PT102727B

PT102727B - Processo de imobilizacao de microrganismos, respectivo produto e utilizacao deste

Info

Publication number: PT102727B
Application number: PT10272702A
Authority: PT
Inventors: Maria De Fatima Teixeira Silva
Original assignee: Proenol Ind Biotecnologica Ld
Priority date: 2002-02-19
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2004-01-30
Also published as: PT102727A

Description

Processo de imobilização de microrganismos, respectivo produto e utilização deste

Âmbito da invenção

A presente invenção respeita a um novo e inovador processo de imobilização de microrganismos (mormente, leveduras ou bactérias), ao respectivo produto e à utilização deste em operações de fermentação ou de bioconversão.

Em particular, a presente invenção respeita à imobilização de microrganismos em esferas de polímeros constituídas por duas ou mais camadas diferentes e susceptiveis de serem desidratadas.

Estas esferas podem encontrar aplicações na elaboração de bebidas fermentadas ou ainda na realização de reacções de bioconversão. Chamarse-á reacções de bioconversão às reacções provocadas por microrganismos mas que não necessitam, necessariamente, do crescimento destes microrganismos. Particularmente, são visadas as aplicações no domínio das bebidas fermentadas, tais como, em geral: vinho, cerveja, vinhos efervescentes, bebidas com gás, cidra, hidromel e álcool (etílico).

Estado anterior da técnica

É sobejamente conhecido que existem diversos modos de imobilização de microrganismos:

as esferas homogéneas, chamadas ainda monocamada ou camada simples constituídas simplesmente por um gel contendo os microrganismos, são descritas nos seguintes documentos de patente: FR2320 349 e FR2359202. Também é conhecido que estas esferas permitem a saída (chamada ainda libertação) dos microrganismos existentes para o meio de reacção, o que em certos casos não é compatível com as exigências do processo (vinhos efervescentes, por exemplo, devido à turvação indesejável que ocasionam).

a patente EP0173915 descreve a realização de uma camada estéril em volta do núcleo de gel contendo os microrganismos - destinada a evitar este fenómeno de libertação - e, em particular, desenvolve a aplicação das esferas ou fios assim obtidos, ditos de dupla camada, nos vinhos efervescentes. Este tipo de preparações podem ser húmidas ou parcialmente desidratadas, como explicado na patente EP0350374.

O problema que actualmente se coloca é que, conforme está provado e é conhecido, dentro das esferas que apresentam tal estrutura (monocamada ou dupla camada) apenas uma pequena fracção dos microrganismos aí incluídos estão realmente activos. Com efeito, os substratos nutritivos trazidos pelo meio ambiente são consumidos pelos microrganismos situados na periferia. Por outro lado, em certos casos, o meio ambiente não contém todos os elementos nutritivos necessários à boa actividade destes microrganismos imobilizados. Obviamente, o problema relatado para as esferas é comum aos biocatalizadores configurados sob outras formas, tais como os biocatalizadores apresentados sob a forma de fios, conforme descrito no citado documento EP0173915. Com efeito, nos biocatalizadores onde os microrganismos se encontram imobilizados, os que se encontram na periferia ou (no caso da existência de uma camada protectora externa isenta de microrganismos) mais próximo desta, consomem a generalidade dos elementos nutritivos provenientes do exterior, impossibilitando ou diminuindo o acesso aos mesmos por parte dos microrganismos situados mais para o interior e, portanto, mais longe da dita periferia, o que ocasiona que estes microrganismos fiquem relativamente inactivos.

Descrição da invenção

Embora a descrição que se segue se baseie no caso do produto com os microrganismos imobilizados - doravante designado simplificadamente por biocatalizador - configurado sob a forma de esferas, deve entender-se que tal forma é usada a titulo meramente exemplificativo, podendo a presente invenção materializar-se sob qualquer outra forma, designadamente a de fios ou placas, desde que seja compatível com os princípios gerais abaixo enunciados e com o âmbito definido nas reivindicações.

