PL89869B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych peptydów, majacych wlasnosci regulo¬ wania zawartosci wapnia we krwi, o wzorze ogól¬ nym podanym na rysunku, w którym linia pomie¬ dzy pierwszym i siódmymi aminokwasem oznacza mostek dwusiarczkowy, R oznacza atom wodoru badz tez wolna albo zacytowana grupe aminowa, X oznacza reszte L-imetioninowa albo L-walinowa, W oznacza reszte L-alaninowa lub L-asparagino- wa i/albo A oznacza reszte L-izoleucynowa lub L-treoninowa, i ewentualnie Y oznacza reszte L- -treoninowa lub L-lizynowa, Z oznacza reszte L- tyrozynowa lub L-leucynowa, P oznacza reszte L- fenyloaninowa lub L-leucynowa, Q oznacza reszte L-fenyloalaninowa lub L-tyrozynowa, a U ozna¬ cza reszte L-glutaminowa lub L-argininowa, oraz ich pochodnych soli addycyjnych i zwiazków kom¬ pleksowych.Jako pochodne nowych peptydów nalezy rozu¬ miec zwlaszcza pochodne N«-acylowe oraz dezami- no-l-peptydy.Grupami acylowymi, którymi acyluje sie grupy J?*-ammowe sa reszty kwasów karboksylowych ta- fcicjb jak alifatyczne, aromatyczne, aryloalifatyczne, hjeiwpcykliczne i heterocykliiloalifatyczne kwasy *^bcdcsyiowe, zwlaszcza nizszych jedno- lub dwu- wajtfofciowych kwasów alkilo- lufo aflkenylokajcbo- ksylowych korzystnie nizszych kwasów alkilokar- 'boksylowych zawierajacych 1—4 atomów wegla ta- Icich Jak kwas mrówkowy, octowy, propionowy lub maslowy, a takze kwas akrylowy albo bursztyno¬ wy; alicyklicznych kwasów karboksylowych, na przyklad kwasów cykloalkilokariboksylowych, ta¬ kich jak niepodstawiony lub podstawiony kwas ben- zoesowy allbo ftalowy ewentualnie niepodstawio¬ nyeh ulb podstawionych kwasów arylo- alkilo- al¬ bo — alkenyflokarboksylowych z tym, ze grupa alkilowa jest nizsza grupa alkilowa, takich jak kwas fenylooctowy; jedno- lub dwuwartosciowych podstawionych lub niepodstawionych kwasów he¬ terocyklicznych o 5 lub 6 czlonowych pierscieniach, zawierajacych atomy azotu, siarki i/albo tlenu jako heteroatomy, takich jak kwasy pirydynokaitooksy- lowe albo tictfenokarboksylowe albo kwasów hete- rocykliloalkilokarboksylowych z tym, ze grupa al¬ kilowa jest nizsza grupa alkilowa, takich jak kwas pirydylooctowy albo imidazolilooctowy, których pierscienie zawieraja ewentualnie podstawniki ta¬ kie jak atomy chlorowca, grupy nitrowe, nizsze grupy alkilowe, alkoksylowe albo karboalkoksy- lowe.Takimi grupami acylowymi sa równiez reszty acylowe aminokwasów zwlaszcza a-aminokwasów takich jak grupa glicylowa, L-leucylowa albo L-pi- roglytamylowa, a takze grupy acylowe pochodzace od kwasów weglowych i tioweglowych albo ich estrów lufb amidów, na przyklad grupy alkiloksy- karbonylowe z tym, ze grupa alkilowa jest niz¬ sza grupa alkilowa, takie jak grupa etoksykarbo- nylowa albo Illrz.-butyloksykarbonyIowa, a takze 818693 grupa benzyloksykarbonylowa ewentualnie zawie¬ rajaca podstawniki wymienione wyzej, karbamyIo¬ wa, tiokarbamylowa oraz N-podstawione pochodne grup karbamyIowyeh i tiokarbamylowych takie jak grupa N-alkilokarbamylowa, z tym, ze grupa alki¬ lowa jest nizsza grupa alkilowa, N-fenylokarbamy- lowa albo N-fenylotiokarbamylowa.Jako sole addycyjne nowych peptydów z kwasa¬ mi nalezy rozumiec zwlaszcza sole kwasów dopusz¬ czalnych farmakologicznie takich jak kwas solny, octowy, siarkowy, fosforowy .albo kwasy sulfono¬ we zwlaszcza kwasy aikilosulfonowe z tym, ze gru¬ pa alkilowa jest nizsza grupa alkilowa, takie jak kwas benzeno — albo toluenosulfonowy.Jako zwiazki zespolone nalezy rozumiec zwiazki o nieustalonej strukturze, które powstaja po doda¬ niu odpowiednich substancji nieorganicznych albo organicznych do dlugolancuchowych peptydów, przedluzajac ich okres dzialania farmakologicznego.Takie substancje sa przykladowo opisane dla ACTH i dla innych peptydów o dzialaniu adreno- kortykotropowym. Jako takie wymienic nalezy zwiazki nieorganiczne pochodne 'metali takich jak wapn, magnez, glin, kobalt i zwlaszcza cynk, szczególnie trudnorozpuszczalne sole takie jak fo¬ sforany, piro- i polifosforany oraz wodorotlenki tych metali a takze polifosforany metali alkalicz¬ nych takie jak Calgon N, Calgon 322, Calgon 188 albo Polyron BI2. Substancjami organicznymi, które przedluzaja w czasie dzialanie nowych peptydów sa przykladowo zelatyny nieantygenne takie jak polioksyzelatyna, poliwinylopiroliden albo karbo- ksymetyloceluloza, a takze estry kwasu sulfono¬ wego albo fosforowego kwasu alginowego, dekstra¬ nu, poljfenoli i polialkoholi zwlaszcza fosforan poli- floretynowy i inozytoszesciofosforan a takze poli¬ mery i kopolimery zasadowych i zwlaszcza kwas¬ nych aminokwasów takich jak protamina alko kwas poliglutaminowy.Nowe zwiazki otrzymuje sie z substancja wytwo¬ rzonych w znany sposób, przez kondensacje po¬ trzebnych do ich budowy aminokwasów z wytwa¬ rzaniem wiazan CONH w dowolnej kolejnosci w czasie, z tym, ze grupy funkcjonalne nie biorace udzialu w reakcji kondensacja przejsciowo ochra¬ nia sie i ze w odpowiednim czasie utlenia sie gru¬ py cysteinylowe do grup cystynylowych.Nowe zwiazki otrzymuje sie zwlaszcza: 1/ Przez odszczepienie grup ochronnych ze zwiaz¬ ków o wzorze ogólnym 1: I : : 1 H-Cysi-Gl^-AspNHaS-Leu^Se^-Tre^Cys^KS-Leu9- -Gli^-Tre^-Tyr^-Tre^-GluNH^4-Asp15-Fen18- AspNH217-Liz18-Fen19-His2«-Tre21-Fen82-Pro28-Glu- NH224-Tre25-Ala26-Ileu27-Gli28-Wal29-Gli8°-Ala81- -Pro82-NH2, w którym X ma takie samo znaczenie jak podano wyzej, a grupa L-alanylowa26 jest za¬ stapiona grupa L-asparagilowa i/lub grupa L-izo- leucylowa27 jest zastapiona grupa L-treonylowa i w których ewentualnie jeden lub kilka aminokwa¬ sów w polozeniach 11, 12, 16, 19, 22 i 24 jest za¬ stapionych wyzej wymienionymi aminokwasami, albo z ich pochodnych, w których to zwiazkach co najmniej jedna grupa aminowa albo karboksy- 89 869 4 < ~ Iowa jest chroniona przez dajace sie odszczepiac grupy,albo r\ ¦ 2/ przez utlenienie do dwusiarczków i w fcazie potrzeby przeprowadzenie otrzymanego peptydami- du w jego sól addycyjna z kwasem albo w zwia¬ zek zespolony zwiazków o wzorze ogólnym: H-Cys^Gi^-AspN^-Leu^Sei^-Tre^-Cys^KS-Leu9- -Gli^-Tr^^Tyr^-Tre^-GluNHa^-Asp^-Fen11- -AspNHg^-Liz^-Fen^-His^-Tre^-Fen^-Pro28- io -GluNH224-Tre2«-Ala2«-Ileu27-Gli28-Wal29-Gli80-Alasl- -Pro82^NH2, w którym X ma takie saime znaczenie jak podano wyzej, i grupa L-alanylowa28 jest za¬ stapiona grupa L-asparagilowa i/lub grupa L-izo- leucylowa27 jest zastapiona grupa L-treonylowa i w którym ewentualnie jeden lub kilka aminokwasów w polozeniach U, 12, 16, 19, 22 i 24 jest zastapio¬ nych aminokwasami wymienionymi wyzej, albo ich pochodnych, w których to zwiazkach grupa mer- kapto — jest ewentualnie ochroniona przez grupe trójfenylometylowa albo acylamidometylowa.Do syntezy substancji wyjsciowych, które przez odszczepienie grup ochronnych daja peptydy, któ¬ rych sposób otrzymania jest przedmiotem wyna¬ lazku, oraz wszystkich pólproduktów stosowanych do otrzymywania substancji, które po utlenieniu daja te peptydy wykorzystywane sa zwlaszcza w syntezie elementów dlugolancuchowych tych pep¬ tydów grupy ochronne, które latwo odszczepiaja sie w wyniku reakcji takiej jak hydroliza, redukcja, aminoliza albo hydrazynoliza. Jako grupy chronia¬ ce grupy aminowe mozna wskazac przykladowo grupy aryloalkilowe, których czlon alkilowy jest nizsza grupa alkilowa, ewentualnie podstawione w pierscieniu atomem chlorowca, grupa nitrowa albo nizsza grupa alkilowa lub aikoksylowa, takie jak grupa dwufenyloimetylowa albo trójfenylometylowa, na przyklad grupa benzhydrylowa, trójfenylomety¬ lowa, dwuparametoksybenzhydrylowa, albo gru¬ py acylowe takie jak grupa formyIowa, trójflu- 40 oroacetylowa, ftaloilowa, p-toluenosulfonylowa, benzylosulfonylowa, bezenosulfenylowa, o-nitrofeny- losulfenylowa albo zwlaszcza grupy pochodnych kwasu weglowego albo tioweglowego, na przyklad grupy kanbobenzoksylowe, ewentualnie podstawdo- 45 ne w pierscieniu aromatycznym atomem chlorow¬ ca, grupa nitrowa albo nizsza grupa alkilowa, ai¬ koksylowa lulb karboaikoksylowa, takie jak grupa karbobenzoksylowa, p-bromo- lub p-chiloirokarbo- benzoksylowa, p-initrokarboibenzoksylowa albo p- 50 -metoksykarbobenzoksylowa; barwne grupy benzy- loksykaribonylowe takie jak grupa p-fenyloazoben- zyloksykarbonylowa i p-/p'-imetoksyfenyloazo/-ben^ zyloksykarbonylowa, toliloksykarbonylowa, 2-feny- loizopropyloksykaiibonylowa, 2-toliloizopropyloksy- 55 karbanylowa, albo zwlaszcza 2-/para-bifenylilQ/-2- -propyloksykarbonylowa oraz alifatyczne grupy o- ksykarbonylowe takie jak grupa alliloksykarbonyIo¬ wa, cyklopentyloksykarbonylowa, Illrz.-amyloksy- karbonylowa, adamantyloksykarlbonylowa, izoborny- 6o loksykatfbonylowa, 2,2,2-trójchloroetylctoykarbóny- lowa, 2-jodoetoksykarbonylowa, a zwlaszcza nirz.- -butyloksykarlbonylowa, a takze karbamylowa, tio¬ karbamylowa, N-fenylokarbamylowa, albo N-feny¬ lotiokarbamylowa. 65 Grupy aminowe moga byc równiez chronione zaM6C6 po«M*ca grap e^aminowych, które otrzymuje sie w wyniku reakcji grupy aminowej z 1,3-dwuketona- mi takimi jak bea%zoiioaceton, acetyloao«4on albo dimedon.Grupy kartoksyjowe chrom* sie przez tworzeni grup amidowych, hydrazydowych albo pfzez estry* fikacj$.Grupy «amidgw£ ajbo hydrajfy^owe moga byc ewrotartpie po^J&wjone, • na prz/Wad am^ows grupa s^^w^np^^ybeozytewa *-- aHao feWj^*"ne- toksyfenylo/-flnetylowa, a hydrazydowa grupa ikar- bobenzoksyiewa, ibrópohtafioetyJoKsyfearb^yJ^wa, trójjfly^oacejylgwa, trój|a^ykm€tyitew;a, JIJ#z,rby- tyloksykartopnylowa albo 2-/p-W«^WW-izopropy- toteyfca^bonyaowa. ^^i&acjs pr**pFfiwadza sie za pomoca naszych ew&atuajnia ©BdafcwiojiKn alkaaoH, takich jak me- tanej, *£a&0i,. alkohol /cyjwioroetylowy, 8;2,$*trój- chloroetanol, 2-jod.OfttanoA, *lfcofeo£ bantoilenatiy^- wy, att» zwlaszcza IJJrz.-^tanol, a iatofce aryteai- kanoli zwlaszcza tych, których czlon alkilowy Jest nizsza £rwa aJJcUow*., na jrzyk**d al&ohal *an*y^ lowy a'Jlo foenzhydrclowy,. .^wmtuilahi pa&tawipi- ne ni&gza grupa alkilowa flifcoksyjowa. alfc) atomami .chlorowca, takie jak alkohol prfutwifeen-- zylowy, ^-meto^yfeenzylowy ajbo &4,Mrójime$yJp- beazyjpwy; fejaoji i Upfenol^ ewentualnie pods-ta- wignych zwiazkami majacymi powinowactwo do elektronów, takich jak jfenol, fosami, t|okr*zpl, P- -nitrotiotenol, 2,4,5- i 24£4r^cblorQfenal, pi$tóo* chiprofeuol, p-jaHrpfenpJf a^wu^ofrnoi, ja-reyja- noifepol albo p-metenosujfonylcrfenol, a takie N^hy* drofcyimid^m kwasu bureztypowego, ^^ycfcejksy- imjdem kwasu ItaJowego., #-hydxoksypiperydyna aifcp ^-byd^oteychiopJiiaa.QrmP7 wpdonptjewwe jLP$y stylowej, jt#e#ayjG- wej _albp tyripzylowej chroni sje prze* ich ^stry^ kacje. ^bP eteryiitoaoje, Qw^ acyjtowymi ftfce sowanyjrai w -reakcji esfrylikacji s% n&m jrugy alka&oitowfi tekie j#k grupa ac^tyj^wa, grupy ary- loUow^ taikie jak grupa )mmkwa i «wja^?za grupy pochodnych kwasu wgglowego te^ kie jak grypa fcei^Jkrt^ a&e etyto- ksykarbonylowa.W reakcji eteryttkacji ^tojswje ^ tafcie gri^py jak gru#a henz/tava, czte^woó^r^piewyte^a j*lfco IlJrz^bUtytowa. Po ochrony jjipp w^Ktoipflenawycli nadaja si$ rówsnjes jgrwy opi»ne p**zez Wej^a&da w £ej, 1AQ /10S77, 3838.