PT103480A - Utilização de salicilato como antídoto nas intoxicações dos mamíferos pelo paraquato - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE À UTILIZAÇÃO DO SALICILATO COMO FORMA DE TRATAMENTO DAS INTOXICAÇÕES DOS MAMÍFEROS PELO HERBICIDA PARAQUATO (PQ). CONSEGUIU-SE, PELA PRIMEIRA VEZ, UMA SOBREVIVÊNCIA DE 100%, 30 DIAS APÓS A ADMINISTRAÇÃO A RATOS WISTAR, POR VIA INTRAPERITONEAL, DE UMA DOSE DE PQ QUE, NA AUSÊNCIA DE TRATAMENTO, SE REVELA 100% FATAL AO FINAL DE 6 DIAS. A ADMINISTRAÇÃO DE SALICILATO, 2 HORAS APÓS O PQ, PERMITIU, ASSIM, REVERTER A TOXICIDADE DO PQ PROLONGANDO A VIDA DOS ANIMAIS PARA OS NÍVEIS DO GRUPO CONTROLO.

Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE SALICILATO COMO ANTÍDOTO NAS INTOXICAÇÕES DOS MAMÍFEROS PELO PARAQUATO"

Domínio técnico da invenção A presente invenção refere-se â utilização do salicilato como forma de tratamento das intoxicações dos mamíferos pelo herbicida paraquato (PQ) (Figura 1 e 2). Conseguiu-se, pela primeira vez, uma sobrevivência de 100%, 30 dias após a administração a ratos Wistar, por via intraperitoneal, de uma dose de PQ que, na ausência de tratamento, se revela fatal ao final de 6 dias. A administração de salicilato, 2 horas após o PQ, permitiu, assim, reverter a toxicidade do PQ prolongando a vida dos animais para os niveis semelhantes aos do grupo controlo, constituindo esta invenção um importante passo na luta contra as intoxicações por PQ.

Antecedentes da invenção O paraquato (PQ) é um herbicida amplamente usado, conhecido por causar intoxicações fatais tanto em humanos como em animais. A letalidade é geralmente o resultado de toxicidade pulmonar severa e consequente falha respiratória. A extrema gravidade desta intoxicação, para a qual ainda não se conhecem antídotos, motivou os estudos que conduziram a esta invenção.

Desde a sua introdução na agricultura em 1962 [1], o paraquato I(PQ: ião 1,1'dimetil-4,4'-bipiridínio: viologénio de metilo) Figura 31, usado como dessecante e desfoliante em várias culturas, tem causado diversas mortes sobretudo por ingestão, acidental ou voluntária, mas também por exposição dérmica [2-5]. Apesar de ser um dos xenobióticos normalmente implicados em tentativas de suicidio, continua facilmente disponível nos países onde se encontra registado. Dependendo da dose ingerida, diferentes quadros clínicos e lesões têm sido observados, tanto em animais de experiência como em humanos. Acumula-se preferencialmente no pulmão por um sistema de transporte, para o qual as poliaminas são o seu substrato natural [1]. Em comparação com outros Órgãos, os pulmões, ou mais concretamente os pneumócitos tipo I e II e as células Clara bronquiolares estão dotados de um sistema activo de captação das poliaminas endógenas, transportando também o PQ para o interior das células [6-10], sendo esta a razão principal para o pulmão ser o órgão alvo da toxicidade do PQ [11·

De forma sucinta, a toxicidade celular do PQ é essencialmente devida ao seu ciclo redox (Figura 4): o PQ é reduzido enzimaticamente, sobretudo pela NADPH citocromo P450 reductase [11] , citocromo NADPH c reductase [12] e pelo complexo I mitocondrial (NADH:ubiquinona oxidoreductase) [13, 14], originando o radical livre PQ'+. O PQ*+ é depois rapidamente reoxidado na presença do oxigénio (que se encontra em elevadas concentrações no pulmão), resultando na contínua geração do radical superóxido (02'~) [15, 161. Esta produção cíclica de Cq conduz à conhecida cascata de formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS), nomeadamente de peróxido de hidrogénio e de radicais hidroxilo (H0‘), com os consequentes efeitos deletérios caracteristicos do stresse oxidativo. Na verdade, os radicais hidroxilo, como resultado do ataque aos lípidos polinsaturados, têm sido implicados na iniciação da lesão da membrana citoplasmática por peroxidação lipídica durante a exposição do PQ in vitro [17], mas também in vivo [16, 18]. Nestes estudos, descrevem-se também lesões como resultado da acção destes radicais ao nivel da despolimerização do ácido hialurónico, da inactivação das proteínas e da danificação do DNA.