Segundo a presente invenção o problema atrás enunciado é resolvido mediante a criação de uma reserva nutritiva no centro da esfera e na localização dos microrganismos numa camada contígua a esta, seguindose, eventualmente, a cobertura do todo por uma camada estéril, definindo, neste caso, uma esfera de três camadas.

Do mesmo modo que o acima indicado para o biocatalizador, deve ter-se também presente que a alusão na descrição que se segue a duas ou três camadas é meramente exemplificativa, consistindo, quando muito, em modos preferenciais de concretização, pois pode-se conceber, segundo o princípio geral da presente invenção, um biocatalizador multicamada com mais camadas, no núcleo do qual, por exemplo, alternam camadas de

reservas nutritivas com camadas que incluem microrganismos, sendo todo o conjunto eventúalmente envolto por uma camada estéril. Embora preferencialmente as camadas sejam concêntricas, tal não é obrigatório.

Do mesmo modo, a reserva nutritiva, pode estar configurada como um conjunto de zonas distintas envoltas pela camada que inclui os microrganismos, sendo o conjunto eventúalmente envolto por uma camada estéril.

Segundo um modo preferencial de concretização da invenção a camada externa estéril, quando existente, será isenta de microrganismos e não apresentará permeabilidade relativamente aos microrganismos em causa.

Segundo um modo preferencial de concretização, o objecto da invenção é uma esfera de camada dupla ou tripla com as seguintes características:

1. Uma reserva nutritiva que tem como objectivo fornecer aos microrganismos incluídos na camada contígua os elementos nutritivos que lhes asseguram uma boa actividade e que estes organismos não encontram no meio onde as esferas vão ser utilizadas e/ou que não conseguem obter em quantidade suficiente. Estes elementos nutritivos podem ser ligeiramente diferentes em natureza e em concentração segundo a legislação em vigor nos países de utilização, mas, de um modo geral, eles fornecerão uma fonte de azoto (amoniacal ou aminada, conforme o microrganismo), sais minerais (fosfatos, sulfatos, potássio, magnésio, entre outros), oligoelementos (ferro, cobre, zinco, entre outros) e vitaminas (tiamina, biotina. entre outras), Serão vantajosamente utilizadas fontes nutritivas complexas como os extractos de leveduras

autolisados.

Consoante o tipo de utilização, esta reserva nutritiva poderá também conter um substrato carbonado como um açúcar fermentescível ou ainda um meio natural completo como um mosto de uva diluído ou não.

Segundo a invenção, esta solução nutritiva é misturada num polímero susceptível de se transformar em gel, como, por exemplo, um alginato de sódio. Uma concentração adequada deste polímero situa- -se entre 1% e 3% em solução aquosa.

2. Uma camada contígua à reserva nutritiva, constituída por uma solução susceptível de se transformar em gel (doravante denominada meio de fixação) e por microrganismos em suspensão nesta solução. Os microrganismos podem ser, nomeadamente, leveduras ou bactérias. Para uma aplicação do tipo da fermentação em garrafa de vinhos efervescentes ou da retoma da fermentação de mosto amuado, é adequada a utilização de estirpes seleccionadas de levedura Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces uvarum.

Para além de Saccharomyces, podem também ser utilizados outros géneros de leveduras, por exemplo, na elaboração de cerveja, cidras ou bebidas de fraco teor alcoólico ou ainda nas reacções de bioconversão. Por exemplo: o género Schízosaccharomyces será vantajosamente utilizado na desacidificação de mostos de uva ácidos: as bactérias Oenococcus oeni ou Lactobacillus para a fermentação maloláctica e; o tipo Candida para a bioconversão de xilose em xilitol.

Segundo uma outra característica da invenção, a concentração

do polímero varia entre 1% e 50%.

Os microrganismos podem ser provenientes de uma cultura fresca realizada segundo as normas em vigor na indústria ou de uma preparação comercial seca activa ou liofilizada e reactivada segundo as recomendações do fabricante.

