PT1034000E - Obtenção de vacinas destinadas a prevenir os efeitos patogénicos associados a uma infecção retroviral vih - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
OBTENÇÃO DE VACINAS DESTINADAS A PREVINIR OS EFEITOS PATOGÉNICOS ASSOCIADOS A UMA INFECÇÃO RETROVIRAL VIH A presente invenção refere-se a um processo para a obtenção de vacinas destinadas à prevenção dos efeitos patogénicos associados, nos seres humanos ou nos animais vertebrados, a infecções retrovirais.
Os efeitos patogénicos associados a uma infecção retroviral são os efeitos nefastos, incluindo eventuais efeitos oncogénicos ou imunossupressores, induzidos pela introdução de um retrovirus no organismo de um hospedeiro (mamífero, ave ou ainda peixe), seguida da penetração e da replicação do referido retrovirus em células do hospedeiro que são células alvo do retrovirus, ou seja, células nas quais o vírus é capaz de penetrar.
Os retrovirus são assim denominados dado que têm a capacidade, graças ao enzima denominado transcriptase reversa, de efectuar uma transcrição de ARN em ADN, enquanto que nos seres vivos a informação genética vai habitualmente do ADN dos cromossomas até às proteinas, por intermédio do ARN mensageiro.
Na família dos retrovirus, distinguem-se três sub-famílias: os oncovírus, os lentivírus e os spumavírus.
Os oncovírus são retrovirus assim denominados dado que podem ser associados a cancros e a infecções malignas. Pode-se citar por exemplo os vírus leucemogénicos (tais como o vírus da leucemia aviária (ALV), o vírus da leucemia murina (MULV), 1 ainda denominado virus de Moloney, o virus da leucemia felina (FELV), os virus da leucemia humana, tais como HTLVl e HTLV2, o vírus da leucemia símia ou STLV, o virus da leucemia bovina ou BLV), os oncovírus de tipo D dos primatas, os oncovirus ed tipo B indutores de tumores mamários, ou oncovirus que provocam um cancro rápido (tais como o virus do sarcoma de Rous ou RSV); ver por exemplo STEHELIN et al., J. Mol. Biol. 101: 349-365 (1976) .
Os lentivirus são assim denominados dado que são responsáveis por patologias de evolução lenta que implicam muito frequentemente fenómenos imunossupressores, incluindo as SIDAS. A Tabela 1 anexa indica a título ilustrativo as patologias associadas a certos lentivirus, assim como as principais células-alvo destes lentivirus.
Os spumavírus manifestam uma especificidade reduzida para um dado tipo de célula ou uma dada espécie, e são por vezes associados a fenómenos imunossupressores; é o caso por exemplo do spumavírus do macaco (ou SFV).
Um dos objectivos da presente invenção é a elaboração de procedimentos e processos vacinais que visam prevenir eficazmente os efeitos patogénicos, incluindo os efeitos oncogénicos ou imunossupressores, associados à infecção de um organismo hospedeiro por um retrovírus. A imunossupressão associada à infecção foi constatada para um grande número de retrovirus, e pode ser considerada como uma constante patogénica da infecção retroviral; ver 2 especialmente BENDINELLI et al., Advances in Câncer Research 45: 125-181 (1985). É especialmente o caso das infecções com lentivírus. É igualmente o caso num número significativo de infecções com oncovírus; ver por exemplo P. SONIGO na obra "SIDA et infection par VIH", MONTAGNIER et al (Médecine Science Flammarion), páginas 113-122 (1989).
Foram testadas numerosas vacinas humanas e animais para prevenir os efeitos patogénicos das infecções por retrovirus mas, em regra geral, estas vacinas são pouco eficazes ou ineficazes. Em particular, no dominio da SIDA humana ou animal, constata-se que, 14 anos após a descoberta do virus VIH (BARRE-SINOUSSI et al., Science 220: 868-871, 1983), não se conseguiu ainda descobrir uma vacina que permita erradicar eficazmente uma infecção pós-vacinal VIH e VIS; ver por exemplo LINHART et al., AIDS Research and Human Retroviruses 13: 593-599 (1997); VOGT et al., Vaccine 13: 202-208 (1995); e LETVIN et al., J. Virol. 69: 4569-4571 (1995). A maioria das preparações vacinais utilizadas compreendendo proteínas do envelope retroviral sob diversas formas, por exemplo, vírus inactivados, proteínas de envelope como as proteínas gp 120 e gp 160 de VIH (ver especialmente GORSE, G.J., Vaccine 10: 383-388, 1992), núcleos de vírus com proteínas de envelope, ou proteínas de envelope associadas a diferentes vectores (vírus quimera, bactérias); ver Levy J.A., Trans. Med. Rev. 2: 265-271, 1988 e Microbiol. Rev. 57: 183-289, 1993, em particular página 247.
Outras preparações utilizando fragmentos do envelope retroviral ou péptidos imunodominantes provenientes das glicoproteínas de envelope, estando estes péptidos presentes 3 sob diferentes formas (lipopéptidos, péptidos ligados a uma proteína suporte), de modo a torná-los imunogénicos; ver especialmente Erikson et ai. Vaccine, 11: 859-865 (1993).
As estratégias vacinais classicamente descritas, por exemplo, no domínio da SIDA humana, símia ou felina, preconizam não modificar os epitopos conservados e imunodominantes das proteínas de envelope, o que pode parecer perfeitamente lógico. Com efeito, por um lado, estes epitopos conservados são comuns a diferentes estirpes virais, o que é favorável à elaboração de uma vacina que deve induzir uma resposta imunitária dirigida como uma maioria de estirpes. Por outro lado, estes epitopos imunodominantes são bem reconhecidos pelo sistema imunitário, celular ou humoral, aquando do processo vacinai e infeccioso e, por acréscimo, representam frequentemente locais de neutralização; ver por exemplo HO et al., J. Virol. 61: 2024-2028 (1987); JOHNSON et al., J. Exp. Med 175: 961-971 (1992); SHAFFERMAN et al., P.N.A.S. U.S.A. 88: 7126-7130 (1991); e Η ΑΜΜΟΝ D et al., J. Immunol. 146: 1470-1477 (1991). O processo da invenção consiste, pelo contrário, em modificar epitopos conservados e imunodominantes de certas proteínas do envelope virai, de modo a originar uma vacina eficaz.
Com efeito, os autores da presente invenção descobriram que zondas conservadas e imunodominantes do envelope retroviral podem estar na origem de fenómenos auto-imunes nocivos. A título de exemplo, no caso do vírus do SIDA humano, observaram que certas zonas conservadas e imunodominantes do envelope do VIH apresentam analogias de estrutura tridimensional e/ou reacções cruzadas com certas zonas de 4 pelo menos uma proteína do sistema imunitário humano, de modo que a administração como vacina de uma proteína virai contendo as referidas zonas intactas induz uma resposta imunitária que está na origem de reacções auto-imunes nefastas que conduzem ao fracasso vacinai.