Presentemente não existe nenhum antídoto eficaz para o tratamento das intoxicações dos mamíferos pelo PQ, dependendo a sobrevivência destes da quantidade ingerida e do tempo que decorre até o início das intervenções médicas para eliminar o PQ que ainda não foi absorvido e/ou captado pelas células. Estas medidas visam prevenir a acumulação do PQ nos tecidos, em especial no pulmão, e incluem procedimentos, tais como indução do vómito e/ou do trânsito intestinal, administração oral de adsorventes, hemodiálise e hemoperfusão [19-23].

Além destas medidas, outros tratamentos adicionais são também adoptados: (i) os destinados a prevenir a formação de ROS, como a quelação do ferro pela desferrioxamina (DFO) [24, 25]; (ii) os destinados a captar ROS, incluindo a manutenção dos níveis de antioxidantes, como da vitamina E [26], (iii) os destinados a reparar as lesões induzidas pelas ROS, particularmente a manutenção dos níveis eficazes de glutationa reduzida, pela administração de N-acetilcisteína (NAC) [27, 281, e (iv) os destinados a diminuir o processo inflamatório (normalmente administrados alguns dias após a intoxicação) através da administração de dexametasona (DX) [29, 30], metilprednisolona (MP) [31], ciclofosfamida (CP) [3I;j e NAC [27, 28].

No entanto estes tratamentos são em geral paliativos e a mortalidade cifra-se numa percentagem superior aos 70%, mesmo após múltiplas terapêuticas administradas concomitantemente. Em estudos anteriores o nosso grupo de investigação conseguiu aumentar a eliminação do PQ acumulado a nivel pulmonar através da indução da sintese de novo da glicoproteina P (Gp-P) . A administração de um indutor da Gp-P, 2 horas após intoxicação de ratos com PQ, permitiu reduzir, em apenas 24 horas, os niveis pulmonares de PQ para menos de 40% dos valores encontrados nos animais controlo. Em consequência, foi conseguida uma prevenção da toxicidade pulmonar, o que conduziu a uma percentagem de sobrevivência de 50% ao final de 10 dias em oposição aos 10% reportados em estudos anteriores, com o mesmo tempo de duração [32] e a outros estudos nos quais o periodo de avaliação foi apenas de 3 dias [33]. Tal invenção, constituiu, assim, um importante passo na luta contra as intoxicações pelo PQ e outros xenobióticos.