3. Uma camada externa adicional (no caso das esferas de três camadas) que é elaborada a partir de um polímero com uma natureza idêntica ao das duas outras camadas e susceptível de se transformar em gel. A concentração do polímero é idêntica à utilizada nas outras camadas. Segundo uma característica adicional da invenção, poder-se-á, para certas aplicações, introduzir nesta camada externa uma preparação enzimática ou uma preparação de compostos orgânicos:

Por exemplo (i), uma solução de lizozima adicionada na camada externa para impedir o desenvolvimento em concorrência de espécies de bactérias sensíveis a esta enzima (exemplo conhecido das bactéria lácticas em vinificação) e que poderão dar origem a uma turvação difícil de eliminar no caso dos vinhos efervescentes;.

Por exemplo (ii), as paredes de leveduras que vão fixar os ácidos gordos inibidores de actividade dos microrganismos fixados, no caso do tratamento de paragens de fermentação.

Segundo uma outra caracteristica da invenção as partículas assim constituídas, chamadas esferas de tripla camada, são produzidas numa só etapa.

A realização simultânea de três camadas concêntricas pode ser feita recorrendo a um dispositivo de tubos concêntricos que define duas zonas anelares concêntricas em torno de uma zona central igualmente concêntrica, fazendo-se a incorporação da reserva nutritiva através do interior do tubo central, a incorporação dos microrganismos e do respectivo meio de fixação, através da zona anelar definida pela parte externa do tubo central e pela parte interna do tubo intermédio e fazendo-se a incorporação da camada externa através da zona anelar definida pela parte externa do tubo intermédio e pela parte interna do tubo externo.

O diâmetro das esferas húmidas é entre 1 e 5 mm. A gelificação faz-se por passagem numa solução de um agente de reticulação, nomeadamente cloreto de cálcio, segundo um procedimento já conhecido, e preferencial, onde a reticulação da esfera se dá do exterior para o interior. Segundo uma outra caracteristica da invenção, estas esferas poderão ser mais ou menos desidratadas até uma actividade da água final de 0,1 a 0,5, de preferência de 0,3 a 0,4. Esta desidratação é realizada através de uma técnica de liofilização, de leito fluidizado ou utilização de estufa. As esferas são conservadas numa embalagem estanque ao vapor de água e ao ar e de preferência mantida a uma temperatura relativamente baixa, sendo o ideal cerca de 4°C. Nestas condições, é possível uma conservação de vários meses.

Os exemplos não limitativos dados abaixo ilustram algumas aplicações, características e vantagens da invenção.

Exemplo 1: Preparação das esferas com tripla camada de alginato, contendo as leveduras Saccharomyces cerevisiae, imobilizadas e previamente preparadas para resistirem a um meio rico em álcool.

As esferas são preparadas a partir de uma solução de alginato de sódio, polímero linear de extracto de algas e composto por ácido a-Dmanurónico e β-D-gulurónico. As leveduras, previamente aclimatizadas ao álcool ou não, são logo de seguida misturadas a uma parte dessa solução numa cuba. Neste exemplo é utilizada a estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae EC1118 comercializada sob a marca Lalvin.

Logo de seguida, e graças a um dispositivo de tubos concêntricos, esta solução passa por um sistema de vibração que permite a formação de esferas.

Estas são logo gelificadas ao entrarem em contacto com uma solução 0,2 M de cloreto de cálcio, sendo o tempo de contacto de 30 minutos.

As esferas assim formadas são lavadas por imersão durante 10 minutos em água desionizada.

De seguida, as esferas são desidratadas parcialmente em leito fluidizado. Esta secagem permite obter uma actividade em água (aW) compreendida entre 0,3 e 0,4. A temperatura de secagem é inferior ou igual a 40°C. O diâmetro das esferas, que se obtém, é de 1,5 a 4 mm. Depois do controlo de qualidade, as leveduras imobilizadas e desidratadas sáo embaladas e armazenadas a 4°C antes da sua utilização.