^3349; Mi**ti?6jSvm^^ -lUjrzr-^^ — ajfep lntoanzy- lOkgykftr^nyloamlpoftyiloWa. ,Qjwy w©*w^j3^9we nie ^usz^ feyc jednak konjteczm^ iehiro«i^«ie.GrmRy meribapio w grupie «y»teMyJm^ej obroni sie za pompce acylowanja albo aJkJtow^i^a.Acylow^nie przeprowadza sj^ za pomeea ^^p takJwA Jajc .^upa ac&ytowa, h&mnlowfi, ^tyiokar- baanyjow^ -alfep ika^bpbenzoksyiowa ewiei^^aaoie za^ wferajaca pod3JUw«aiki, A&iluje *ti .za 'pcfm^a gmp &k&b j#k grupa m^^butyio* lufo bmw^iGmsiytews* $M& trupy arylometyiowe, tajcie jak .grupa Ib^n*y3hw»ra, pHErt- tro*?enzylpwa .dwuSe^yJoucietylowi, *8^wo«laksy^ bee^y^roicwa -ai^o W^^ylom^tyie^^, a takie grypa fenyioc^lq^k^ik^ helTsylowa i inne /patrz. $,er, |#l /iWfiW, 1^1/Mnr»« na przyklad grupa acylamidometylowa /patrz Te- trahedjpon 3tteafs Nr 26 /1»68/ 30&7 albo opis pa- te»towy BFtf Nr 2O6OW0/.Qr*pa aoylamidometyl^wa jest grupa o wzone T^Hr-^H-OOt-R, w którym CXD—R oznacza gru¬ pe aeylowa kwaou kasiboksylowego "takiego jak ali¬ fatyczny, aatomaaiycflny, aryloadifatyczoy albo hete- rocykiicz»y kwas kariboksylowy, albo pochodna kwasu w^owego tafea jak grupa estrowa kwasu i# wajiowe^o iub fentbawiinowego. R oznacza zwlaszcza nizsza grupe alkilowa, ewentualnie zawierajaca pottóftw^jk^ taka J*H ,«rupa metylowa, etylowa, pjfipyJ^wa., if^pro^ylowa, aHbutylowa aiibo HJrz.^ -butyJ^wa a i«(iai«arn4ka«u na przyklad sa: atom i* chlojru aibo firupa il«6Jfl»orometyiowa lub nitrowa.R oznacza równiez grupe cykloalkilowa, ewentuaib- ni* iej pGgh^&na, »»wiei^|^eja 3-H8, korzyaitnie 5r^6 ataków w ©i^fffei^Biu, tetoA jak grupa cyMopentyr lo^ft. %ttQ ^ytó^ek«y^awa a^bo grupe aromatyczna 2« l^b l^ftoaiilfttyoj^ft, ^wenjaisalnie ieh poebodne, w których pi£*Scj$n aronuttycway korzystnie jest pierr seteitfem bfil^eliowym, zwlaszcza grupe fenylowa albo towsytowa, ew^ituajmifi icfi pochodne, takie jftk Mm&l f^nylewa luib ibenzyfrwm ewentualnie zfiWiwoaiac/i w -ezjfonie fenylowym atom jehlorowoa aibp wfe*ft jgrui^ alkiiowa lub aJkoksylowa albo grwe etl^Wfi, fibo gr^pe bet^rocykUloiKa, korzyatr- nie je4nocyklic«aa, taka jak grupa tienyflowa albo fu^yl^wa,, ^wentjiainie zawierajaca podstawniki wy*- gg r^«nta&e wy*ej. d&ntpa a«ylamidemetylowa rmoze byc zwlaszcza grupa acetyloamidometylowa. Grupa imanowa gru¬ py jbysty^dyJtewej nie musi byc koniecznie chronio¬ na, flie 'korzystnie chroni sie ja za pomoca takich grup tek benzylowa, trójlenylometylowa, karboben-. zcj^yl^wii, ja^am^ntyioksyka^boaylowa albo jedna z wy^ej fwysmianionych grup Wey^gand^a.Wymiandone wyzej grupy ochronne odszczepia sie w«znany sposób. Grupe kanbebenzoksylowa od- 45 szczepia *ie za pomoca hydroge^olizy, grupe N- -tcojtfenylometylowa — za pomoca kwasu mineral¬ nego takiego jak fluorowodór lub korzystnie chlo- rowojd^r albo 'kwasu organicznego takiego jak kwas mrdwtowy, oetawy chloreoetowy albo trójfluoro- 50 ootowsr w bezwodnym troj&uoaroetanolu, jako roz- pusz«£alniku, ewentualnie w mieszaninie z woda, aiteo wodnego -roltworu kwasu oetowego, grupe IHrL^wityJoksykarbonyiewa — za pomoca kwasu trójfluoiBooetowogo albo solnego, grupe 2-/p-bife- « nylilo/«iziop»0.pyloksytea*boftylowa — za pomoca wodnego roztworu kwasu eetow«go albo mieszani¬ ny lodowatego kwasu octowego, 82,2% kwasu mrów- kawajo i wody yT7:l4fi/. fister metylowy przeprowa¬ dza aie w hj^drazyd dzialaniem wodzianu hydra- 55 zyny. EstflfrWB ^grupy metylowe lulb etylowe hydró- lizuje «ie rowienezonj^n roztworem wodorotlenku sodowego. Estrowa albo eterowa grupe Illrz.-buty- lowa odszjC«epia aie za pomoca kwasu trójfluoro- octogirego. 60 W przypadku otrzymywania peptydów sposobem wedlug wynalazku przez odszczepienie grup ochron¬ nych koray«Uvi« chroni sie grupe karboksylowa w la^auehu feocenym i ewentualnie krancowa grupe kajbofcsyiowa przez estryUikacje IHrz.-lbutanolem, 65 natomiast g grupa IIIrz.Hbutylpksykairtonylowa? grupy wodoro¬ tlenowe w grupie serylowej, treonylowej i tyiozy- lowej, o ile wlasnie akurat wymagaja ochrony, przez eteryifikacje nirz.-butanolem i w razie po¬ trzeby grupe iminowa grupy histydylowej — grupa 2,2,2-trójifluoro-l-IIIrz.-butylctoyikaj±Knyloamino- etyJowa. Wszystkie wymieniona grupy ochronne mozna w razie potrzeby odszczepiac jednoczesnie . za pomoca kwasnej hydrolizy aa przyklad za po¬ moca kwasu trójfluorooctowego, solnego albo flu¬ orowodorowego.Stosowany jako substancja wyjsciowa do otrzy¬ mywania peptydów sposobem wedlug wynalazku, peptyd o otwartym lancuchu moze byc korzystnie otrzymany z grupami ochronnymi takimi jak opi¬ sano wyzej.Grupy merkapto korzystnie chroni sie za pomoca grupy benzylowej, trójfenylometylowej albo acy- lamidometylowej. Grupy S-trójfenylometylowe moz¬ na selektywnie odszczepic z ochronionego peptydu w rozpuszczalniku organicznym za pomoca octanu rteciowego i siarkowodoru z zachowaniem grup odszczepianych za pomoca kwasu trójfluorooctowe- go. Grupy S-benzylowe odszczepia sie selektywnie z ochronionego peptydu za pomoca sodu w cieklym amoniaku. Grupy S-acylamidometylowe usuwa sie przez mieszanie ochronionego peptydu, korzystnie w temperaturze pokojowej, w wodnym roztworze soli metalu ciezkiego, rozpuszczalnej w wodzie, ta¬ kiej jak octan albo azotan rteciowy, srebrowy, kadmowy, cynkowy albo sól organometaliczna me¬ talu ciezkiego.Oprócz wody stosuje sie równiez inne rozpusz¬ czalniki takie jak metanol, dwumetylotformamid albo mieszaniny tych rozpuszczalników. W kazdym przypadku otrzymuje sie ochroniony peptyd z wol¬ nymi grupami merkapto, który mozna utlenic do ochronionego dwusiarczku za pomoca jodu w lo¬ dowatym 'kwasie octowym, dwujodoetanu w orga¬ nicznym rozpuszczalniku albo tlenu atmosferyczne¬ go w cieklym amoniaku. Grupy merkapto korzyst¬ nie chroni sie za pomoca grup trójfenylometylo¬ wych albo acylamidometylowych i usuwa sie je z ochronionego peptydu z równoczesnymi wytworze¬ niem mostka dwusiairczkowego za pomoca.jodu w metanolu albo w kwasie octowym. Tworzenie pierscieni dwusiarczkowych przeprowadza sie na etapie syntezy czlonu zawierajacego obie grupy cy- stednylowe na przyklad dekapeptydu 1—10 albo na etapie syntezy amidu dotriakontapeptydowego.Podczas syntezy pochodnej N-acylowej grupy a- cylowe moga byc wykorzystane do ochrony grup aminowych. Otrzymany peptyd mozna nastepnie przeprowadzic w znany sposób w jego sól addy¬ cyjna z kwasem i/albo w zwiazek zespolony.Synteze soli addycyjnych z kwasem przeprowadza sie w znany sposób.Takzesynteze zwiazku zespolonego przeprowadza sie w znany, albo w analogiczny do znanego spo¬ sób.Zwiazki zespolone z substancjami nieorganiczny¬ mi takimi jak trudnorozpuszczalne zwiazki metali takich jak glin albo cynk korzystnie wytwarza sie w analogiczny sposób jak opisano dla ACTH na przyklad w wyniku reakcji z rozpuszczalna sola odpowiedniego metalu taka jak chlorek lub siar¬ czan cynkowy i wytracenie fosforanem i/albo- wo¬ dorotlenkiem metalu alkalicznego.Zwiazki zespolone z substancjami organicznymi takimi jak polioksyzelatyna, kaifocksymetylocelu- loza, poliwinylopiroladon, .polifosforan floretynowy albo kwas poliglutaminowy wytwarza sie przez mie¬ szanie tych substancji z peptydem w roztworze wodnym. W taki sam sposób wytwarza sie takze W nierozpuszczalne zwdazid z polifosforanami metali alkalicznych.Przedmiotem wynalazku jest równiez takie wy¬ konanie syntezy,^ w której substancja wyjsciowa jest produkt otrzymany w dowolnym etapie spo- l? sobu wedlug wynalazku i przeprowadza sie tylko brakujace etapy albo reakcje syntezy przerywa sie na dowolnym etapie i/albo wytwarza sie sub¬ stancje wyjsciowa in situ i/albo stosuje sie sub¬ stancje wyjsciowa w postaci soli.Peptydy stosowano jako substancje wyjsciowe w sposobie wedlug wynalazku wytwarza sde przez laczenie poszczególnych aminokwasów, w razie po¬ trzeby stosujac latwo'Odszczejpialne grupy ochron¬ ne, albc^ tez wstepnie wytworzonych mniejszych ^ czlonów peptydowych1 w odpowiedniej kolejnosci, z tym, ze ewentualnie na odpowiednim etapie syn¬ tezy wytwarza sie mostek dwusiarczkowy. Synteze dlugolancuchoWego peptydu przeprowadza sie we¬ dlug znanych sposobów z uwzglednieniem mozli- wosci wytworzenia mostka dwusiarczkowego.Laczenie aminokwasów i/albo czlonów peptydo¬ wych'odbywa sie w ten sposób, ze na przyklad aminokwas albo peptyd zawierajacy ochroniona grupe ct-aminowa i aktywowana krancowa grupe karboksylowa poddaje sie reakcji z aminokwasem albo peptydem zawierajacymwolna.grupe a-amino¬ wa i wolna krancowa grupe karboksylowa albo ochroniona przez estaryfikacje lu/b w postaci amidu, albo aminokwas lub peptyd zawierajacy aktywo- 40 wana grupe a-aminówa i ochroniona krancowa gru¬ pe karboksylowa poddaje sie reakcji z aminokwa¬ sem albo .peptydem zawierajacyiii wolna krancowa grupe karboksylowa i ocnroniona grupe ct-a wa. 45 Grupe karboksylowa aktywuje sie przeprowadza¬ jac ja na przyklad w azydek, bezwodnik, imidazo- lid lub izóksazolid kwasowy albo aktywowana grupe estrowa taka jak cyjanometyloWa, karboksy- metylowa, p-nitrofenylotio estrowa, p-nitrofenylo- 50. wa* 2,4,5-trójchlorofenylowa, pieciochlorofenylowa, N^hydroksyimidu kwasu bursztynowego, N-hydró- ksyimidu kwasu ftalowego, -8-hydroksychinollnowa albo ^N-hydroksypiperydynowa, albo w Wyniku re¬ akcji z karbodwuimidem /ewentualnie lacznie z N- 55 -hydroksyimi-dem kwasu bursztynowego albo z 1- -hydroksybenzotriazolem ewentualnie podstawionym atomem chlorowca albo grupa metyloWa luJb metó- ksylowa/, albo z N,N'-karbonylibdwuimidazolem.Grupe;aminowa ^aktywuje sie na przyklad w wy- 60 niku reakcji z amidem kwasu fosforawego. Jako najdogodniejsze mozna Wskazac nastepujace meto¬ dy: taurlbodiwuinudowa* azydowa, aktywowanych estrów i bezwodnikowa a takze metode Merrifieldfa; oraz metode. anhydrc^N-karboksylowania, albo 65 anhydro-W-tiókarbóksylowania. --• ¦89869 9 Synteze substancji wyjsciowych korzystnie prze¬ prowadza sie w ten sposób, ze wychodzi sie z czlonu zawierajacego pierwszych 10 N-krancowych aminokwasów i kondensuje sie go z czlonem za¬ wierajacym reszte aminokwasów korzystnie w re¬ akcji Weygand'a — Wiinscha.Wymieniony wyzej czlon mozna równiez laczyc z czlonem zawierajacymi aminokwasy znajdujace sie w polozeniach 11—28 z wolna krancowa grupa karboksylowa, a nastepnie skondensowac otrzyma¬ ny oktakozapeptyd z czteropeptydem zawierajacym aminokwasy znajdujace sie w polozeniach 29—32, na przyklad za pomoca reakcji WeygancTa — Wiinscha.Ponizej podano korzystny sposób syntezy pepty- du o wzorze ogólnym 1, w którym X oznacza gru¬ pe L-metionylowa.N-krancowy dekapeptyd /l—'10/ moze byc otrzy¬ many w sposób opisany w Helv. 53, 556, /1970/.Czlon zawierajacy aminokwasy, znajdujace sie w polozeniach 11—32, który kondensuje sie z N-kran- cowym dekapeptydem /l—107, syntetyzuje sie przy¬ kladowo z czlonów zawierajacych aminokwasy w polozeniach 11—16, 17—20, 21—23, 5J4—28 i 29-^32.Czlon zawierajacy aminokwasy znajdujace sie w polozeniach 24—28 moze byc na przyklad zsyntety- zowany stosujac korzystnie metode aktywowanego estru do polaczenia aminokwasu, znajdujacego sie w polozeniu 27 /Tre/ z aminokwasem znajdujacym sie w polozeniu 28 /Gli/, do dwuskladnikowego czlonu przylacza sie aminokwas wystepujacy w po¬ lozeniu 26 /AspNH8/, po czym do otrzymanego trój¬ skladnikowego czlonu przylacza sie aminokwas wystepujacy w polozeniu 25 /Tre/ i nastepnie ami¬ nokwas znajdujacy sei w polozeniu 24 /GM/. Grupy wodorotlenowe grupy treonylowej moga bfc chro¬ nione przez eteryfikacje IIIrz.