Na origem da presente invenção encontra-se, por um lado, a observação mencionada anteriormente que zonas conservadas e imunodominantes de certos retrovírus, presentes habitualmente em preparações vacinais, são precisamente, num número significativo de casos, zonas que provocam reacções auto-imunes nefastas uma vez que apresentam analogias de estrutura tridimensional e/ou reacções cruzadas com certas proteínas do hospedeiro do vírus. À origem da presente invenção, encontra-se assim, por outro lado, a observação que as referidas proteínas do hospedeiro utilizam a mesma célula alvo, ou as mesmas células alvo, que os referidos retrovírus. 0 conjunto destas observações efectuadas pelos autores da invenção conduziu-os a pensar que as proteínas de envelopes retrovirais e as proteínas do hospedeiro que apresentam analogias de estrutura tridimensional e/ou reacções cruzadas fixam-se em numerosos casos nas mesmas células alvo e possuem, nestas células alvo, receptores membranares comuns.
Diz-se que uma proteína apresenta uma reacção cruzada com uma outra proteína quando é possível obter por imunização in vivo ou in vitro com auxílio de uma das referidas proteínas, uma resposta imunitária dirigida também contra a outra proteína, por exemplo quando esta imunização induz uma resposta humoral (dita do tipo B) e permite obter e seleccionar pelo menos um anticorpo monoclonal que é capaz de reconhecer a outra proteína, ou quando uma mesma resposta imunitária celular (ou 5 seja de tipo T) induzida n in vitro por uma das proteínas reconhece as duas proteínas, segundo os testes conhecidos para evidenciar uma resposta imunitária do tipo T, tais como por exemplo os testes de citotoxicidade in vitro. Sabe-se que o termo "imunização" designa o processo de indução de uma resposta imunitária consecutiva ao estímulo, por se colocar em contacto in vivo ou in vitro, de células imunocompetentes de um hospedeiro com um antigénio, e que um dos objectivos da administração de um agente vacinai é justamente de se obter uma tal imunização. A invenção tem então como objecto um processo de obtenção de uma vacina contra os efeitos patogénicos associados à infecção de um hospedeiro, animal ou humano, por um retrovírus VIH capaz de penetrar numa célula alvo do referido hospedeiro , possuindo a célula alvo um receptor membranar para a proteína do hospedeiro interleucina-2 (IL-2), processo no qual se prepara um agente vacinai à base de um polipéptido compreendendo pelo menos uma parte da proteína de envelope gp41 de uma estirpe patogénica do referido retrovírus, e no qual o referido polipéptido é preparado sob uma forma modificada, entendendo-se que: - a referida parte da proteína do envelope gp41 é escolhida entre aquelas que compreendem pelo menos um fragmento de uma zona imunodominante da referida proteína de envelope contendo o referido fragmento pelo menos um aminoácido que é um aminoácido conservado da referida zona imunodominante e que está presente na referida estirpe patogénica, - o referido polipéptido, no estado não modificado, induz uma resposta imunitária dirigida simultaneamente contra a referida zona imunodominante e contra a proteína do hospederio IL-2, 6 - o referido polipéptido modificado é escolhido entre aqueles que induzem uma resposta imunitária dirigida contra a referida zona imunodominante da proteina de envelope gp41 e não contra a proteina do hospederio IL-2.
Na definição do processo da invenção que acaba de ser dada, o agente vacinai é dito "à base" de um polipéptido modificado. Tal significa que o agente vacinai compreende um tal polipéptido modificado, mas tal não significa que o agente vacinai é necessariamente de natureza exclusivamente polipeptidica. Com efeito, neste agente vacinai, o referido polipéptido pode, eventualmente, estar ligado (especialmente de modo covalente) ou associado, de forma conhecida por si, a qualquer molécula biocompativel que pode ser escolhida, por exemplo, entre os polímeros, os lípidos, os péptidos (compreendendo lipopéptidos, glicopéptidos, proteínas), os ácidos nucleicos, os oligossacáridos, etc. A referida molécula biocompativel pode especialmente servir de suporte ao agente imunogénico polipeptidico. Pode também servir para modificar a conformação do polipéptido e, neste último caso, a referida molécula deve ser considerada como um substituinte que modifica o residuo de aminoácido ao qual está ligada, modificando o referido substituinte assim, em definitivo, a antegenicidade do polipéptido cujo residuo de aminoácido faz parte. 0 processo da invenção pode compreender, pelo menos numa fase preliminar de pesquisa, uma etapa que consiste em seleccionar (não modificados) compreendendo pelo menos uma parte, tal como definida acima, da proteína do envelope virai gp41 de uma estirpe patogénica do retrovírus VIH. Esta parte de proteína que compreende pelo menos um fragmento imunogénico 7 de uma zona imunodominante, é tal que o polipéptido (não modificado) é capaz de induzir uma resposta imunitária dirigida em simultâneo contra a proteína virai (mais precisamente contra o fragmento da zona imunodominante contida na referida parte) e contra a proteína do hospedeiro IL-2, e é a existência de uma tal resposta imunitária, dirigida contra a proteína do envelope virai gp41 e contra a proteína do hospederio IL-2, que define, no presente pedido, o carácter patogénico de uma estirpe virai. Pode-se assim seleccionar os polipéptidos (não modificados) compreendendo tal fragmento.
Um fragmento polipeptídico é dito imunogénico se a imunização de um hospedeiro, in vivo ou in vitro, com o referido fragmento, eventualmente ligado a um suporte apropriado (tal como uma proteína, um lípido ou um polipéptido), permite obter uma resposta imunitária, do tipo B e/ou do tipo T, dirigida contra o referido fragmento polipeptídico.
No presente pedido, quando se fala de uma resposta imunitária, sem outras, trata-se de uma resposta imunitária de um vertebrado, consecutiva a uma imunização in vitro ou in vivo. 0 processo da invenção pode também compreender pelo menos uma etapa que consiste em modificar, do modo que será indicado de seguida, um polipéptido assim seleccionado, e em escolher, entre os polipéptidos assim modificados, pelo menos um polipéptido modificado que induz uma resposta imunitária dirigida contra a proteína do envelope virai gp41 não contra a proteína do hospedeiro IL-2.