Exemplo 2: estabilidade das leveduras durante o armazenamento

A fim de avaliar a preservação da actividade das esferas, detentoras da camada de Saccharomyces cerevisiae. depois de uma conservação de 6 meses a 4°C. o controlo é realizado da seguinte forma:

- 30 gramas de esferas preparadas segundo o exemplo 1, acima, são colocadas numa solução de sacarose a 50g/f (volume 100 ml) a 37°C;

- A solução é mantida a 37°C e a evolução da concentração do açúcar é seguida ao longo do tempo;

- Após duas horas a concentração do açúcar é inferior a 2g/l, o que corresponde ao final da fermentação.

Este controlo de referência é efectuado no tempo 0 (ou seja, logo depois da produção das esferas) e também após 6 meses de armazenagem a 4°C. O fim da fermentação é efectivado depois do mesmo tempo de incubação de 2 horas. Portanto, as leveduras imobilizadas preparadas segundo o exemplo 1, permanecem estáveis durante 6 meses de armazenagem a 4°C.

Porto, 18 de Fevereiro de 2002.

O Mandatário

Pedro Gil da Sijva Pelayo de Sousa Henriques

Agente Oficial da Propriedade Industrial

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de imobilização de microrganismos caracterizado por ser incorporada no seio do meio de fixação dos microrganismos uma reserva nutritiva adequada aos microrganismos presentes em tal meio, seguida de reticulação, nomeadamente desse meio de suporte.
2 - Processo conforme a reivindicação anterior, caracterizado por o posicionamento da reserva nutritiva coincidir com a zona mais afastada da fronteira externa do meio de fixação dos microrganismos.
3 - Processo conforme a reivindicação 1, caracterizado por a reserva nutritiva ser fisicamente separada em zonas distintas, posicionando-se no seio do meio de fixação dos microrganismos com maior densidade nas zonas deste mais distantes da fronteira externa do mesmo.
4 - Processo conforme qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a reserva nutritiva incluir elementos nutritivos que forneçam, designadamente, uma fonte de azoto (amoniacal ou aminada, conforme o microrganismo), sais minerais (fosfatos, sulfatos, potássio, magnésio, entre outros), oligoelementos (ferro, cobre, zinco, entre outros) e vitaminas (tiamina, biotina, entre outras).
5 - Processo conforme qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por serem utilizadas fontes nutritivas complexas como os extractos de leveduras autolisados.
6 - Processo conforme qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a reserva nutritiva conter também um substrato carbonado como um açúcar fermentescível ou ainda um meio natural completo como um mosto de uva diluído ou não.
7 - Processo conforme qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a reserva nutritiva ser misturada num polímero susceptível de se transformar em gel, nomeadamente, um alginato de sódio.
8 - Processo conforme a reivindicação anterior caracterizado por a quantidade do dito polímero se situar entre 1% e 3% em solução aquosa.
9 - Processo conforme qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por a(s) camada(s) contígua(s) à reserva nutritiva ser(em) constituida(s) por uma solução susceptível de se transformar em gel e por microrganismos em suspensão nesta solução.
10 - Processo conforme a reivindicação anterior, caracterizado por a solução susceptível de se transformar em gel possuir uma concentração de polímero que varia entre 1% e 50%.
11 - Processo conforme qualquer das reivindicações 9 a10, caracterizado por os microrganismos serem leveduras ou bactérias.