-butanolem.Czlon zawierajacy aminokwasy wystepujace w polozeniach 24—28 z ochroniona grupa aminowa grupy glutamylowej i wolna grupa kaiiboksylowa grupy glicylowej laczy sie z czlonem zawierajacym aminokwasy wystepujace w polozeniach 2?—32: H-WalnGli-Ala-IPro-NH, /Helv. 53, 2135 71*70/ ko^ rzystnie wedlug metody karlbodwuimddowej z N- -hydroksyimddem kwasu bursztynowego.Po odszczepieniu grupy ochronnej z grupy ami¬ nowej glutaminy czlon zawierajacy aminokwasy znajdujace sie w polozeniach 24—32 laczy sie ko¬ rzystnie wedlug metody kailbodwulmidowej wobec N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego z czlonem zawierajacym aminokwasy wystepujace w poloze¬ niach 21—23: Z-Tre/tBu/nFen-Pro-OH /Helv., 53, 2135/1970//.Polaczenie czlonu zawierajacego aminokwasy, wy¬ stepujace w polozeniach 17—20: Z-Asp, NH,-Liz- /Boc/-Fen-His-NHnNHf /Helv. 53, 2135 /1970// z czlonem zawierajacym aminokwasy wystepujace w polozeniach 21—32, pozbawionym grupy Z chronia¬ cej grupe aminowa nastepuje na przyklad metoda azydowa.Po odszczepieniu grupy Z chroniacej grupe ami¬ nowa asparaginy czlon zawierajacy aminokwasy wystepujace w polozeniach 17—32 w celu skomple¬ towania fragmentu 11—32 laczy sie z czlonem za¬ wierajacym aminokwasy wystepujace w polozeniach 1# 11—16: Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre-/tBu/-GluNHf-Asp- /OtBu/-Fen^NHNH1 /Helv. 53, 2136 /1970/, korzyst¬ nie metoda azydowa.Polaczenie wyzej opisanego czlonu, zawierajace- s go aminokwasy wystepujace w polozeniach 11—32 z czlonem zawierajacym aminokwasy wystepujace ' I. .' .. ¦¦/¦ ~— w polozeniach 1—(10: Boc^Cys-Gli-AspiNHt-Leu-Ser- -/tBu/-Tre/tBU/^Cys-Met-Leu-Gli-OH /Eelv. 53, 556 (1970// przeprowadza sie korzystnie stosujac metode karbodwuimidowa z N-hydroksyiitóidem kwasu bur¬ sztynowego.Odszczepienie wszystkich wystepujacych jeszcze grup ochronnych przeprowadza sie korzystnie w is kwasie trójfluorooctowym albo w stezonym kwa¬ sie solnym, otrzymujac peptyd, zawierajacy AspNH2*-Tre".W zaleznosci od wybranego sposobu syntezy o- trzymuje sie nowe zwiazki w postaci zasad albo ^ ich soli. Z soli otrzymuje sie w znany sposób za¬ sady. Z zasad w wyniku reakcji z kwasami, które nadaja sie do otrzymywania soli dopuszczalnych terapeutycznie otrzymuje sie sole, a mianowicie z kwasami nieorganicznymi takimi jak cWLorowco- wodorowe, na przyklad kwas solny, bromowodoro¬ wy, nadchlorowy, azotowy, tiocyjanowy, siarkowy, fosforowy, albo z kwasami organicznymi takimi jak kwas mrówkowy, octowy, propionowy, gliko- lowy, mlekowy, pirogronowy, szczawiowy, malono- wy, bursztynowy, maleinowy, fumarowy, jablko¬ wy, winowy, cytrynowy, askorbinowy, hydróksyma- leinowy, dwuhydroksymaleinowy, benzoesowy, fe¬ nylooctowy, 4-aminolbenzoesowy, 4-hydroksybenzo- esowy, antranilowy, cynamonowy, migdalowy, sali- cylowy, 4-amniosa'licylowy, 2nfenokBybenzoesowy, 2-acetoksybenzoesowy, metanosulfonowy, etanosul- fonowy, hydroksyetanosulfonowy, ibeneenosulfonowy, p-tpluenosuil!fonowy, naftalenosullonowy, albo sul- fanilowy. 40 Nizej zamieszczone przyklady ilustruja blizej wy¬ nalazek. Temperatury podano w stopniach Celsju¬ sza.W chromatografii cienkowarstwowej zastosowano nastepujace uklady rozpuszczalników: uklad 43C: Illrz.-alkohol amylowy : izopropanol: :woda £1:21:28/ uklad 45: IIrz.-butanol: 3% roztwór wodny amo¬ niaku /70:3O/ uklad <52: n-butanol: lodowaty kwas octowy: ^ :woda /75:7,5:21/ uklad 52A: n-butanol: lodowaty kwas octowy : : woda /67:10:23/ uklad 70: octan etylu : pirydyna : woda /40:20:40/ 55 Warstwa górna. uklad 80: octan etylu : aceton : woda /72:24:4/ uklad 06: Ilra^butanoi: lodowaty kwas octowy : Ywoda/67:10:23/ uklad 100: octan etylu : pirydyna : lodowaty kwas w octowy : woda /62:21:6:11/ uklad 101A: n-butanol: pirydyna : lodowaty kwas octowy:woda /42:<24r4:$0/ uklad 10*2A: octan etylu:keton metylowo-etylowy : :kwas mrówkowy :.woda /50:30:10:10/ 85 uklad 107: octan etylu : pirydyna: woda /49:24:27/ 45 5011 uklad 112E: n-bHitanol : pirydyna: kwas mrówko¬ wy : woda /44:24:2:20/ uklad 121: izopropanol: 25% wodny roztwór amo¬ niaku : woda /70:10:20/ uklad 121A: izopropanol : 25% wodny roztwór amo¬ niaku : woda /85:5:19/ Wartosci Rf dla chromatografii cienkowarstwo¬ wej: — DS: na plytkach silikazelowych SiL 254, firmy Antec Birsfelden — DC: na plytkach celulozowych, firmy Merck, Darmstadt — DA: na plytkach Alox /45 g Al^O, firmy Camag, Muttenz+3,5 g gipsu, grubosc 0,3 nim/ W przykladach zastosowano nastepujace skróty: Boc = grupa iIIrz.-butyloksykarbonylowa Z = grupa karibolbenzoksylowa OtBu = ester IIIrz.4utylowy ONp = ester p-nitrofenylowy Orne = ester metylowy OSu = ester hydroksyimidu kwasu bursztynowe¬ go tBu = eter Illrz.-butylowy Bmp = grupa |3-merkaptopropionylowa DMF = dwumetylofonmamid.I Przyklad I. Chlorowodorek H-Cys-Gli- —— 1 -AfipNH2-I-eu-Ser-Tre-CysHMet-Leu-Gl(i-Tre-Tyr- -QluNH£-Asp-Fen-A6pNH2-Liiz-Fen-His-Tre-Fen- -Pj39-GlulNH£-Tre^AspNH2-Tre-CJld-Wal-Gli-Ala- -Pro^iNHfi I mg Bac-Cys-Gli-AspNH2-Leu-Ser-/tBu/-Tre- 1 /ftBu/-Cys-Met-Leu-Gli-Tre/tBu/-TyT/tB.u/-Tce/tBu/- -GluNH2-Asp/OtBu/-Fen-AspNH2-Liz/iBoc/-iFen-His- -Tre/tBu/-Fen-Pro^Ga'UiNHj-Tre/tBu/-AspNHj-T^e- /tBu/-GOi-WalHGU-Ala-Pro-NH2 rozpuszcza sie w temperaturze 0° w 1,2 ml najczystszego 12 n kwa¬ su solnego, w ciagu 1—2 minut, po czym przez otrzymany roztwór przepuszcza sie krótko azot i pozastawia ma 10 minut w temperaturze 0°. Na¬ stepnie oziebia sie roztwór stalym dwutlenkiem wegla, odpowietrza w wysokiej prózni i zateza do gestego syropu powoli podnoszac jego temperature.Otrzymany syrop rozpuszcza sie w 2 ml wody, tio- ffi'lizuje, pozostalosc jeszcze raz liofilizuje sie z 2 ml wody i nastepnie suszy jsie na powietrzu. Tak o- trzymany produkt jako bezpostaciowy proszek, roz¬ puszczalny w wodzie jest chlorowodorkiem pep- tydu zawierajacego AspNiy^-Tre27, wykazujacy w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci tRf:DC:Rf/45/-0,45; Rf/lQlA/=^0,53; Rf/U12E/=0,39.Rezultaty elektroforezy cienkowarstwowej .dla o- trzyunanego zwiazku na plytce celulozowej przy wartosci pH=l;9 i spadku napiecia — 16 V/cm: dlugosc drogi przeTsytej w kierunku katody w cia¬ gu 1,5 godziny wynosi okolo "3/7 cm.Ochroniony dotriakontapeptydamid wyitwarza sie w nastepujacy sposófo: a/ Z-Tre/tlBu/-GiliOMe 22,3 g Z-Tre/tBu/-OSu d 8J2& g HC1 • H-GIMDMe rozpuszcza sie albo sporzadza zawiesine w 100 ml dwumetyloformaimidu, po czym dodaje sie 7,49 mj N-metylomorfoliny, miesza utrzymujac w tempe¬ raturze 22° w ciagu 1 dnia i odparowuje sie do sucha w wysokiej .prózni. Pozostalosc po odparo¬ waniu rozpuszcza sie w octanie etylu, kolejno pxze- mywa 5% "kwasem cytrynowym, 5% roztworem wodnym KHCOs i woda, suszy nad siarczanem so¬ dowym i zateza ido sucha. Oleista pozostalosc utrzy¬ mywana w ciagu nocy w temperaturze 0° krysta¬ lizuje. Otrzymany dwupeptyd topnieje w tempera- io turze 48°, nie daje sie rozdzielic chromatograficz¬ nie i mozna go bezposrednio stosowac w dalszych etapach syntezy.Otrzymany zwiazek wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf:DS: !5 :Rf/45/=0,77; R^chloroform-metanol=9:1/=0,7.0. b/ H-Tre/tBuZ-G-n-OMe.HC1 ,0 g Z-Tre/tBu/-Gli-OMe rozpuszcza sie w 200 ml metanolu i dodaje 13,2 ml i n HO oraz 0,5 g wegla palladowanego /10% Pd/, po czyim uwodarnia sie do stanu nasycenia z absorpcja C02. Nastepnie od¬ sacza sie katalizator i zateza roztwór do sucha, w wyniku czego otrzymuje sie biala pianke. Otrzy¬ many produkt wykazuje w chromatografii cienko¬ warstwowej nastepujace wartosci RF:DS:Rf/45/= = 0^64; R^chloroform :metanol=9:l/=0.,41; Rf/l52/= = 0,42. c/ Z-AspNH2-Tre/tBu/-Gli-OMe: 18,9 g Z-AspNHjHO(Np i 12,5 g H-Tre/tBu/-Gli- -OMe-HCl rozpuszcza sie w 95 ml DMF. Do otrzy- manegó roztworu dodaje sie 4,6 ml N-metylomorfo- liny i pozostawia miszanirie reakcyjna w tempera¬ turze -pokojowej na 15 godzin, po czym odparowuje sie z niej rozpuszczalnik w wysokiej prózni, a po¬ zostalosc po odparowaniu rozdrabnia sie ucierajac z octanem etylu i odsacza. Nastepnie kolejno prze- krystalizpwuje sie osad z mieszaniny metanolu, chloroformu i eteru naftowego oraz z mieszaniny etanolu i wody.Otrzymany produkt topnieje w temperaturze 165° 40 i wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DSiRf/45/=0i68; ^/chloroform : metanol=9:1/=0^8; d/ H-AApiNHe-Tre/tBu^-Gli-OMe 45 8,5 g Z-AspJi[Hf-Tre/tBiiPGli-OMe w 210 mi me¬ tanolu uwodarnia sie wobec wegla palladowanego /10% Pd/. Otrzymany produkt jest bezpodstaoiowa pianka i topnieje w temperaturze okolo 60°. W chromatografii cienkowarstwowej wykazuje on na- 50 stepujace wartosci Rf:DS:Ry,/45y=0,42; Rf/5i2/=fl,27. ey1^-,rre/tiBu/-As.pINHi!-Tre/tBu/-Gli-OMe. floztwór Ifil g Z-Tre/tBu/-OSu i 5,55 g H-AspNH2-Tre/tBu/-Gli-OMe w 50 ml DMF, utrzy¬ mywany w temperaturze 22°, pozostawia sie na noc, 55 po czym odparowuje sie do suchia w wysokiej prózni. iH)zostalosc .po odparowaniu rozpuszcza sie w mieszaninie -octanu etylu i n-butanolu /l :!