PL95416B1 - Sposob otrzymywania produktow degradacji edei - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia produktów degradacji czasteczek edein A, B, D i F lufo :ich miesznniny przez ffo^zczepiteinie wiazania amidowego miedzy kwasem 2,3-dwuami- nopropionowym i kwasem 2,6-dwuamino-7-hydro- ksyazelainowym.Edeiny A, B, D i F sa amidami pieciopeptydów wytwarzanymi przez szczep Baicillus brevis Vm4.Ich kompleks wytwarzany na drodze biosyntezy stanowi mieszanine edein A, B, D i F czesciowo rózniacych sie skladem aminokwasowyim. Miano¬ wicie aminokwasem N-koncowym jest w nich ^-tyrozyna lub izofenyloalanina, a nastepnymi aminokwasami w lancuchu peptydowym: izose- ryna, kwas dwuaminopropionowy, dwuaminohydro- ksyazeiiainowy oraz glicyna zwiazana amidowo z resizte sperimidyny lub guanyilcisperimidyny.Dotychczas znany jest jedynie sposób otrzymy¬ wania produktów degradacji edeiny A przy za¬ stosowaniu karboksypepltydazy B i nastepnie izo¬ lacji produktów przy pomocy elektroforezy, na¬ tomiast nie jest znany sposób otrzymywania pro¬ duktów degradacji pozostalych odein lufo ich mie¬ szaniny. Wyniki badan swiatowych, prowadzonych nad wrazliwoscia róznych substratów na dzialanie kiarboksypejptydazy B wskazuja, ze rozszczepia ona Wiazanie peptydowe utworzone z aminokwasów o konfiguracji S (ot).Niedogodnoscia opisanego- sposobu otrzymywa¬ lo 2 nia produktów degradacji jest koniecznosc sto¬ sowania drogich substancji wyjsciowych w posta¬ ci karfooksypeptydazy B i jednorodnej edeiny A, co czyni proces nieekonomicznym, a ponadto spo¬ sób wyodrebnienia produktów przy pomocy ele¬ ktroforezy uniemozliwia stosowanie go na skale przemyslowa.Sposób otrzymywania produktów degradacji we¬ dlug wymalaizku polega -na tym, ze jednorodne edeiny A, B, D i F lub ich mieszanie oraz pre¬ parat wstepnie oczyszczonej lipazy, wzglednie pan- kreatyny zawiesza sie w buforze o pH 7^5 do 8,5 lub w roztworze kwasnego weglanu amonowego, a otrzymane peptydy rozdziela sie znanymi sposo¬ bami. Uzyskane peptydy rozdziela sie przez chro¬ matografie joiniowyimienna i/lub filtraicje moleku¬ larna, przez chromatografie podzialowa na zelu kinze-mowym i/lub filtracje mlolekiuliarna oraz przez ehroimatogriaffie adscirbcyjna na tlenku glinu ii/lub filtraicje molekularna. W tein sposób z edeiny A otrzymuje sie kwas N3-(/?-tyryzyloizoserylo-2,3- -dwuaminopropionowy H(2,6-dwuamino-'7-hydroksy-9-azelainylo-gliicylo-:3^ aminopriOpyio)-l,4,dwuaiminotautan (Daha-Gly-Sper); z edeiny B-i(/?-Tyr-Iser-Dpr) oraz N-!(i2,6-dwuaimino- -l7-hydroksy-9-lazelainylo-glicylo-3-aminopropylo)- -N-guianylo-l^-dwuaminobutan) (Daha-Gly-Gsper); z edeiny D kwas N3-i(/?-fenyllo-/?