•
12 - Processo conforme a reivindicação 11, caracterizado por, para a fermentação em garrafa de vinhos efervescentes ou a retoma da fermentação de mosto amuado, serem seleccionadas estirpes de levedura Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces uvarum.
13 - Processo conforme a reivindicação 11, caracterizado por, para a desacidificação de mostos de uva ácidos ser usado o género Schízosaccharomyces.
14 - Processo conforme a reivindicação 11, caracterizado por, para a fermentação maloláctica, serem utilizadas bactérias Oenococcus oeni ou Lactobacillus.
15 - Processo conforme a reivindicação 11, caracterizado por, para a bioconversão de xilose em xilitol, ser utilizado o género Candida.
16 - Processo conforme qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por, simultânea ou posteriormente, à etapa de reticulação do meio de fixação dos microrganismos o conjunto ser dotado de uma camada externa estéril, sem microrganismos e sem permeabilidade para os microrganismos existentes no meio de fixação.
17 - Processo conforme a reivindicação anterior, caracterizado por a camada externa ser elaborada a partir de um polímero com uma natureza idêntica ao das camadas interiores e susceptível de se transformar em gel e existente numa concentração também idêntica à utilizada nessas outras camadas.
18 - Processo conforme qualquer das reivindicações 16 a 17, caracterizado por se introduzir na camada externa uma preparação enzimática ou uma preparação de compostos orgânicos.
19 - Processo conforme a reivindicação anterior caracterizado por à dita camada externa ser adicionada uma solução de lizozima que impede o desenvolvimento em concorrência de espécies de bactérias sensíveis a esta enzima, nomeadamente de bactérias lácticas em vinificação.
20 - Processo conforme a reivindicação 18 caracterizado por à dita camada externa serem adicionadas paredes de leveduras que vão fixar os ácidos gordos inibidores de actividade dos microrganismos fixados, no caso do tratamento de paragens de fermentação.
21 - Produto com microrganismos imobilizados, caracterizado por possuir incorporada, no seio do meio de fixação dos microrganismos e dos correspondentes microrganismos, uma reserva nutritiva.
22 - Produto conforme a reivindicação anterior, caracterizado por . possuir três camadas, sendo a camada interna constituída pela reserva nutritiva, sendo a camada intermédia constituída pelos microrganismos e pelo respectivo meio de fixação e sendo a camada externa estéril, sem microrganismos e sem permeabilidade para os citados microrganismos.
23 - Processo conforme qualquer das reivindicações 1 a 20, para produção do produto conforme a reivindicação anterior, caracterizado por o produto ser feito numa só etapa com as três camadas, utilizando um dispositivo de tubos concêntricos, definindo duas zonas anelares concêntricas em torno de uma zona central igualmente concêntrica, e fazendo-se a incorporação da reserva nutritiva através do interior do tubo central, a incorporação dos microrganismos e do respectivo meio de fixação, através da zona anelar definida pela parte externa do tubo central e pela parte interna do tubo intermédio e fazendo-se a incorporação da camada externa através da zona anelar definida pela parte externa do tubo intermédio e pela parte interna do tubo externo.
24 - Processo conforme a reivindicação anterior, caracterizado pela reticulação do produto dispensado pelo sistema de tubos ser feita pela passagem do mesmo por uma solução de um agente de reticulação.
25 - Processo conforme a reivindicação anterior caracterizado por o polímero susceptivel de se transformar em gel ser de natureza idêntica nas três camadas do produto e por, quando este for um alginato de sódio o agente de reticulação ser cloreto de cálcio, fazendo-se a reticulação do dito produto exclusivamente do exterior para o interior.
26 - Processo conforme qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado por o produto dispensado pelo dispositivo de tubos concêntricos ser cortado por um dispositivo vibratório, formando-se esferas.
27 - Processo conforme qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado por o produto ser seguidamente parcialmente desidratado, até uma actividade da água final de 0,1 a 0,5, de preferência de 0,3 a 0,4, nomeadamente por uma técnica de liofilização, de leito fluidizado ou utilização de estufa.
28 - Produto conforme a reivindicação 22, produzido segundo o processo da reivindicação 26, caracterizado por possuir forma esférica e três camadas.
29 - Produto conforme a reivindicação anterior caracterizado por o diâmetro externo das esferas húmidas estar compreendido entre 1mm e 5mm.
30 - Utilização caracterizada pelo emprego do produto de qualquer das reivindicações 21 a 22 ou 28 a 29, para fermentação de bebidas em garrafa.
31 - Utilização caracterizada pelo emprego do produto de qualquer das reivindicações 21 a 22 ou 28 a 29, para retoma de fermentação de vinhos amuados.