/, ko¬ lejno przemywa otrzymany roztwór ;5°/o kwasem cytrynowym, 5°A roztworem wodnym KHO08 oraz 60 . woda i odparowuje do sucha, a pozostalosc prze- kry&talizowuje sie -z mieszaniny metanolu i eteru.Otrzymany #rod.ukt topnieje w temperaturze 145— —146° d swylcazuje w chromatografii cienkowarstwo¬ wej nastepujace wartosci R^ 65 DS: B/tóy-O^, B1/52/=0,7581*889 fs f/ fi-tr#/fflir/-AspNHf-Tre/tQti/-aii-OMe 2,0 g Z-TM»/tBtt/-AsipNHrTfe/tBu/-Gai-OMe w 20 ml metenoltr trwodarnia aie w znany sposób do sta¬ nu nasycenia. Otrzymany produkt jest bezpostacio¬ wa pianka i wykazuje w eforwnató£ra£M cienkowar¬ stwowej nastepujace wantosci Rf:. / DS: BfA*5/=0,41, Rf/56/=*0,34. g/ Z-GIuNH2-Tre/ltBu/-Asp(NH2-Tre/tBu/-Gli-OMe Roztwór 5,33 g H-Tre/tBu/AspNH2-Tre/tfeu/-Gli- -OMe i 4,95 g Z-GIuNH2-ONp w 80 ml DMF, utrzy¬ mywany w temperaturze 22f°G, pozostawia sie na noc, z tymr ze powstajacy w wyniku reakcji pen- tapeptyd zaczyna krystalizowac juz po krótkim czasie. Nastepnie dodaje sie do mieszaniny reakcyj¬ nej 500 ml wody i odsacza osad w temperaturze 0°, po czym suszy sie go i oczyszcza przez szla¬ mowanie w mieszaninie acetonu i acetohitrylu /l:l/„ Otrzymany krystaliczny produkt topnieje w tem¬ peraturze 220° i wykazuje w chromatografii cien¬ kowarstwowej nastepujace wartosci Rf: iDS: R£/100/=0,65, Rf/chloroform : metanol=8:2/=0,36, Rf/52/=0,58. h/ Z-GluNHa-Tre/tBuZ-Asp/NH^-Tre/tBu/^GiLi-OH 6,42 g estru metylowego pentapeptydu otrzyma¬ nego w sposób opisany w punkcie g rozpuszcza sie, ogrzewajac, w 58 ml trójfluoroetanolu, po czym w temperaturze pokojowej dodaje sie 25 ml 1 n wodorotlenku sodowego i miesza, utrzymujac w temperaturze 22°, w ciagu 6 godzin. Po dodaniu md 1 n HCl zmydlony pentapeptyd zaczyna kry¬ stalizowac* Mieszanine reakcyjna zateza sie do objetosci 50 ml, odsacza osad i przemywa &o woda do zaniku jonów chlorkowych. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na¬ stepujace wartosci Rf: Ds: Rf/52/=0,4)6; 11^100/= =0^9. i/ Z-Glu(fm2-Tre/tBu/-Asp(NH8-Tre/tBu/^li-Wal- -Gli-AiIa-Pro-NH2. 500 mg Z-GluiNH2-Tre/tBu/-AspNH2-Tre/tBu/-GiLi- -Ofi, 336 mg tt-Wal-Gli-Ala-PTO-NH2 /Hehr. 53, 2i3ftA9?Ó/ i 10tf mg N-h^roksyiimidu Icwasii 'bur¬ sztynowego rozpuszcza sie, ogrzewajac, w' 4 ml DMF. bo otrzymanego roztworu dodaje sie 202m£ dwu- cyktoheksylokapbodwuhnidu i miecza, utrzymujac mieaz^iikie j?eakcyjna w temperaturze.^^, w ciagu 4 godzin, Wpcowadzeme do mieszamkiy reakcyjnej mieszaniny 100 ml eteru i 100 ml eteru naftowego powoduje wytracenie produktu reakcji w postaci galarety, który odsacza sie. Surowy produkt oczysz¬ cza sie przez dwukrotne rozpuszczenie w miesza¬ ninie metanolu oraz wody 785:15/ i wytracenie ete¬ rem. Gezy&caony produkt topnieje w temperaturze 198-4*0° i wykazuje w chiematogralii cienkowar¬ stwowej nastepujace wartosci Rf: DS: TL/W.^iAL, Rf/107/^ 0,5(9, Bf/chlocoiorm;m£tanol-7;3/=50^35. i/ H-GluNH2-Tre/tBu/-Asp^H-TTe/tBuZ-GlA-WaiU -Gli-Ala-Pro-NH2. .Pochodna z wymienionego wyzej zwiazku w ilos¬ ci -3,1 g w 120 ml 80% trójfluoroetanolu uwodar- nia sie do\ stanu nasycenia wobec 310 mg wegla palladowanego /10% Pd/ z absorpcja C02. Przesacz z mieszaniny reakcyjnej zateza sie do objetosci o- ko$q 5 ml, dodaje 40 ml wody f pozostawia na noc utrzymujac w temperaturze 0°. W tych warun- U kach w^rystaKzoWuJe czysty nonap«^tyd o temp©- ratiirze topnienia okolo 240° /z KMtkka^em/. Otrzy¬ many j&odutet wykazuje w chromatografii cienko warstwowej nastepUSace wartosci Rf: DS: R^/sW^BO/ Rf/WZ/^0,32; R/rO/=«,lL8. k/ Z^Tre/ffi^-Fen-Pro-GltiI«H^^ -Tr^/tBu/^li-Wal^li-Ala-Pr^^Hf. 517 mg Z-Tre/IBuAFettrlPrO-OK /Helv. 53, 2135 /107O//. ie 410 mg' nonapeptydu otrzymanego w 3pos6b opi¬ sany w punkcie ji W mg N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego fozpufiacza sie lub sporzadza zawie¬ sine, lekko ogrzewajac, w 4 ml mieszaniny trój- fh*e*oetaneiu i chloroformu /£:4/, po czym dodaje sie do roritwoffu lub zawteskiy utrzymane} w tem¬ peraturze 22°, 177 mg dwucykloheksylokarbodwu* iml&u i mi^Bza iv ciagu nastepnych 20 godzin. fla- sfepttie odparowuje sie mieszanine poreakcyjna do sucha a pozostalosc jednokrotnie wytraca sie z mieszaniny cliloroiormu i eteru naftowego. Suro¬ wy produkt oczyszcza sie stosujac rozdzial Graig'a w uklatfzie rozpuszczalników metanol — roztwór buforowy — chloroform — czterochlorek wegla /10:3:5:4/ odbierajac 420 frakcji eluatu o objetosci 29 5 ml kazda, Sklad roztworu buforowego jest na¬ stepujacy: 2M ml lodowatego kwasu; octowego, 19,25 g octaam aJftoggroega i 000 mil wody.Czysty dodekapeptyd otrzymuje sie jako bezpo¬ staciowy proszek o temperaturze okolfr 195 /z iroz- kladem/ przez odparowanie do sucha frakcji o ko¬ lejnych humenach 135*~lfc4 /r maks^lfG; K—0,61/ do sutfia i odwuWimowanle octanu amonowego w temperaturze ^45°^ w wysokiej prózni. Otrzymany prodi&t wykazuje w chromatografii oienkowarstwo- we} nastepujace wartosci Rf: DSr ILfM/"*M; af/7«/*0,M; Rf/SzA/^O,^ 1/ H-T«/tBu/-Fen-PilO-GluNH1-Tre/^u/-AspNH2- -Tre/mu/-G^Waa-Gai-Ala-iP3Po-'NHf. 504 mg Z-dodekapeptydli otrzymanego w sposób 40 opisany w punkcie k rozpuszcza sie, ogrzewajac, w 30 ml metanoul i uwodarnia w sposób taki jak poprzednio wobec 100 mg wegla pafladewanes©. Po odparowaniu przesaczu z mieszaniny poreakcyjnej do sfccha otrzymuje *ie pnodukt jako bdzpostacio- 45 wy bialy proszek. Otrzymany produkt wykazuje w t*hxomato0ra£ii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Hf: DS: Rf/43C/~0;25; Rf/70/-*$35; ftftó2A/*0^2^ *n/ Z^AspNH^Iiz/Boc/-Fen-HiS'Tre/tBuAFen- M -feto-d4u«Hi-Ti«/tBu/-A«pirarTr€^t®u/-Gll-Wal- -GK-AlaJPro-iNH2.Do roztworu 47$ mg Z-ArtpWHj-Liz/Boc/-Pen-His- -NHNH* /Wlv. 5», 2l*6 fWWf w 4,5 .ml DMF, u- trzymywariegc* w tenapewrtutze —20°, dodaje sie 55 378 fil 3,2 n roztworu Chlorowodoru w dioksanie i 00 |il ajbotynu nirz.-butylu. (Po 15 minutach mie¬ szania roztworu utrzymywanego w temperaturze —10° dodaje sie kolejno roztworu 410 mg K-i?re- /tBu/-Feri^I^^ulKHi-T^^ 60 -GliAWal*<»y-Akr-P»Q-NS2 w 6 ml DMF i na kon¬ cu 260 pi etylodwuizopropyloamdny. Mieszanine re¬ akcyjna utóymywana w temperaturze 0° pozosta¬ wia sie na noc, po czym wytraca sie z niej suro¬ wy ^rodtikt przez wkropienie 100 ml eteru. 65 Stlrowy produkt oczyszcza sie stosujac rozdzial89 869 1« Craiga w ukladzie rozpuszczalników metanol — roztwór buforowy— chloroform — czterochlorek wegla /10:5:lO:5/ odbierajac 200 frakcji eluatu o objetosci 3 ml kazda. Sklad roztworu buforowego taki sam jatoi podano w punkcie k. Czysty heksa- dekapeptyd otrzymuje sie jako bezpostaciowy pro¬ szek odparowujac frakcje o kolejnych numerach 18-^37 /r mafcs=27; k^HJ/ do sucha i odsublimo- wanie substancji buforowej w temperaturze 40°, w wysokiej prózni. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci R£: DS: Rf/43C/=O,40; Rf/52/=0,20;Rf/70/=» =0,58. n/ Octan H-A&pNHf-Liz/Boc/-Fen-His-Tre/tBu/- Fen^Pro^GlulNHf-Tr«/tBu/-AspiNH1-Tre/tBu/-Gli- -Wal-Gli-Ala-Prc^NH,.Pochodna z wymienionego wyzej heksadekapep- tydu w ilosci 270 mg w 27 ml 80% kwasu octo¬ wego uwodarnia sie wobec 50 mg wegla pallado- wanego, w ciagu 2 godzin, po czym odsacza sie katalizator, a przesacz zateza sie do objetosci okolo 3 ml i liofilizuje. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace war¬ tosci Rf: DS: Rj/W-0,07.; Rf/OS/^O^; Rf/107/=0,65. o/ Z-Tre/tBu/-.Tyr/tBU/-Tre/tBu/-GluNHt-Asp- /OtBu/-ren-Asp(NH1-Liz/Boc/-ren^Hiis-Tr€/tBu/- -Fen-Pro-GluiNHt-Tre/tBu/-Aa|)NHi-Tape/tBu/-Gli- -Wal-Gli-Ala-Pro-NHfr Do roztworu 185 mg Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre- /tBu/-GluNH2-Asp/OtBu/-Fen^NHNHf /Helv. 53, 2135 /1970// w 2 ml DMF, utrzymywanego w tem¬ peraturze —20°, dodaje sie 117 \»1 3,24 n roztworu chlorowodoru w dioksanie i 21 \il azotynu Illrz.- -butylu. Roztwór miesza sie w ciagu w tempera¬ turze —10° 15 minut, po czym dodaje sie oziebione¬ go do temperatury 0°, roztworu 108 mg octanu H-AspiNH8-Liiz/Boc/-Fen-His^Tre/tBu/nFen-Pro- -GluNHt Tre/tBu/-AspN|iI-Tre/tBu/-Gli-Wal-Gli- -Ala-Pro-NH2 w 4 ml DMF, oraz 80 fil etylodwu- izopropyloaminy i pozostawia na noc utrzymujac mieszanine reakcyjna w temperaturze 0°.Surowy produkt wytraca sie przez wkroplenie roztworu reakcyjnego do mieszaniny 40 ml eteru i ml eteru naftowego, po czym oczyszcza sie sto¬ sujac rozdzial1 Graiga w ukladzie rozpuszczalników metanol— roztwór buforowy — chloroform -* czterochlorek wegla /20:5:10:lO/ i odbierajac 300 frakcji eluatu o objetosci 3 ml kazda. Sklad roz¬ tworu buforowego podano w punkcie k. Po od¬ parowaniu frakcji oznaczonych kolejnymi numera¬ mi 98^117 /r maks.—107; K-0,5i5/ do §ucha i od- su-blimowandu substancji buforowej, w tempera¬ turze 40°, w wysokiej prózni, otrzymuje sie chro¬ matograficznie czysty dokozapeptyd jako bezposta¬ ciowy proszek. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace war¬ tosci Rf: DS: Rf/43C/-O,30; Rf/52/«*0,30; Rf/06/=O,48. p/ H-Tre/tBW-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-GluNHt-Asp- /OtBu/-Fen-AspNHf-Liz/Boc/-Fen^His-Tre/tBu/- -FenMPro-GluNHt-Tre/bBu/-AspNH1-Tre/tBu/-Gli- -Wal-GH-Ala-Pro-NH,.Pochodna z dokozapeptydu w ilosci 2100 mg w 26 ml 80% 'kwasu octowego uwodarnia sie wobec 50 mg wegla paMadowanego w ciagu 15 godzin, od¬ sacza katalizator, zateza przesacz do objetosci okolo ml i liofilizuje. W celu usuniecia kwasu octo¬ wego zliofilizowana pozostalosc wytraca sie dwu- 3 krotnie z mieszaniny metanolu i roztworu wodoro¬ weglanu sodowego. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/43C/=0,31; Rf/100/^0,29. | ¦ q/ Boc-Cys-GU-AspNH,--Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/- 45 50 "I -Cys-Met-Leu-Gli-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/- -GluNH,-Asp/OtBu/-Fen-AspiNHt-Liz/Boc/-Fen-His- -Tre/tBu/-Fen-Pro-GluiNHf-Tre/ljBu/-A»pNHt-Tre- /tBu/-Gli-Wal-Gli-Ala-PronNH,. 170 .mg uwodornionego doikozapeptydu otrzyma¬ nego w sposób opisany w punkcie p i 101 mg I" : :—~^— 1 Boc-Cys-Gli-AspNH1-Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys- -Met-Leu-Gli-OH /Helv. 53, 556 /1970// rozpuszcza sie, ogrzewajac, w 1,2 ml DMF, dodaje 15,8 mg N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego oraz 21,3 mg dwucykloheksylokarbodwudmidu i miseza w atmosferze azotu, utrzymujac mieszanine reakcyj¬ na w temperaturze 45°, w ciagu 3,5 godziny. Na¬ stepnie wytraca sie surowy produkt przez wkrop¬ lenie mieszaniny poreakcyjnej do 20 ml eteru, nie zawierajacego nadtlenków, i oczyszcza go stosujac rozdzial Craiga w ukladzie rozpuszczalników me¬ tanol — roztwór buforowy — chloroform — cztero¬ chlorek wegla /11:3:6:7/ odbierajac 450 frakcji elu¬ atu o objetosci 3 ml kazda.Sklad roztworu buforowego podano w punkcie k.Po zatezeniu frakcji eluatu o kolejnych numerach 190—210 /r maks."200; K=»0,8/ do sucha i odsubli- mpwaniu substancji buforowej otrzymuje sie czy¬ sta, ochroniona pochodna dotriakontapeptydu jako bezpostaciowy proszek. Otrzymany produkt wyka- 40 zuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepu¬ jace wartosci Rf: DS: R/70/^0,53; R^lOOZ-0,35; Rf/52A/=0,29.I : Przyklad II. Chlorowodorek Bmp -Gli- -AspNHt-Leu-Ser-Tire-Cys-Met-Leu-iGli-Tre-Tyr- -Tre-GluNHt-Asp-Fen-AspNH^Liz-Fen-His-Tre- -Fen-Pro-GluNHj-Tre-AspNHj-Tre-Glu-Wal-Gli- -Ala-Pro-NH,.I : :—— 50 mg Bmp-Gli-AspNH2-Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/- 1 -Cys-Met-Leu-Gii-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/- ^GluNH2-Asp/OtBu/-Fen-AspNH8-Liz/Boc/-Fen- -His-Tre/tBu/-Fen-PrO-GluNHt-Tre/tBu/-AspNH,T 95 -Tre/tku/-Gli-Wal-Gli-Ala-Pro-NHt przeprowadza sie w wymieniony peptyd w wyniku acydolizy za po¬ moca 12 n HO, w sposób opisany w pirzykladzie I, utrzymujac mieszanine reakcyjna w temperaturze 0°. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rx/*5/-0£0; Rf/101A/=0,59; R£/112£/«0,43.Rezultaty elekroforezy cienkowarstwowej dla u- trzymanego zwiazku przy wartosci pH 1,9 i spadku 65 napiecia 16 V/cm: Dlugosc drogi przebytej w kie-8*8*9 17 runku katody w ciagu 1,5 godziny wynosi okolo 2,4 cm. ¦ • -- v - Ochroniony dotriakontapeptydamdd wytwarza sie . . . I . • - ' '.... w nastepujacy sposób: 61 mg Bmp-Gli-AspNH2- _ : -! -Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys^Met-Leu^Gli-OH /Of- fenlegungsschrift RFN Nr 2 060 434/, 113 mg H-Tre- /tBu/-Tyr/tBu/.Tre/tBu/-GiuNH,-A«p/OtBu/-Fen- -AspNHf-I^TBó<^^Fen^His-Tre/tBu/-Fen-Pro- -GluNH,-TreABu/-AspiNHtHTre/tBu/-01i-Wal-Gli- -Ala-Pro^NH2 /otrzymanego w sposób opisany w przykladzie I p/ i 10,5 mg N-hydroksyicmidu kwasu bursztynowego rozpuszcza sie w 6,9 ml DMF. Po dodaniu 14 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu wypiera sie z naczynia reakcyjnego powietrza azo¬ tem, zamyka je i miesza mieszanine reakcyjna w ciagu 3,5 godziny; utrzymujac w temperaturze 45°.Nastepnie wytraca sie surowy produkt dodajac ml eteru, nie zawierajacego nadtlenków i o- czyszcza za pomoca rozdzialu Craig'a w ukladzie rozpuszczalników: metanol: roztwór (buforowy : chlo¬ roform : czterochlorek wegla=11 :3*j6:7 odbierajac 240 frakcji roztworu o objetosci 3 ml kazda, Przez odparowanie do sucha frakcji o kolejnych nume¬ rach 108—12$ /r maks=118; K=0,97/ i odsublimo- wande substancji buforowej otrzymuje sie czysty produkt jako bezpostaciowy proszek.Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/52/=*0,29; Rf/T0/=0,65; Rf/I00/=0,38.: I— Przyklad III .. Chlorowodorek Bmp-Gli- 16 ¦ 1 -AspNHj-iLeu-Ser-Tre-Cys-Wal-Leu-Gli^Liz-Leu- -Tre-GluNHt-Asp-Fen-AspiNH2-Ldzv-Fen-His-Tre- -Tyr-Pro-GluNHj-Tre-AspiNHt-Tre-GUJWal-iGU- -Ala-Pro^NH2. i————:— ———: 50 mg Bmp-Gh-AspNHs-Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/- 1 -Gys-Wal-Leu-Gll-L.iz/Boc/-Leu-Tre/tBu/-GluNH2- -As^)/OtBu/-Feri-AspNH2-Liz/Boc/-Fen-His-Tre/tBu/- -Tyr/tiBu/^Pro-GluNH2-rrre/tBu/JAspNH2-Tre/tBu7- -Gli^Wal-Gli-Ala^Pro^NH, przeprowadza sie w wy¬ mieniony peptyd w wyniku acydolizy za pomoca 12 n HC1, w sposób opisany w przykladzie I, u- trzymujac mieszanine reakcyjna w temperaturze 0°. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci '.jtf: DC: R/lOiA/^0,91; Rf/112E/=6,45.Rezultaty elektroferozy cienkowarstwowej dla otrzymanego produktu przy wartosci pH 1,9 i spad¬ ku napiecia 16 V/om: Dlugosc drogi! przebytej w kierunku katody w ciagu 1,5 godziny wynosi okolo 3,7 cm.Ochroniony dótriakontapeptydamid moze byc ó- trzymany na przyklad w nastepujacy sposób: a/ Z-Leu-Tre/tBu/-GluNHrAsp/OtBu/-Fen-ÓMe. 4,15 g H-TreABa/-GluNHf-Asp/OtBu/^Fen-ÓMe /Helv. 53, 2135 A970//, rozpuszcza sie 40 ml DMF, dodaje 3,26 g Z-Leu-ONp i pozostawia na noc u- trzymujac w temperaturze 22°. W wyniku'reakcji powstaje pentapeptyd, który wykrystalizóWuJe po dodaniu wody, Surowy produkt oczyszcza sie przez kolejna krystalizacje z mieszaniny metanolu, chlo¬ roformu i eteru naftowego oraz metanolu i wody.Czysty produkt topnieje w temperaturze 204° i wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na¬ stepujace Wartosci Rf: DS: R^hloroiorm : meta¬ nol?*9:l/-0,39;Rf/69/=0,52. b/ H-Leu-Tre/t(Bu/-Glu[NH2-Asp/OtBu/-(Fen-OliiIe. 4,8 g Z-pentapeptydu w 100 ml metanolu uwo- darnia sie do stanu nasycenia w znany sposób i po odsaczeniu katalizatora odparowuje przesacz do sucha, otrzymujac jako produkt bezpostaciowa bia¬ la pianke. Otrzymany produkt wykazuje w chró- io matografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DG: Rf/chlorotform : metanol"911/^OyU; fRf/89/= =0,29. c/ Z-Liz/Boc/iLeu-Tre/tBu/-GlulMH2-Asp/OtBu/- ^Fen-OMe. 4 g H-Leu-Tre/tBu/-GluiNH1-Asp/OtBu/-Fen-OMe i 3,5 g Z-Liz/Boc/jONp rozpuszcza sie w 25 ml DMF i (pozostawia na noc utrzymujac mieszanine reakcyj na w temperaturze 22°.W wyniku reakcji otrzymuje sie heksapeptyd, który wytraca sle w postaci galarety przez doda¬ nie do mieszaniny poreakcyjnej eteru i nastepnie oczyszcza przez przekrystailizowanie z mieszaniny metanolu, octanu etylu i eteru naftowego.Czysty produkt topnieje w temperaturze 211— —212° i wykazuje w chromatografii cienkowarstwo¬ wej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/chloroform: : metanol=9:l/-0,50; R^/^CK*. d/ Z-Lis/Boc/HLeu-Tre,/IUBU/-GluNH2-Asp/OtBu/- -sFen-N(HNHf. 5 g wyzej wymienionego estru metylowego roz¬ puszcza sie, ogrzewajac, w 50 ml DMF, dodaje ml wodzianu hydrazyny i pozostawia na 5 go¬ dzin, utrzymujac mieszanine reakcyjna w tempe¬ raturze 22°. Produkt reakcji wytraca sie przez do- 38 danie 250 ml wody, odsacza sie (bardzo rozdrobnio¬ ny osad i przemywa woda do ujemnej reakcji na foline.Otrzymany produkt topnieje w temperaturze o- koló 220° /z rozkladem/ i wykazuje w chromato- 40 grafii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/chloroform : metanol—9sl/«a,'0,24; Rf/89/-=0,27. e/ Z-Tre/tBu/-^r/lttBu/-.Pro-GluNHt-Tre/tBu/- -Asp^2-Tre/tBuV-GH^Wal-Gli-Ala-Pro-NH2.Do roztworu 393 mg Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Pro-OH 45 /Óf^ehlegungsschTfe RFN Nr 2O50 434/ i 66 pi NHmetyiomortfoliny w 5 ml czterowodorofuranu, oziebionego do temperatury —30°, wprowadza sie 82 jil chiorowegianu izdbutyiu w ciagu -minuty, po czym miesza sie; mieszanine reakcyjna, utrzymywa- 5ó na temperaturze 0°, w ciagu nastepnych 10 minut.Nastepnie Wprowadza sie oziebionydo temperatu¬ ry 0° roiztwóir 300 mg H-GluNH2-rPre/tBu/-AspNH2- -Tre/tBu/-Gli-Wal-Gli-Ala-iPró-NH2 /otrzymanego W sposób ójrisany w przykladzie I j/ w 6 ml mie- fó szaniny trojJluoroetanolu i chloroformu /6:4/, mie¬ sza sie mieszanine ireakcyjna utrzymywana w tem¬ peraturze 0° W ciagu 1 godziny i pozostania na noc utrzymujac ja w temperaturze 22°. ' Mieszanine poreakcyjna zateza sie do otrzyma- 6o nia galaretowanej masy, która wytraca sie z mie¬ szaniny czterochlorku wegla i eteru naftowego.Surowy produkt oczyszcza sie za .pomoca rozdzialu Craiga w ukladzie rozpuszczalników metanol: roz¬ twór buforowy : chloroform : czterochlorek wegla ~= 65 =10:3:5:4 odbierajac 400 frakcji roztworu o objetos-MN9 ci 3 ml kazda. BMtotd roBtwor* bufetowego' podfcoo w przykladzie I k. FrcStfffje o koiejftytlh Motorach 116—143 /r maks:=130; K=*0j4# o*pa*ow*Je **e do s*«fea i po odffubtimcwSffta SUfctetaftCJi twrfofowe^ w temperaturze 40ó w Wysokiej prózni otrzymuj« sie chromatogralkznie ezyaty dodefca^eptyd jako bez- 8osiaciowy proszek* Otrzyna&ny tprodukt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: D&: Rj/43C/-0,42l Rf/MA/=M7; R/70/«O£5. i/ H^T*e/t©U^Tyr/tB»-P«o-Glw»Hj*Tre/tBi«/- -Aspifra2-Tre/t©u/ 1V56 g (^xkk5p^ptydu otrzymanego w sposób opi¬ sany w punkcie e rozpuszcza sie, ogrzewajac, w 89 ml metanok^ pa caysn ttwodsnmitf sie go w zna¬ ny Sposób. Po zatezeaiu rc&twora poreakayjliegó do sucha otrzymuje sie produkt jako bezpostacio¬ wa pozostalosc o temirjferaturze topnienia okolo 150°.Otrzymany produkt wykazuje w chroTaatografii cienkowarstwowej nastepujace wafctosei W? DS: Rf/43C/=030; Rf/52A/=0,21; Rf/70/=0,5* g/ Z-AspNH2-Lia/Boc/-FexHH»-Tre/tBu/-TyrytBu/- -Pro-GluNiVTre/tBu/-Afi|NHk-Tre/tBil/-G^-Wal- -GK^Ala-Pro-NHz. 445 mg Z^A«pNHrnLA2/B€)cAren^Hi«-NIiNH2 [HeiVi 59, 2196 /l&70/] rozpuszcza sie, ogrzewajac, w 4 ml DMF, po czym foolejfló dodaje do roztworu, utrzymywanego w teTOjpsraturzo —20°, 850 ul 3*2 n chlorowodoru w dioksanie i 83 Lii azotym IHrz.- -butylu. Mieszanine reakcyjna, utrzymywana w temperaturze —IQ°, miesza sie jeszcze w ciagu 15 minut i dodaje roztworu 400 mig wyzej wymfendo- nego uwodornionego- dodekapeptydu w 5 ml DMJT, oraz l&2 (t*J etylodwui^opropyloaminy. Mieszanine reakcyjna utrzymywana w temperaturze 0° roteaza aie w ciagu nastepnych 2 .godzin, po czym dodaje sie jeszcze raz 48 lU etylodwuizopropyloaminy i pozostawia na noc utrzymujac w temperaturze 0°.Przez wkropienie roztworu poreakcyjnego do 100 ml eteru wytraca sie surowy produkt, który oczyszcza sie za pomoca rozdzialu Craiga w ukladzie rozpusz¬ czalników : metanol: roztwór buforowy i chl«roloitm : :.;czterochlorek wegla=10a3l7:4 ódfaierajae 6$0 frak¬ cji o objetosci 3 ml kazda* T frakcji oznaczonych kolonymi numerami 230^-275 /r maks=25i5; K—0g5/ otrzymuje sie w sposób wyzej opisany czysty hek- sadekapeptyd, jako bezpostaciowy proszek. Otrzy¬ many produkt wykazuje w chromatografii cienko¬ warstwowej nastepujace wartosci Hf: DS. ftf/43C/= =0,37; ftf/52A/=0,27; A/TO/-Ó,to- h/ Octan H-AspNHt-Lii/Bo€/-Fen-Hk-Tre/tBu/* -Tyr/tBu/^Pi^^GluNI^Ti^/tBu/-Aj^K1-*re/tBW- -Gli-Wal^li-Ala^IPro-NH* 250 mg heksttdekapeptydtt otrzymanego W sposób opasany w go uwodar»&a sie w znany sposób. Po Odsaczeniu katalizatora przesacz zateza sie do objetosci okolo 4 ml i liofilizuje. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace war¬ tosci Rf; DS: Rf/43C/=0,24; Rf/52/=Óyl4; R|/W=0,34. i/ Z-I^z/Bocy^eu-Tre/tBuZ-ÓluNH^-Asp^Otfeu/- -Fen-AspNH2-Liz/Boc/-Fen-His-Tpe/tBu/-Tyr/tBu/- -Pro-GluiNH2-Tre/tBu/-AspiNH2-Tre/tBu/-Gli-Wal- -GU-Ala-Pro-NH* /OtBu/-Fen-NHINH2 rozpuszcza sie, ogrzewaja*, w Z mfl DMF i o^ roMwofu oziebionego do tempera¬ tury —20° kolejno dodaje sie 154 ul 3,2 n roztwo- fu chlorowodoru W dioksanie i &7 pi azotynu Ufrz.-tJ&tyM. F* wyMi^lanra w «iagu 1-5 Hafciut migsietntoy refelteyjrft& utrzymywanej w tempera¬ tura* ^-10^ tiMajfe tfh? do ftiej Oziebianego do tem¬ peratury 0° roztworu 275 mg wyi*} wym^fttorego ic oc*aft» h*fcaAdetop*,Pt^du W 2 ml DMF oraz »5 pi «tykrdw'ui»oj0*topyk)a«iiny i utrzymuj ac' W tempera¬ turze 0° rtrieaz* sie w dagn natftspnydh dwóch go* cfilin. Nfifet^pfiif. dodaje sie do rmcszankiy reakcyj¬ nej jeszcfoo 24 jfkl et^lo^Wma3CMKpyloan4kiy i pozo- 115. 