Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania dezacetoksycefalosporyny C (kwas 3-metylo-7-/5-amino- adypoilo/-cefemo-3-karboksylowy) o wzorze 1 oraz jej soli- Zwiazek ten jest znany [Stedman i inni, J. Med. Chem., 7(1964), 117-119 i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3124576]. Otrzymano go przez kataWtyczne uwodornianie cefalosporyny C i nie charakteryzujac bezposrednio przeprowadzono w pochodne. Równiez pochodne zwiazku o wzorze 1, na przy¬ klad kwas 3-metylo-7-/fenoksyacetylo/-cefemo-3-karboksylowy-4, otrzymuje sie przez katalityczne uwodornia¬ nie pod wysokim cisnieniem odpowiedniego zwiazku 3-acetoksymetylowego (Morin i inni, J.Am.Chem.Soc. 85(1963), 1896-97). Inna droga wytwarzania takich pochodnych polega na przegrupowaniu sulfotlenkowym odpowiednich penicylin (Morin i inni, L.c).Zwiazek o wzorze 1 ma duze znaczenie praktyczne, mniej ze wzgledu na stosunkowo slabe dzialanie antybiotyczne, lecz ze wzgledu na stosowanie go jako materialu wyjsciowego do wytwarzania wartosciowych pochodnych o wzorze ogólnym 2, w którym R oznacza grupe acylowa inna niz grupa aminoadypoilowa, zwlaszcza grupe acylowa, wystepujaca w acylowych pochodnych kwasu 6-aminopenicylanowego i kwasu 7-aminocefalosporanowego o zastosowaniu leczniczym (Sassiver i inni, Adv. Appl. Microbiol. 13 (1970), 163-235). W celu wytworzenia takich pochodnych acylowych odszczepia sie najpierw od zwiazku o wzorze 1 grupe 5-aminoadypoilowa, na przyklad sposobem wedlug francuskiego opisu patentowego nr 1394820 lub belgijskiego opisu patentowego nr 720185, przy czym otrzymuje sie zwiazek o wzorze ogólnym 2, w którym R oznacza atom wodoru. Zwiazek ten mozna nastepnie acylowac w dowolny sposób.Sposób wedlug wynalazku umozliwia otrzymanie zwiazku o wzorze 1 metoda fermentacji. Stwierdzono, ze mikroorganizm, produkujacy cefalosporyne C, mozna poddac takiej mutacji, ze produkuje dezacetoksycefalospo- ryne C.2 94 449 Biosynteza cefalosporyny C w mikroorganizmach nie jest dotychczas w pelni wyjasniona. Jako produkt uboczny przy produkcji cefalosporyny C znana byla dezacetylocefalosporyna C, lecz nie dezacetoksycefalospory- na C. Jest wiec zupelnie nieoczekiwane, ze udalo sie wytworzyc mutanta, produkujacego dezacetoksycefalospo- ryne C. Wykrycie mutantów pozwala wnioskowac, ze dezacetoksycefalosporyna C stanowi produkt przejsciowy w biosyntezie cefalosporyny C przez mikroorganizmy, tworzace cefalosporyne C i ze w przypadku mutantów zablokowane sa te etapy reakcji, które przeprowadzaja dezacetoksycefalosporyne C w cefalosporyne C, wzgled¬ nie w dezacetylocefalosporyne C.Poniewaz reakcje biosyntetyczne zachodza przy wspóludziale enzymów, mozna sadzic, ze w przypadku nowego mutanta jeden lub kilka enzymów, bioracych udzial w biosyntezie cefalosporyny C z dezacetoksycefalo- sporyny C, nie wystepuje wcale albo sa zablokowane calkowicie lub czesciowo. Oznacza to, ze jeden lub kilka enzymów nie moze wcale albo nie moze w pelni spelniac swojej funkcji katalizowania przemiany dezacetoksyce- falosporyny C w cefalosporyne C (jako produkt koncowy). W pierwszym przypadku wytworzenie cefalospory¬ ny C nie nastepuje w ogóle, w drugim przypadku obok dezacetoksycefalosporyny C moglaby powstac mniejsza lub wieksza ilosc cefalosporyny C lub dezacetylocefalosporyny C. Za pogladem, ze nowy mutanty wykazuja defekt wzgledem jednego lub kilku enzymów, bioracych udzial w przeprowadzaniu dezacetoksycefalosporyny C w cefalosporyne w mikroorganizmie, przemawia fakt, ze z mikroorganizmów, produkujacych cefalosporyne C, wzglednie w ich bezkomórkowych ekstraktach mozna wykryc enzym, który w obecnosci tlenu i kofaktora (donator H: NADH, NADPH) przeprowadza dezacetoksycefalosporyne C w dezacetylocefalosporyne C. Enzym ten (C-hydroksylaza dezacetoksycefalosporynowa), nalezacy prawdopodobnie do grupy oksydoreduktaz, stanowi rozpuszczalna proteine o optimum pH=6,5 i denaturuje sie na goraco (5 minut