Descrição da invenção

Apesar da já por nós proposta via de tratamento, através da indução da sintese de novo da glicoproteina P (Gp-P), a persistente lacuna relacionada com a inexistência de um antídoto que garanta 100% de sobrevivência no tratamento das intoxicações pelo PQ motivou o estudo que aqui descrevemos. É objectivo da presente invenção fornecer uma solução eficaz de forma a reduzir a toxicidade do PQ no pulmão, aumentando a percentagem de sucesso dos tratamentos e consequentemente a sobrevivência dos intoxicados. A presente invenção refere-se a utilização do fármaco salicilato de sódio (Figura 5) - no tratamento das intoxicações dos mamíferos pelo PQ (Figura 3). O ácido acetilsalicílico é um dos fármacos mais amplamente utilizados, com uma média de consumo anual de cerca de 30 g por pessoa nos países industrializados [34] . Apenas nos Estados Unidos, 35000 kg deste fármaco são consumidos diariamente [35]. A maior parte do ácido acetilsalicílico é absorvido como tal, mas alguma extensão já entra na circulação sistémica como ácido salicílico após hidrólise pelas esterases da mucosa gastrointestinal e do fígado. Pode ser detectado no plasma apenas num curto período de tempo, devido à sua rápida hidrólise no plasma, no fígado e nos eritrócitos. De facto, 30 minutos após uma dose de 0,65 g, apenas 27% do total do salicilato plasmático encontra-se na sua forma acetilada. Uma vez que esta desacetilação é rápida, tem-se assumido que os efeitos anti-inflamatórios do ácido acetilsalicílico são largamente mediados pelo salicilato [36] . Esta assumpção tem suporte na evidência experimental que, in vivo, o salicilato e o referido ácido acetilsalicílico apresentam potências anti-inflamatórias similares [37] , mesmo nao apresentando os salicilatos a capacidade de acetilar o resíduo de serina no local activo da cicloxigenase, como acontece com os produtos comerciais cujo princípio activo é o ácido acetilsalicílico (ex. a Aâpirinâ.*) [38, 39] . Acresce o facto da semi-vida plasmática destes medicamentos ser de cerca de 15 minutos, enquanto que a do salicilato é de 2 a 30 horas, dependendo da dose administrada. No que se refere â distribuição, mais de 80% do salicilato circulante liga-se às proteínas plasmáticas, especialmente a albumina [40], apresentando também tendência para se acumular nos tecidos inflamados [41] . De salientar que o uso terapêutico do salicilato de sódio em doenças reumáticas ocorre há mais de 130 anos [42] . Vários são os mecanismos implicados na sua actividade anti-inf lamatória, tais como: (i) inibição das cicloxigenases [43, 44], (ii) activação da proteína quinase activadora do mitogénio (MAPK) p38 [45], (iii) inibição do Nuclear Factor (NF)-kB [46], (iv) inibição do receptor 6 activador da proliferação dos peroxissomas [47], e (v) actividade antioxidante através da captação do radical HO' [48] .

Com excepção da activação do MAPK p38 pelo salicilato [45], os efeitos observados são habitualmente inibitórios. 0 factor de transcrição NF-κΒ tem sido visto como um elemento chave na resposta das células a um estímulo inflamatório. A actividade do NF-κΒ é atribuída a proteínas da família Rel/NF-κΒ que formam homo e heterodímeros da combinação das subunidades p65 (ou RelA), p50, p52, c-Rel e RelB, os quais se ligam a locais alvo no DNA, controlando a transcrição genética. Na maioria das células o NF-κΒ (a designação para p50-RelA, o heterodímero mais comum) está retido no citoplasma como um complexo inactivo ligado a proteínas inibitórias [ΙκΒ; (ΙκΒα, -β, -ε, -γ, ρ105, plOO e Bcl-3; para revisão ver [49, 50]]. Os Lipopolissacarideos (LPS) bacterianos, a i&Yíjl, o Factor de Necrose Tumoral (TNF)oí, a luz W, as ROS e cadeias duplas de RNA virai são indutores clássicos do NF-κΒ. Estes factores induzem cascatas de sinalização que activam as quinases ΙκΒ (IKKs), as quais fosforilam as resíduos de serina 32 e 36 do ΙκΒα, levando o IkBoí a poliubiquitinação e consequente degradação desta proteína inibitória com subsequente activação do NF-kB [51]. Após activação, o NF-κΒ migra para o núcleo, onde se liga aos locais kB na região promotora dos genes alvo, regulando a sua transcrição. Genes alvos incluem: enzimas pró-inflamatórias, citoquinas, quimioquinas, inibidores de apoptose, moléculas de adesão celular, ΙκΒα e muitos outros. Deste modo, os efeitos anti-inflamatórios da aspirina e do salicilato têm sido relacionados com o seu potencial de inibição da via do NF-κΒ em vários estudos [52-55] .

