PL90105B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszaniny nowych antybiotyków aminoglikozydowych, a mianowicie antybiotyków J'—20A i J'-20B oraz gentamycyny lub poszczególnych jej skladników, ewentualnie w postaci dopuszczalnych w farmacji soli addycyjnych z kwasami, na drodze hodowli drobnoustroju z rodzaju Micromonospora, nalezacego do rzedu Actinomycetales.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 3 091372 opisano szczep z gatunku Micromonospora, oznaczony jako Micromonospora purpurea, oraz jego zastosowanie do wytwarzania antybiotyku amjnoglikozydo- wego nazwanego gentamycyna. Jak stwierdzono nastepnie, antybiotyk ten sklada sie z trzech frakcji nazwanych gentamycyna Clf C2 oraz C|a. Szczep Micromonospora purpurea, wytwarzajacy gentamycyne,zostal zdepono¬ wany w Northern Utilization Research and Development Divislon, U.S. Departament of Agriculture i otrzymal nr 2953.Niespodziewanie stwierdzono, ze mutant szczepu Micromonospora purpurea, oznaczony w niniejszym opisie Micromonospora purpurea J'-20, wytwarza mieszanine nowych antybiotyków, nazwana J1 -20, skladaja¬ ca sie z,dwóch glównych skladników antybiotyku JI-20A i antybiotyku JI-20B oraz malych ilosci gentamycy¬ ny.Wzglednie proporcje zawartosci gentamycyny, antybiotyku JI-20A oraz antybiotyku JI-20B w mieszani¬ nie Jl—20 moga sie znacznie zmieniac w zaleznosci od warunków i skali hodowli. Stad tez termin mieszanina Jl—20 stosowany w niniejszym opisie dotyczy kazdej mieszaniny antybiotyków o powyzszym skladzie, wytwa¬ rzanych w procesie hodowli Micromonospora purpurea Jl—20- Typowa mieszanina Jl—20 sklada sie z 1-3% gentamycyny, 12-22% antybiotyku JI-20A oraz 75-83% antybiotyku Ji-206.Szczep mutant Micromonospora purpurea Jl—20 jest bardzo podobny pod wzgledem wlasciwosci taksonomicznych i morfologicznych do szczepu M.purpurea NRRL 2953 opisanego w opisie patentowym Stanów2 90105 Zjednoczonych nr 3091572. Jednakze obserwuje sie kilka znacznych róznic w tych wlasciwosciach. Mimo, ze szczep mutant jest podobny do szczepu M.purpurea NRRL 2953. posiada on wyrózniajaca ceche, polegajaca sie tym, ze wytwarza on kompleks, rózniacy sie wyraznie od wytwarzanego przez szczep macierzysty.Wzorcowa próbka szczepu Micromonospora purpurea JI-20 zostala zdeponowana w Northern Utilization Research and Development Division, U.S. Dopartament of Agriculture, Peoria, Illinois,gdzie otrzymal nr NRRL 5467.Szczep mutant Micromonospora purpurea JI-20 otrzymuje sie na drodze dzialania na Micromonospora purpurea NRRL 2953 nitrozoguanidyna i selekcji z zastosowaniem znanych technik. Dla znajacych problem jest oczywiste, ze w celu otrzymania M.purpurea JI-20 mozna stosowac takze inne czynniki mutagenne oraz rózne techniki mutowania.Wlasciwosci morfologiczne oraz inne dane taksonomiczne szczepu Micromonospora purpurea JI-20 NRRL 5467 sa zestawione w ponizszych tabelach l-IV.W tabeli I podane sa wyniki obserwacji makroskopowych i mikroskopowych 14-dniowej hodowli Micromo¬ nospora purpurea JI-20, prowadzonej w temperaturze 24-26°C, na pozywce agarowej, zawierajacej 3% NZ ftroioe TypA) pepton otrzymany w wyniku enzymatycznego trawienia kazeiny i sluzacy jako zródlo azotu) 1% drtcsttozy:oraz 1,5% agaru.Do opisu barw w tabeli li nastepnych zastosowano dwa rodzaje oznaczen. Pierwsze oznaczenie wzieto z „Descriptive Color Name Dfctionary", Taylor, Knoche i Granville, wydanej przez Container Corporation of America (1950) i polaczono z numerami wybarwien odpowiadajacych nazwie barwy. Numery wybarwien zaczerpnieto z „Color Harmony, Nanual", 4 wydanie, 1958, wydanej przez to samo wydawnictwo. Drugie oznaczenia sa synonimami lub prawie synonimami pierwszych i pochodza z National Bureau of Standards, Circular, 553, listopad 1955. Do opisu spodniej strony zastosowano te same oznaczenia, przy czym obserwacje prowadzono ogladajac poprostu spodnia strone przez dno szalki Petri'ego.W tabeli II opisano wyniki obserwacji kolonii Micromonospora purpurea JI-20, hodowanych na róznych innych pozywkach; w tabeli III wyniki przyswajania azotu, zas w tabeli IV przyswajania weglowodorów.W tabeli III stosowano pozywke, zawierajaca podana ilosc zródla azotu, 1% glukozy, 1,5% agaru i wode destylowana.Pozywka, stosowana wedlug tabeli IV, sklada sie z 1% podanego weglowodanu, 0,5% wyciagu drozdzowego, 1,5% agaru oraz wody destylowanej, Drobnoustrój jest organizmem aerbowym i rosnie dobrze w zakresie temperatur 25-38°C. Powyzej temperatury 38°C wzrost jest mierny, natomiast w temperaturze 45°C i powyzej nie obserwuje sie praktycznie wzrostu. Korzystna dla wytwarzania antybiotyku jest hodowla podpowierzchniowa z napowietrzaniem, przy pH = 6,7-8,3.Micromonospora purpurea JI-20 z reguly dobrze znosi dodatek do 3% chlorku sodowego. Test dwunasto- dniowy z dodatkiem 1,5 do 3% chlorku sodowego wykazal dobra tolerancje na ten zwiazek. Nie dotyczy to jednak wyzszych stezen, 4, 5 i 