w temperaturze 100°C).W nowym mutancie, wzglednie w jego bezkomórkowych ekstraktach nie mozna bylo wykryc tej hydroksylazy.Z tego mozna wnioskowac, ze wskutek braku hydroksylazy w nowych mutantach biosynteza cefalosporyny C ulega przerwaniu na etapie dezacetoksycefalosporyny C. Nowe mutanty, które mozna okreslic jako mutanty z defektem C-hydroksylazy dezacetoksycefalosporynowej (hydroxylaza-defectiva or leaky mutants) nie zostaly dotychczas znalezione w przyrodzie.Sposób wytwarzania dezacetoksycefalosporyny C polega wedlug wynalazku na tym, ze mutant z defektem C-hydroksylazy dezacetoksycefalosporynowej, otrzymywany na drodze napromieniowania Cephalosporium acremonium ATCC 14533 swiatlem nadfioletowym, hoduje sie w znany sposób, a dezacetoksycefalosporyne C wyodrebnia sie z brzeczki fermentacyjnej metodami znanymi dla uzyskiwania cefalosporyny C Mikroorganizmy, produkujace cefalosporyne C, poddawane mutagenezie, sa znane.Nowe mutanty wytwarza sie metodami znanymi dla uzyskiwania mutantów, przez dzialanie promieniowania, powodujacego mutacje albo czynników chemicznych na postacie wzrostowe szczepu grzyba, takie jak zwlaszcza konidia, nastepnie artrospory, wegetatywne grzybnie lub ewentualnie askospory.Do spowodowania mutacji mozna stosowac promieniowanie radioaktywne, takie jak promienie a, j? lub 7' albo neutrony, nastepnie promienie nadfioletowe. Znanymi chemicznymi mutagenami sa na przyklad czynniki alkilujace, zwlaszcza nizsze czynniki alkilujace, takie jak siarczan dwuetylowy, metanosulfonian etylu, etanosul- fonian etylu, albo analogi zasad nukleotydowych, takie jak 5-bromouracyl lub 2- aminopuryna, albo zwiazki, zmieniajace chemicznie zasady nukleotydowe, takie jak hydroksylamina, kwas azotowy lub 1-metylo-3-nitro-ni- trozoguanidyna, albo zwiazki, powodujace usuniecie lub dodatkowe wprowadzenie jednej lub kilku zasad nukleotydowych, na przyklad akrydyny, takie jak proflawina. Promieniami lub chemicznymi czynnikami, powodujacymi mutacje, dziala sie np. na konidia szczepu grzyba. Czas oddzialywania odmierza sie tak, aby liczba mutantów byla mozliwie duza, przy takim czasie oddzialywania wiekszosc konidiów (okolo 90—99%) obumiera, porównaj na przyklad opis patentowy ogloszeniowy RFN nr 2101345 (case 4—6940/E), fig. 1.Mutagenna obróbke prowadzi sie korzystnie tak, aby stopien przezycia wynosil okolo 1%.Doswiadczalnie stwierdzono, ze stosunek liczby konidiów, przetrzymujacych mutagenna obróbke do liczby otrzymanych mutantów, produkujacych dezacetoksycefalosporyne C, jest niezaleznie od metody traktowania staly i powtarzalny w granicach statystycznych. Jednego mutanta, produkujacego dezacetoksycefalosporyne C, przecietnie znajduje sie wsród 5000-10000 konidiów, przetrzymujacych obróbke mutagenna.Obróbke mutagenna mozna prowadzic na przyklad w sposób nastepujacy: Zawieszone w buforze fosforanowym M/15 o wartosci pH=7 konidia w ilosci 2,5 * 104/ml rozprowadza sie równomiernie na powierzchni stalej pozywki agarowej, zawierajacej wszystkie potrzebne substancje odzywcze, na przyklad na tak zwanej kompleksowej pozywce pelnej 1H (10 g glukozy, 4g ekstraktu drozdzowego, 4g D,L-metioniny, 25 g agaru, wody do 1000 ml, sterylizacja wciagu 20 minut w temperaturze 120° i pod cisnieniem 1,2 atm, wartosc pH po sterylizacji 7,0); na 1 plytke agarowa zuzywa sie 0,1 ml. W ten sposób na powierzchni agaru znajduje sie 2,5 * 103 zywych konidiów. Plytki agarowe poddaje sie teraz w ciagu 14 sekund dzialaniu promieni nadfioletowych z lampy sterylizacyjnej TUV Philipsa o maksymalnej intensywnosci promie-94 449 3 niowania przy dlugosci fali 2537 A, przy czym na powierzchnie dochodzi 10000 erg/sek/cm2. Promieniowanie mozna mierzyc za pomoca precyzyjnego przyrzadu pomiarowego UV i tak dawkowac, aby uzyskac pozadana liczbe konidiów, które przezyly, na przyklad 1% (30 ± 5).Zadane mutanty wyodrebnia sie sposród konidiów, poddanych mutagennej obróbce w ten sposób, ze