Sendo as ROS indutoras clássicas do NF-κΒ e dada a capacidade do PQ gerar ciclo-redox pelos mecanismos acima descritos, a invenção aqui descrita visou provar que a indução do NF-κΒ pela exposição ao PQ, com consequente cascata de sinalização inflamatória, pode ser inibida no seu inicio. Usamos para este fim o salicilato de sódio que já mostrou inibir a fosforilação do ΙκΒ-α, resultando na sua estabilização [55]. Na verdade, este estudo revelou-se muito mais importante do que à partida era esperado, pois pela primeira vez, é descrito um fármaco que constitui um VERDADEIRO ANTÍDOTO, ;j â que com apenas uma dose foi possível reverter toda a toxicidade dos animais intoxicados com o PQ e garantir a sua sobrevivência a 100%.

Com a aplicação industrial da invenção dar-se-á um importante passo na luta contra as intoxicações por PQ. De salientar que a invenção aqui descrita resultou da administração do salicilato de sódio, 2 horas após a intoxicação dos animais com o PQ. Este intervalo confere um maior realismo na aplicação às intoxicações humanas, pois reflecte, em grande parte dos casos, o tempo que medeia entre a ingestão deste herbicida e o início do possível tratamento hospitalar do paciente. A novidade relativamente a esta invenção é que o uso do salicilato de sódio no tratamento das intoxicações dos mamíferos pelo PQ provou ser capaz de conferir, para doses fatais deste herbicida, uma sobrevivência de 100%.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1. Percentagem de ratos sobreviventes do grupo controlo, do grupo paraquato e do grupo paraquato + salicilato de sódio em função do tempo. * * * p<0.001 versus grupo paraquato.

Figura 2. Peso dos animais do grupo controlo, do grupo paraquato e do grupo paraquato + salicilato de * * * sódio em função do tempo. pcO.OOl versus grupo paraquato.

Figura 3. Estrutura do PQ e seus sais disponíveis no mercado.

Figura 4. Representação esquemática do mecanismo de toxicidade do PQ. A: Diaforases celulares, SOD: Superóxido dismutase ou espontaneamente, CAT: Catalase, Gpx: Glutationa peroxidase, Gred: Glutationa reductase, Paraquato, PQ'+:

Paraquato catião-radical, HMP: Via das Hexoses Monofosfato, FR: Reacção de Fenton, HWR: Reacção de Haber-Weiss.

Figura 5. Estrutura do salicilato de sódio.

Figura 6.1 Fotografias de microscopia Óptica (A) e electrónica (B) do pulmão de animais do grupo controlo, evidenciando (em A e B) uma estrutura preservada com espaços alveolares amplos e livres; Em B são visíveis pneumócitos do tipo I e II (ampliação original: A - 640x; B - 1.600x).

Figura 6.II Fotografias de microscopia óptica (A) e electrónica (B) do pulmão de animais do grupo salicilato 96 h (200 mg/Kg, i.p.), evidenciando uma estrutura preservada, com a presença de fagócitos dispersos; em B são visiveis dois pneumócitos tipo II e um macrófago (ampliação original: A - 1.050x; B - 4.000x).

Figura 6.111 Fotografias de microscopia Óptica (A) e electrónica (B) do tecido pulmonar de animais do grupo paraquato 24 h (25 mg/Kg, i.p.), evidenciando uma acentuada congestão vascular e um notório e generalizado colapso alveolar (em A) ; para além da tumefacção mitocondrial das células endoteliais, é possível observar-se (em B) um aglomerado intravascular de plaquetas, com evidentes sinais de activação, sugerindo a ocorrência de uma obstrução vascular (ampliação original: A - 640x; B - lO.OOOx).

Figura 6.IV Fotografias de microscopia Óptica (A) e electrónica (B) do tecido pulmonar de animais do grupo paraquato + salicilato 24 h, mostrando (em A) um ligeiro colapso dos alvéolos com espessamento das sua paredes, assim como a presença de alguns fagócitos na luz alveolar; em B, para além de regiões hipodensas na parede alveolar, sugestivas de edema, e de tumefacção mitocondrial atingindo principalmente os

pneumócitos do tipo I, são ainda notados dois macrófagos, imersos em material granular na luz alveolar (ampliação original: A - 900x; B 2.500x).