-aIanyfloizoserylo) 2,3-ioWuamino|prqpionowy (Iphe-Iser-Dpr) oraz (Da- 95 416¦'*v** ha-Giy-Gsper); z edeiny F (Iphe-Iser-Dpr) oraz (Daha-Gly-Sper); zas z kompleksu: (^-Tyr-Iser, Dpr), ha-Gly-Gsper).Stwierdzono równiez, ze karboksypeptydaza B rozszczepia pozostale elementy B, D i F. Jak wy¬ kazaly przeprowadzone badania w tworzeniu wia¬ zania peptydowego, ulegajacego rozszczepieniu en¬ zymem, uczestniczy grupa aminowa zwiazana z weglem 2 o konfiguracji R (D) kwasu 2,6-dwuami- no-7-hydroksyazelainowego, który Jest C-konco- wym aminokwasem edein. Z tego wynika, ze edei- na A nie jest substratem dla karboksypeptydazy B. Trawienie enzymem edein A, B, D i F zacho¬ dzi wiec w sposób niespecyficzny i niekoniecznie musi w nim uczestniczyc karboksypeptydaza B, a np. nie zdefiniowane enzymy ja zanieczyszczaja¬ ce, co Jest efektem nieoczekiwanym.Prowadzone badania udowodnily, ze degradacje edein mozna prowadzic enzymami wstepnie oczy¬ szczonej lipazy badz pankreatyny, przy czym w procesie tym biora równiez udzial nie zdefiniowa¬ ne dotad enzymy zanieczyszczajace.Zalety sposobu wedlug wynalazku polegaja na mozliwosci uzyskania peptydów, które sa substra- tami w otrzymywaniu analogów naturalnych odein o równie szerokim spektrum dzialania przediiw- drobnoustrojowego i zmniejszonej toksycznosci, bo¬ wiem edeiny naturalne charakteryzujace sie wy¬ soka aktywnoscia przeciwdrobnoustrojowa, ze wizgledu na duza toksycznosc nie moga byc stoso¬ wane jako leki.Ponadto proponowane rozwiazanie umozliwia otrzymanie w prosty i tani sposób w sikali prze¬ myslowej produktów degradacji edein A, B, D i F w postaci trójpeptydów i amidów diwupeptydów, zbudowanych z aminokwasów niebialkiawyoh i pa- Mamdm, eliminuje stosowanie drogich soibstnatów i pozwala na otrzymanie prosta technologia oczy¬ szczonych produktów z dobrymi wydajira&ciaml Sposób otrzymywania produktów degradacji ede¬ in wedlug wynalazku ilustruja podane nizej przy¬ klady. x Przyklad I. 13 g kompleksu edein w postaci siar¬ czanu i 5,353 g preparatu lipazy zawiesza sie w 464 ml 0,1 ml kwasnego weglanu 'amonowego i in¬ kubuje w 25°C przez 14 dni.Nastepnie mieszanine reakcyjna odsacza sie od zawiesiny bialka i uzyskany klarowny roztwór odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, w tem¬ peraturze ponizej 35°C do objetosci 40 ml, po czym poddaje sie procesowi wstepnego rozdzialu przy pomocy filtracji molekularnej na kolumnie Seplha- dex-6-10.Otrzymuje sie I frakcje, zawierajaca N-{2^6-dwu- axnino-7-hydroksy-9-azelainylo-glicylo-3-amino- -propylo)-l,4-dwuaminobutan oraz N-(2,6Hdwuami- no-7-hydroksy-9-azelainyiliOHgiicylo^^aimmopropy- lo)-N'-guanylo-l,4-dwuaminobutan i II frakcje za¬ wierajaca kwas N8-(^-tyrozylo-izQserylo)-a^- -aminopropionowy oraz kwas N8-{£-fenylo-/?-ala- nyloizoserylo)^2,3-dwuamiiK)propionowy.Frakcje I zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem. §5416 40 45 50 55 00 do dbpetósci 50 ml i przy silnym mieszaniu wkrad¬ la do 1 1 metanolu. .-.*#¦' Wytracony z roztworu osad odwirowuje sie, przemywa acetonem i dwukrotnie suchym ete¬ rem, a nastepnie suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem. W ten sposób otrzymuje sie 6,17 g suro¬ wej mieszaniny peptydów Daha-Gly-Sper i Da- ha-Gly-Gsper. 