plytki agarowe inkubuje sie, na przyklad wciagu 7 dni w temperaturze 25°C, i bada oddzielne kolonie, w powyzszym przypadku 25—35 kolonii o srednicy okolo 8 mm, czy wytwarzaja dezacetoksycefalosporyne C wzglednie, czy zawieraja enzym-hydroksylaze, odpowiedzialny za przeprowadzanie dezacetoksycefalosporyny C wdezacetylocefalosporyne C. Badan tych, jak zwykle, nie prowadzi sie w poszczególnych koloniach jako takich, lecz generacyjnych pochodnych, które uzyskuje sie przez hodowanie poszczególnych kolonii w pozywce cieklej, na przyklad we wstrzasanych kolbach wciagu 3—7 dni w temperaturze 23°C. Mozna badac albo przesacz hodowli, aby stwierdzic, czy obecna jest w nim dezacetoksycefalosporyna C, wzglednie czy nie ma tam lub jest tylko w niewielkiej ilosci cefalosporyna C, albo mozna badac grzybnie, aby stwierdzic, czy znajduje sie tam wspomniana hydroksylaza.Ze wzgledu na to, ze —jak juz wyzej wspomniano — przecietnie wsród 5000—10000 kolonii, otrzymanych z konidiów, które przezyly obróbke mutagenna, znajduje sie tylko jedna kolonie, produkujaca dezacetoksycefa¬ losporyne C, wazne jest z punktu widzenia technicznego dysponowanie wstepnym sposobem selekcyjnym, którym mozna by wydzielic kolonie, tworzace cefalosporyne C. Nadaje sie tu zwlaszcza mikrobiologiczny - plytkowy test dyfuzyjny z mikroorganizmami, wrazliwymi na cefalosporyne C, lecz nie wrazliwymi w takim samym stopniu na dezacetoksycefalosporyne C, na przyklad test z Alcaligenesfeacalis, Sarcina lutea lub Neisseria catarrhalis. W stosunku do tych szczepów dezacetoksycefalosporyna C wykazuje tylko bardzo slaba aktywnosc, a wiec stanowi maly srodek hamujacy, podczas gdy cefalosporyna C jest silnie aktywna i odpowiednio tworzy duzy osrodek hamujacy. Z dalszego badania na obecnosc dezacetoksycefalosporyny C w przesaczu hodowlanym mozna wiec wykluczyc te przesacze, które wykazuja duzy osrodek hamujacy w stosunku do wskazanych mikroorganizmów testowych. Przecietnie mozna w ten sposób wykluczyc z dalszego badania 95% hodowli.W mniej aktywnych, w stosunku do wskazanych mikroorganizmów, brzeczkach fermentacyjnych mozna prowa¬ dzic badania na obecnosc dezacetoksycefalosporyny C na przyklad droga biologiczna, biochemiczna i za pomoca chromatografii cienkowarstwowej.Badanie biologiczne prowadzi sie na przyklad tak, ze z kilku, na przyklad 5—10 przesaczy hodowlanych i ilosci standardowej autentycznej dezacetoksycefalosporyny C sporzadza sie bioautogram ze wskazanymi mikroorganizmami, na przyklad z Alcaligenes fsacalis. W tym celu chromatografuje sie przesacze hodowlane i standartowa dezacetoksycefalosporyne C na bibule w jednym z omówionych w tablicy 1 ukladów rozpuszczal¬ ników, stosujac czas rozwijania okolo 8—10 godzin, po czym kladzie sie bibule na plytke agarowa z odpowiednim mikroorganizmem. Po uplywie 30 minut utrzymywania w temperaturze 4° bibule usuwa sie, a plytke agarowa inkubuje wciagu okolo 12—20 godzin w temperaturze 37°C. Dezacetoksycefalosporyna C wykazuje osrodek hamowania na miejscu wartosci Rf (patrz tablica 1). Mozna z tego odczytac, które przesacze hodowlane zawieraja dezacetoksycefalosporyne C i z wielkosci osrodka hamowania wnioskowac o ilosci dezace¬ toksycefalosporyny C. W ten sposób mozna równiez sprawdzic, czy badany mutant produkuje wylacznie dezacetoksycefalosporyne C lub czy obok produkuje tez cefalosporyne C, dezacetoksycefalosporyne C albo inna mikrobiologicznie czynna substancje.Badanie biochemiczne na obecnosc hydroksylazy dezacetoksycefalosporyny C mozna prowadzic na przyklad w ten sposób, ze w grzybni mutowanego szczepy wzglednie w otrzymanych z niej bezkomórkowych ekstraktach prowadzi sie badania na obecnosc lub nieobecnosc wymienionej hydroksylazy. Grzybnie uzyskuje sie na przyklad wten sposób, ze badany szczep (z jednej kolonii wyzej wspomnianych plytek agarowych) w syntetycznej pozywce cieklej (tak zwana syntetyczna pozywka podstawowa C3, patrz nizej), do