Figura 6.V Fotografias de microscopia Óptica (A) e electrónica (B) do tecido pulmonar de animais do grupo paraquato 48 h revelando (em A) zonas de necrose da parede alveolar com preenchimento do espaço alveolar com macrófagos, detritos celulares e infiltrado inflamatório, sendo ainda notórios capilares repletos de eritrócitos de contornos angulados, sugestivos de estase vascular; em B podem ser observados três vasos sanguíneos obstruídos por plaquetas com francos sinais de activação e regiões intersticiais de hipodensidade sugestivas de edema intersticial (ampliação original: A - 900x; B - 4.000x).

Figura 6.VI Fotografias de microscopia Óptica (A) e electrónica (B) do tecido pulmonar de animais do grupo paraquato + salicilato 48 h mostrando (em A) a presença de uma estrutura alveolar aparentemente preservada mas com detritos e fagócitos no espaço alveolar e com a presença de inclusões citoplasmáticas em alguns fagócitos; em B, para além do polimorfonuclear intravascular, são também visíveis detritos celulares no espaço alveolar assim como a presença de um macrófago e de fibroblastos e fibras de colagénio no espaço intersticial (ampliação original: A - 900x; B -3.150x).

Figura 6.VII Fotografias de microscopia Óptica (A) e electrónica (B) do pulmão de animais do grupo paraquato 96 h evidenciando a congestão vascular e o colapso alveolar assim como a presença de

detritos e fagócitos no espaço alveolar (em A) ; em B é de realçar os sinais de activação fibroblástica com a presença de grandes áreas de espaço intersticial preenchidas por fibras de colagénio (ampliação original: A - 640x; B 6.300x).

Figura 6.VIII Fotografias de microscopia Óptica (A) e electrónica (B) do pulmão de animais do grupo paraquato + salicilato 96 h evidenciando (em A) uma estrutura alveolar relativamente preservada, algumas áreas de necrose da parede alveolar com detritos no espaço alveolar, assim como a presença de fagócitos alveolares e intersticiais com inclusões citoplasmáticas; em B são observados dois leucócitos no espaço intravascular, um macrófago com inclusões citoplasmáticas semelhantes a figuras de mielina e a existência de fibrobastos e fibras de colagénio no interstício (ampliação original: A -900x; B - 2.500x).

Figura 7. Activação do NF-κΒ nos pulmões pelo paraquato.

Gel obtido por Fluorescence Electrophoretic Mobility Shift Assay (fEMSA). Os extractos nucleares dos pulmões diferentes grupos foram obtidos como descrito em Materiais e Métodos. Linha 1 - controlo; Linha 2 - paraquato 24 horas; Linha 3 - paraquato 48 horas; Linha 4 - paraquato 96 horas; Linha 5 - sonda especifica (SP); Linha 6 - experiência de competição com um excesso molar de 50x de um competidor não específico (UC) em relação a SP; Linha 7 - experiência de competição com um excesso molar de 50x de um competidor especifico (SC, SP não marcada) em relação a SP; Linha 8 - salicilato 24 h; Linha 9 - salicilato 48 h; Linha 10 - salicilato 96 h; Linha 11 - paraquato + salicilato 24 h; Linha 12 paraquato + salicilato 48 h; Linha 13 paraquato + salicilato 96 h. Os resultados referem-se a uma de 3 experiências realizadas em separado, sendo representativos dos resultados globais obtidos.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção refere-se ao processo de utilização do salicilato como forma de tratamento das intoxicações dos mamíferos pelo PQ (Figura 1 e 2). O salicilato é um anti-inflamatório não esteróide (ΑΙΝΕ). Durante mais de duas décadas, as propriedades anti-inflamatórias das especialidades farmacêuticas contendo este principio activo (como a Aspirina*) . foram exclusivamente atribuídas ao bloqueio da síntese das prostaglandinas e tromboxanos via inibição da actividade da cicloxigenase [39]. Hoje são atribuídos aos salicilatos vários mecanismos implicados na sua actividade anti-inflamatória, tais como: (i) inibição das cicloxigenases [43, 44], (ii) activação da proteína quinase activadora do mitogénio p38 [45], (iii) inibição do Factor Nuclear (NF)-kB [46], (iv) inibição do receptor 6 activador da proliferação dos peroxissomas [47], (v) actividade antioxidante através da captação do radical HO' [48] . A grande vantagem desta invenção é ter-se conseguido, pela primeira vez, impedir totalmente a toxicidade e a letalidade do PQ (25 mg/Kg, í.p.) através da administração de um potente anti-inflamatório - o salicilato de sódio (200 mg/Kg, i.p.) e deste modo aumentar a sobrevivência dos animais para 100%, ou seja, ao nivel dos ratos controlo.