6tawia sie ja na 1& jgodzin utrzymujac w tempera¬ turze 0°. Z iftceszan&ty poreakcyjnej wytraca sie fro go /7:J/ W postaci proszkowatego osadu, który o- cuyszcza sia z& pomoca rozdzialu G^aig^ w ukladzie rtopififeczailników metanol: roztwór buforowy : chlo¬ roform j ozterodhiórek wegla=10:3:5:5 odbierajac Mb fraifcji rCzlwoTu o objetosci 3 ml kazda. Sklad roztworu buforowego podano w przykaldzie I k.Z frakfcji fozfcwo*u ózAfaczonych kolejnymi nunie'- rami 08^132 /t makfl=M3; K^O^/ wydziela sie w spo&óto opisany wyzej chromatograficznie czysty dokozapeptyd, który wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/43CP=0,*&; R^/^0,2©; R|/9«/=0,48. w j/ H-Lis/BocV-IJeii^Ttte/IBi^-GiuWHrAs|i/DtBW^ -AspNH2^Liz/Boc/-Fen-His-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Pro- -t5ruNM2-Trsr/tfiu/-Aspr^Hf-Trs/t6u/-Óli-Wal-Gl{- -Ala-Pro-KHi. 173 nt# dokózBpeptydu otrzymanego w sposób *s opisali^ w pUhfcote i/ w 30 ml gl^/o kwasu octo¬ wego uwodarnia sde w ciagu 15 godzin wobec 50 mg w^gla .palladowanego, a przesacz zateza sie do obje¬ tosci OKoió &J4 ffil i MóflffiWj"e.W celu usuniecia kwasu octowego wytraca sie M liofikzat a mie«zaniny trójfluoroetanolu i 56/i roz- twor» wodoroweglanu sodowego.Otttyflfeany produkt wyk**uje w chromatografii cienkowarstwowej «aste|iajaxe w*rto^ci Rf: 0$: Rim/^%Jtli R#/70/*0,«8j iLfflW"*,!!. 45 | ' •¦ : "I fe/ Bmf)-61i-AspNH2-Leu-Sar/tóu/-Tre/tBu/-Cys- -Wai-^u-LizViBoc/-I^u-Tre/tBu/-GluiNHt-AnD /OtB.u/-^en-AspNH2-Lizy^c^-fen-ffis-t're/itóu/- -Tyr/tBu/-Pro-QluNH1-Tre/tBu/-Ai&pNIl8-Tre/tBu/- ja -Cli-Wal^lMia-Pro-NHi, i27 mg dokozapeptydu otfzymanego w sposób o- ^lalfifty W .^ttttlScife J, 05 mg Bm-p-C^^AspliHi-Leni- : 1 -Se/t«iL/*Tre/tBu/-€ysh-Wal-LeTi-01i-OH /Off&n- 55 legung»ohrift RFN Nr 2(050 434/, 12 mg N-hydro- k^yrmWu kwasu bttcsitynowegGl i 17,5 ntg dwu- €j«ofe^a^k**r.be DiAF ewerrtwairwe sporzadza zawiesine i miesza sie roztwór vlu!b zawiesine/ utrzymywany w tempera- 60 turze 45° w oiagu 3,5 godziny.Surowy produkt wytraca sie za pomoca 50 ml eteru i oczyszcae za pomoca roadzialu Graig^ w ufeladzie loz^uazcfialnlków ¦: metanol; roatwor bufo¬ rowy : chloroform : czterocWorek wegla" 10:3:5:4 od- m bie^aMc 250 frakcji o objeto&i 3 ml kazda. Sklad80889 21 roztworu buforowego podano w przykladzie I k. Z frakcji eluatu oznaczonych kolejnymi numerami 88—ii 10 li maks. =100; K=0,67/ wydziela sie w opi¬ sany wyiej sposób chromatograficznie jednorodny ochroniony dotriakontapeptyd jako bezpostaciowy proszek. Otrzymany produkt wykazuje w chroma¬ tografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/^2/=0,28; Rf/70/=0,65; Rf/100/=0^7.Przyklad IV. Chlorowodorek Bmp-Gli- 22 -AspNHg-Leu-Ser-Tre-Cys-Met-LeuHGli-Liz-Leu- -Tre-QluNH4-Asp«-iLeu-AsipNH^L*iz-Lieu-His-Tre- -Tyr^Pro-GliiNHg-Tre-AspNHa-TreHGli^Wal-Gli- -Ala-tP*o-NH* I ' 50 mg Bmp-Gli-AspNH2-Leu-Ser/tBu/-Tre/,tBu/- 1 -Cys-Met-Leu-Gli-Iiiz/Boc/-Leu-Tre/tBu/-GluNH2- -Asp/OtBu/-I^u-AspNH2-Liz/Boc/--Leu-His-Tre- /ltB^/-Tyr/tBu/-Pro-GluNH2-Tre/tBu/-AspNH2- -Tre/tBu/-Gli-Wal-Gli-Ala^Pro-NH2 przeprowadza sie w sposób Opisany w przykladzie I za pomoca 12 n HO, utrzymujac mieszanine reakcyjna w tem¬ peraturze 0°, w wolny peptyd. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na¬ stepujace wartosci Rf: DC: Rf/45^0,47; Rf/101A/= =0,50; ftf/llzE/=0,42. Rezultaty elektroforezy cien¬ kowarstwowej dla otrzymanego produktu przy War¬ tosci pfr'1,9 i spadku napiecia 16 V/cm: dlugosc drogi przebytej w kierunku katody w ciagu 1,5 gódfcifiy wynosi okolo 3,7 cm.Ochroniony dótriakontapeptydatnid wytwarza sie w nastepujacy sposób: a/ H-Leu-l,re/t^u/-CluL^H2-Asp/OtBu/-Leu-OMe. 3,6 g Z-Leu-Tre/tBu/-01uNH2-Asp/OtBu/-Leu- -OMe /opis patentowy RFN Nr 2 060 434/ w 90 ml metanolu uwotfarnia sie do stanu nasycenia wobec 360 mg wegla palladowanego z absorpcja C02, od¬ sacza sie od katalizatora i odparowuje do sucha.Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: ES: Rf/chloroform : metan<31=d:l/=0,l5; Rf/89/-0,32. b/ Z-Lis/Boc/-Leu^ -Leu-Ome.Bo roztworu 840 mg H-Leu-Tre/tBu/-GluNH2- -Asp/ótBu/-Lreu-OMe w 5 ml DMF dodaje sie 765 mg Z-Liz/Boe/-ONp i pozostawia mieszanine reak¬ cyjna na noc, utrzymujac ja w temperaturze 22°.Nastepnie zateza sie ja w wysokiej prózni do ge¬ stego syropu i wytraca surowy -produkt w postaci galarety za .pomoca 30 ml eteru. Surowy produkt oczyszcza sie przez wytracenie z mieszaniny meta¬ nolu, octanu etylu i eteru naftowego. Czysta po¬ chodna heksapeptydu topnieje w temperaturze 218— —220° i wykazuje w chromatografii cienkowarstwo¬ wej nastepujace wartosci Rf: iDS: Rf/chloroform: :metanol=9:l/=0,41; Ri/89/=0,61. c/ Z-Iiz^Bo^Leu-Tre/tBuZ-GluNHa-Asp/OtBu/- -Leu-NHNH* Do roztworu 720 mg estru metylowego heksapep- tydu opisanego w punkcie b, w 40 ml bezwodnego metanolu, dodaje sie 3,6 ml wódziami hydrazyny i pozastawia mieszanine reakcyjna na 5 godzin u- trzymujac ja w temperaturze 22°. Otrzymany w wy¬ niku reakcji hydrazyd heksapeptydu wytraca sie przez dodanie 75 ml wody odsacza, dobrze przemy* wa woda i suszy. Produkt topnieje w temperaturze 215—218p i wykazuje w chromatografii cienkowar¬ stwowej nastepujace wartosci JUi DS: Bf/chloro- formimetanol^S^/^OjSS; Rf/89/^^^. d/ Z-AspNH2-Liz/Boc/^Leu-His-Tre/tBiL/-Tyr- /tBu/-Pr^-GluNH2-Tre/t®u/-AspNH2-Tre/tBq/-Gai- -Wal-Gli-Ala-Pro-NH2. 636 mg iZ-AspNH2-Ldzi/,Boc/-Lieu-His-NHNHB /opis io patentowy RIFN Nr 2 060 434/ rozpuszcza sie ogrze^ wajac, w 10 ml DMF. Otrzymany roztwór oziebia sie do temperatury —20° i kolejno dodaje 525 ^1 3,2 n roztworu chlorowodoru w dioksanie oraz 119 ul azotynu Illrz.-butylu. Nastepnie miesza sie mieszanine reakcyjna, utrzymywana w temperatu¬ rze —15° w oiajn 16 minut, po czym dodaje sie, oziebionego do temperatury 0°, roztworu 600 mg H-Tre/tBu/-Tyr^Bu/^ro^luNH2-Tre/tBu/-AspNH2- -Tre/tBu/-GH-Wal-Gld-Ala-PrcHNH2/otrzymanego w sposób opisany w przykladzie III fi/ w 4,5 ml DMF oraz 230 jil N-metylomorfoliny.Mieszanine reakcyjna utrzymywana w tempera¬ turze 0° miesza sie w ciagu nastepnych dwóch godzin, dodaje jeszcze raz 46 ul N-metylomoifoliny i pozostawia na noc utrzymujac mieszanine reak¬ cyjna w temperaturze 0°. Surowy produkt wytraca sie za pomoca 100 ml eteru i oczyszcza stosujac rozdzial Craig'a w ukladzie rozpuszczalników: acetonitryl: roztwór buforowy : chloroform : meta- nol=1:1:1:1 i odbierajac 500 frakcji roztworu obje¬ tosci 3 ml kazda. Sklad roztworu buforowego po¬ dano w przykladzie I k. Frakcje roztworu o ko¬ lejnych numerach 38-^62 7r maks.=i50; K=0,11/ od¬ parowuje sie do sucha i odsubtómowujie sutostan- cje buforowa w temperaturze 40° w wysokiej próz¬ ni, otrzymujac czysty heksadekapeptyd jako bez¬ postaciowy proszek. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/4SC/=0,3&; Rf/52A/=0,2tf; 40 Rf/70/=0,31. e/ Octan H—AspNH2-Liz/Boo/-Leu-Hifi-TreytBu/- -Tyr/tBu/-Pro-GluNH2-Tre/tiBu/-AspNH2-Tre/tBu/- -Gli-Wal^li-Ada-(Pro-NH* 360 mg heksadekapeptydu otrzymanego w sposób 45 opisany w punkcie dw45 ml 80*/t kwasu octowego uwodarnia sie do zanikniecia produktu wyjsciowe¬ go wobec 50 mg wegla palladowanego. Przebieg re- akcji kontroluje sie za (pomoca chromatografii cien¬ kowarstwowej. Przesacz po odsaczeniu katalizato¬ ra ra zateza sie do objetosci ofeolo 4 mi i IiofHixuje.Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci . Rf: DS: Rf/43,C/=&,20; R/70/^0,40. ii Z-Liz/Boc/-Leu-Tre/tBu/-GluNH2-Asp/OtBu/- 55 -Leu-AspNH2-Liz/Boc/-Leu-His-Tre/tBu/-Tyr/ifeu/- -^m-iGluNHa-Tre/tBu/-AspNH2-Tre/tJBu/- -Gli-Ala-Pro-NHa.Do roztworu 230 mg Z-Liz/Boc/-Leu-Tre/tBu/- -GluNH2-Asp/OtBu/-LeuHNHNH2 w 2 ml DMF, eo oziebionego do temperatury —20°, kolejno dodaje sie 134 jil 2,3 n roztworu chlorowodoru w dioksa¬ nie i 32 ul azotynu Illrz.-toutyru. ftoztwór reakcyj¬ ny, utrzymywany w temperaturze —10°, miesza sie w ciagu nastepnych 15 minut, po czym dodaje sie 65 roztworu 306 mg octanu heksapeptydu, otfzymtoe-89 869 23 24 go w sposób opisany w punkcie e, w 3 ml DMF i 63 jil N-metylomorfoliny. Po dwugodzinnym wmie¬ szaniu mieszaniny reakcyjrtej utrzymywanej w tem¬ peraturze 0° dodaje sie jeszcze 15 \il N-metylomor¬ foliny i pozostawia na noc utrzymujac mieszanine reakcyjna w temperaturze 0°. Surowy produkt wy¬ traca sie za pomoca mieszaniny 60 ml eteru i 30 ml eteru naftowego i oczyszcza stosujac rozdzial Craig'a w ukladzie rozpuszczalników: metanol: : roztwór buforowy : chloroform : czterochlorek we¬ gla=10:3:5:5 odbierajac 240 frakcji eluatu.Sklad roztworu buforowego podano w przykla¬ dzie I k. Z frakcji o kolejnych numerach 83—107 /r maks=—95; K=0,65/ wydziela sie w sposób wy¬ zej opisany czysty dokozapeptyd jako bezpostacio¬ wy proszek. Otrzymany produkt wykazuje w chro¬ matografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS.' Rf/52/-=027; Rf/7O/=0,59; Rf/100/-0,41. g/ H-LizyBocZ-Leu-Tre/tBuZ-GluNHa-Asp/OtBu/- HLeu-AspNH2-Liz/Boc/-LeuHHiis-Tre/tBu/-Tyr/tBu/- -Pro-GluNHa-Tre/tBu/-AsplNHf-Tre/tBu/-Gli-Wal- -Gli-Ala-Pro-NHg. ilOO mg dokazapeptydu otrzymanego w sposób o- pisany w punkcie f w 16 ml Wflh kwasu octowego uwodarnia sie wobec 15 mg wegla palladowanego W ciagu nocy. Przesacz po odsaczeniu katalizato¬ ra zateza sie do objetosci okolo 2 ml i liofilizuje.W celu usuniecia resztek kwasu octowego pozo¬ stalosc rozpuszcza sie w 0,6 ml trójfluoroetanolu i iionownie wytraca wikraplajac otrzymany roztwór do 5 ml SW roztworu wodoroweglanu sodowego.Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/52/-0,18; Rf/70/=O,50; Rf/lO0/=0,20.I ' 1 h/ Bmp-Gli-AspNHf-Iieu-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys- -Met-Leu-Gli-Liz/Boc/-Leu-Tre/tBu/-GluNH2-Asp- /OtBu/-Leu-AaplNHt-Liz/Bocy-Iieu-Hiis-Tre/tBu^- -Tyr/tBu/-Pro-Glu(NH2-Tre/tBu/nAspNHrTre/tBu/- -Gli-Wal-Ala-Pro-NH2.I ~ 43 mg Bmp-Gli-AspNH2-Lieu-Ser/tBu/-Tre/tBu/- TCys-Met-Leu-Gli-OH /offenlegungsschrift RFN Nr 2 050 454/, 80 mg wyzej wymienionego uwodornio¬ nego dokozapeptydoi, 7,5 mg N-hydroksydmidu kwasu bursztynowego i 10 mg dwucykloheksylo- karbodwuimidu rozpuszcza sie w 0,6 ml DMF, a mieszanine reakcyjna, utrzymywana w temperatu¬ rze 45°, miesza sie w atmosferze azotu w ciagu 3,5 godziny. Surowy produkt wytraca sie dodajac ml eteru i oczyszcza za pomoca rozdzialu Craig'a w ukladzie rozpuszczalników: metanol: roztwór bu¬ forowy : chloroform : czterochlorek wegla=ll:3:6:7 odbierajac 200 frakcji eluatu o objetosci 3 ml kaz¬ da. Sklad roztworu buforowego podano w przy¬ kladzie I k. Z frakcji o kolejnych numerach 90— —115 /r imaiks=100 K—1,0/ wydziela sie w sposób wyzej opisany czysta substancje jako bezpostacio¬ wy proszek. Otrzymany produkt wykazuje w chro¬ matografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/52/~0,27; Rf/70/=0,66; Rf/100/=0,31.I Przyklad V. Chlorowodorek H-Cys-AspNH2- 55 -GluNHj-Asp-Lreu-AjpNHa-Liz-Leu-His-Tre-Tyr- -Pro-GluNH2-Tre-AipNHt-Tre-Gli-Wai-Gdi-Ala- -Pro-NH2.I ¦ "*— ~ 50 mg Boc-Cys-Gld-AspNH2-Leu-Ser/tBu/-Tre- 1 /'tBu/-Cys-Met-Leu-Gli-Liz/Boc/-Leu-Tre/tBu/- -GluNH2-Asp/OtBu/-Lieu-AspNH2-Liz/Boc/-Leu- -His-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-^ro-GluNH2-Tre/tBu/- -AspNH2-Tre/1tBu/-Gli-Wal-Gli-Ala-Pro-NHt prze- prowadza sie w sposób opisany w przykladzie I, traktujac 12 n HC1, utrzymujac mieszanine reakcyj¬ na w temperaturze 0°, w wolny peptyd, który wy¬ kazuje w chromatografii cienkowarstwowej naste¬ pujace wartosci Rf: DC: Rf/45/^0,43; Rf/101A/= =0,43; Rf/112E/=0£8.Rezultaty elektroforezy cienkowarstwowej dla otrzymanego produktu przy wartosci pH 1,9 i spad¬ ku napiecia 16 V/cm: dlugosc drogi przebytej w ciagu 1,5 godziny w kierunku katody wynosi okolo 4,9 cm.Ochroniony dotriakontapeptydamid wytwarza sie w nastepujacy sposób: I : 110 mg Boc-Cys-Gli-AspNH2-Leu-Ser/tBu/-Cys- -Met-Leu-Gli-OH [Helv. 53, 556 /197M, 185 mg H-Liz/Boc/-Leu-Tre/tBu/-GluNH2-Asp/OtBu/-Leu- -AspNHf-Liz/Boc/-Leu-His-Tre/tBu/-'3ryrABu/-Pro- -GluNH2-Tre/tBu/-A&pNH2-Tre/tBu/-Gli-Waa-Gli- -Ala-Pro-NHf /polipeptydu otrzymanego w sposób opisany w przykladzie IV g/ i 17,2 mg N-hydroksy- imidu kwasu bursztynowego rozpuszcza sie, ogrze¬ wajac, w 1,5 ml DMF, dodajac 23 mg dwucyklo- heksylokarbodwuimidu i miesza w atmosferze azo¬ tu w ciagu 3,5 godziny, utrzymujac temperature 45°. Nastepnie wytraca sie surowy produkt przez dodanie 30 ml eteru nie zawierajacego nadtlenków i oczyszcza za pomoca rozdzialu Craig a w ukla¬ dzie rozpuszczalników: metanol: roztwór buforo¬ wy : chloroform : czterocljlorek wegla=11:3:6:7 od- 40 bierajac 350 frakcji roztworu. Z frakcji o kolejnych numerach 140—179 /r maks.