której dodano 4g D,L-metioniny, inkubuje sie na przyklad wciagu 96 godzin w temperaturze 23°C i oddziela, na przyklad przez odwirowanie, (W tym przypadku stosuje sie korzystnie pozywke syntetyczna, aby wykluczyc obecnosc innych nieznanych lub podobnych enzymów, pochodzacych ze skladników pozywki, na przyklad z maczki z orzeszków ziemnych).W celu uzyskania bezkomórkowego ekstraktu grzybnie przemywa sie dwukrotnie buforem fosforanowym M/15 o wartosci pH=7,0, po czym komórki rozpuszcza sie za pomoca prasy X (np. firmy AB Biox, NACKA 2, Szwecja) w analogiczny sposób, jak opisano na przyklad dla oksydazy D-sminokwasów przez Benza i innych w Eur.J. Biochem. 20 (1971) 82. Tak uzyskany bezkomórkowy surowy ekstrakt w buforze fosforanowym M/15 o wartosci pH=7 bada sie na jego zdolnosc do przeprowadzania dezacetoksycefalosporyny C w obecnosci tlenu wdezacetylocefalosporyne C, na przyklad przez poddawanie go reakcji z dezacetoksycefalosporynaC wciagu 4 godzin w temperaturze 23°C, stosujac wstrzasanie. Jezeli hydroksylaza jest obecna, to tworzy sie dezacetyloce- falosporyna C. Te przeprowadza sie za pomoca dalszego enzymu (C-O-acetylo-transferaza dezacetylocefalospory-4 94 449 nowa) i acetylo-1-C14-koenzymu A w cefalosporyne C.Jezeli hydroksylaza nie jest obecna, to nie tworzy sie dezacetylocefalosporyna C, a wiec takze nie tworzy sie (radioaktywna) cefalosporyna C. Dezacetoksycefalosporyna C gromadzi sie podczas hodowania szczepu grzyba i mozna ja nastepnie wykryc w przesaczu hodowlanym. Syntetyczna pozywka podstawowa C3: (NH4)2S04 2,5 g KN03 5,0 g MgS047H20 0,2 g KH2P04 0,2 g CaC03 5,0 g roztwór pierwiastków sladowych s.o. 10 ml maltoza 40,0 g oleinianmetylu 7,0 g mezo-inozyt 2,0 g H2 Odestylowana ad 1000 ml pH przedsterylizacja 7,3 g pH posterylizacji 7,0 ± 0,2 Sterylizacja: w autoklawie, w ciagu 20 minut, w temperaturze 120°C, cisnienie 1,2 atn.Badanie droga chromatografii cienkowarstwowej na obecnosc dezacetoksycefalosporyny C mozna prowa¬ dzic we wstepnie oczyszczonym roztworze fermentacyjnym badanego szczepu (z jednej kolonii; wyzej omówio¬ nych plytek agarowych). Fermentacje szczepu i wstepne oczyszczanie brzeczki fermentacyjnej korzystnie prowadzi sie w sposób znany dla uzyskania cefalosporyny C. Szczep fermentuje sie na przyklad w kompleksowej pozywce pelnej w ciagu 144 godzin i brzeczke fermentacyjna wstepnie oczyszcza w sposób, opisany w belgijskim opisie patentowym nr 750292 (Case 4—6770;, na przyklad przez zakwaszenie, saczenie, ekstrakcje, adsorpcje na zywicach niejonowych o rozwinietej powierzchni, ewentualnie absorpcje na slabo zasadowych wymieniaczach, eluowanie i liofilizacje. Tak otrzymany liofilizat bada sie droga chromatografii cienkowarstwowej. W tablicy 1 podaje sie wartosci Rf na celulozie w 9 róznych ukladach rozpuszczalników. Ponadto tablica ta zawiera odpowiednie wartosci Rf dla cefalosporyny C, dezacetylocefalosporyny C i laktonu dezacetylocefalosporyny C.Jako rozpuszczalniki stosuje sie: A: izopropanol — kwas mrówkowy — woda (77:4:19) B:n-butanol-aceton-dwuetyloamina-woda (37::37:8:18) C: n-butanol-kwas octowy-pirydyna-woda (37,5:7,5:5:25:30) D: n-butanol-etanol-woda-lodowaty kwas octowy (50:15:20:15) E: 66% wodny roztwór acetonitrylu F: 80% wodny roztwór fenolu G: n-butanol-kwas mrówkowy-woda (4:1:1) H: n-butanol-kwas octowy lodowaty-woda (faza górna) (11 3:7) I: 70% wodny roztwór n-propanolu Ta bI i ca I Wartosci Rf w ukladzie rozpuszczalników Zwiazek A B C D E F G H I Dezacetoksycefalosporyna C Dezacetylocefalosporyna C Lakton dezacetylocefalosporyny C Cefalosporyna C 0,21 0,16 0,20 0,25 0,18 0,00 0,00 0,00 0,20 0,17 0,37 0,27 0,33 0,14 0,17 0,22 0,27 0,25 0,45 0,38 0,62 0,52 0,9 0,72 0,33 0,25 - 0,29 0,49 0,36 0,47 0,44 0,22 0,16 - 0,33 Dezacetoksycefalosporyna C, uzyskana droga fermentacji wykazuje te same wartosci Rf, co zwiazek otrzymany syntetycznie. Jak wykazuje tablica 1, dezacetoksycefalosporyne C mozna w razie potrzeby oddzielic od pozostalych zwiazków na drodze chromatografii cienkowarstwowej.94 449 5 Do oddzielania nadaje sie równiez analizator aminokwasów [(AA) (Technicon TSM 1 firmy Technicon Corp., Tarryton, N.Y., St. Zjedn. Am.)]