Nenhum outro tratamento anterior conseguiu uma taxa de sobrevivência de 100%. Como foi referido, a toxicidade do PQ depende maioritariamente da sua acumulação no pulmão onde ai inicia a cascata do stresse oxidativo e do processo inflamatório que conduz i lesão celular. Em conformidade, é plausível considerar que esta protecção adquire particular importância no pulmão, quer seja por interferência no mecanismo de toxicidade do PQ (pelas razões acima descritas), quer seja por modificar a sua molécula e deste modo anular a sua captação pulmonar ou a sua capacidade de gerar um ciclo-redox. O salicilato de sódio (200 mg/kg de peso corporal, i.p.) foi administrado 2 horas após intoxicação com PQ. Este período de tempo entre a exposição ao PQ e a administração de salicilato de sódio foi estabelecido com base no tempo que normalmente medeia entre a ingestão deste herbicida e o início do possível tratamento hospitalar do paciente. A dose é a descrita em numerosos estudos que visam a inibição do NF-κΒ in vivo [56, 57] .

Em consequência, foi conseguida uma reversão da toxicidade pulmonar, constituindo, assim, esta invenção um importante passo na luta contra as intoxicações por PQ.

De seguida, é descrito um exemplo de uma forma de realização da invenção num mamífero, o rato.

Reagentes e farmacos utilizados

Foram utilizados paraquato (viologénio de metilo; dicloreto de 1,1'-Dimetil-4,4'-bipiridilo), salicilato de sódio (sal sódico do ácido 2-hidroxibenzoico), soro fisiológico [ (SF) NaCl 0,9%)] e tiopental sódico (1 g) . Todos os reagentes utilizados apresentavam grau analítico ou o grau de pureza mais elevado disponível.

Tratamento dos animais - Ensaios in vivo

As experiências foram realizadas em ratos macho Wistar (n=54) , com peso médio de 250 ± 10 g. Os animais foram distribuídos de forma aleatória, mantidos em número de dois por gaiola de polietileno com rede metálica no topo, acamados com carolo de milho, em ambiente controlado (ciclos de luz/escuro de 12 horas, temperatura ambiente de 22 ± 2 e humidade relativa de 50-60%) até, pelo menos, uma semana (quarentena) antes da experiência, por forma a aclimatizarem-se às condições do biotério. Ração própria para roedores e água da torneira foram fornecidas ad libitum durante o período de quarentena.