—159; K=*QfiZ/ wy¬ dziela sie chromatograficznie czysty, ochroniony do- triakontapeptyd przez ich odparowanie do sucha i odsulblimowanie substancji buforowej w tempe- 45 raturze 45° w wysokiej prózni. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na¬ stepujace wartosci Rf: DS: Rf/52A/—0,28; Rf/70/= =0,54; Rt/lOQ/=Q&.I : 50 Przyklad VI. H-Cys-Gli-AspNH2-Leu-Ser- 1 -Tre-Cys -Met-(Leu-Gli-Tre-Ty r-Tre-GluNHf-Aap- -Fen-AspNH2-Liz-Fen-His-Tre-Fen-Pro-GluNHf- -Tre-Ala-Tre-Gli-Wal-G]i-Ala-Pro-NHt.I 202 mg Boc-Cys-Gli-AspNH,-Leu^Ser/tBu/-Tre- ¦I "I -Leu-Ser-Tre-CysHMet-Leu-Gli-Liz-Leu-Tre- /tBLVjCys-Met-Leu-Gli-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/- -GluNH2-Asp/OtBu/-Fen-AspiNHf-Iiiz/Boc/-Fen- -His-Tre/tBu/-Fen-Pro-GluNH2-Tre/tBu/.Ala-Tre- oo /tBu/-Gli-Wal-GH-Ala-Pro-NH2 rozpuszcza sde w 6 ml 90% kwasu trójfluorooctowego, a otrzymany roztwór przedmuchuje sie azotem i pozostawia na 90 minut, utrzymujac go w temperaturze 23°. Na¬ stepnie wlewa sie do 50 ml eteru, nie zawieraja- 05 cego nadtlenków i oziebionego lodem, odsacza wy-89 869 26 tracony osad, przemywa eterem i suszy w tempe¬ raturze 45° pod obnizonym cisnieniem. Jako pro¬ dukt otrzymuje sie 185 mg trójfluorooctanu Tre 27 peptydu. Otrzymany produkt przepuszcza sie przez kolumne z wymieniaczem jonowym Nr II firmy 5 Merck /lekko zasadowy, postac octanowa/ i prze¬ prowadza w ten sposób w octan, który otrzymuje sie po zliofilizowaniu w ilosci 158 mg.W celu oczyszczenia surowego produktu rozpusz¬ cza sie 80 mg octami w 5 ml wody i dodaje mie- 10 szajac 1,2 ml wymieniacza jonowego Nr II firmy Merck /lekko zasadowy, postac wolnej zasady/.Wartosc pH mieszaniny ustala sie na okolo 6,5 i wytraca sie rozdrobniony osad. Mieszanine miesza sie w ciagu 2 godzin, aby calkowicie wytracic osad 15 i w tym czasie jej wartosc pH .podnosi sie do 7,1.Nastepnie odsacza sie osad razem z wymieniaczem jonowym, przemywa starannie woda i rozpuszcza wytracony peptyd w goracym 90% kwasie octowym, po czym odsacza sie od wymieniacza jonowego, 20 przemywa osad 9<0°/o kwasem octowym a kwasny przesacz liofilizuje. Jako produkt otrzymuje sie 74 mg peptydu w postaci soli kwasu octowego, o wysokiej czystosci, okreslonej za pomoca chroma¬ tografii cienkowarstwowej i elektroforezy. Otrzy- 25 many produkt wykazuje w chromatografii cienko¬ warstwowej nastepujace wartosci Rf: DA: Rf/52/= =0,49 [Kalcitonina M: Rf/52/=0,55/] DC: Rf: /101A/=0,52 {Kalcitonina M: Rf: /101A/=0,57].Rezultaty elektroforezy cienkowarstwowej na 30 plytkach celulozowych dla otrzymanego produktu przy wartosci pH 1,9 i napieciu 280 V, dlugosci drogi przebytej w kierunku katody w ciagu 2 go¬ dzin wynosi 4,5 cm /dla Kalcitoniny M dlugosc dro¬ gi w tych warunkach wynosi 4,5 om/. 35 Analiza na zawartosc aminokwasów za pomoca totalnej hydrolizy 6 n HC1, w roztworze utrzymy¬ wanym w temperaturze 110°, w ciagu 24 godzin, wykazuje wyliczona ze wzoru zawartosc amino¬ kwasów. 40 Substancje wyjsciowa wytwarza sie w nastepuja¬ cy sposób. a/ Z-Ala-Tre/tBu/-Gli-OMe Mieszanine 18,9 g Z-Ala-ONp, 13,4 g chlorowo¬ dorku H-Tre/tBu/-Gli-OMe, 100 ml DMF i 6,2 ml 45 N-metylomorfoliny miesza sie w ciagu 17 godzin w temperaturze pokojowej, po czym odpedza sie roz¬ puszczalnik w wysokiej prózni. Pozostalosc po od¬ parowaniu rozpuszcza sie w octanie etylu, przemy¬ wa i -suszy w sposób opisany w przykladzie I a, a 50 nastepnie odparowuje sie rozpuszczalnik i przekry- stalizowuje pozostalosc z mieszaniny eteru i eteru naftowego. W ten sposób otrzymuje sie 16 g pro¬ duktu, topniejacego w temperaturze 104—106°. b/ H-Ala-Tre/tBu/-Gli-OMe 55 J3j3 g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie a uwodarnia sie w roztworze metano¬ lowym wobec 1,5 g wegla palladowanego /10°/o Pd/.Jako produkt otrzymuje sie 9,4 g bezbarwnej zy¬ wicy. 60 c/ Z-Tre/tBu/-Ala-TreMBu/-Gli-OGVEe 9,4 g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie b oraz 13,2 g Z-Tre/tBu/^OSu rozpuszcza sie w 100 ml DMF i pozostawia na 17 godzin w temperaturze pokojowej. Nastepnie wytraca sie 61 produkt wlewajac mieszanine poreakcyjna do 500 ml wody z lodem, odsacza, suszy i przekrysta- lizowuje z mieszaniny acetonu oraz eteru naftowe¬ go z mala iloscia wody. Produkt topniejacy w temperaturze 193—195° otrzymuje sie w ilosci 13,6 g. d/ H-Tre/tBu/-Ala-Tre/tBu/-Gli-Oj!le 13,1 g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie c w 750 ml metanolu uwodarnia sie wo¬ bec 2,6 g wegla palladowanego. Jako produkt o- trzymuje sie 9,95 g bezbarwnego oleju. e/ Z-GluNH2-Tre/tBu/-Ala-Tre/tBu/-Gli-OMe Zwiazek tytulowy otrzymuje sie w taki sam spo¬ sób jak pochodna pentapeptydu w przykladzie Ig i przekrystalizowuje go z metanolu otrzymujac ,7 g produktu topniejacego w temperaturze 198— —202°. f/ H-GluNH2-Tre/tBu/-Ala-Tre/1lBu/-Gli-OMe g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie e w 1 1 etanolu uwodarnia sie wobec 2 g . wegla palladowanego otrzymujac 8,2 g produktu, który nalezy natychmiast przerabiac w nastepnym etapie syntezy. ,g/ Z-Tre/tBu/-Fen-'Pro-GluNH2-Tre/tBu(^Ala- -Tre/tBu/ Mieszanine 8,2 g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie f, 8,3 g Z-Tre/tBu/-Fen-Pro-OH [Helv. Chim. Acta 53, 2135 /1970/], 100 ml DMF, 4,0 g N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego i 4,2 g dwucykloheksyloikarbodwuimidu miesza sie w ciagu 17 godzin w temperaturze pokojowej. Nastep¬ nie odsacza sie dwucykloheksylomocznik, wlewa przesacz do 1,3 1 wody z lodem, odsacza wytracony osad po 2 godzinach, suszy i miesza ze 120 ml octanu etylu. Nierozpuszczony proszek odsacza sie, przemywa octanem etylu i suszy.Produkt otrzymany w ilosci 8,5 g wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace war¬ tosci Rf: DS: Rf/121A/=0,78; Rf/102A/=0,85; Rf/43C/=0,71. h/ Z-Tre/tBu/-Fen-Pro-GluNH2-Tre/tBu/-Alai- -Tre/tBu/-Gli-OH. ,15 g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie g rozpuszcza sie, ogtzewajac, w 110 ml 90% metanolu, a otrzymany roztwór ochladza sie do temperatury 23° i dodaje 13,5 ml 1,0 n wodnego roztworu wodorotlenku sodowego. Po 10 mniutach dodaje sie 45 ml wody i po nastepnych 5 minutach jeszcze 25 ml wody. Po dwudziestu minutach wle¬ wa sie roztwór do 270 ml 0,05 n kwasu solnego, oziebionego lodem, odsacza osad, kolejno przemy¬ wa woda z lodem oraz mieszanina wody i acetó- nitrylu 74:1/ i suszy.Produkt otrzymany w ilosci 4,1 g wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace war¬ tosci Rf: DS: Rf/45i/,= 0^7; Rf/100/=0,33; Rf/43C/=0,28. i/ H-Tre/tBu/-Fen-Pro-GluNH2-Tre/tBu/-Ala- -Tre/tBu7-GlWH Z 3,65 g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie h sporzadza sie zawiesine w 125 ml DMF i uwodarnia wobec 0,5 g wegla palladowane^ go /10°/o Pd/. Produkt otrzymany w 'ilosci 2,62 g uciera sie z woda, odsacza i suszy. Otrzymany pro¬ dukt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowejwm flstet^pujaefc wartosci HF: DS: Rf/IO0/**1&,12; Rf/52/=* -Pro-CHu^2-Tr*/t^-Ai^^ 7,2 g Z-AspNH2-liE/B^/-F€!«-His-NH-NH2 [Helv.Chim. Acta M, 2133 /Wt^A roafcaszeaa s*e w 30 ml DMF, irtrzfttmj^e roz|Htó^aMffc w temperaturze 8tia, fto czytn oziebia sle; otrzymaly roztwór do tetnperatury -30° i kolejno dodaje 7,74 ml 3,7 n roztworu chlorowodoru w dioksanie oraz 1,42 ml azotyn* IIIrz.^btftjrttL Mieszanine reakcyjna utrzymywana w tempera¬ turze —16° poio&tawia sie na 10 minut, po czym znowu oziebia sie ja do temperatury —30° i wkrap- hr toztwor 0,43 n H-Txeg^tBu/-Fe2i^Pr -Tre/tBu/-Ala-Tre/tBu/-GliOHoraz 7,8 ml N-ety- lodwuizopropykwminy w 76 ml DMF i pozostawia na 18- godzin utrzymujac ja w (temperaturze 0°.Nastepfl&e wlewa sie ja da 400 ml 1% kwasu octo¬ wego oziebionego lodem. Wytracony osad odsacza stie, przemywa woda i suszy nad chlorkiem wap¬ niowym pod obnizonym cisnieniem. Wysuszony produkt ekstrahuje sie na cieplo acetonitrylem, odsacza osad i suszy. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografia cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf; DS; R/W)/=033; Rf/100/=0,21. k/ Z-A»pNH2-Lia/Boc/-!Fen-Hiis-Tre/tBu/-Fen-Pro- -GluNHl-Tre/tBu/-Ala^Tre/tBu/^GliHWal-Gli-Ala- -Pro-NHg.Do mieszaniny 7,5 g Z-^AsplNH2-IJiz/Boc/-Fen-Hifl- -Tre/^Bu/-Fen-ProHGlulNH2-Tre/tBu/-Ala-Tre/tBu/- -Gli-OH, 0,99 g N-hydroksyimidu kwasu burszty¬ nowego, 1,84 g H-Wal-Gli-A0a-Pro-NH2 /Helv.Chim. Aete lc./ oraz 70 ml DMF dodaje sie 1,11 g dwucyklpheksyloka24odwuimidu i miesza w ciagu godzin, utrzymujac w temperaturze 45°. Nastep¬ nie wlewa sie mieszanine poreakcyjna do 1,2 1 eteru, oziebionego lodem, odsacza osad i suszy.Surowy produkt dwukrotnie miesza sie z 200 ml porcjami (mieszaniny acetonitrylu i metanolu /9:1/, odsacza i suszy. Otrzymany w ilosci 8,5 g produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na¬ stepujace wartosci Rif: ES: Rf/4S/=«0,50; Rf/0^=O,46; R^/100/^0^9; R/121/^0,60. 1/ Octan H-AspNH2-Ldz/Boc/HFen-Hds-Tre/tBu/- -Fen-pro-GauNH2-Tre/tBu/-Ala-Tre/tBu/-Gli-Wal- -Gld-Ala-PixJNH2. 