. W tablicy 2 podane sa okresy retencji wyzej wymienionych zwiazków (próbki 20 fd\ 5 milimolarnego roztworu zwiazku w0,2m buforze cytrynianu sodowego o wartosci pH=2).Ponadto dezacetoksycefalosporyne C mozna wykryc i oddzielic od pozostalych zwiazków metoda wysokocisnie¬ niowej chromatografii cieczowej [(HPLC) (porównaj J. Konecny i inni, J. Antibiotics 26, 135 1973)]. W tabli¬ cy 2, zewnetrzna kolumna prawa, podane sa odpowiednie okresy retencji w minutach.Tablica 2 Okres retencji w min.Zwiazek AA HPLC DezacetoksycefalosporynaC 59 11,0 DezacetylocefalosporynaC 93 10,0 Lakton dezacetylocefalosporynyC 93 5,5 CefalosporynaC 54 12,4 Fermentacje mutanta w sposobie wedlug wynalazku i wyodrebnienie dezacetoksycefalosporyny C z brzeczki fermentacyjnej prowadzi sie metodami znanymi dla uzyskiwania antybiotyków. Ze wzgledu na to, ze dezacetoksycefalosporyna C wykazuje bardzo podobne wlasciwosci chemiczno-fizyczne do cefalosporyny C, mozna tu stosowac wszystkie znane sposoby uzyskiwania cefalosporyny C z cieczy fermentacyjnej.Dezacetoksycefalosporyne C mozna wiec uzyskiwac z brzeczki fermentacyjnej na przyklad sposobem wedlug brytyjskich opisów patentowych nr nr 810196, 938758, 968324, 1036125, 1109362, 1205226, (Ca$e 4-6067), francuskich opisów patentowych nr 1429873 lub nr 2011520 (Case 4-6485), belgijskiego opisu patentowego nr 750292 (Case 4-6770) lub opisów ogloszeniowych RFN nr nr 2101345 (Case 4-6840), 1933187, 2031754 lub 1939341.Grzyb hoduje sie aerobowo, korzystnie podpowierzchniowo, wstrzacajac i mieszajac, doprowadzajac powietrze do kolb wstrzasowych lub znanych fermentorów. Roztwór fermentacyjny zawiera zródlo wegla i azotu oraz ewentualnie substancje, przyspieszajace wzrost i sole nieorganiczne. Jako zródlo wegla stosuje sie na przyklad dajace sie asymilowac weglowodany, takie jak glukoza, sacharoza, laktoza, maltoza, skrobia, dalej mannit, inozyt, gliceryna. Jako pozywki zawierajace azot i ewentualnie substancje przyspieszajace wzrost, stosuje sie na przyklad aminokwasy, zwlaszcza metionine, peptydy i proteiny oraz produkty ich odbudowy, na przyklad maczke z orzeszków ziemnych, maczke sojowa, pepton lub trypton, dalej ekstrakty miesne, rozpusz¬ czalne w wodzie czesci ziaren zbóz lub pozostalosci po destylacji przy wyrobie alkoholu, na przyklad sucha pozostalosc po destylacji przy wyrobie alkoholu z kukurydzy, sole amonowe i azotany. Z innych soli nieorga¬ nicznych pozywka moze zawierac na przyklad chlorki, weglany, siarczany metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych, zelaza, miedzi, cynku i manganu.Hodowle prowadzi sie w temperaturze 18—37°C, korzystnie w temperaturue okolo 23°C, wciagu 4—7 dni.Do wyodrebnienia dezacetoksycefalosporyny C mozna stosowac rózne metody. Korzystnie stosuje sie do wyodrebnienia dezacetoksycefalosporyny C z brzeczki fermentacyjnej metody znane do wyodrebnienia cefalo¬ sporyny C.Wyodrebnianie mozna prowadzic bezposrednio z brzeczki fermentacyjnej metoda Whole-Brotha albo korzystnie z przesaczu hodowlanego po oddzieleniu grzybni, na przyklad droga saczenia, ewentualnie w obecnos¬ ci pomocniczych materialów filtrujacych, takich jak ziemia okrzemkowa. Przed lub po saczeniu mozna zastosowac obróbke za pomoca kwasów, na przyklad kwasów mineralnych, takich jak kwas siarkowy, lub kwasów organicznych, takich jak kwas szczawiowy, w celu wytracenia z pozywki trudnorozpuszczaInyeh soli, na przyklad soli wapniowych iw celu rozlozenia ewentualnie obecnej penicyliny N. W celu dalszego wstepnego oczyszczania przesaczu hodowlanego mozna z niego usuwac zanieczyszczenia liofilowe. Do tego celu nadaje sie na przyklad ekstrakcja z niemieszajacych sie z woda rozpuszczalnikiem lub