Assim, enquanto que técnica anterior ensinava, como notado acima, não modificar os epitopos conservados e imunodominantes das proteínas de envelopes retrovirais, o processo da invenção tem como objectivo, pelo contrário, modificar a antigenicidade de tais epitopos de modo a obter uma resposta imunitária diferenciada em relação à proteína do envelope virai e de uma proteína do hospedeiro.
Sabe-se que para modificar a antigenicidade de um polipéptido. É possível modificar o referido polipéptido com auxílio de uma mutação incidente em pelo menos um amionácido. Definir-se-+a mais adiante o que se deve entender aqui por "mutação". 0 aminoácido mutado pode estar situado no fragmento imunogénico, ou mesmo numa zona do polipéptido exterior do referido fragmento. Sabe-se com efeito que a modificação de uma aminoácido situado no exterior de um fragmento pode afectar a estrutura espacial do referido fragmento, e por isso da sua antigenicidade; em particular, mostrou-se que a conformação de um resíduo de aminoácido, num péptido, pode ser influenciada pela natureza dos resíduos de aminoácidos em posições que vão de +8 a -8 em relação a este resíduo de aminoácido; ver por exemplo GARNIER et al., J. Mol. Biol. 120: 97-120 (1978). Além disso, a natureza dos resíduos de aminoácidos tem ainda uma influência, mas esta influência não é nem sistemática nem quantificável a partir apenas do conhecimento da sequência peptídica considerada.
Uma aminoácido mutado pode então estar situado, no polipéptido modificado, no interior ou no exterior do fragmento imunogénico. Quando está no exterior do fragmento imunogénico, não é geralmente separado da extremidade mais próxima do referido fragmento imunogénico, na cadeia 9 polipeptídica, por mais de oito (e especialmente por mais de sete) resíduos de aminoácidos. Em particular, um aminoácido mutado em conformidade com a presente invenção, está situado no exterior do fragmento imunogénico, não está geralmente separado por mais de oito resíduos de aminoácidos, e em particular por mais de sete resíduos de aminoácidos, do aminoácido conservado mais próximo pertencente à zona imunodominante da qual pelo menos um fragmento está contido no polipéptido não modificado. 0 polipéptido modificado em conformidade com a presente invenção pode ser por exemplo a proteína de envelope JP61 inteira de uma estirpe virai VIH patogénica, modificada por pelo menos uma mutação como indicada acima. 0 polipéptido modificado pode também ser uma parte da proteína de envelope gp41 de uma estirpe virai VIH patogénica, modificada por pelo menos uma mutação como indicada anteriormente. 0 polipéptido modificado pode ser igualmente uma proteína quimera compreendendo pelo menos uma parte da proteína de envelope gp41 sendo a referida parte da proteína envelope definida como anteriormente e compreendendo pelo menos uma mutação. A definição dada acima do processo da invenção implica que o polipéptido utilizado compreende pelo menos uma parte de uma zona de imunodominante e conservada de uma proteína de envelope virai gp41. Na descrição da presente invenção, chama-se "zona conservada" uma zona, eventualmente reduzida a um só resíduo de aminoácido, da proteína virai, onde se reencontra, para uma maioria de estirpes de um dado vírus (por exemplo em pelo menos 6 estirpes em cerca de 10), um ou vários aminoácidos idênticos ou funcionalmente análogas situadas na mesma posição em alinhamentos de sequências 10 peptídicas da referida proteína de diversas estirpes. Um tal aminoácido idêntico ou funcionalmente análogo é denominado aminoácido conservado. A noção de conservação de aminoácidos funcionalmente análogos é conhecida, e existem numerosas matrizes de substituição que permitem quantificar esta noção (Dayhoff, M.O. et al., em Atlas of Protein Sequence and Structure, 1978, Vol 5, Supl 3, Capítulos 22 e 23).
As zonas conservadas podem ser facilmente determinadas, após sequenciação de proteínas de diversas estirpes do vírus estudado, pelos métodos de alinhamentos múltiplos das sequências obtidas. Pode-se utilizar para tal por exemplo o programa Clustal-w (Thompson J.D. et al., Nucleic Acids Research 22: 4673-4680, 1994). Por outro lado, as sequências de proteínas de diversas estirpes virais são frequentemente acessíveis nas bases de dados. Por exemplo, o servidor Web da base de dados VIH de Los Alamos apresenta as sequências VIHl e VIH2 actualizadas regularmente. O endereço deste servidor na rede da internet é : http://hiv-web.lanl.gov/HTML/sequences.html
As tabelas 2a, 2b, e 2c anexas são exemplos de alinhamento de sequência das regiões pertencentes às glicoproteínas de envelopes homólogos da região 545-682 da glicoproteína transmembranar de VIHl (entrada SWISSPROT ENV_HVl BR), respectivamente para VIHl e VIH2. A última linha das tabelas resume, com auxílio dos símbolos, o grau de homologia, e logo o grau de conservação, observada. O símbolo indica uma posição do alinhamento em que o mesmo resíduo está presente em todas as sequências, o símbolo indica uma posição no alinhamento em que os aminoácidos presentes nas diferentes sequências são muito similares, o símbolo indica uma 11 posição no alinhamento em que os aminoácidos presentes nas diferentes sequências são similares, e a ausência de símbolo indica uma posição no alinhamento em que os aminoácidos presentes nas diferentes sequências são pouco similares. Esta simbologia é utilizada pelo programa de alinhamento Clustal w (versão 1.7).
Na descrição do presente pedido, chama-se zona imunodominante de uma proteína uma sequência peptídica que induz numa grande maioria de casos (por exemplo em cerca de pelo menos 7 casos em 10) uma resposta humoral e/ou celular do sistema imunitário dirigido contra a referida zona após imunização com uma proteína contendo a referida sequência ou com um péptido constituído essencialmente pela referida sequência. A definição do processo da invenção faz referência às células alvo de um vírus que são as células no interior das quais o vírus é capaz de penetrar. As células alvo dos retrovírus são geralmente conhecidas. Os vírus têm a propriedade de se fixar nas células que são susceptíveis de infectar. Pode-se então eventualmente procurar através de experiências de rotina in vitro as células alvo de um vírus estudado. A definição do processo da invenção faz também referência às células do hospedeiro que têm um receptor membranar para uma proteína do hospedeiro IL-2. As células do hospedeiro com um receptor para uma proteína do hospedeiro IL-2 são frequentemente conhecidas e, em caso contrário, é possível, através de experiências de rotina, determinar se uma dada proteína se fixa no referido tipo de célula. Pode-se igualmente averiguar se a proteína se fixa num dado receptor 12 membranar utilizando uma linha celular transfectada por um gene que expressa o referido receptor membranar.