7-procentowych. Drobnoustrój wykazuje zmiennosc w redukcji azotanów, dajac zarówno dodatnia jak i ujemna reakcje. Moze byc to zwiazane z sila wzrostu hodowli w czasie wykonywania testu.T a b I i c a I Morfologia Micromonospora purpurea Jl—20 Pozywka: 3% NZ Amine Typ,,A, 1 % dekstrozy, 1,5% agaru Obserwacje makroskopowe Obserwacje mikroskopowe Wzrost: umiarkowany, hodowla pofaldowana, Nie obserwuje sie zarodników na zadnej z brak rozsianych pigmentów, brak grzybni pozywek. powietrznej. ..' w mlodych hodowlach grzybnia nie podzielona, ' która jednak w starych hodowlach moze Barwa: g41 C brudno-pomaranczowa, umiarko ulegac lizie. wanie pomaranczowa53. Srednica grzybni 0,4—0,690105 Tablica II Opis kolonii na róznych pozywkach Pozywka Opis Glukoza, asparagins agar Mleko Sacharoza Skrobia Celuloza Agar Bennetta Agar Emersona Pasta pomidorowa, agar z maka owsiana Glukoza, wyciag drozdzowy, agar Ziemniaki Sacharoza agar azotanowy (agar Czapka) Agar tyrozynowy Obserwacje po 2, 7 i 14 dniach Gordon i Smith, J.Bact.69,147 Pepton, Iron agar Obserwacje po 2, 7 i 14 dniach Mleko lakmusowe Wzrost: umiarkowany, hodowla pofaldowana, brak grzybni powietrznej, brak rozsianych pigmentów.Barwa: powierzchnia:gope terrakotra; silnie brazowa 65.Spód:gopg henna; silnie brazowa 55.Wzrost: dobry, hodowla pofaldowana, brak rozsianych pigmentów, brak grzybni powietrznej, test na hydrolize pozytywny.Barwa: Powierzchnia: goicjasnobursztynowa; ciemnopomeranczowo-zólta 72.Wzrost: dobry, hodowla pofaldowana ciemnokasztanowa.Wzrost: dobry, pofaldowania, barwa ciemnokasztanowa.Wzrost: wyrazny, celuloza ulega rozkladowi Wzrost: dobry, pofaldowania, brak rozsianych pigmentów, brak grzybni powietrznej.Barwa: Srodek powierzchni: g4gc. barwa jasnej kory debowej; jasnobrazowa 57.Obrzeza: g51g kakaowo-brazowa; umiarkowanie czerwonawo-brazowa 43.Spód: m4pg barwa ciemnej kory debowej silniebrazowa 55).Wzrost: umiarkowany, hodowla pofaldowana, bloniasta, brak rozsianych pigmentów, brak grzybni powietrznej.Barwa: Powierzchnia: gole barwa rdzawej kory debowej,; szarawo-czerwo- nawo-pomarariczowa 39.Spód:g4nc barwa ciemnej kory debowej, silniebrazowa 55.Wzrost: dobry, hodowla pofaldowana, bloniasta, brak rozsianych pigmentów, brak grzybni powietrznej.Barwa: Powierzchnia: g41a pomaranczowa; silnie-pomaranczowa 50.Spód: barwa niewykrywalna.Wzrost: dobry, hodowla pofaldowana, bloniasta, brak rozsianych pigmentów brak grzybni powietrznej.Barwa: Powierzchnia: g3gc barwa jasnej kory debowej; jasnozóltawo- brazowa 76.Spód: m3le cynamonowa; jasnozóltawo-brazowa 76.Wzrost: dobry w obecnosci weglanu wapnia; skapy podczas nieobecnosci weglanu wapnia.Barwa: Obrzeza: g8pe barwa wina burgundzkiego, ciemnoczarwonawo- brazowa 44 Srodek: g5ic barwa jasnego persimonu; umiarkowanie czerwonawo-pomaranczowa 37 Wzrost: umiarkowany, pofaldowania brak rozsianych pigmentów, brak grzybni powietrznej Barwa : Powierzchnia: g10pn barwa ciemnego baklazana.Spód' m8pn hebanowo-brazowa; ciemnoczerwonawo-szara 3.Wzrost: skapy, jasnobrazowy rozsiany pigment Wzrost: skapy, brak reakcji Calkowita peptonizacja mleka, odczyn kwasny.90106 Tablica III Zródlo azotu Opis 0,5% wyciagu drozdzowego Difco 1.0% NZ Amine Typ A 1%asparaginy 1% kwasu glutaminowego 1% azotanu sodowego 1% azotanu amonowego Wzrost: umiarkowany, hodowla bloniasta do pofaldowanej, brak roz¬ sianych pigmentów, brak grzybni powietrznej.Barwa: Powierzchnia: g7-1/21 rózowofioletowa; ciemnoszarawo- purpurowa 229.Spód:m6mopi brazowo-mahoniowa; umiarkowanie czerwonawo-brazowa 45, Wzrost: umiarkowany, hodowla bloniasta, brak rozsianych pigmentów brak grzybni powietrznej.Barwa: Powierzchnia: g10ni barwa baklazana, ciemnoczerwonawo purpurowa 242.Spód: mdpi brazowo-mahoniowa; umiarkowanie czerwonawo-brazowa 43.Wzrost: skapy, powierzchnia plaska, brak rozsianych pigmentów, brak grzybni powietrznej.Barwa: Powierzchnia g7-1/2pi barwa ciemnego wina; ciemnoczerwonawo- brazowa 44.Spód: m7—1/2pi barwa ciemnego wina; ciemnoczerwona 16.Wzrost: skapy, powierzchnia plaska, brak rozsianych pigmentów, brak grzybni powietrznej.Barwa: Powierzchnia: g7pl barwa wina burgundzkiego, szarawo-czerwo- nawo-brazowa 47.Spód: mdpi gleboko brazowo-mahoniowa; szarawo-czerwonawo-brazowa 46. wzrost: skapy wzrost: skapy Tablica IV Przyswajanie weglowodanów Weglowodan Uwagi D(+)-mennoza Sacharoza D(+)-ksyloza L(+)-arabinoza D(+)-glukoza /J-laktoza DM-ryboza Skrobia D(—)—arabinoza Celuloza D(-)-galaktoza Gliceryna i—Inozytol D(-)lewuloza(fruktoza) D(+)-mannitol D(+)-melibioza D(+)-meJecytoza D(+)-rafinoza L(+)-ramnpza Salicyl*: - J — v$pri)il»r /.