mieszanina rozpuszczalników i/lub adsorpcja na wymieniaczach jonowych.Jako nie mieszajace sie z woda rozpuszczalniki stosuje sie na przyklad alifatyczne, cykloalifatyczne, aralifatyczne i aromatyczne weglowodory, zawierajace najwyzej 12 atomów wegla, ewentualnie podstawione atomami chlorowca, takimi jak brom, fluor, a zwlaszcza chlor, na przyklad heksan, cykloheksan, benzyna, eter naftowy (temperatura wrzenia 110-140°C), nafta (temperatura wrzenia 210-210°C), czterochlorek wegla,6 94 449 chloroform, chlorek metylenu, metylochloroform, chlorek etylenu, perchloroetylen, perfluoroetylen, bromek izopropylu, benzen, toluen, ksyleny, dalej estry, zwlaszcza nizsze estry alkilowe nizszych kwasów tluszczowych, takie jak octan etylu, octan butylu, octan amylu, ketony, takie jak metyloizobutyloketon, metyloizoamyloketon, etery, takie jak eter dwuizopropylowy, nie mieszajace sie z woda lub mieszajace sie z woda w niewielkim stopniu alkohole, takie jak butanol, 2-etylobutanol, etyloheksanol, cyklopentanol, cykloheksanol.Ekstrakcje nie mieszajacym sie z woda rozpuszczalnikiem prowadzi sie korzystnie w obecnosci cieklego wymieniacza jonowego. Proces prowadzi sie korzystnie w kwasnym zakresie pH, na przyklad przy wartosci pH=1-6.Zamiast wstepnego oczyszczania przesaczu hodowlanego droga obróbki kwasami i/lub ekstrakcji rozpusz¬ czalnikami, mozna go poddac kolejnej obróbce mocna zywica kationowymienna, mocna zywica anionowymien- na, tak jak to opisano w brytyjskim opisie patentowym nr 968324.W celu oddzielenia dezacetoksycefalosporyny C z ewentualnie wstepnie oczyszczonego, jak wyzej omówio¬ no, przesaczu hodowlanego mozna zastosowac rózne metody, które mozna stosowac jedno- lub wielokrotnie, pojedynczo lub w dowolnej kombinacji. Z metod tych stosuje sie zwlaszcza absorpcje i adsorpcje, rozdzielanie pomiedzy rozpuszczalniki i wytracanie osadu.Jako srodki absorpcyjne lub adsorpcyjne mozna stosowac na przyklad wegiel aktywny, tlenek glinu, celuloze, zywice jonowymienne i niejonowe zywice adsorpcyjne, a do eluowania zwlaszcza roztwory wodne.Stosowanie wegla aktywnego i tlenku glinu opisane jest na przyklad w brytyjskim opisie patentowym nr 810196.Jako wymieniacz jonowy wymienia sie na przyklad slabo zasadowe wymieniacze anionowe, z których zadany produkt mozna eluowac na przyklad roztworem octanu pirydyny przy wartosci pH okolo 6. Mozna stosowac równiez mocno zasadowe zywice anionowymienne, z których produkty mozna eluowac za pomoca okolo 1 n roztworu kwasu octowego, na przyklad wedlug brytyjskich opisów patentowych nr 810196 i nr 968324. Jako niejonowe zywice adsorpcyjne stosuje sie usieciowane dwuwinylobenzenem polimery styrenu o duzej powierz¬ chni, z których mozna eluowac dezacetoksycefalosporyne C, na przyklad za pomoca wodnych roztworów alkoholi, takich jak ninizsze alkanole, na przyklad metanol, etanol, a zwlaszcza izopropanol, na przyklad wedlug belgijskiego opisu patentowego nr 750292.Metode rozdzielenia pomiedzy rozpuszczalniki mozna stosowac na przyklad w postaci rozdzielenia w przeciwpradzie. Jako uklad rozpuszczalników stosuje sie mieszaniny wody i fenolu lub fenoli, podstawionych nizszymi rodnikami alkilowymi, na przyklad wedlug brytyjskiego opisu patentowego nr 810196.Do wytracania dezacetoksycefalosporyny C z wodnych roztworów nadaja sie na przyklad mieszajace sie z woda rozpuszczalniki organiczne, takie jak ketony, na przyklad aceton, albo nizsze alkanole, na przyklad izopropanol. Zwiazek ten mozna wytracac równiez ze stezonych roztworów wodnych w postaci soli z metalami, takimi jak metale alkaliczne, na przyklad sód, albo metale ziem alkalicznych, na przyklad wapn lub bar, szczególnie korzystne jest wytracanie tego zwiazku jako trudnorozpuszczalnego kompleksu metali ciezkich, na przyklad jako kompleksu z miedzia, rtecia, kwasem, olowiem, kadmem, manganem, zelazem, kobaltem, niklem, a zwlaszcza cynkiem, na przyklad wedlug francuskiego opisu