No presente pedido, considera-se que uma resposta imunitária, por exemplo uma resposta de anticorpos, obtida por imunização com auxilio do polipéptido modificado preparado em conformidade com o processo da invenção, é dirigida contra a proteina de envelope virai gp41 e não contra a proteina do hospedeiro IL-2, quando os anticorpos obtidos têm afinidades para a proteina do hospedeiro e para a proteina do envelope do retrovirus que apresentam uma importante diferença, traduzindo-se especialmente por diferenças de reactividade consideradas como muito significativas em testes ELISA, tias como por exemplo densidades ópticas numa razão de cerca de 4 (pelo menos), o que significa que a densidade óptica observada após fixação dos referidos anticorpos na proteina virai gp41 é pelo menos quatro vezes mais elevada do que aquela observada para a fixação dos referidos anticorpos na proteina do hospedeiro IL-2. De modo análogo, uma resposta imunitária do tipo celular é considerada como dirigida contra a proteina do envelope gp41 mas não contra a proteina do hospedeiro IL-2 quando da imunização in vitro de células imunocompetentes do hospedeiro com a vacina candidata induz a formação de células activadas cuja reacção em relação a células (incluindo as linhas celulares transfectadas) que expressam a proteina de envelope retroviral é significativamente mais elevada do que a reacção em relação a células que expressam a proteina do hospedeiro, por exemplo quando, na medição óptica final, ou na contagem final de radioactividade (especialmente radioactividade de 51Cr emitida por células alvo) do teste utilizado, ou ainda na apreciação por todos os métodos conhecidos de uma lise celular causada 13 por células citotóxicas induzidas, as escalas de resposta estão numa razão de cerca de 4 (pelo menos). Os critérios que acabam de ser indicados permitem pelo menos fazer uma primeira escolha entre os péptidos modificados estudados, mas em definitivo é a ausência ou a diminuição do efeito patogénico devido à supressão ou ao enfraquecimento (evidenciado por qualquer modo apropriado) da resposta imunitária em relação à proteina do hospedeiro, que constituirá o critério de selecção dos péptidos modificados susceptiveis de constituir agentes vacinais satisfatórios.
As zonas imunodominantes e conservadas cuja antigenicidade se pretende modificar, em conformidade com a invenção, podem ser escolhidas entre aquelas que originam in vitro uma reacção cruzada, do tipo B e/ou do tipo T, com a proteina do hospedeiro IL-2.
Pode-se também escolher uma tal zona imunodominante e conservada entre aquelas para as quais se determinou anteriormente uma analogia de estrutura tridimensional com uma zona da proteína do hospedeiro IL-2, sendo a referida analogia de estrutura susceptível de ser associada a uma reacção cruzada in vitro e/ou in vivo. A analogia de estrutura tridimensional entre certas zonas de duas proteínas faz referência a disposições equivalentes, no espaço, de resíduos de aminoácidos que são similares devido especialmente à sua cadeia lateral e/ou aos seus grupos químicos funcionais análogos. As estruturas tridimensionais das proteínas podem ser obtidas com auxílio de espectros de ressonância magnética nuclear (rmn) e/ou de espectros de difracção de raios X. Por exemplo, a estrutura da proteína gp41 de VIS foi obtida com auxílio do espectro RMN (Caffrey 14 M. et al., J. Mol. Biol. 271, 819-826, 1997). Entre outros, é possível, em certos casos, obter um bom modelo com auxílio de técnicas de modelação molecular, a partir de coordenadas atómicas de uma proteína de estrutura conhecida. Pode-se utilizar para tal, especialmente, o programa informático de modelação molecular X-plor (referência: "A system for X-ray crystallography and NMR, Version 3.1", Axel T. Brunger, Yale Unversity Press, 1992) .
Para procurar uma analogia de estrutura tridimensional, pode-se fazer uso por exemplo aos métodos conhecidos de visualização e de sobreposição em monitor gráfico da estrutura tridimensional de moléculas biológicas. Existem programas informáticos que permitem a visualização das estruturas tridimensionais das moléculas com diferentes modos de representação, o cálculo de parâmetros geométricos (tais como distâncias, ângulos, etc) e a sobreposição objectiva e quantitativa de várias estruturas moleculares (especialmente programas informáticos RASMOL: Sayle, R.A. e Milner-White E.J., J. Mol. Biol., 247, 536-540, 1995 e ANTHEPROT: Geourjon C. e Deléage G., J. Mol. Graph. 13, 209-212, 1995) assim como a estimativa da acessibilidade aos solventes (programas informáticos X-plor, já mencionado, e CCP4: Collaborative Computational Project Number 4, Acta Cryst., D50, 760-763, 1994.
No entanto, de modo a se ter uma estimativa mais fina destas analogias estruturais, é útil considerar, ao nível de cada aminoácido, os grupos funcionais posicionados de modo análogo nas duas proteínas que se comparam. Para tal, os co-inventores da presente invenção utilizam métodos que permitem calcular superfícies moleculares com o objectivo de comparar 15 prioridades funcionais entre duas estruturas tridimensionais, para ter em conta não aminoácidos na sua globalidade, mas também, mais especialmente, grupos químicos funcionais de cada um entre eles (por exemplo: funções amida, carboxílico, hidroxilo, sulfidrilo, amina, etc.). Pode-se assim tomar em consideração, nas estruturas comparadas, aminoácidos funcionalmente análogos e não apenas unicamente aminoácidos idênticos.
Considera-se então que uma zona de uma proteína retroviral gp41 apresenta uma analogia de estrutura tridimensional com uma dada zona de uma proteína do hospedeiro IL-2, quando as técnicas que acabam de ser mencionadas permitem evidenciar, nas duas zonas comparadas, uma organização espacial similar de certos aminoácidos idênticos ou funcionalmente análogos.
Deve notar-se que os aminoácidos funcionalmente análogos e reagrupados de modo similar no espaço podem estar relativamente afastados uns dos outros na mesma cadeia peptídica. Mas a analogia de estrutura tridimensional, entre duas proteínas que são comparadas, pode também se referir à disposição no espaço, de modo similar, de aminoácidos idênticos ou funcionalmente análogos no caso em que, estando uma das proteínas oligomerizada, os resíduos de aminoácidos implicados estão situados em cadeias diferentes do oligómero, enquanto que os resíduos de aminoácidos da outra proteína que são implicados nesta analogia podem estar situados numa mesma cadeia peptídica desta outra proteína. É particularmente prudente procurar analogias de estrutura tridimensional e/ou reacções cruzadas com zonas da proteína 16 do hospedeiro IL-2 implicadas na fixação da referida proteína sobre o seu receptor.
