados na Figura 1. Constata-se que as três estirpes de leveduras (NCYC 3388, NCYC 3389 e NCYC 3390) apresentam perfis distintos. As restantes estirpes que se podem 12 observar na Figura 1 foram utilizadas para testar se esta técnica permitia a diferenciação das três estirpes de levedura presentes relativamente a outras estirpes pertencentes ao mesmo género Saccharomyces, o que veio a acontecer.

Os resultados da tipagem molecular permitiram a construção de um dendrograma (Figura 2) indicador da semelhança genética entre as estirpes do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção. A estirpe S. cerevisiae NCYC 3388 apresenta uma semelhança genética de 50% com S. cerevisiae NCYC 3389 e S. cerevisiae NCYC 3390. Estas duas últimas têm por sua vez, um valor de semelhança genética de aproximadamente 75%. A baixa semelhança genética observada entre as estirpes do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção permite considerar que as mesmas representam estirpes distintas entre si.

Exemplo 3

Este exemplo explicita um modo possivel de produção industrial do consórcio microbiano de leveduras da invenção através do cultivo celular, em meio de mosto, num fermentador, através da aplicação de um regime semi-continuo. A produção de biomassa de levedura da presente invenção foi efectuada num reactor comercial de 6 litros de volume total, por fermentação em regime semi-continuo. O reactor foi inoculado com 10% (v/v) do consórcio microbiano de leveduras da invenção, previamente crescida, a partir de um tubo em rampa, em balão de Erlenmeyer de 1 litro com anteparas a 30 °C com agitação, durante 16 horas. O meio de cultura foi mosto vinico diluído a uma concentração inicial de 20 g/L de açúcares totais. 13

Suplementou-se o meio de mosto com di-hidrogenofosfato de amónio, hidrogenofosfato de potássio, sais minerais e vitaminas. 0 processo de produção de biomassa iniciou-se com uma fermentação em regime descontinuo à temperatura de 30 °C e pH mantido a 4,5. A agitação aplicada foi de 500 rpm e o arejamento de 4 L/min. O cultivo deve ser mantido durante 10-14 horas, tendo sido de 12 horas. No final deste cultivo descontínuo, a concentração de biomassa seca era de 7,0 g/L. Imediatamente após o fim do regime descontínuo, iniciou-se a alimentação do reactor com uma solução de mosto diluído contendo 100 g/L de açúcares totais. A taxa específica de crescimento imposta neste regime pode tomar valores entre 0,08 e 0,20 1Γ1; sendo a mais conveniente o valor de 0,10 h-1; que permitiu manter uma concentração residual de açúcar dentro do reactor próxima de zero. A única variável ambiental que variou em relação ao regime anterior, foi a agitação, inicialmente a 500 rpm, e que foi variando automaticamente para que a concentração de oxigénio dissolvido não tomasse valores abaixo de 40%. A alimentação ao fermentador deve ser mantida durante 16 a 24 horas, tendo sido de 18 h. O caudal de alimentação foi reduzido para 21,6 mg de açúcares totais por hora, nas duas últimas horas da fermentação. No final do regime semi-contínuo, a concentração celular era de 20,3 g/L (peso seco) . Na Figura 3 observa-se o perfil cinético da produção de biomassa de levedura ao longo das duas fases da fermentação.

Exemplo 4

Este exemplo ilustra Levedura Seca Activa (LSA) um modo possível de produção de a partir da biomassa do consórcio 14 microbiano de leveduras da presente invenção, obtida conforme descrito no Exemplo 3. 0 processo comportou as seguintes operações unitárias: filtração, extrusão e secagem (Figura 4) . 0 caldo de cultura celular após o fim do processo fermentativo é filtrado através de um equipamento de filtração comercial, que também pode ser um filtro de Buchner, composto por um leito de fécula de batata colocado entre dois filtros de papel. A filtração é idealmente realizada debaixo de vácuo para se conseguir uma maior rapidez de filtração. Obteve-se, com esta operação unitária, uma pasta de levedura com cerca de 50-80% de humidade, sendo 70% de humidade o valor mais usual. A pasta de levedura, também designada levedura prensada, foi seguidamente extrudida num extrusor manual ou automático do tipo alimentar. A levedura extrudida apresentou-se na forma de esparguetes com aproximadamente 1 mm de espessura, mas qualquer outra forma é igualmente adequada desde que a espessura não ultrapasse os 5 mm. A pasta extrudida foi então colocada num secador de leito fluidizado com controlador de temperatura incorporado. Qualquer outro equipamento de secagem que possua controlo de temperatura e possibilidade de introdução de um fluxo de ar é igualmente adequado nesta parte da técnica. A potência de injecção do ar foi controlada para que a temperatura de secagem seja entre 25 e 38° C, sendo idealmente realizada a 34 °C. O tempo de secagem é de 10 a 60 minutos, tendo sido de 15 min o tempo necessário à obtenção de uma LSA com cerca de 90% de matéria seca. 15

Exemplo 5

Este exemplo descreve a determinação dos parâmetros tecnológicos para a avaliação da qualidade da LSA produzida de acordo com o Exemplo 4.