200 mg tak otrzymanego proszku oczyszcza sie od substancji barwnych i zasadciwyeh przy pomocy filtracji molekularnej na Sephadex LH-20 w ukladzie woda-metanol 1:1, Roztwór peptydów wyeluowanych z kolumny za¬ teza sie do 4 ml i wkrapla do 100 ml schlodzo- _nego metanolu. Otrzymana zawiesine wiruje sie, a osad przemywa acetonem i dwukrotnie suchym eterem. W ten sposób otrzymuje sie 120 mg mie¬ szaniny peptydów Daha-Gly-Sper i Daha-Gly- -Gsper. Frakcje II, uzyskana z rozdzialu na Se- phadex G-10 zateza sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem, w temperaturze ponizej 35°C do obje¬ tosci 100 ml, a nastepnie rozdziela na kationicie karboksylowym w formie NH+4 i eluuje naj¬ pierw woda, a potem 0,2 N roztworem aniliny do zaniku substancji ninhydrynododatnich.Otrzymany roztwór odparowuje sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem w temperaturze 35°C do su¬ cha i (pozostalosc rozpuszcza sie w 25 ml wody, zas roztwór wodny wkrapla do 25 ml metanolu, a otrzymana zawiesine wkrapla z kolei do 700 ml acetonu. Uzyskany osad odwirowuje sie i prze¬ mywa kolejno acetonem, eterem i suszy nad pie¬ ciotlenkiem fosforu, otrzymujac 2,5 g mieszaniny peptydów ^-Tyr-Iser-Dpr oraz Iphe^Iser-Dpr.Przyklad II. 0,5 g suszonego proszku pan¬ kreatyny, uzyskanego przez odtluszczenie i od- wtodiBenie trzuski przy pomocy acetonu i etoru, zawiesza sie w 20 ml 0,2 N kwasnego weglanu amonowego i miesza przez pól godziny, sl na¬ stepnie uzyskana zawiesine dodaje sie do roz¬ tworu 1 g kompleksu edein, rozpuszczonego w 18 ml 0,1 N kwasnego weglanu amonowego i utrzymuje w temperaturze 25°C przez 14 dni przy ciaglym mieszaniu.Izolacje otrzymanych produktów przeprowadza sie analogicznie, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 0,178 g mieszaniny ^-Tyr-Iser^Dpr i Ipha- -Iser-Dpr oraz 0,216 g mieszaniny Daha-Gly-Sper i Daha-Gly-Gsper.Przyklad III. 100 mg edeiny D w postaci siarczanu i 40 mg preparatu lipazy zawiesza sie w 3,6 ml 0,1 N kwasnego weglanu amonowego i inkubuje w 25°C przez 14 dni.Nastepnie mieszanine reakcyjna przesacza sie, przesacz odparowuje pod zmniejszonym cisnie¬ niem, w temperaturze ponizej 35°C do 1 ml, po czyim rozdziela sie przy pomocy filtracji moleku¬ larnej na kolumnie wypelnionej Sephadex LH-20, otrzymujac 30 mg peptydu Daha-Gly-Sper oraz mg peptydu Iphe-Iser-Dpr.Przyklad IV. 200 mg edeiny A w postaci siarczanu i 80 mg preparatu lipazy zawiesza sie w 72 ml 0,2 N roztworze octanu N-metylomorfo- liny o pH = 8,5 i inkubuje w 25°C przez 14 dni, a nastepnie izoluje otrzymane produkty, jak w65416 przykladzie III, otrzymujac 54 mg peptydu Daha- -Gly^-Sper oraz 30 mg peptydu /?-Tyr-Iser-Dpr.Przyklad V. 0,5 g edeiny D w postaci siar¬ czanu i 0,2 g preparatu lipazy zawiesza sie w 18 ml 0'1 N Uriwasnego weglanu amonowego i in- kubuje w 25°C przez 14 dni, a nastepnie izoluje otrzymane produkty, jak w przykladzie II, otrzy¬ mujac 160 mg peptydu Daha-Gly-Gsper i 91 mg peptydu ^-Tyr-Iser-Dpr.Przyklad VI. 50 g edeiny F w postaci siar¬ czanu i 20 mag preparatu lipazy zawiesza sie w 1,8 ml 0,025 N buforu TRIS o pH = 7,6,5 zawie¬ rajacego dodatkowo 0,1 N Nad i inkubuje w 25°C przez 14 dni, a nastepnie izoluje otrzymane pro¬ dukty, jak w przykladzie III, otrzymujac 12 mg Daha-Gly-Sper