Para preparar o polipéptido modificado que constitui o agente vacinai obtido segundo a invenção, pode-se utilziar os métodos conhecidos de síntese peptídica ou os métodos de engenharia genética. Pode-se isolar ou preparar uma sequência polinucleotídica que codifica para pelo menos uma parte da proteína de envelope gp41 do vírus e, se desejado, pode-se introduzir nesta fase, na sequência nucleotídica, mutações que permitem obter um produto de tradução mutado que constitui o polipéptido modificado. Pode-se igualmente sintetizar directamente uma sequência polinucleotídica modificada que compreende uma ou várias mutações e que codificam para o polipéptido modificado. As sequências polinucleotídicas mutadas assim obtidas são introduzidas de forma conhecida num vector apropriado permitindo expressar o referido polipéptido, eventualmente sob forma modificada. Um tal vector é por exemplo E. coli, um baculovírus, ou uma célula de mamífero. Pode-se assim efectuar a mutação num polipéptido não modificado obtido segundo um dos métodos anteriores.
No presente pedido, denomina-se "mutação" qualquer modificação de uma região (eventualmente reduzida a um só resíduo de aminoácido) de um polipéptido, por meios físicos, meios químicos (modificação covalente ou não covalente) e/ou biológicos (mutações por substituição, deleção e/ou inserção de um ou vários aminoácidos), conduzindo à modificação das potencialidades funcionais do ou dos aminoácidos constituintes de referida região, dita "região mutada". A título de exemplo, podem-se efectuar modificações que 17 conduzem à abolição, aquisição e/ou modulação das propriedades de pontes de dissulfureto, ligações de hidrogénio, interacções electrostáticas e/ou de interacções hidrofóbicas, à modificação da capacidade de uma proteina em formar um hetero-complexo, ou ainda, no caso de uma proteina oligomérica, à modificação do estado de oligomerização ou da estabilidade do oligómero. A modificação de um aminoácido a de uma cadeia polipeptidica (incluindo a modificação de um aminoácido terminal do polipéptido considerado) pode influenciar a conformação dos aminoácidos vizinhos na cadeia, incluindo, como se recordou acima, a conformação de um aminoácido b separado de a por um número de resíduos de aminoácidos que pode ir até sete ou oito, e quando o aminoácido b faz parte de um epitopo, qualquer modificação do aminoácido a (especialmente qualquer adição de um substituinte ou qualquer modificação de um substituinte) é susceptível de modificar a antigenicidade do epitopo considerado.
Na fase de procura de polipéptidos modificados em conformidade com a invenção, a escolha dos aminoácidos a mutar e/ou a escolha dos métodos de mutação pode ser feita de modo arbitrário ou de modo planeado. Pode-se utilizar especialmente pelo menos um dos seguintes métodos de modificação: 1) a substituição de um ou vários aminoácidos com uma cadeia lateral hidrofóbica (Exemplos: Ala, Leu, Vai, Ile, Phe, Trp, Met, Tyr, Cys) por um ou vários aminoácidos com uma cadeia lateral hidrofílica (Exemplos: Arg, Asp, Asn, 18
Glu, Gin, Ser, Thr, His, Lys) ou indiferente (Exemplos: Gly, Pro) e vice versa; 2) a substituição de um ou vários aminoácidos com uma cadeia lateral com carga positiva (Exemplos: Arg, Lys, His) por um ou vários aminoácidos com uma cadeia lateral com carga negativa (Exemplos: Asp, Glu) ou neutra e vice versa; 3) a aquisição, a supressão e/ou a modificação de uma ou várias pontes dissulfureto; 4) a realização de mimotopos, em particular obtidos por retro inverso; 5) as substituições, supressões, adições e/ou outras modificações de pelo menos um aminoácido potencialmente dador ou aceitador de ligações de hidrogénio; 6) as substituições, supressões, adições e/ou outras modificações de pelo menos um aminoácido potencialmente dador ou aceitador de ligações iónicas; 7) a modificação dos impedimentos estéricos por substituições, supressões, adições e/ou outras modificações de um ou vários aminoácidos; 8) a utilização de aminoácidos não naturalmente presentes nas proteínas ; 9) a modificação da glicosilação (criação, supressão ou modificação de locais de glicosilação ou dos seus açúcares associados).
Naturalmente, os polipéptidos modificados assim obtidos são testados, como indicado acima, de modo a seleccionar os polipéptidos modificados que induzem uma resposta imunitária dirigida contra a proteina de envelope gp41 e não contra a proteina do hospedeiro IL-20. 19 0 processo da invenção pode ser aplicado à obtenção de vacinas, especialmente contra os seguintes vírus: VIH. A invenção tem igualmente como objecto a utilização de um polipéptido modificado, tal como definido anteriormente, na preparação de uma composição vacinai destinada a prevenir os efeitos patogénicos associados à infecção de um hospedeiro por um retrovírus VIH. A invenção refere-se igualmente a uma composição vacinai podendo ser obtida pelo processo da invenção e contendo como ingrediente activo um polipéptido modificado tal como descrito acima. Uma tal composição pode ser utilizada num método de vacinação destinado a prevenir os efeitos patogénicos das infecções com retrovírus VIH, consistindo este método essencialmente em administrar a um animal vertebrado, incluindo um ser humano, um polipéptido modificado tal como definido acima em quantidade suficiente para obter um efeito de vacinação. A formulação das composições vacinais, e o seu método de administração, são conhecidos em si e não serão aqui substancialmente descritas. A invenção tem também como objecto um polinucleótido retroviral modificado que codifica para um polipéptido modificado tal como definido anteriormente. 0 polinucleótido modificado pode ser obtido como indicado anteriormente. A invenção estende-se a um vector de expressão no qual o referido polinucleótido modificado foi inserido, sendo o referido polinucleótido assim capaz de expressar o polipéptido modificado. 0 polipéptido modificado obtido segundo a invenção pode 20 igualmente servir de agente imunogénico com vista a induzir por imunização a formação de anticorpos utilizáveis especialmente no tratamento das infecções retrovirais, e a invenção refere-se então igualmente a anticorpos obtidos em resposta à imunização de animais (incluindo humanos), in vivo ou in vitro, com auxilio do agente vacinai contendo um polipéptidomodifiçado descrito acima. Os anticorpos da invenção são especialmente anticorpos policlonais purificados ou anticorpos monoclonais que apresentam a caracteristica de reconhecer a proteína de envelope retroviral sem reconhecer a proteína do hospedeiro. A purificação dos anticorpos policlonais, e a selecção dos anticorpos monoclonais, podem ser realizadas com auxílio da proteína virai e da proteína do hospedeiro, de modo a apenas reter os anticorpos que reconhecem a proteína virai e não a proteína do hospedeiro. Os anticorpos da invenção podem ser utilizados especialmente no tratamento precoce das infecções provocadas no referido hospedeiro pelo retrovírus contra o qual se dirigem. A posologia é a posologia usual dos anticorpos. As composições farmacêuticas contendo tais anticorpos constituem igualmente um dos objectos da invenção.