Para avaliar a qualidade da LSA produzida, determinaram-se os seguintes parâmetros tecnológicos: teor de matéria seca (através do cálculo da percentagem de humidade) , número de células viáveis, número de células totais, a percentagem de viabilidade celular e o poder fermentativo, de acordo com a legislação nacional em vigor a que se encontra sujeita a produção comercial de LSA. A percentagem de humidade foi determinada por pesagem da água evaporada em 2,5 g de LSA após 4 h de secagem em estufa a 100 °C. O número de células viáveis foi determinado por contagem do número de unidades formadoras de colónias (U.F.C.) presentes em placas de extracto de levedura-malte-agar, após inoculação à superfície e incubação durante 48 horas a 30 °C. As soluções inoculadas foram obtidas por diluições decimais duma solução-mãe de concentração 10-2 g produto/mL. Para obter as soluções-mãe re-hidrataram-se 200 mg de LSA em 20 mL duma solução estéril de KC1 0,2 M, mantida a 40 °C num banho termostatizado, com agitação, durante 20 min. O número total de células (mortas e viáveis) foi calculado por contagem microscópica em hemocitómetro (câmara de Neubauer melhorada). As contagens foram feitas em soluções 10~4 g/mL obtidas por diluição das soluções-mãe acima referidas. Para avaliar a capacidade fermentativa da LSA, utilizou-se o método Lallemand (Cuinier, 1985) que define o poder fermentativo como o tempo gasto por 5 g de LSA para fermentar 5 g de glucose a 3 7 °C. As 5 g de LSA foram re-hidratadas em 50 mL de água estéril a 37 °C, com agitação, durante 10 min. Em seguida 16 adicionou-se 100 mL duma solução contendo 5 g de glucose gue foi mantida em banho-maria a 37 °C. De 30 em 30 min agitou-se a solução e doseou-se a glucose presente no meio através dum método rápido semi-guantitativo.

Na Tabela 1 apresentam-se os valores dos parâmetros tecnológicos obtidos para a LSA produzida a partir do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção.

Tabela 1: Parâmetros tecnológicos da LSA obtida conforme descrito no Exemplo 4.

Parâmetro Tecnológico LSA Legislação a cumprir para LSA (1) Células 1,88x1o11 >(20-30) X1010 Viáveis Células Totais 8,2 9x1011 =10n Poder lh 30 ' <2 h Fermentativo ^ Fonte: Villetaz, 1992.

Exemplo 6

Este exemplo demonstra as vantagens comparativas do uso do inoculo de leveduras do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção no processo industrial de produção de vinho branco com características organolépticas semelhantes às de vinho regional alentejano. 17

Foram realizadas microvinificações em mosto de uvas brancas da região do Alentejo, obtido após desengace, esmagamento e prensagem das uvas. 0 mosto foi colocado em garrafões e deixado em repouso de um dia para o outro, para efectuar a defecação. A parte límpida do líquido foi recolhida por um tubo, permanecendo no sedimento as substâncias indesejáveis. 0 mosto limpo foi tratado com bentonite a 0,2 g/L, para que durante a fermentação ocorra a precipitação das moléculas proteicas responsáveis por turvações. O mosto foi, então, dividido em quatro partes iguais de aproximadamente 1500 mL e colocado em garrafões fechados com rolhas ou tampas de borracha, que sustentam os sifões de fermentação, com água destilada, para evitar qualquer oxidação. Cada dois garrafões foram inoculados com as seguintes inóculos de leveduras: consórcio microbiano de leveduras da invenção (Saccharomyces cerevisiae NCYC 3388, Saccharomyces cerevisiae NCYC 3389 e Saccharomyces cerevisiae NCYC 3390) produzido tal como descrito no Exemplo 4 e uma levedura Comercial para aplicação em enologia, Saccharomyces cerevisiae sob a forma de levedura seca activa, adiante designada por LSAcom. As inoculações foram efectuadas de forma a obter-se a mesma concentração inicial de leveduras (107 lev/mL de mosto) em todos os ensaios. As fermentações duraram 12 dias a uma temperatura controlada de 16 °C ± 1 °C. As fermentações terminaram quando o teor residual dos açúcares dos vinhos atingiu 1 a 3 g/L. Depois da fermentação e da sedimentação das leveduras, colheram-se as amostras para análise cromatográfica. Após a extracção das leveduras por trasfega, os vinhos receberam um novo tratamento com S02 (40-50 mg/L). Foram, em seguida, filtrados e engarrafados. A Tabela 2 apresenta os valores das concentrações em glicerol, e ácidos orgânicos de todos os vinhos produzidos. 18