patentowego nr 2011520.Do rozdzielania dezacetoksycefalosporyny C i ewentualnie utworzonej równiez droga fermentacji cefalo- sporyny C nadaje sie zwlaszcza chromatografia na celulozie. Przy wysokiej zawartosci cefalosporyny C moze sie okazac celowe prowadzenie chromatografii w wiecej niz jednym stopniu. Moze sie tez okazac korzystne przeprowadzenie cefalosporyny C w jednym z etapów chromatografii w dezacetylocefalosporyne C, poniewaz zwiazek ten latwiej mozna oddzielic od dezacetoksycefalosporyny C. Cefalosporyne C przeprowadza sie w dezacetylocefalosporyne C w znany sposób droga dezacetylowania, na przyklad za pomoca dezacetylaz, takich jak dezacetylaza cytrusowa albo dezacetylaza z mikroorganizmów, tak jak to opisano w brytyjskim opisie patentowym nr 1080904 dla dezacetylowania kwasu 7-aminocefalosporanowego, zwlaszcza za pomoca dezacety- lazy z Bac. subtilis ATCC 6633. DezacetyIowanie mozna prowadzic za pomoca liofilizatu komórkowego mikroorganizmu albo za pomoca enzymu, uzyskanego z mikroorganizmu.Eluowanie prowadzi sie na przyklad za pomoca roztworów wodnoalkoholowych lub wodno-fenolowych, takich jak wodny roztwór nizszego alkanolu, na przyklad propanolu lub butanolu, albo wodny roztwór fenolu.Dezacetoksycefalosporyna C o wzorze 1 ma nastepujace wlasciwosci: W widmie nadfioletowym w wodzie Xmax wynosi 260 nm. W widmie magnetycznego rezonansu jadrowego w D20 wystepuje ostry sygnal przy 1,92 , który mozna przyporzadkowac 3 protonem grupy CH3 w polozeniu 3.W widmie w podczerwieni w bromku potasu brak typowych dla cefalosporyny C pasm przy 8,15 ju i 9,7 /x, a zamiast nich wystepuje pasmo przy 3,36/i. Skrecalnosc optyczna dezacetoksycefalosporyny C wynosi (a)fc° = +125° ± 1%-1 w wodzie). Podczas hydrolizy dezacetoksycefalosporyny C za pomoca 6 n HCI w ru¬ rze cisnieniowej (24 godziny, temperatura 110°C) otrzymuje sie obok innych produktów rozkladu kwas a-aminoadypinowy. Dalsze charakterystyczne dane podano juz w tablicach 1 i 2.94 449 7 We wszystkich wymienionych danych charakterystycznych wystepuje pelna zgodnosc pomiedzy dezaceto- ksycefalosporyna C, otrzymana na drodze fermentacji oraz dezacetoksycefalosporyna C, otrzymana chemicznie.Ponizsze przyklady blizej wyjasniaja sposób wedlug wynalazku. Temperatury podane sa w stopniach Celsjusza.Przyklad I. Zawartosc ampulki z liofilizowana zawiesina grzybni i zarodników mutanta z defektem C-hydroksylazy dezacetoksycefalosporynowej 127a/2, który otrzymano droga napromieniowania Cephalospo- rium acromonium ATCC 14533 promieniami nadfioletowymi tak, jak to opisano w czesci ogólnej opisu, rozpuszcza sie w 5 ml M/15 buforu fosforanowego o wartosci pH=7. Kolbe Erlenrrieyera o pojemnosci 500 ml o 4 lamaczach przeplywu, zawierajaca 100 ml pozywki a) szczepi sie 5 ml zawiesiny Cephalosporium i wciagu 72 godzin inkubuje na wirujacej wstrzasarce o 250 obrotach na minute, amplitudzie 50 mm, w temperaturze °C. Za pomoca tak uzyskanej hodowli wstepnej szczepi sie roztwór hodowli glównej b), tez znajdujacej sie w kolbie, Erlenmeyera o pojemnosci 500 ml i 1 lamaczu przeplywu, a zawierajacej 100 ml pozywki. Kolby inkubuje sie wciagu 168 godzin na wirujacej wstrzasarce o 250 obrotach na minute w temperaturze 25°C. Od czwartego dnia poczawszy pobiera sie codziennie próbki do badania aktywnosci biologicznie (dyfuzyjny test plytkowy) i chemicznie (chromatogram cienkowarstwowy). Po uplywie 168 godzin tworzy sie maksymalna ilosc dezacetoksycefalosporyny C. Roztwór hodowlany wykazuje wtedy wartosc pH=7,5, i stezenie okolo 750 mg/litr dezacetoksycefalosporyny C.Pozywka a) sproszkowany namok kukurydziany octan amonu sacharoza pH przed sterylizacja pH po sterylizacji Pozywka b) maczka z orzeszków ziemnych melasa z buraków maczka kukurydziana oleinian metylu DL-metionina boraks CaC03 12,0 g/litr 4,5 g/litr ,0 g/litr 7,5 7,0 ,0 g/litr ,0 g/litr ,0 g/litr .6,7 g/litr ,0 g/1itr 0,5 g/litr ,0 g/litr pH przed sterylizacja nalezy nastawic za pomoca KOH na wartosc 7,0. 