Os exemplos seguintes ilustram a invenção. EXEMPLO 1
Expõe-se de seguida como os autores da presente invenção procuraram analogias estruturais e antigénicas entre uma proteína de envelope de um vírus, a saber a proteína gp41 do VIHl, e uma citocina, a saber a interleucina-2 (abreviadamente: IL-2) humana. 21
Note-se que as sequências peptídicas de gp41 e da IL-2 humana não são homólogas. Com efeito, as duas proteínas não apresentam globalmente entre si mais de 16,5% de identidade de sequência, não sendo este limiar de homologia significativo, como se pode facilmente constatar com auxílio de simulações in silico realizadas em sequências da mesma composição mas cuja prdem dos aminoácidos foi aleatoriamente modificada.
Trabalhos antigos (Bost et al., Immunology 65: 611-615, 1988) sinalizaram uma homologia de sequência entre a proteína pg41 e a IL-2 (sequência LERILL). Deve notar-se que esta sequência LERILL de gp41 não constitui uma zona imunodominante desta proteína; ver LEVY J.A., Microbiol. Rev. 57: 183-289 (1993) em particular página 232. A sequência LERILL está por seu lado situada no interior da partícula virai; corresponde à parte C-terminal de gp41.
Tendo observado que a IL-2 e os retrovírus associados aos SIDAS parecem ter células alvo comuns, os autores da presente invenção puseram a hipótese que o receptor da interleucina-2 humana poderia ser comum à IL-2 e à proteína gp41 do vih e procuraram então eventuais analogias estruturais tridimensionais entre estas duas últimas.
No presente pedido, as numerações dos resíduos de aminoácidos da sequência peptídica da interleucina-2 e de gp41 são aquelas utilizadas no banco SIWSSPROT (versão 34).
As sequências peptídicas da IL-2 e da proteína gp41 são conhecidas. No presente pedido, faz-se referência às seguintes sequências publicadas: 22 - para IL-2: entrada SWISSPROT (versão 34) tendo como código IL2_HUMAN; - para gp41: entrada SWISSPROT (versão 34) tendo como código ENV_HV1BR.
As estruturas publicadas que foram utilizadas são as seguintes: - para IL-2: entrada PDB (Brookhaven Databank) URL; - para gp41: entradas PDB (Brookhaven Databank) - 1AIK, - 1ENV.
Por outro lado, a estrutura tridimensional da IL-2, determinada por RMN, é conhecida (Mott, P.C. et al., J. Mol. Biol., 248: 979, 1995), tal como a estrutura de certos domínios da proteína gp41, que foi obtida com auxílio do espectro de difracção de raios X (Chan, D.C. et al., Cell, 89, 263-273, 1997; Weissenhorn, W. et al., Nature, 387, 426-430, 1997) . Por outro lado, foi obtido um modelo tridimensional de uma parte de uma porção do domínio externo, na região 545-671, da proteína gp41 (forma trimérica), por modelação molecular, pelos co-inventores da presente invenção. Este modelo molecular foi obtido utilizando o programa informático X-plor através de uma estratégia próxima daquela da modelação molecular sob condições RMN. As condições necessárias para a modelação molecular da forma trimérica foram deduzidas da estrutura tridimensional de um mutante pll do domínio "leucine zipper" da proteína GCN4 (código PDB:1GCM), cristalizado sob a forma de um trímero do tipo "coiled coil". 23
Examinando as estruturas obtidas, foram encontradas analogias tridimensionais entre certas zonas da proteína gp41 e certas zonas da interleucina-2 que participam na fixação num seu receptor. 0 modo de fixação da IL-2 no seu receptor, assim como as zonas da IL-2 implicadas nesta fixação, são com efeito conhecidos; ver BAZAN J.F., P.N.A.S. USA 87: 6934-6938 (1990); Bamborough P. et al., Structure 2: 839-851 (1994); Gnarra J.R. et al., P.N.A.S. USA 87: 3440-3444 (1990); Takeshita T. et al., Science 257: 379-382 (1992) e CAVAILLON J.M., Les Cytokines (Masson, Paris, 1996), páginas 119-125.
Estes resultados foram confirmados por estudos de comparações globais das estruturas de gp41 e da IL-2, e também por comparações locais realizadas com interesse mais específico nos grupos funcionais análogos de cada uma das estruturas, com já indicado na descrição acima.
Observou-se especialmente que as regiões 53-61 e 88-93 da IL-2, organizadas em hélice alfa, se sobrepõem de modo satisfatório com duas das três hélices do trímero central de gp41. Tal implica que nas duas proteínas, grupos contidos em hélices diferentes podem ter propriedades de acessibilidade e de organização relativa comparáveis.
Descobriram-se igualmente analogias estruturais tridimensionais locais entre uma região imunodominante fortemente conservada da glicoproteína gp41 do VIH (mais precisamente na região 545-682) e da interleucina-2 humana. A sequência peptídica da região 545-682 da proteína gp41 do VIHl (código SWISSPROT: ENV_HV1BR) está reproduzida na Tabela 3 em anexo. 24
Na Tabela 3bis anexa, representaram-se as sequências peptídicas de quatro zonas desta região de gp41 (555-577, 572-601, 590-620 e 628-663), nas quais se evidenciam as analogias estruturais e/ou das reacções cruzadas com a IL-2.
As zonas da IL-2 implicadas na analogias de estrutura que acabam de ser mencionadas são as zonas 27-47, 45-69, 99-121 e 131-153 da IL-2. As sequências peptídicas destas zonas são representadas na Tabela 4 anexa. É importante notar que a zona 27-47 da IL-2 está implicada na fixação da IL-2 na cadeia beta do seu receptor. Com efeito, os aminoácidos na zona 27-47 pertencem à hélice A que participa na fixação no receptor de IL-2 (RIL-2), mais precisamente no beta RIL-2.
Os amionácidos na zona 45-69 pertence a uma região da IL-2 que participa na fixação com alfa RIL-2.
Os aminoácidos na região 99-121 pertencem à hélice E que participa na fixação em beta RIL-2.
Os aminoácidos na zona 131-153 da IL-2 pertencem à hélice F participando na fixação em gama RIL-2. A título ilustrativo, precisam-se na Tabela 4bis anexa as analogias das estruturas que foram encontradas entre a zona 572-601 de gp41 e a zona 27-47 da IL-2 humana. Os aminoácidos externos implicados nesta analogia de estrutura tridimensional são sublinhados na Tabela 4bis. 25
Deve notar-se no entanto que uma mesma zona de gp41 pode apresentar analogias de estrutura tridimensional com várias zonas distintas de il-2.