Após o período de quarentena, foram designados 2 animais por cada gaiola, onde nela permaneceram 24, 48 e 96 horas, tendo-lhes sido permitido o acesso â ração e a água ad libitum. Dez grupos aleatórios de 3 animais cada foram tratados como se apresenta de seguida: (I) Grupo 1/ n=3 (controlo, C): injectados intraperitonealmente (i.p.) com 0,5 mL de SF. Duas horas após, os animais receberam uma outra administração de 0,5 mL de SF. Os animais foram sacrificados 24 horas após a segunda administração de SF; (II) Grupo II, n=9 (SAL): injectados i.p. com 0,5 mL de SF. Duas horas após, os animais foram injectados i.p. com uma dose de 200 mg/kg de salicilato de sódio dissolvido em SF, volume final (VF) 0,5 mL. Os animais foram sacrificados 24 (n=3, grupo SAL 24 h), 48 (n=3, grupo SAL 48 h) e 96 horas (n=3, grupo SAL 96 h) após a administração do salicilato de sódio; (III) Grupo 111, n=9 (PQ) : injectados i.p. com uma dose de 25 mg/kg de PQ dissolvido em SF, VF 0,5 mL. Duas horas após, os animais receberam 0,5 mL de SF. Os animais foram sacrificados 24 (n=3, grupo PQ 24 h) , 48 (n=3, grupo PQ 48 h) e 96 horas (n=3, grupo PQ 96 h) após a administração do SF; (IV) Grupo IV, n=9 (PQ + SAL) : injectados i.p. com uma dose de 25 mg/kg de PQ dissolvido em SF (VF 0,5 mL) . Duas horas após, os animais receberam 200 mg/kg i.p. de salicilato de sódio em 0,5 mL de SF (VF 0, 5 mL) . Os animais foram sacrificados 24 (n=3, grupo PQ + SAL 24 h), 4 8 (n=3, grupo PQ + SAL 48 h) e 96 horas (n=3, grupo PQ + SAL 96 h) após a administração do salicilato de sódio.

Quatro outros grupos foram constituídos (n=6 cada), tendo sido estes sujeitos aos mesmos tratamentos mas com uma variante: estes animais foram destinados ao estabelecimento da curva de sobrevivência.

Os tratamentos em todos os grupos foram efectuados sempre entre as 8 e 10 horas da manhã.

Preparação de amostras para análise histológica.

Dois animais pertencentes a cada um dos grupos foram destinados para a análise histológica. As amostras foram sujeitas aos procedimentos considerados de rotina para posterior observação à microscopia electrónica de transmissão (MET). Com o animal sob anestesia, a fixação do pulmão foi iniciada in si tu através da perfusão com gluteraldeído, diluído a 2,5% em tampão de cacodilato de sódio (0,2 M; pH 7,2 - 7,4), durante 3 minutos. Após remoção e seccionamento dos pulmões em pequenas peças de formato cúbico, com cerca de 1 mm de aresta, a fixação, agora por difusão, prolongou-se por mais duas horas. Depois de duas lavagens, de 30 minutos cada, com solução tampão, as peças foram pós-fixadas em tetróxido de ósmio, diluído a 2% em tampão de cacodilato de sódio, durante 2 horas. Em seguida, as amostras sofreram desidratação progressiva, sob a acção de concentrações crescentes de álcool etílico, durante três horas, e impregnação com epon, durante quatro horas. O óxido de propileno foi o composto utilizado na transição desidratação - impregnação. O corte das amostras foi consequente à fase de inclusão que durou 2 dias. Todos os procedimentos foram realizados a uma temperatura de 4 2C, com excepção da fase de inclusão, que foi executada em estufa a uma temperatura de 60SC. Após polimerização da resina, foram realizados cortes ultra-finos (Ultracut), com uma espessura de 500 Â, As grelhas preparadas com os cortes ultra-finos foram contrastadas com uma solução aquosa saturada de acetato de uranilo, durante 30 minutos, e com uma solução de citrato de chumbo, durante 15 minutos, tendo-se procedido a lavagens no início e no final de cada um destes procedimentos. As preparações foram observadas num microscópio electrónico de transmissão da marca Zeiss EM a 60 Kvolts.

Foi efectuada a avaliação das alterações estruturais e ultra-estruturais, registadas nos grupos experimentais e consideradas desviantes relativamente ao grupo controlo (Figuras 6.1-6. VIII).

Preparação de amostras para obtenção dos extractos nucleares de pulmão.