•Konsola;:i 0,5%wyciagu drozdzowego wzrost dobry wzrost dobry wzrost dobry wzrost umiarkowany wzrost umiarkowany wzrost umiarkowany wzrost umiarkowany wzrost umiarkowany wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy wzrost wystarczajacy skapy do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego do skapego90105 5 Fermentacje Mjurpurea JI-20 prowadzi sie zazwyczaj w dwóch etapach, w stadium zarodnikowania otrzymuje sie odpowiednie inokulum, zas w stadium produkcyjnym wytwarzany jest antybiotyk.Stadium zarodnikowania moze sie skladac z kilku kolejnych przejsc, w tym przygotowywania hodowli podstawowej, a nastepnie inokulum, w jednym lub kilku etapach. Typowe warunki otrzymywania Inokulum polegaja na hodowli w odpowiedniej pozywce, w temperaturze okolo 25-35°C, w warunkach aerobowych z mieszaniem, korzystnie na trzesawce obrotowej, w ciagu 1-4 dni.W stadium produkcyjnym pozywke, zawierajaca przyswajalne zródla azotu i wegla, takie np. jak wymie¬ nione wyzej w tabelach, zaszczepia sie w warunkach jalowych inokulum, przygotowywanym w stadium zarodni¬ kowania. Fermentacje w stadium produkcyjnym prowadzi sie w warunkach podobnych do stosowanych w stadium zarodnikowania, wciagu 4-7 dni. Inaczej jednak niz podczas stadium zarodnikowania, kiedy to wartosc pH jest wzglednie stala, w stadium produkcyjnym potrzebna jest jego regulacja w celu utrzymania w korzystnym zakresie pomiedzy 6, 7 i 8,3. Koniecznym jest takze w czasie fermentacji dodawanie odpowied¬ nich srodków gaszacych piane. Sa to srodki powszechnie znane i dostepne w sprzedazy. Do takich nalezy np. silikonowy srodek przeciwpienny o nazwie handlowej GE-60 (General Electric Co). Podczas fermentacji, szczególnie po uplywie pierwszych dwudziestu czterech godzin, pobiera sie próbki brzeczki w celu okreslenia momentu maksymalnego wytwarzania antybiotyku, stosujac przy tym opisana ponizej metode.Oznaczenia wykonuje sie stosujac metode krazkowo-plytkowa z wykorzystaniem w charakterze drobno¬ ustroju testowego szczepu Staphylococcus sureus ATCC 6538P. Metoda ta jest opisana szczególowo przez Odena iwsp. w Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1963. American Society for Microbiology, str.8-13.Wzorcem odniesienia jest antybiotyk JI-20B w postaci wolnej zasady o mocy 1000 mcg/mg. Jeden mikrogram tego standardu — daje w jednym mililitrze 0,1 m roztworu buforu fosforanowego o pH = 8,0, strefe zahamowa¬ nia o srednicy 16,8 ± 1,5 mm. W stosunku do antybiotyku JI-20B w postaci wolnej zasady, przyjetego jako wzorzec, moc siarczanu antybiotyku JI-20B wynosi 730 mcg/mg, antybiotyku JI-20A zasady 723 mcg/mg oraz siarczanu antybiotyku JI-20A 527 mcg/mg.Po osiagnieciu maksimum wytwarzania antybiotyk izoluje sie w brzeczki fermentacyjnej, stosujac znane sposoby wyodrebnienia antybiotyków zasadowych, polegajace na zakwaszeniu, saczeniu, adsorpcji, elucjl i zatezaniu, ewentualnie liofilizacji. W opisanym procesie jony wapniowe, obecne w brzeczce, wytraca sie w postaci nierozpuszczalnych soli, brzeczke zakwasza, korzystnie kwasem mineralnym i nastepnie klaruje na drodze saczenia lub wirowania. Po zobojetnieniu antybiotyki absorbuje sie na odpowiedniej kationowej zywicy jonowymiennej, np. na slabo kwasnym wymieniaczu w formie amoniowej. Eluuje sie produkt z kolumny rozcienczonymi roztworami zasad, korzystnie wodorotlenkiem amonowym i eluaty zateza, stosujacnp. liofiliza¬ cje. Typowymi kationowymi wymieniaczami jonowymi sa dostepne w sprzedazy: Amberlit IRC-50/Rohm and Haas, Phiiadelphia) oraz Lewatyt CNP (Farben Fabriken Bayer, Leyerkusen, NRF). Inna metoda Izolacji moze byc ekstrakcja rozpuszczalnikami. Sposób ten jest szczególnie wygodny w przypadku izolowanie antybiotyków w postaci pochodnych, takich jak zasady Schiffa. Ponadto mozna takze stosowac adsorpqe na weglu aktywnym.Dogodna metoda rozdzialu mieszaniny JI-20 na poszczególne skladniki jest chromatografia. W typowym rozdziale chromatograficznym mieszanina JI-20 absorbuje sie na kolumnie wypelnionej zelem krzemionkowym i nastepnie eluuje odpowiednia mieszanine rozpuszczalników, np. dolna faza mieszaniny chloroformu, metanolu I stezonego roztworu amoniaku (1:1:1) Eluaty z kolumny mozna kontrolowac, stosujac chromatografie cienkowarstwowa na plytkach, pokrytych zelem krzemionkowym i wywolujac metoda bioautograficzna, przy pomocy szczepu Staphylococcus aureus ATCC 6538P. Frakcje, zawierajace poszczególne skladniki, laczy sie zateza i wyodrebnia. Przy zastosowaniu podanego wyzej adsorbenta i ukladu eluujacego kolejnosc eluq'i poszczególnych skladników mieszaniny JI-20 jest nastepujaca: gerrtamycyna, antybiotyk JI-20B oraz,antybio¬ tyk JI-20A.Strukture oraz wlasciwosci fizykochemiczne I biologiczne skladników Ci, C, i C1a gentamycyny opisano w Journal of Infectlous Diseases od 119 numery 4 i 5, Unicverslty of Chicago Press.W tablicy V zestawiono wlasciwosci fizykochemiczne antybiotyku JI-20A i antybiotyku JI-20B.6 90105 Tablica V Chemiczne i fizykochemiczne wlasciwosci antybiotyków JI-20A i JI-20B 1. Analiza elementarna (znaleziono) wegiel wodór azot 2. Wzór empiryczny 3. Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego 4. Skrecalnosc wlasciwa [a]**(0,3%, woda) . pKa 1. Analiza elementarna (znaleziono) wegiel wodór azot 2. Wz 3. Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego AntybiotykJl- 45,66% 8,18% 13,53% C19H„N,0, • rysunek 1 + 160° 8,1 Siarczany JI-20A ,64% 6,55% 8,78% C19H39N509 -2,5 H3S04 • 1,5H20 rysunek 3 -20A HaO Cao H.Antybiotyk JI-20B 46,47% 8,45% 13,93% c20H41N;o9-Hao rysunek 2 + 172° 8,1 JI-20B ,73% 6,70% 8,71% (H41N509 -2,5 {S04 • 2H20 rysunek 4 Widma magnetycznego rezonansu jadrowego, przedstawione na rysunkach 1—4, wykonane na spektrome¬ trze Varian A-60-A (Varian Asso ciates, Palo Alto, California), stosujac roztwór antybiotyku w ciezkiej wodzie.Widma zapisywano w jednostkach PPM (czesci na milion), wykorzystujac pasmo MDO przy 4,61 jako standard wewnetrzny.Mieszanina antybiotyczna JI-20, jego skladniki JI-20A i JI-20B) oraz ich addycyjne sole kwasowe tworza hydraty z woda oraz solwaty z polimerami, rozpuszczalnikami organicznymi, np. z alkoholami. Hydraty isolwaty sa calkowitymi odpowiednikami zasadowych antybiotyków i ich addycyjnych soli kwasowych pod wzgledem aktywnosci biologicznej. Sa one tylko inna postacia, która mozna latwo wyodrebniac z roztworów.Stwierdzono, ze antybiotyki JI-20A i JI-20B posiadaja planarny wzór 1, w którym R moze oznaczac atom wodoru) antybiotyk JI-20A) lub rodnik metylowy (antybiotyk JI-20B). Przypuszcza sie,ze antybiotyki JI-20A maja stereochemiczny wzór 1a. Jak wynika z powyzszych wzorów, antybiotyki JI-20A i JI-20B sa antybiotykami aminoglikozydowymi j naleza do tej samej klasy, co gentamycyna,sterptomycyna, neomycyna, paromycyna, sizomycyna, kanamycyna i podobne. Sa to antybiotyki zasadowe, które mozna przeksztalcac w rózne nietoksyczne, dopuszczalne w farmacji pochodne o tej samej wartosci antybiotycznej, co wyjsciowe wolne zasady. Róznica polega tylko na stopniu aktywnosci. Do takich pochodnych naleza miedzy innymi addycyjne sole kwasowe i zasady Schiffa pochodnych oksazolidynowych antybioatyków.Dopuszczalno w farmacji addycyjne sole kwasowe antybiotyków JI-20A i JI-20B otrzymuje sie na drodze miareczkowania wolnej zasady antybiotyku kwasem. Korzystnym jest wyodrebnianie takich soli na drodze wytracania z roztworów wodnych mieszajacych sie z woda rozpuszczalnikami organicznymi, korzystnie nizszymi alkoholami, mozna tez liofilizowac roztwór wodny soli. Stosuje sie na ogól kwasy nieorganiczne (mineralne) i organiczne kwasy karboksylowe, takie jak alifatyczne o prostym lub rozgalezionym lancuchu, cykloalifatyczne, aromatyczne oraz aryloalifatyczne. Przykladowo moga to byc takie kwasy, jak siarkowy, fosforowy, cyklopropa- nokarboksylowy, adamantowy, karboksylowy, benzoesowy, piwalowy, fenylooctowy, octowy, propionowy, kapronowy, stearynowy i olejowy.Dopuszczalne w farmacji zasady Schiffa pochodnych oksazolidynowych otrzymuje sie w reakcji alkoholo¬ wego roztworu antybiotyku w postaci zasady, z nadmiarem odpowiedniego aldehydu. Reakcje prowadzi sie powyzej lub w temperaturze pokojowej wciagu okolo jednaj godziny, a nastepnie mieszanine reakcyjna ochladza sie i otrzymuje pochodna,zazwyczaj w postaci krystalicznej. Altenrat/wnie pochodna mozna wytracac, zatezajac mieszanine reakcyjna. Jak to wynika ze wzoru ogólnego 1, antybiotyki JI-20A i Jl- 20B, posiadaja cztery pierwszorzedowe grupy aminowe, z których kazdamoze tworzyc zasady Schiffa. Poza tym w czasteczce antybiotyku jest jeszcze drugorzedowa grupa aminowa, sasiadujaca z trzeciorzedowa grupa hydroksylowa,, któr*90105 7 w reakcji z aldehydem tworza pierscien oksazolidynowy. Tak wiec podczas reakcji antybiotyku z nadam iarem aldehydu zuzywa sie piec moli aldehydu na kazdy mol antybiotyku i tworzy sie zasada Schiffa oksazolidynowej pochodnej antybiotyku o wzorze ogólnym w, w którym R oznacza atom wodoru lub rodnik metylowy, a Hx oznacza rodnik alkilowy o 1-11 atomach wegla, rodnik cykloalkilowy o 3-11 atomach wegla, rodnik ary Iowy, aryloalkilowy o 6-11 atomach wegla lub aromatyczny rodnik heterocykliczny o 5-11 atomach wegla.Do aldehydów, które mozna stosowac dlotrzymania zasad Schiffa oksazolidynowych pochodnych o wzorze ogólnym 2 naleza: aldehyd octowy, aldehyd propionowy, aldehyd maslowy, aldehyd krotonowy, furfural, aldehyd, cyklopentylooctowy, wanilina, aldehyd weratrowy, aldehyd benzoesowy, aldehyd p-nitrobenzoesowy] pirydoksal i inne.Zasady Schiffa pochodnych oksazolidynowyeh nie rozpuszczaja sie zbyt dobrze w wodzie, natomiast sa rozpuszczalne w wiekszosci zazwyczaj stosowanych rozpuszczalników organiczny*, takich jak chloroform, metanol, aceton, octan etylu i podobne. Sa one na ogól nietrwale w rozpuszczalnikach organicznyeh,zawieraja¬ cych slady wody, wykazujac tendencje do rewersji do wyjsciowego wolnego antybiotyku. Slady kwasu ulatwiaja tego typu rewersje.Mieszanina antybiotykówJI-20 wykazuje znaczna aktywnosc przeciwbakteryjna podczas testów in vtro na pozywce Muellera-Hintona. Najmniejsze stezenie hamujace w stosunku do 32 szczepów Escherichia coli wynosi od 0,3 do 50 mcg/ml.Poszczególne