Por outro lado, os autores da invenção notaram que na região 600-612 de gp41, as três lisinas (K) na posição 606 nas três cadeias de trimero de gp41 são susceptiveis de formar um epitopo conformacional, podendo estas lisinas de gp41 corresponder, no espaço, às lisinas 52, 96 e 55 da IL-2.
Observaram igualmente reactividades imunológicas cruzadas entre as proteínas gp41 e IL-2. Em particular, utilizando as técnicas ELISA e PEPSCAN, com anticorpos proveneinetes de soros VIH purificados por imunopurificação numa coluna contendo IL-2 humana imobilizada, constataram que certos destes anticorpos reconhecem zonas de IL-2 implicadas na fixação do IL-2 em cadeias alfa, beta e gama do seu receptor, e especialmente das zonas que pertencem à hélice A (KTQLQLEHLLLTLQ), a hélice E (RFMLISNINVIVLELK), a hélice F (TIVEFLNRWITFCQSIISTLT), a volta AB e o início da hélice B (NNYKNPKLTRMLTFKFYMFKK).
Utilizando as técnicas de depósito pontual em filtro (ou "dot") e as técnicas de imunotransferência do tipo "western blot", foi igualmente demonstrado que anticorpos policlonais provenientes de soros de doentes VIH+ e imunopurifiçados na IL-2 humana, reconhecendo os oligómeros da proteína gp41.
Os estudos efectuados mostraram igualmente que anticorpos monoclonais anti-gp41 murinos e humanos dirigidos contra zonas conservadas imunodominantes da proteína gp41 dos VIH 26 reconhecem zonas de IL-2 que participam na fixação desta última em cadeias alfa, beta ou gama do receptor da IL-2.
Pode-se então obter vacinas contra o vírus VIH em conformidade com a invenção, especialmente através da preparação dos polipéptidos contendo pelo menos uma das zonas de gp41 descritas na Tabela 3bis, estando os referidos polipéptidos sob forma modificada, ou seja contendo pelo menos uma mutação, como indicado anteriormente. Deve-se entender que estes recortes da região 545-652 em zonas podem apresentar um certo carácter arbitrário, e é por isso que certas zonas indicadas podem se sobrepor. EXEMPLO 2 = Mutações em gp41 de VIH.
Preparam-se, segundo os métodos conhecidos, glicoproteínas de envelope gp41 mutadas. Estas mutações são descritas na Tabela 5 anexa que representa a sequência implciada de gp41 e, alinhadas sob esta, as sequências mutadas. 0 nível das mutações está assinalado sublinhando os aminoácidos implicados.
Prepararam-se composições vacinais compreendendo cada uma, em solução aquosa salina, estéril e apirogénica, uma das proteínas gp41 mutadas obtidas acima.
Imunizam-se coelhos ou ratinhos com as proteínas mutadas obtidas, e investiga-se se os anticorpos desenvolvidos por estes animais reconhecem ou não reconhecem a interleucina-2 humana, por exemplo através da técnica ELISA ou PEPSCAN. Seleccionam-se as proteínas mutadas que induzem a formação de 27 anticorpos que não reconhecem a IL-2, mas que reconhecem a proteína gp41. MORGAN, "PEPTIDE , Oxford A técnica PEPSCAN é descrita por J. WORTHINGTON e K. "Epitope mapping using synthetic peptides", em ANTIGENS - A practical approach" (G.B. WISDOW Ed.) University Press (1994) . 28 TABELA 1 LENTIVIRUS HOSPEDEIRO CÉLULA-ALVO PRINCIPAL VAIE Cavalo Macrófago Anemia hemolítica VÍRUS VI SNA Carneiro Macrófago Maedi-visna: -encefalite -pneumonia intersticial VECA Cabra Macrófago -Imunodeficência -encefalopatia -artrite VIB Bovino Linfócito T -Imunodeficiência -linfocitose bovina VIF Gato+felinos Linfócito T Imunodeficiência (SIDA) VIS Primatas (macacos) Linfócito T Imunodeficiência (SIDA) VIH Homem Linfócito T Imunodeficiência (SIDA) VAIE - designa o vírus da anemia infecciosa equídea VECA designa o vírus da encefalopatia caprina VIF significa: vírus da imunodeficiência felina VIS significa: vírus da imunodeficiência símia VIH significa: vírus da imunodeficiência humana. 29 TABELA 2a
30 GíMl ΟΝΙ" QP41 GP4l“ mn GA4 1' G£>4l" QM1 GF41" G341 GPítT QMl QW§1 QJMl £Ρ$Γ Wl" GNl~ GP3 i" GF41" 684 l" 684 Γ GM1 GP4 1 GP4 Ϊ" GP4 i" GP41'" mi i TABELA 2a(continuação)
m 112 LEE LPEKâS LMN&ffH í TQ ”H V1 í £ LLSL&KNfcS LWNÍÍ^ÍÍ Ϊ TO “fiVlEL LtELDfíims»^FSlTO ~HV im LLELDKWAS LfcWS ITK “'MV im LL EL8&WAS l#mt$ I BK “ KV 1 m LLQL BftíffftS LW^^FSITK "HV1C4 LLOL pWíAS Lfm-fSM TK Η. V1SI. Li EL DKW A S Ltf NVÍ EDIBK " KVIBèí LLELDKVVAS LtfNWFNÍ f N "BVIJE LLgLDKWA.SLI^yE^ITK ~miji Lmh®mb$f ftith
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QAA^LLSG 1'VQQQm LIBA IBÂQQB LLÀLTWI IK C?IQ AB-11B v E R Y LKIXÍ Q- LILI% CAI A11CT t A V B sleoíbaimtbbei drei m^rsi ι bs IIIISOBQCíIKÍIIOILLELIBABA LBíIInriB “
Tabela 3bis
Zonas de gp41
Zona 555-577 QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWG zona 572-601 QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW Zona 590-620 RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS Zona 628-663 WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ TABELA 4
IL-2 Zona 27-47 TKKTQLQLEHLLLDLQMILNG Zona 45-69 LNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKK 34
Zona 99-121 HLRPRDLISNINVIVLELKGSET Zona 131-153 TATIVEFLNRWITFCQSIISTLT TABELA 4bis
gp41 IL-2 Zona 572-601 QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW Zona 27-47 TKKTQLQLEHLLLDLQMILNG TABELA 5Mutações ao nível da zona 555-577
Zona 555-577 QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWG
Mutação 1
Mutação 2
Mutação 3
Mutação 4
Mutação 5
Mutação 6
Mutação 7
Mutação 8 QQQNNLLAAIEAQQHLLQLTVWG QQQNNLLRAIERQQHLLQLTVWG QQQNNLLAAIERQQHLLQLTVWG QQQNNLLRAIEAQQELLQLTVWG QQQNNLLRAIEAQQQLLQLTVWG QQQNNLLRAIEAQQHLLRLTVWG QQQNNLLRAIEAQQHLLKLTVWG QQQNNLLRAIEAQQQLLKLTVWGMutações ao nível da zona 572-601
zona 572-601 QLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIW
Mutação 1
Mutação 2
Mutação 3
Mutação 4
Mutação 5
QLTVWGIKQLQARILAVERYLKAQQLLGIW QLTVWGIKQLQARILAVEAYLKDQQLLGIW QLTVWGIKQLQARILAVEAYLKAQQLLGIW QLTVWGIKQLQARILAVEDYLKRQQLLGIW QLTVWGIKQLQARITAVERYLKDQQLLGIW 35
Mutações ao nível da zona 590-620