Tabela 2. Teores dos principais ácidos orgânicos e de glicerol nos vinhos produzidos (em g/dm3)

Leveduras inoculadas Ácido Cítrico Ácido Tartárico Ácido Málico Ácido Succínico Ácido Acético Ácido Láctico Glicerol Mistura Inv. 0,982 2,019 2, 813 3, 177 0,339 0,189 6,850 LSAcom 0,969 1,386 2,945 2,319 0,985 0,161 6,550

Pela análise do guadro anterior é visível gue o balanço dos diversos ácidos orgânicos é mais favorável no vinho produzido com o consórcio microbiano de leveduras da presente invenção. A produção de ácido acético é mais reduzida no vinho produzido por esta associação, traduzindo-se num menor nível de acidez volátil, por outro lado os restantes ácidos orgânicos, apresentam uma maior concentração. Ambos os factos são qualitativamente importantes.

Nas regiões de clima mais quente, as concentrações de ácidos nos mostos são normalmente inferiores. A redução da degradação de alguns destes ácidos durante o metabolismo fermentativo das leveduras, permitirá uma redução das correcções tartáricas a efectuar.

Outro aspecto que ressalta, resulta da maior produção de glicerol pelo consórcio microbiano de leveduras da presente invenção. Este composto contribui de forma positiva para uma melhor estrutura e permite uma melhor maturação e longevidade dos vinhos. 19 A concentração dos compostos voláteis num vinho é determinada pelo mosto, que fornece os compostos precursores e pelas leveduras que contribuem para a produção dos compostos voláteis finais (Lema et al., 1996). Por esse motivo, determinou-se a composição em ésteres, álcoois superiores e ácidos gordos dos vinhos utilizando cromatografia gasosa clássica (Tabela 3).

Tabela 3. Teor em álcoois superiores nos vinhos obtidos nas microvinificações descritas neste exemplo (mg/L).

Leveduras Invenção LSAcom Succinato de dietilo 21 28 Acetato de 2-etilfenilo 703 714 Decanoato de etilo 109 72 Octanoato de etilo 419 553 Hexanoato de etilo 759 654 Acetato de isoamilo 7 951 7 408 Acetato de etilo 56, 9 66,4 Lactato de etilo 742,5 873,5 Soma dos Ésteres 10 065,7 10 368,9 Hexanol 391 367 1-Propanol 35 48,2 2-Metil-l-propanol 22, 7 22,3 1-Butanol 1,05 1, 15 2-Metil-l-butanol 22, 8 24, 9 3-Metil-l-butanol 139, 4 127, 3 2-Feniletanol 13, 8 12, 8 20

Soma i dos álcoois superiores 625,8 603,7 Ácido Isobutirico 498 370 Ácido Butírico 485 544 Ácido Hexanóico 5 245 5 794 Ácido Octanóico 7 797 6 908 Ácido Decanóico 1 130 555 Ácido Dodecanóico 51 30 Soma < dos ácidos gordos 15 206 14 201 0 consórcio microbiano de leveduras da presente invenção, comparado nas mesmas condições tecnológicas, com uma levedura comercial Saccharomyces cerevisiae, produz no vinho uma maior concentração dos compostos responsáveis por aromas frutados e florais (decanoato de etilo e hexanoato de etilo), bem como uma maior concentração de acetato de isoamilo, responsável pelo aroma a banana nos vinhos, favorecendo desta forma as caracteristicas de fruta e juventude, bem como a complexidade aromática. Não havendo grandes diferenças nos niveis de álcoois superiores é de salientar, no vinho produzido com o consórcio microbiano de leveduras da invenção, a maior quantidade de ácidos gordos, o que é positivo tendo em conta que estes compostos, são os precursores dos ésteres etilicos homólogos, responsáveis pelos aromas frutados e florais.