skladniki, a tym samym i ich mieszanina wykazuje in vitro szerokie spektrum aktywnosci przeciwbakteryjnej. W tabeli VI zestawiono wyniki testów po 24 godzinach inkubówania w obecnosci szeregu wybranych bakterii Granrulodatnich igram-ujemnych. Badania przeprowadzono na pozywce Muellera^intona, wyniki przeliczono na antybiotyki w postaci wolnych zasad, chociaz stosowano siarczany.Tablica VI Aktywnosc antybiotyczna in vitro Najmniejsze stezenie hamujace Drobnoustrój wmcg/ml Antybiotyk JI-20A Antybiotyk JI-20B Staphylococcus sureus 70 Staphyloeoceus aureus 2059 Staphylococcus aureus 45 Escherichia coli 11775 Escherichia coli 12740 Klebsiella pneumoniae 18 Klebsiella pneumoniae 13883 Klebsiella rhinoscleromatis 18804 Protous mirabilis 8019 Pseudomonasaeruginosa 59 Pseudomonas aeruginosa 60 3,0 7,5 0,3 0,3 0,3 7,5 7,05 0,05 0,8 3,0 3,0 3,0 7,5 0,3 03 0,3 17,5 0,08 i 0,08 0,8 s 7,5 17,5 Antybiotyki JI-20A i JI-20B wykazuja dzialanie przeciwbakteryjne przeciw infekcjom, wywolywanych u zwierzatek laboratoryjnych, takich jak myszy, bakteriami patogennyml. Sprawdzone to zostalo w testach na myszach. Antybiotyk podawano w postaci zawiesiny lub roztworu w nosniku wodnym, zawierajacym 0,5% karboksymetylocelulozy, w dwóch dozach. Pierwsza podawano wkrótce po zakazeniu zwierzatek dootrzewnowo bakteriami drugi w cztery godziny pózniej. Myszki z grupy kontrolnej, którym nie podawano antybiotyku naogól padaly po 18 godzinach. Procent przezycia w grupie, której podawano antybiotyk obliczono po 48 godzinach po zakazeniu. Wyniki analizowano, stosujac standartowy rachunek prawdopodobienstwa i oznaczano wartosc PD50 z 95% wiarygodnoscia. Wyniki podane sa w tabeli VII.8 90105 Tablica VII Aktywosc przeciwbakteryjna in vivo PD$0 w mg/kg Drobnoustrój Staphylococcus aureus Gray 979 Streptococcus pyogenes C2V Pseudomo nas aeruginoss 413 15T6-7 Escherichia coli 626 11775 Salmonella sp.S.C.Antybiotyk JI-20A 2,9 3,0 40,0 50,0 50,0 ,0 4,0 3,0 Antybiotyk JI-20B 14.0 2,8 40,0 50,0 50,0 ,0 8,0 4,5 Antybiotyki JI-20A i Jl—20B oraz ich addycyjne sole kwasowe mozna stosowac, pojedynczo lub w mieszance z detergentami i/lub innymi srodkami przeciwbakteryjnymj, jako srodki hamujace wzrost iub zmniejszajace ilosc wrazliwych na ich dzialanie bakterii. Dotyczy to szczególnie bakterii, wymienionych w poprzedniej czesci opisu. Mozna wiec powyzsze antybiotyki dodawac do roztworów, stosowanych do celów sanitarnych, np. do mycia szkla laboratoryjnego i innego wyposazenia, lub do prania ubran ochronnych, stosowanych w laboratoriach. Do powyzszych celów mozna równiez stosowac mieszanine, zawierajaca antybioty¬ ki JI-20A i JI-20B oraz gentamycyne. Pozwala to uniknac rozdzialu mieszaniny. Takze zasady Schiffa oksazolidowych pochodnych omawianych antybiotyków mozna stosowac w charakterze bakteriostyków, doda¬ wanych do olejów i smarów takich, jak farby olejne i inne oleje j smary, stosowane do celów technicznych.Mieszanina antybiotyków JI-20, jej poszczególne skladniki, addycyjne sole kwasowe oraz odpowiednie zasady Schiffa mozna podawac doustnie. Moga one byc takze podawane miejscowo w postaci masci, zarówno hydrofNowych jak i hydrofobowych; w postaci plynów do przemywan, wodnych i nlewodnych, w postaci emulsji lub kremów. Do otrzymywania kompozycji stosuje sie dopuszczalne w farmacji nosniki, takiejak woda, oieje, wazeliny, poliestry, polialkohole i podobne. Zasady Schiffa sa szczególnie przydatne do przygotowywania niewodnych kompozycji do stosowania miejscowego ze wzgledu na ich zgodnosc z farmacutycznymi nosnikami, uzywanymi zazwyczaj w tego rodzaju kompozycjach.Do stosowania doustnego opisywane antybiotyki stosuje sie w postaci tabletek, kapsulek, eliksirów lub w postaci dodatku do pokarmu dla zwierzat. W tych postaciach antybiotyki sa najbardziej skuteczne w przypad¬ kach leczenia zakazen przewodu zoladkowo-jelitowego, powodujacych nieswoista biegunke. W stosowaniu doustnym u zwierzat dawki antybiotyków wynosza od okolo 5 do okolo 50 mg na kologram wagi ciala na dzien, korzystnie w 2-4 porcjach.Preparaty do stosowania domiejscowego zawieraja od okolo 0,1 do okolo 3,0 g antybiotyku na 100 g masci, kremu lub plynu do przemywania. Nanosi sie je lagodnie na chore miejsca 2-5 razy dziennie.Opisywane antybiotyki mozna stosowac w postaci plynnych, takich jak roztwory zawiesiny i podobne, w przypadkach chorób uszu i oczu. Mozna je równiez podawac pozajelitowo w postaci iniekcji domiesniowych.Roztwory lub zawiesiny iniekcyjne podaje sie na ogól w ilosci 2-5 mg antybiotyku na kilogram wagi ciala,na dzien, korzystnie w 2-4 dawkach. Dokladna dawka zalezy od stadium i rodzaju & zakazenia, wrazliwosci drobnoustroju na antybiotyk i indywidualnych cech leczonego osobnika.Nastepujace przyklady ilustruja sposób przygotowywania niektórych gotowych form, w których antybio¬ tyki, wytwarzane sposobem wedlug wynalazku, i ich pochodne moga byc stosowane.90105 9 Tabletki