3 litry roztworu hodowlanego, zawierajacego 0,75 dezacetoksycefalosporyny C na litr zakwasza sie 50% objetosciowo wodnym roztworem kwasu siarkowego do wartosci pH=3,0 i odwirowuje. Przesacz hodowlany o zawartosci 680 mg dezacetoksycefa¬ losporynyC na litr ekstrahuje sie 1,5 litra roztworu 10% cieklego wymieniacza jonowego (Amberlitu LA—2 w postaci octanowej) w 2-etyloheksanolu w 3 porcjach' po 0,5 litra, po czym dezacetoksycefalosporyna C pozostaje w fazie wodnej. Ekstrahowany przesacz hodowlany zakwasza sie 50% kwasem siarkowym do wartosci pH=2,6 i perko I uje 15 litrami usieciowanego dwuwinylobenzenem polimeru styrenu, o duzej powierzchni, stanowiacego niejonowa zywice adsorpcyjna (Amberlit XAD—2). Zywice przemywa sie 750 ml odjonizowanej wody i nastepnie eluuje sie 3 litrami 12% wodnego roztworu izopropanolu. Eluat chwyta sie w 4 frakcjach po 600 ml. Frakcje o najwyzszym stezeniu dezacetoksycefalosporyny C liofilizuje sie. Surowy liofilizat zawiera 24% dezacetoksycefalosporyny C. Mozna go analogicznie, jak w przykladzie II, przeprowadzic w kompleks z cyn¬ kiem, a nastepnie w wolna dezacetoksycefalosporyne C.Przyklad II. W 27 litrach brzeczki, otrzymanej wedlug przykladu I, nastawia sie na wartosc pH»2,8, za pomoca 50% kwasu siarkowego i saczy po dodaniu 810 g pomocniczego srodka filtrujacego na prasie filtracyjnej. Kwasny przesacz adsorbuje sie na 18 litrach adsorpcyjnej zywicy polistyrenowo-dwuwinylobenzeno- wej (Amberlit XAD-2). Predkosc przeplywu wynosi 18 litrów na godzine. Kolumne z ta zywica eluuje sie 20% objetosciowo wodnym roztworem izopropanolu. Predkosc eluowania wynosi 36 litrów na godzine. Eluat wychwytuje sie we frakcjach o objetosci do 2 litrów. Ponad 70% zaadsorbowanej substancji aktywnej znajduje sie we frakcjach 7—18, to jest w 24 litrach eluatu. Frakcje te adsorbuje sie na 500 ml zasadowej zywicy anionowymiennej (Amberlit I RA—68 w postaci octanowej). Predkosc przeplywu wynosi 5 litrów na godzine.Kolumne eluuje sie nastepnie buforem z octanu pirydyny o wartosci pH=5,5, który jest o 0,44 molarny w stosunku do pirydyny i 0,2 molarny w stosunku do kwasu octowego. Predkosc eluowania wynosi 1 litr na godzine. Chwyta sie eluaty do 200 ml. Frakcje 2-13, to jest 2,4 litra, zawieraja calkowita ilosc substancji aktywnej. Frakcje te zateza sie pod obnizonym cisnieniem w temperaturze 30-35°C do objetosci 100 ml.Koncentrat mieszajac wprowadza sie do 1200 ml izopropanolu. Otrzymany osad odsacza sie na nuczy,8 94 449 przemywa izopropanolem, odsysa i rozpuszcza w 200 ml wody. Do klarownego roztworu dodaje sie 20 g octanu cynku, po czym jednorodny roztwór zadaje sie wciagu 15 minut 250 ml izopropanolu. Wytraca sie przy tym dezacetoksycefalosporyna C w postaci kompleksu z cynkiem. Po 4-godzinnym chlodzeniu w temperaturze 0° odsacza sie na nuczy. Pozostalosc przemywa sie woda i izopropanolem, i suszy w temperaturze 50°C pod obnizonym cisnieniem. Produkt otrzymuje sie w postaci jasnobezowych krysztalów, które wedlug wysokocisnie¬ niowej chromatografii cieczowej (HPLC) i chromatogramu cienkowarstwowego sa identyczne z dezacetoksycefa¬ losporyna C (gdyz zwiazek kompleksowy z cynkiem zachowuje sie w obu tych metodach analizy tak samo, jak wolna dezacetoksycefalosporyna C).Z tego kompleksu z cynkiem mozna wolna dezacetoksycefalosporyne C otrzymac w taki sam sposób, jak uwalnia sie cefalosporyne C z kompleksu cynkowego (porównaj opis patentowy St.Zjedn.Am. nr 3661901)/ Przykladowo okolo 10% wodna zawiesine kompleksu z cynkiem mieszajac zadaje sie powoli silnie kwasnym kationitem w postaci — H (sulfonowy i sieciowany dwuwinylobenzepem polistyren — np. Dowex 50—WX 12®), az do uzyskania odczynu o wartosci pH=2,5. Nastepnie roztwór saczy sie i zateza. Mozna tez wytwarzac sól sodowa na drodze dodawania lugu sodowego do odczynu o wartosci pH=6,5, nastepnego zatezenia i wykrystali¬ zowania soli sodowej. PL