Para além dos aspectos referidos o consórcio microbiano de leveduras da presente invenção apresenta em relação à levedura comercial, para o mesmo mosto, um poder alcoogénico superior como se observa na Tabela 4. 21

Tabela 4. Teor em açúcares redutores e teor alcoólico dos vinhos

Levedura Açúcares redutores g/dmJ Teor alcoólico % Vol. Mistura Inv. 00 1-1 13,2 LSAcom 2,50 12,6

Exemplo 7

Os vinhos obtidos conforme o Exemplo 6 foram sujeitos a uma análise sensorial, baseada num teste de preferência. Utilizou-se, para isso, um teste triangular cujo objectivo é determinar a existência de diferenças sensoriais entre dois produtos semelhantes, indicando de forma complementar a sua preferência. 0 teste foi levado a cabo por provadores com experiência de análise sensorial e, para além de permitir uma clara distinção entre os dois vinhos, indicou como produto preferido o vinho produzido pelo consórcio microbiano de leveduras da presente invenção (Figura 5).

Exemplo 8

Este exemplo ilustra a importância da inoculação do consórcio microbiano de leveduras da presente invenção para assegurar um arranque rápido das fermentações de vinhos brancos.

Foram realizadas microvinificações na adega experimental da

Universidade de Évora em mosto de uvas brancas da região do 22

Alentejo de acordo com o descrito no Exemplo 6. Na Figura 6 apresentam-se as curvas de fermentação das microvinificações realizadas através da medição da densidade dos mostos. Verifica-se que o consórcio microbiano de leveduras da presente invenção produzido na forma de LSA de acordo com o Exemplo 4, assegura um arranque mais rápido da microvinificação por comparação com uma fermentação espontânea (não inoculada).

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Lisboa, 17 de Novembro de 2008

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Consórcio microbiano de leveduras, caracterizado por ser constituido por 30 a 99% de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3388, 20 a 70% de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3389 e 20 a 70% de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3390.
2. 2. Consórcio microbiano de leveduras, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser constituido por 1/3 de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3388, 1/3 de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3389 e 1/3 de levedura Saccharomyces cerevisiae NCYC 3390.
3. 3. Consórcio microbiano de leveduras, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se encontrar na forma de levedura seca activa.
4. 4. Processo para a preparação do consórcio microbiano de leveduras como descrito na reivindicação 1, caracterizado por compreender os seguintes passos: a) colheita de uvas brancas de castas tipicas da região demarcada do Alentejo; b) esmagamento manual das uvas em condições assépticas em frascos de microvinificação esterilizados;; c) fermentação natural do mosto resultante durante um periodo de três a quatro semanas, a uma temperatura controlada de 15 a 25°C; d) retirada de pequenos volumes de mosto, no meio e no final da fermentação, através de uma pipeta esterilizada 1 do interior da cultura e sua diluição em soro fisiológico esterilizado seguindo o método das diluições sucessivas; e) cultura da suspensão diluida por espalhamento em placa de Petri contendo meio de gelose de mosto (mosto de uva, 1 L, agar-agar, 20 g, peptona, 10 g, pH neutro); f) repicagens sucessivas das placas com colónias diferenciadas para novas placas contendo o mesmo meio de cultura; g) selecção das estirpes de acordo com o rendimento alcoólico, velocidade de arranque de fermentação e qualidade do aroma, seguida de ensaio da velocidade de fermentação, poder alcoogénico, tolerância ao etanol, resistência à temperatura e ao SO2, produção de SH2, formação de véu, turvação e sedimento, análise sensorial; h) conclusão do processo fermentativo para as estirpes seleccionadas em g) , filtração do caldo de cultura, extrusão da pasta de levedura e secagem a uma temperatura de secagem entre 25 °C e 38 °C, de um modo preferido entre 30°C e 36°C, de um modo mais preferido 34°C, durante de 10 a 60 minutos, de um modo preferido 10 a 20 minutos, de modo a atingir cerca de 90% de levedura seca activa.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por as uvas brancas de castas típicas da região demarcada do Alentejo serem uvas das castas Roupeiro, Galego e Olho de Lebre. 2
6. 6. Utilização do consórcio microbiano das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por se aplicar à produção de vinho branco com propriedades organolépticas semelhantes às dos vinhos brancos da região do Alentejo.
7. 7. Utilização do consórcio microbiano de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o referido vinho branco ter um teor de ácido acético entre 0,300 e 0,500 g/dm3, um teor de glicerol de 5, 500 g/dm3 a 9, 500 g/dm3, um teor de ésteres de 8 500 mg/dm3 a 12 000 mg/dm3, bem como um teor de ácidos gordos e precursores dos ésteres de 12 000 mg/dm3 a 17 000 mg/dm3. Lisboa, 04 de Maio de 2009 3