mg 25mg 100 mg Mieszanina antybiotyków JI-20 Laktoza doskonale sproszkowana Skrobia kukurydziana Poliwinylopirolidon Stearynian magnezu ,50 197,50 ,00 7,50 2,50 26,25 171,25 ,00 7,50 250 105,0 126,0 .0 7,5 We wszystkich przypadkach stosuje sie 5% nadmiar substancji aktywnej. Przygotowuje sie mieszanine, skladajaca sie z mieszaniny JI-20, laktozy i poliwinylopirolidonu. Po wysuszeniu dodaje sie skrobie i stearynian magnezu, miesza i formuje tabletki.Pigulki Siarczan antybiotykuJI-20B 105,00 mg */ Laktoza 4 600,00 g Skrobia kukurydziana (wstepnie zzeletynizowana) 1000,00 mg Stearynianmagnezu 95,00 mg Woda 100,00 ml 6,000,00 */ stosuje sie 5% nadmiar antybiotyku.Siarczan antybiotyku JI-20B, laktoze i czesc skrobi miesza sie w odpowiednim mlynku kulowym.Z pozostalej czesci skrobi i wody przygotowuje sie paste, z która nastepnie miesza sie uprzednio przygotowana sproszkowana mieszanke. Otrzymuje sie wilgotna mase, która granuluje sie i nastepnie granulki suszy.Granulki rozdrabnia sie,dodaje stearynianu magnezu, miesza i tabletkuje stosujac odpowiednie urzadzenia.Masc Antybiotyk JI-20A, zasada Metyloparaben (U.S.P.)* Propyloparaben (U.S.P) Wazelina 1,09 0£g 0,1 g do1000,0g * U.S.P. — zgodny z Farmakopeja St.Zjedn.Ameryki Miesza sie razem antybiotyk JI-20A, metyloparaben, propyloparaben z 10% uprzednio stopionej wazeliny.Mieszanine przepuszcza sie przez mlynek koloidalny i dodaje pozostala ilosc stopionej wazeliny, podczas mieszania i chlodzenia. Gdy mieszanina osiagnie konsystencje pólstala przenosi sie ja do odpowiednich pojemników.Powtarzajac powyzsze postepowanie mozna otrzymac masci,zawierajace równowazne ilosci antybiotyku JI-20B, mieszaniny antybiotykówJI-20, odpowiednich zasad Schiffa lub addycyjnych soli kwasowych.10 90105 Roztwory do iniekcji Siarczan antybiotyku JI-20B Metyloparaben (U.SP.) Propyloparaben (U.S.P.) Wodosiarczyn sodowy (U.S.P.) Dwuwodzian soli dwusodowej czterooctanu etylenodwu- aminy, czysty Woda Fiolka 2 ml 84,0***) 3,6 mg 0,4 mg 6,4 mg 0,02 do 2fi ml 50 lit 2100,0*) 90.0 9 ,0 mg 160/) g ,0 g 50fi litra */ stosuje sie 5% nadmiar antybiotyku.Porcje 50-1 itrowa roztworu do iniekcji przygotowuje sie w sposób nastepujacy, Okolo 35 litrów wody do iniekcji wlewa sie do odpowiedniego reaktora wykonanego ze stali kwasoodpornej i zaopatrzonego w plaszcz ogrzewczy. Po ogrzaniu wody do temperatury okolo 70°C dodaje sie metyloparaben i propyloparaben i miesza do rozpuszczenia, nastepnie ochladza zawartosc reaktora do temperatury 25-30°C przepuszczajac zimna wode przez plaszcz. Przez roztwór w reaktorze przepuszcza sie w ciagu 10 minut azot i nastepne operacje wykonuje sie pod azotem. Dodaje sie kolejno sól dwusodowa czterooctanu etylenodwuaminy, wodorosiarczyn sodowy i po ich rozpuszczeniu, siarczan antybiotyku JI-20B. Nastepnie dodaje sie wody do iniekqi do objetosci 50 litrów i calosc miesza sie do uzyskania jednorodnego roztworu. Roztwór saczy sie w warunkach jalowych przez filtr, zatrzymujacy bakterie i zbiera w odpowiednim pojemniku. Jalowym roztworem napelnia sie jalowe wolne od pyrogenów fiolki do wielokrotnego uzytku,zamyka korkiem i kapsluje.W podobny sposób otrzymuje sie roztwory iniekcyjne, zawierajace antybiotyk JI-20A, mieszanine antybiotykówJI-20 i w szczególnosci ich addycyjne sole kwasowe.Wynalazek jest ilustrowany nastepujacymi przykladami. Przyklady liii dotycza hodowli Micromonospora purpurea JI-20, szczególnie szczepu oznaczonego numerem NRRL 5467, oraz wytwarzania mieszaniny antybiotyków JI-20 i jej poszczególnych skladników. Przyklady III i IV ilustruja wyodrebnianie antybiotyków i rozdzial mieszaniny JI-20 na indywidualne skladniki. Otrzymywanie pochodnych antybiotyków opisane jest w przykladach V-XII.Przyklad I. Przygotowywanie hodowli podstawowej.A. Pierwsze stadium.Serie jalowych kolb trzesawkowych o pojemnosci 300 ml napelnia sie jalowa pozywka o nastepujacym skladzie: 0,3g 0,5g 0,5g 2,4 g 0,1 g 0,1 g 100fi ml Kazda z kolb zaszczepia sie za pomoca igly lub ezy hodowla Micromonospora purpurea JI-20 i inkubuje w temperaturze okolo 28°C, na trzesawce obrotowej, w ciagu 2-3 dni.B. Drugie stadium.Serie jalowych kolb o pojemnosci 3 litry napelnia sie 1 litrem jalowej pozywki o skladzie, jak w stadium A, a nastepnie dodaje w warunkach jalowych 50-100 ml hodowli, otrzymanej w stadium A. Calosc inkubuje sie na trzesawce obrotowej w temperaturze 28°C, wciagu 2-3 dni. Hodowle laczy sie w warunkach jalowych wiruje i usuwa supernatant. Osad, zawierajacy komórki grzybni, przemywa sie jalowa woda i przechowuje w temperaturze ponizej 0°C, jako hodowle podstawowa.Przyklad II.A. Przygotowywanie inokulum pierwszego stopnia. W jalowej kolbie trzesawkowej o pojemnosci 3 litrów umieszcza sie 1 litr jalowej pozywki o skladzie, opisanym w przykladzie I, etap A, a nastepnie zaszczepia Wyciag miesny Trypton Wyciag drozdzowy Skrobia rozpuszczalna Dekstroza Weglan wapniowy Woda90105 11 w warunkach