Zona 590-620 RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS Mutação 1: KYLKDQQLLGIWSCSGKLICTTAVPWNASWS Mutação 2: RYLKDQALLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS Mutação 3: RYLKDQQQLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS Mutação 4: RYLKDQAQLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS Mutação 5: RYLKDQARLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWS Mutação 6: RYLKDQQLLNSWGCSGKLICTTAVPWNASWS Mutação 7: RYLKDQQLLGIWGCSQKLICTTAVPWNASWS Mutação 8: RYLKDQQLLGIWGCSFKLICTTAVPWNASWS Mutação 9: RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASSS Mutação 10: RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNADTL Mutação 11: RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNATNR Mutação 12: RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNANTR Mutação 13: RYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNANTS
Mutações ao nível da zona 628-663 Zona 628-663 WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ Mutação 1: WNNMTWMEWDREINNYESLIHSLIEESQNQQEKNEQ Mutação 2: WNNMTWMEWDREINNYTSNIHSLIEESQNQQEKNEQ 28-05-2007 36
Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES 1. Processo de pesquisa e de obtenção de uma vacina contra os efeitos patogénico associados à infecção de um hospedeiro, animal ou humano, por um retrovirus VIH capaz de penetrar numa célula alvo do referido hospedeiro, possuindo a referida célula alvo um receptor membranar para a proteína do hospedeiro interleucina-2 (IL-2), no qual: a) preparam-se agentes vacinais à base de um polipéptido compreendendo pelo menos uma parte da proteína do envelope gp41 de uma estirpe patogénica do referido retrovirus, estando presente o referido polipéptido, nos referidos agentes vacinais, sob uma forma modificada, - sendo a referida parte da proteína do envelope gp41 escolhida entre aquelas que compreendem pelo menos um fragmento de uma zona imunodominante da referida proteína do envelope gp41, contendo o referido fragmento pelo menos um aminoácido que é um aminoácido conservado da referida zona imunodominante e que está presente na referida estirpe patogénica, sendo o referido polipéptido escolhido entre aqueles que, no estado não modificado, induzem uma resposta imunitária dirigida em simultâneo contra a referida zona imunodominante e contra a proteína do hospedeiro IL-2, e b) selecciona-se como vacina um tal polipéptido modificado escolhido entre aqueles que induzem uma resposta imunitária dirigida contra a referida zona imunodominante da proteína do envelope gp41 e não contra 1 a proteína do hospedeiro IL-2.
- 2. Processo segundo a reivindicação 1, no qual a referida zona imunodominante é escolhida - entre aquelas que originam uma reacção cruzada, do tipo B e/ou do tipo T, com a referida proteína do hospedeiro IL-2, e/ou - entre aquelas para as quais se determinou anteriormente uma analogia de estrutura tridimensional com uma porção da referida proteína do hospedeiro IL-2.
- 3. Processo segundo qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual: - o referido agente vacinai contém, numa forma modificada, um polipéptido compreendendo pelo menos uma porção da zona 545-682 da proteína gp41 de VIH 1.
- 4. Processo segundo qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual o referido agente vacinai é um oligómero de pelo menos uma parte da proteína do envelope gp41 do referido retrovírus VIH de forma modificada.
- 5. Processo segundo qualquer uma das reivindicações anteriores, no qual os referidos polipéptidos modificados são obtidos através da produção de mimotopos.
- 6. Agente vacinai podendo ser obtido segundo o procedimento de qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
- 7. Agente vacinai contra os efeitos patogénicos associados 2 à infecção de um hospedeiro, animal ou humano, por um retrovirus VIH, sendo o referido retrovirus capaz de penetrar numa célula alvo do referido hospedeiro possuindo um receptor membranar para uma proteína do hospedeiro interleucina-2 (IL-2), possuindo o referido retrovirus uma proteína do envelope gp41 que induz uma resposta imunitária dirigida em simultâneo contra uma zona conservada e imunodominante da referida proteína de envelope gp41 e contra a referida proteína do hospedeiro IL-2, sendo o referido agente vacinai capaz de induzir uma resposta imunitária dirigida contra a referida zona da referida proteína do envelope gp41 e não contra a referida proteína IL-2.
- 8. Agente vacinai segundo a reivindicação anterior, que é um mimotopo de pelo menos uma parte da referida zona conservada e imunodominante.
- 9. Anticorpo podendo ser obtido por imunização com auxílio de uma vacina segundo qualquer uma das reivindicações 6 a 8, reconhecendo os referidos anticorpos a referida proteína envelope gp41 e não a proteína do hospedeiro interleucina-2.
- 10. Composição farmacêutica contendo um anticorpo segundo a reivindicação 9 .
- 11. Utilização de um polipéptido modificado podendo ser obtido pelo processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, na preparação de uma composição vacinai destinada a prevenir os efeitos patogénicos associados à identificação de um hospedeiro, animal ou humano, por um retrovirus VIH capaz de penetrar numa célula alvo do referido hospedeiro, 3 possuindo a referida célula alvo um receptor membranar para uma proteína do hospedeiro interleucina-2, e possuindo o referido retrovirus uma proteína de envelope gp41 indutora de uma resposta imunitária dirigida em simultâneo contra uma zona conservada e imunodominante da referida proteína de envelope gp41 e contra a referida proteína do hospedeiro interleucina-2.
- 12. Utilização de um agente vacinai tal como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8 na preparação de uma composição vacinai contra o referido retrovirus.
- 13. Polinucleótido que codifica para um polipéptido modificado tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e vector de expressão contendo o referido polinucleótido. 28-05-2007 4
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