Os pulmões foram homogeneizados (Homogeneizador Ultra-Turrax®) em tampão de lise celular (AC) na proporção 1 g de tecido/3 mL de AC com a seguinte composição: 10 mM Hepes (pH 7,9), 10 mM KC1, 1,5 mM HgClj, 0,2% Igepal, 0,5 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM dithiothreitol (DTT) e 0,25 mM fluoreto de fenilmetil sulfonilo (PMSF). Os homogeneizados foram incubados em gelo durante 15 minutos e de seguida centrifugados (850 g, 4°C durante 10 min) . Os sedimentos foram ressuspendidos (etapa de lavagem) em 500 pL de tampão AC, incubados de novo em gelo durante 15 minutos e depois centrifugados (14000 g, 4 *0 durante 30 segundos). Os sedimentos foram de novo ressuspendidos, mas agora em 500 pL de tampão BC (tampão de lise nuclear) contendo: 20 mM Hepes, pH 7,9, 420 mM NaCl, 1,5 mM 0,2% Igepal, 0,5 mM EDTA, 20% glicerol, 1 roM DTT, 0,25 mM PMSF, aprotinina (5 pg/mL), pepsatina (5 pg/mL), leupeptina (5 pg/mL). Os homogeneizados foram de seguida incubados em gelo durante 30 minutos e centrifugados (13000 g, 4°C durante 10 min). Os sobrenadantes foram armazenados a -80aC para posterior semi-quantificação por fEMSA. O teor proteico foi determinado de acordo com o método de Lowry et al. [58]. 01igonucleótidos

Os oligonucleótidos sintéticos foram adquiridos a Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden) e estão sumariados na Tabela 1.

Oligonucleót idos Sequência NF - kB - FW- Cy 5 5'-Cy5-GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T-3’ NF-kB-FW 5'-GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T-3' NF-kB-R 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3'

Tabela 1 - Oligonucleótidos utilizados neste estudo. O Cy5 (indodicarbocianina) é um corante fluorescente que se encontra ligado à extremidade 5' OH do oligonuleótido.

Determinação da activação da transcrição do NF-κΒ nos extractos nucleares por fEMSA

Os ensaios de ligação foram realizados de acordo com o método descrito por Ruscher et al. [59]. Os extractos nucleares (20 pg de proteína) foram incubados (uma hora a 4aC) na seguinte mistura: 0,5 pmol de sonda específica (SP), tampão de ligação ao DNA [ 1C mM HEPES (pH 7,9), 0,2 mM EDTA, 50 mM KC1] , 2,5 mM de DTT, 250 ng de poli(dl-dC) · poli(dl-dC), 1% of Igepal e 10% glicerol. 9 pL da mistura foram resolvidos por electroforese num gel de poliacrilamida desnaturante a 5% (10°C, 800 V, 50 mA, e 30 W) durante 3 horas em 1 x com tampão TBE (90 mM tris-borato, 2 mM EDTA, pH 8,3) usando um sequenciador de DNA -ALF-Express™ DNA-sequencer (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) . A temperatura foi regulada por um termostato externo - ALFexpress 11 Cooler system (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). A especificidade das ligações foi confirmada pela adição de um excesso molar de 50 x de um competidor específico e não específico não marcado (SC e UC, respectivamente). Os sinais foram analisados pelo programa ALFwin Fragment Analiser 1.03 (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden).

Análise Estatística A comparação estatística das curvas de sobrevivência foi realizada usando o teste estatístico de Logrank. Aceitou-se significância apenas para valores de p inferiores a 0,05.

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Lisboa

Claims (5)

1. Utilização do salicilato e seus derivados na formulação de medicamentos caracterizados por se destinarem ao tratamento das intoxicações dos mamíferos pelo paraquato.

2. Utilização do salicilato e seus derivados na formulação de medicamentos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar o salicilato de sódio.

3. utilização do salicilato e seus derivados na formulação de medicamentos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se usar o salicilato de sódio numa dose susceptivel de inibir a activação do NF-kB.

4. Utilização do salicilato e seus derivados na formulação de medicamentos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se utilizar o salicilato de sódio numa dose compreendida entre 100 e 200mg/Kg de peso corporal por dia.

5. Utilização do salicilato e seus derivados na formulação de medicamentos, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se utilizar o salicilato de sódio em doses múltiplas diárias compreendidas entre 20 e 100 mg/Kg de peso corporal. Lisboa,