jalowych 60 ml hodowli podstawowej, przygotowanej wedug przykladu I. Calosc inkubuje sie w temperaturze 28°C na trzesawce obrotowej (280 obr/min) w ciagu 2-3 dni.B. Przygotowanie inokulum drugiego stopnia.Do fermentora o pojemnosci 10 litrów zaladowuje sie w warunkach jalowych 6 litrów wodnego roztworu pozywki o nastepujacym skladzie: Makasojowa 210 g dekstryna 200 g cereloza 30 g weglan wapniowy 42 g chlorekkobaltu 12 mg srodek przeciwpienny (GE-60) 3 ml Do pozywki dodaje sie w warunkach jalowych 600 ml inokulum, przygotowanego wedlug opisu w etapie A niniejszego przykladu. Calosc fermentuje sie wciagu 22—26 godzin, w temperaturze okolo 34°C, na trzesawce obrotowej, przy napowietrzeniu okolo 5 litrów na minute C. Wytwarzanie antybiotyków.Przygotowuje sie jalowa pozywke o nastepujacym skladzie: maka sojowa dekstryna cereloza chlorek kobaltu weglan wapniowy srodek przeciwpienny (GE-60) 3,16 kg 4,5 kg 450 g 200 mg 630 g 100 ml Po wysterylizowaniu pozywki i doprowadzeniu pH do wartosci 7,3 za pomoca rozcienczonego kwasu lub zasady, dodaje sie 6 litrów pozywki, przygotowanej w etapie B niniejszego przykladu. Calosc poddaje sie fermentacji w temperaturze 34°C, przy wartosci pH od okolo 6,7 do 8,3 podczas napowietrzania w ilosci 0,032 m3/minute i mieszania z szybkoscia okolo 400 obrotów na minute. Po 24 godzinach i nastepnie co 12 godzin oznacza sie stezenie antybiotyków w brzeczce, poslugujac sie metoda opisana uprzednio w celu uchwycenia maksimum wytwarzania antybiotyku. Izolacja otrzymanych podczas fermentacji produktów opisana jest w przykladzie III.Przyklad III. Izolacja mieszaniny antybiotyków.Do brzeczki fermentacyjnej dodaje sie podczas mieszania 630 g kwasu szczawiowego, a nastepnie wartosc PH doprowadza sie do 2 przy pomocy 6n kwasu siarkowego. Calosc miesza sie wciagu 20 minut, saczy i przemywa osad, zawierajacy grzybnie woda. Polaczone przesacze zobojetnia sie przy pomocy 6n wodorotlen¬ ku amonowego i przepuszcza przez kolumne o wymiarach 5X65 cm, wypelniona wymieniaczem Amberlit IRC-50. Kolumne przemywa sie woda po jonitach, az do calkowitego usuniecia sladów brzeczki (bezbarwny wyciek). Eluuje sie 2n roztworem wodorotlenku amonowego do momentu, gdy eluaty osiagna odczyn silnie zasadowy, czyli wartosc PH = 10 lub powyzej, a nastepnie przemywa kolumne woda po jonitach. Zebrane eluaty przepuszcza sie, celem odbarwienia, przez komne, wypelniona wymieniaczem Amberlit IRA-401S w formie wodorotlenowej. Wymiary kolumny 5 X65 cm. Wycieki z kolumny laczy sie i zateza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 4,3 litra. Próbke 100 ml zatezono roztworu .liofilizuje sie, otrzymujac 1,6g mieszaniny antybiotyków JI-20 o mocy biologicznej 591 mcg/mg, oznaczonej wzgledem S-aureus wobec wzorca gentamycyny o mocy 1000 mcg/mg. Poniewaz wzieto 1/43 roztworu calkowita wydajnoscjnieszaniny antybio¬ tykówJI-20 wynosi 66,8 g.Przyklad IV. Rozdzial mieszaniny antybiotyków JI-20. 1,5 g mieszaniny JI-20, otrzymanej w przykladzie III, nanosi sie na kolumne z zelem krzemionkowym i eluuje dolna faze mieszaniny chloroformu, metanolu i stezonego roztworu amoniaku (1:1:1). Eluaty z kolumny kontroluje sie, stosujac chromatografie cienkowarstwowa na plytkach pokrytych zelem krzemionko¬ wym, wywolujac bioautograficznie wobec szczepu Staphylocoecu s aureus ATCC 6538P. Frakcje zawierajace poszczególne antybiotyki, laczy sie, zateza do objetosci 60-100 ml i liofilizuje, otrzymujac w kolejnosci schodzenia z kolumny: 30 mg gentamycyny, 740 mg antybiotyku JI-20B oraz 170 mg antybiotyku JI-20A.Czysty antybiotyk JI-20B posiada moc biologiczna 1000 mcg/mg.Przyklad V. Otrzymywanie siarczanu mieszaniny JI-20. 7,5 g mieszaniny antybiotyków JI-20 z przykladu III rozpuszcza sie w 60 ml wody i wartosc pH doprowadza do okolo 4,0 przy pomocy 12 n kwasu siarkowego. Dodaje sie nastepnie wegle aktywnego dla odbarwienia roztworu i calosc miesza sie wciagu 30 minut. Mieszanine saczy sie i przesacz dodaje do 650 ml metanolu. Wytracony osad odsacza sie, przemywa metanolem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w ternperatu-12 90105 rze okolo 55°C. Otrzymuje sie tytulowy produkt o skrecalnoscl wlasciwej [a]2£ = +119° (woda) i,mocy biologicznej 516 mcg/mg.' Przyklad VI. Otrzymywanie chlorowodorku mieszaniny Jl -20. 