i 9 mg Iphe-Iser-Dpr.Przyklad VII. 2 g mieszaniny zawierajacej Daha-Gly-Sper i Daha-Gly-Gsper oraz zanieczy¬ szczenia peptydowe o charakterze zasadowym pod¬ daje sie rozdzialowi na celulozie anionowymien- nej w formie OH—, Jako roztwór eluujacy sto¬ suje sie wode.Uzyskane w wyniku rozdzialu wodne zasady poszczególnych peptydów zobojetnia sie prz^ po¬ mocy rozcienczonego kwasu siarkowego otrzymu¬ jac odpowiednie siarczany. Tak otrzymane roztwo¬ ry zateza sie do niewielkiej objetosci pod zmniej¬ szonymi cisnieniem i wkrapla sie do schlodzone¬ go metanolu.Dalszy ciag postepowania z wytraconym osadem Jest analogiczny do sposobu opisanego w przykla¬ dzie I. Otrzymuje sie odpowiednie siarczany w nastepujacych ilosciach: 1. siarczan Daha-Gly-Sper 1,05 g 2. siarczan Daha-Gly-Gsper 0,16 g 3. sialrczany zasadowych peptydów ^ 0,43 g Przyklad VIII. 1 g mieszaniny zawierajacej siarczany Tyr-Iser-Dpr i Ipher-Iser-Dpr zanieczy¬ szczone aminokwasami i peptydaimi oraz szereg aminokwasów i peptydów o charakterze obojet¬ nym i zasadowym poddaje sie rozdzialowi na kationicie* karboksylowym w formie amonowej.Jako eluent stosuje sie kolejno: wode i wodny roztwór amoniaku o stezeniach 0,020%, 0,027°/o, 0,81*/o, 0,189%. Wolna zasade peptydu Iphe-lsef- Dpr wykonuje sie roztworem amoniaku o steze¬ niu 0,17%, zas wolna zasade peptydu ^-Tyr-Iser- Dpr otrzymuje sie stosujac 0,081% roztwór amo¬ niaku. Tak uzyskane roztwory zageszcza sie przez odparowanie pod zmniejszonym cisnieniem do ob- jetnosici 3 ml Ipiha-Iser-Dpr i 5 ml ^-Tyr-Ilser-Dpr.Zatezone roztwory wodne wkrapla sie odpo¬ wiednio do 4 ml i 6 ml metanolu, a otrzymane zawiesiny z kolei wkrapla sie do 100 ml i 120 ml acetonu. Dalszy ciag postepowania z wytracony¬ mi osadami jest analogiczny do sposobu opisane¬ go w przykladzie I. Uzyskuje sie 408 mg wolnego peptydu ^-Tyr-Iser-Dproraz 80 mg wolnego pep- tydu Iphe-Iser-Dpr.Przebieg reakcji enzymatycznych oraz procesy rozdzialu na kolumnach byly kontrolowane przy pomocy elektroforezy wysokonapieciowej w bu¬ forze pirydynowo^octanowym o pH 6,4. ^ Identyfikacje uzyskanych produktów przeprowa- wadzano poprzez okreslenie ich skladu aminokwa- sowego. 40 45 PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe ii. Sposób totrzymywanda produtków degradacji ededn, znamienny tym, ze jednorodne edeiny A, B, 1. D i F lub ich mieszanine oraz pnejptaralt wstepnie laczyszczonej lipazy, wzglednie pankreatyray zawie¬ sza sie w1 buforze o pH 7,5 do 8,5 lub w tfOBttwo- irze kwasnego weglanu amonowego, a uzyskane peptydy rozdziela sie znanymi sposobami
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze uzyskane peptydy rozdziela sie przez chromato¬ grafie jonowymienna i/lub filtracje molekularna*
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze uzyskane peptydy rozdziela sie przez chromato¬ grafie .na zelu krzemowym i/lub filitraoje mole¬ kularna.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze uzyskane peptydy rozdziela sie przez chromato¬ grafie adisorbcyjna na tlenku glinu i/lub ifliltua- cje molekularna. PL