2,0 g mieszaniny Jl—20 rozpuszcza sie w 15 ml wodyi dodaje podczas mieszania kroplami 6 n kwas solny do wartosci pH = 3,5. Nastepnie calosc miesza sie wciagu 15 minut z weglem aktywnym w celu odbarwienia roztworu. Mieszanine saczy sie i wlewa przesacz do 500 ml acetonu, wytraca sie gumowaty osad,z nad którego dekantuje sie ciecz. Pozostalosc rozpuszcza sie w wodzie i liofilizuje, otrzymujac tytulowy produkt o temperatu¬ rze topnienia 208-213°C (z rozkladem) i skrecalnosci wlasciwej [a]" = 128° (woda).Przyklad VII. Otrzymywanie siarczanu antybiotyku JI-20B. 3,0 g zwiazku JI-20B otrzymanego wedlug przykladu IV, rozpuszcza sie w 24 ml wody i zakwasza do wartosci pH - 4,0 przy pomocy 6n kwasu siarkowego, a nastepnie calosc miesza w ciagu 30 minut z weglem aktywnym, Mieszanine saczy sie, przesacz wlewa do 250 ml metanolu, odsacza wytracony osad, przemywa go metanolem i suszy po zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie siarczan antybiotyku Jl—20B o skrecalnosci wlasciwej [a]2p= + 120° (woda, i mocy biologicznej 758 mcg/mg.Przyklad VIII. Otrzymywanie siarczanu antybiotyku JI-20A.Powtarzajac postepowanie z przykladu VII, dodaje sie kwas siarkowy do wodnego roztworu 1£g antybiotyku JI-20A i otrzymuje tytulowy zwiazek o skrecalnosci wlasciwej [a]2£ - +115 (woda) i aktywnosci 458 mcg/mg.Przyklad IX. Otrzymywanie zasady Schiffa pochodnej oksazolidynowej antybiotyku JI-20B z alde¬ hydem salicylowym.Do 250 mg antybiotyku JI-20B w 10 ml bezwodnego etanolu dodaje sie 0/4 ml aldehydu salicylowego i calosc miesza sie wciagu 48 godzin, po czym zateza sie roztwór do objetosci 5 ml pod zmniejszonym cisnieniem. Zatezony roztwór wlewa sie do 100 ml wody, odsacza wytracony osad i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 186—190°C i skrecalnosci wlasciwej [a]2£ »+161° (etanol).Przyklad X. Otrzymywanie zasady Schiffa pochodneoksazolidynowej antybiotyku JI-20B z aldehy¬ dem benzoesowym.Do 260 mg zwiazku JI-20B w 10 ml bezwodnego etanolu dodaje sie 0/4 ml aldehydu benzoesowego i calosc miesza wciagu 48 godzin. Roztwór zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem do malej objetosci i wlewa do mieszaniny eteru i heksanu. Wytracony osad saczy sie, przemywa heksanem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 155—158°C i skrecalnosci wlasciwej [a]2*- +69° (etanol).Przyklad XI. Otrzymywanie zasady Schiffa pochodnej oksazol idy nowej antybiotyku JI-20B z alde¬ hydem p-chlorobenzoesowym.Do 250 mg zwiazku JI-20B w 10 ml bezwodnego etanolu dodaje sie 425 mg aldehydu p-chlorobenzoeso- wego i calosc miesza wciagu 24 godzin. Roztwór zateza sie do objetosci 2 ml pod zmniejszonym cisnieniem, rozciencza 2 ml metanolu i,wlewa podczas mieszania do 60 ml wody.Wytracony osad saczy sie, przemywa woda i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 161—165 i skrecalnosci wlasciwej [a]2p = +147° (etanol).Przyklad XIL Otrzymywanie zasady Schjff a- pochodnej oksazolidynowej antybiotyku Jl—20B z alde¬ hydem propionowym. 1,0 g antybiotyku JI-20B w 20 ml bezwodnego etanolu ogrzewa sie do temperatury okolo 75°C i dodajac 0,9 ml aldehydu propionowego. Calosc ogrzewa sie w temperaturze 75°C wciagu 18 godzin, a nastepnie zateza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 4 ml. Zatezony roztwór dodaje sie kroplami, podczas mieszania, do 200 ml eteru. Wytracony osad odsacza sie, przemywa eterem i suszy. Otrzymuje sie tytulowy zwiazek o temperaturze topnienia 163-168°C i skrecalnosci wlasciwej [a]2p = + 68° (etanol).Stosujac postepowanie wedlug przykladów IX—XII, ale zastepujac antybiotyk JI-20B równowazna iloscia antybiotykuJI-20A lub mieszaniny Jl—20 otrzymuje sie odpowiednie zasady Schiffa pochodnych oksazolidyno- wych. PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania mieszaniny antybiotyków JI-20A, JI-20B i gentamycyny lub jej poszczególnych skladników, ewentualnie w postaci soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, ze szczep Micromono- spora purpurea JI-20 zwlaszcza szczep NRRL 5467,', hoduje sie w srodowisku odzywczym, w warunkach aerobowych, a nastepnie mieszanine antybiotyków lub jej skladniki izoluje sie znanymi metodami i ewentualnie przeksztalca w sole addycyjne z kwasami.90105 13 2. ' 2. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze proces prowadzi sie w warunkach hodowli podpowierzchniowej, aerobowej. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, albo 2, z n a m i e n n y tym, ze hodowle prowadzi sie w temperaturze 25-38°C przy wartosci pH = 6,7-8, 3. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, z n,a m i e n n y tym, ze izolacje antybiotyków prowadzi sie, zakwaszajac srodowisko fermentacyjne, oddzielajac grzybnie,zobojetniajac srodowisko fermentacyjne i nastepnie ekstrahujac produkt. 5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze ekstrakcje prowadzi sie przy uzyciu wymieniaczy jonowych, 6. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze srodowisko fermentacyjne zakwasza sie, oddziela grzybnie, nastepnie srodowisko fermentacyjne zobojetnia sie, ekstrahuje z niego mieszanine antybiotyków i rozdziela ja na poszczególne skladniki za pomoca chromatografii. Wzór 190 105 R.CH.NH2 NH, -0. Wl OH —0- AOH HO NHZ RCHN'CHRj \0H HO N HO j 0 H3C NHCH3 OH WZÓR la -0- N'CHR i OH N W; 0 MH3 H3C OH WZÓR 290105 I 8.0 7.0 6 0 5.0 4.0 3 0 2 0 1.0 O FIG. 1 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 FIG. 2 (\ W'. JsaH jv. 0.0 70 6 0 5 0 4 0 3 0 2.0 1.0 C FIG. 3 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 '

2.0 10 0 FIG. 4 PL PL PL