7,06 g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie k w 400 ml 80°/« kwasu octowego uwo- darma sie wobec 1 g wegla padladowanego /10°/o Pd/.Otrzymany w ilosci 6$ g produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace war¬ tosci Rf: DS: Rf/9W=0,35; Rf/121/=0,72; Rf/45/=0,27. m/ Z-Tre^Bu/-Tyr/1JBu/-Tre/tBu/-GliNH2-Asp- -/OtBu/-Fen-Asp(NHa-Liz/Boc/-Fen-ras-Tre/tJBu/- -Fen-Pro-GluNH2-Tre/tBu/-Ala-Tre/tBu/-Gli-Wal- Gli-Ala-Pro-*lH2. 565 mg Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBuiA ^Asp/OtBti/-Fen-NH-NH2 /Helv. Chim. Acta 1. c./ rozpuszcza sie w 4 ml DMF, utrzymujac rozpusz¬ czalnik w temperaturze 80°, Otrzymany roztwór aziejbia sie do temperatury —20°, dodaje 0,35 ml 3,7 n roztworu -chlorowodoru w dioksanie oraz 0,007 mJ azotynu inrz.-butylu i miesza w ciagu " minut utrzymujac w tt^erafairze —15°. Na¬ stepnie wkrapla sie, oziebiony do temperatury 0°, roztwór 600 'mg octanu H-AspNH1-LizV,Boc/-Fen- -His-Tre/tBuy-Fen^ro-GauNH2-Tre/tBu/-Aaa-Tre- /tBuz-Gli- Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 w 5 ml DMF i 0,33 ml N-etylodwuizopropyloaiminy, po czym mie¬ sza sie w ciagu 5 .minut, Utrzymujac w tempera¬ turze —15°, po czym pozwala sie ogrzac do tem¬ peratury 23° i miesza w ciaga nastepnych 6 go- io dzin. Mieszanine poreakcyjna wlewa sie do 100 ml wody z lodem, odsacza osad, przemywa go woda I stszy nad chlorkiem wapniowym pod obnizonym cisnieniem. Surowy produkt oczyszcza sie wytraca¬ jac go z mieszaniny metanolu oraz wody i uciera- jac wysuszony osad z acetonem. Produkt otrzy¬ many w ilosci 650 mg wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/43C/=0,33; Rf/W=10,60. n/ H-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBui/-GluNH2-Asp- /OtBu/-Fen-Asp»NH2-Liz/Boc/-Fen-His-Tre/tlBu/- -Fen-Pro-GluNR2-Tre/tBu/-Ala-Tre/tBu/-Gli-Wal- -Gli-Ala^Pro-iNH2. 610 mg zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie m w 25 ml 80% kwasu octowego uwo- darnia sie wobec wegla palladowanego. Produkt re¬ akcji rozpuszcza sie w 30 ml n-ibutaoolu nasyco¬ nego woda, a otrzymany roztwór w celu usunie¬ cia kwasu octowego kolejno przemywa sie dwu¬ krotnie rozcienczonym roztworem weglanu sodo- wego, dwukrotnie pólnasyconym roztworem chlorku sodowego i woda. Nastepnie odparowuje sie buta¬ nol z warstwy ibutanolowej i otrzymuje sie 605 mg produktu, w postaci -bezbarwnej pianki, który wy¬ kazuje w chromatografii cienkowarstwowej naste- pujace wartosci Rf: DS: Rf/il00/«i0,a0; Rf^96/=0,40.I ¦ ; o/ Boc-Cys-Gli-AsnNH2-Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/- -Cys-HMet-Leu-Gli-Tre/tBu/-Tyn/tBu/-Tre/tBu/- 40 -GluNH2-Asp/OtBu/-Fen-AspNH2-Liz/Boc/-Fen-His- -Tre/mn/^en-Pro-GIuNHg-Tre/tBu^-Ala-Tre/tBu/- -Gli-Wal-Gli-AlaHPTo-NH2.Do mieszaniny 605 img H-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre- /tBuy-GluNH2^sp/OIBu/^Fen-AjpNH2-Liz/Boc/- 45 -Fen-HJis-Tre/tBu/-(Feaa-Pro-GluWH2-Tre/tBu/-Ala- -Tre/tBu/-Gli-,Wal-Gli-Ala-Pro-NH2, 200 mg i : dekapeptydu Boc-Cys-Gli-AspNH2-Leu-Ser/tBui/- 1 -Tre/tiBu/-Cyis-Met-Leu-Gai-OH [Helv. Chim. Acta w 53, 556 /107O/], 46 mg 1-hydioksyibenzotriazolu i mi DMF dodaje sie 75 mg dwrwyklohek^ylokar- bodwuimidu, po czym miesza sie kolejno utrzy¬ mujac 'mieszanine reakcyjna w temperaturze 40°, w ciagu 00 minut i w temperaturze 23° w ciagu 55 16 godzin.Nastepnie odsacza sie wytracony dwucykloheksy- lomocznik i wlewa przesacz do 100 ml eteru, nie zawierajacego nadtlenków i oziebionego lodem. Wy¬ tracony osad odsacza sie, przemywa eterem i suszy. eo Surowy produkt oczyszcza sie wstepnie kolejno wytracajac go dwukrotnie z (mieszaniny DMF oraz eteru i dwukrotnie z mieszaniny DMF oraz eteru i dwukrotnie z mieszaniny DMF oraz wody. Wy¬ tracony produkt poddaje sie_ rozdzialowi w przeciw- 99 pradzie w ukladzie rozpuszczalników 3,66 1 meta-£9 $p*JdP tt nolu, 1 1 roztworu bu£orowfifi&, 2 1 chloroformu i 2,32 1 czterochlorku wegla odbierajac 300 frakcji roztworu,. Roztwór buforowy zawiera 29 ml lodo¬ watego kwasu octowego i 19 g octanu amonowe¬ go w 1 1 wody. Czysty produkt znajduje sie we frakcjach o kolejnych numerach H23—137 /wspól¬ czynnik podzialu K=t9,7$/. Otrzymany produkt wy¬ kazuje w chromatografii cienkowarstwowej naste¬ pujace arartosoi Bi: DS: af/100/^,312; R^A/^0,41.I :— Przyklad VII. Octan H-Cys-Gli-AspNH2- ~t -Leu-Ser-Tre-Cys-Met-Leu- -GluNiH2-Asp-Fen-AsplNH2-Liz-Fen-His-Tre-Een- -Pro-Gl«NHr-Tre-Ala-TjJe-Gli-Wal-Gli-Ala-Pro - NE2. 1" : 490 mg Boc-Cys-GH-AspNH2-Leu-Ser/tBu/-Tre- J. /tBuM^ys-Met-Leu-Gli-Tre/1Bu/-Leu-Tre/tBu^L -GluNHi-As«p/OtBu/-Fen-AspNH2-LizyiBoc/-ren- -His-Tre/tBu/-Fen-Pro-GltiNH2-,rre/tBu/-Ala-Tre- /tBu/-Gli-Wal-Qli-Ala-Pro-NH2 wprowadza sie do 12 ini ochlodzonego lodem 90% kwasu trójifluoro- octowego, przedmuchuje azotem, pozwala sie ogrzac do temperatury pokojowej i pozostawia w tej tem¬ peraturze na 1*0 minut.Nastepnie oziebia sie roztwór reakcyjny znowu do temperatury 0°, wiewa do 150 ml eteru, nie za¬ wierajacego nadtlenków oraz oziebionego lodem, i pozostawia calosc utrzymywana w temperaturze 0° na dwie godziny, po czyim odsacza sie wytraco¬ ny drobny osad, przemywa -eterem i suszy. Wy¬ suszony osad rozpuszcza sie w 15 ml 5% kwasu octowego i przepuszcza otrzymany roztwór przez kolumne zawierajaca wymieniacz jonowy Nr II Mercfca, slabo zasadowy, postac octanowa w celu usuniecia kwasu trójfluorooctowego. Kolumne eluuje sie trzykrotnie 10 ml porcjami 5% kwasu octowego a polaczone eluaty liofilizuje sie. Jako produkt otrzymuje sie 432 mg octanu Leu^—Tre27 peptydu w postaci bezbarwnego lekkiego proszku.Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DC: Rf/101A/=0,50; DA: R.g/512/^0,45. Rezultaty cienko¬ warstwowej elektroforezy na plytkach celulozowych dla otrzymanego produktu przy wartosci pH 1,9 i napieciu 280 V: dlugosc drogi przebytej w ciagu 2 godzin w kierunku katody wynosi 4,5 cm.Substancje wyjsciowa wytwarza sie w nastepu¬ jacy sposób: a/ Z-Tre/tBu/-Leu-Tre/tBu/^Glu!NH2-Asp/OtBu/- -Fen-NH-NH2.Do roztworu 12,7 g H-Leu-Tre/tiBuPGluNHg-Asp- /OtBu/-Fen-OlMe w 1O0 ml DMF dodaje sie 9,0 g Z-Tre/tBu/-OSu i pozostawia na 17 godzin utrzy¬ mujac mieszanine reakcyjna w temperaturze 25°.Nastepnie wytraca sie z niej osad za pomoca wody, odsacza, suszy i przekrystaKzowuje z octanu etylu — wydajnosc 14,2 g. Otrzymany produkt w celu dalszego oczyszczenia wytraca sie z mieszaniny me¬ tanolu orsaz wody i wówczas topnieje on w tempe¬ raturze 1417—199°. W celu przeprowadzenia w hy¬ drazyd IBfi % otrzymanego Z-TreiftBu/-Leu-Tre- /tfiu/-GluNiHz-AspJ40tBu/-Fen^OMe j^zpuszczai sie w 700 ml metenofcu, dodaje 7© ani wodzianu hydra¬ zyny d pozostawia na 45 minut w temperaturze po¬ kojowej. Nastanie zateza sie mieszanine reakcyjna pod obnizonym wytraca z niej osad przez dodanie 5Qfl*ml wody.Wytracony calkowitego jej zobojetnienia i suszy, Jako produkt otrzymuje *& 13,5 g suroG^e^o hy¬ drazydu. W celu oczyszczenia kolejno wytraca 4»ie go z mieszaniny DMF i wody oraz przekrystaiizp- wuje z metanolu. Jako produkt otrzymuje jdg JA g *o krysztalów o temperaturze topnienia 225—227°.Fen-AspNH2HLiz/Bgc/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen-Pro- -Gluira2-Tre^ffiu/TAla'-^re/t^ -Prc-NHj, Zawiesine 4^00 g Z-Tre/tBu/-Leu-Tre/tBu/- -GluNH2-Asp/OtBu/-Fen-NHNH2 w 25 ml DMF utrzymuje sie, mieszajac, w temperaturze "70°, do calkowitego rozpuszczenia sie polipeptydu. Po ozie¬ bieniu otrzymanego roztworu do/temperatury —20° dodaje sie 2y50 ml 3,70 n roztworu chlorowodoru w dioksanie i wkrapia siat mieszajac, do roztworu utrzymywanego w temperaturze —80p, 0,48 ml jazo- tynu IHrz.-bntyflu. Nastepnie pozwala sie ogrzac mieszaninie reakcyjnej do temperatury -^14)° i mie- sza sie, utrzymujac ja w tej temperaturze. Po l5 minutach mieszania kolejno wtanapla sie do (mie¬ szaniny reakcyjnej, oziefbiony do temperatury -^10° roztwór 4,5 g octanu H-AapNH2-Iiz^oc/-Fen-«is- -Tre/tBu/-Fen-Pro-GluNH2-Tre/tBu/-Ala-Ti»e/tBu/- M -Gli-Wal-Gli-Ala-Pro-NH2 w 50 ml DMF i 1/6 -ml N-etylodwuizopropyloaminy, pozwala sie jej ogrzac do temperatury 0° i miesza sie, utrzymujac ja w tej temperaturze, w ciagu nastepnych 69 minut z tym, ze powoli wkrapla sie do alej jeszcze 0$ «sl N-etytodwuizopropyloaminy.Po wkropleniu aminy pozostawia «ie mieszanine reakcyjna, utrzymywana w temperaturze %&* na 17 godzin. W wyniku reakcji wytraca sie gala¬ retowaty osad. Do mieszaniny poreakcyjnej wiewa 44 sie 500 'mi eteru, nie zawierajacego nadtlenków i oziebionego lodem, odsacza wytracony Wid, prze¬ mywa go eterem i suszy. Wysuszony prodiakt ucie¬ ra sie z 200 ml wody z lodem, po czym ponownie odisacza, suszy i kolejno trzykrotnie wytraca sie tt z mieszaniny DMF i wody oraz dwukrotnie z mie¬ szaniny DMF i octanu -etylu.Produkt otrzymany w ilosci 4,08 g wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace war¬ tosci Bi: 50 DS: R/70/=A,«l; Bv/IM/=Q2&. cl H-Tre/tBu/-Leu-Tre/tBu^ -Fen-Asp,NHt^iz/Boc/-Fe^-Hds-TreiitBuy-Fen^25o^ -GluNH2-Tre/,tBu/-Ala-Tre/tBu/^Gli-Wal-Gli-Ala- -Pro-NH* 55 3,0 g zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie b .rozpuszcza sie w 200 ml 90% kwasu octowego i uwodarnia w znany sposób wobec fly5 g wegla palladowarnego JW/o Pd/. Otrzymany w wy¬ niku reakcji uwodarnianda octan oczyszcza sie od 60 kwasu octowego rozpuszczajac go w 200 ml n-bu- tanoul nasyconego woda, i kolejno przemywajac kilkakrotnie (rozcienczonym roztworem weglanu so¬ dowego, rozcienczonym roztworem chlorku sodowe¬ go oraz woda. Wytworzona podczas przemywania 65 roztworu Jbutanolowego obfita emulsja oddziela sie89 869 31 na wirówce. Nastepnie odparowuje sie roztwór bu- tamolowy do sucha otrzymujac 2,15 g H-Tre/tBu/- -Leu-Tre/itBu/-GluNH2-Asp/OtBu/-Fen-AspNH2- -Uzi/!Boc/-Fen-IHis-Tre/tBu7HFen^^^^ /tBu/-Ala-Tre/tBu/-Gli-Wal-GH-Ala-Pro-NH2 — w postaci bezbarwnej zywicy.Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/96/=0,37; R/100/=0,19.I d/ Boc^ys-Gli-As|pNHtTLeu-Ser/tBu/-Tre/tBu/- 32 -J -Cys-Met-Leu-Gli-Tre/tBu/-Leu-Tre/tBu/-GluNH2- -Aspy^Bu/^en-AspNH8J2z/Boc/-Fen-His-Tre- /tBu/-Fen-Pro-GluiNH2-Tre/'tBu/-AiaTTre/tBu/-Gli- ^Wal-Gli-Ala-Pro-NH2.Do mieszaniny 2,01 g zwiazku otrzymanego w '•"' I sposób opisany w punkcie c, 1,00 g Boc-Cys-Gli- ' -—«TH -AspNH2-Leu-Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys-Met-Leu- -Gli-OH, 250 mg N-hydroksyimidu kwasu 'burszty¬ nowego i 30 ml DMF dodaje sie, 400 mg dwu- cyklohefcsylokarbodwimidu, po czym calosc miesza sie 6 godzin, utrzymujac temperature 43°. Nastep¬ nie oziebia sie mieszanine reakcyjna do tempera¬ tury 0° na trzy godziny, odsacza wytracony dwu- cykloheksylomocznik i wlewa przesacz do 250 ml eteru, nie zawierajacego nadtlenków i oziebionego lodem. Wytracony osad odsacza sie, przemywa ete¬ rem i suszy. Surowy produkt oczyszcza sie kolej¬ no wytracajac .go trzykrotnie z mieszaniny DMF i wody oraz trzykrotnie z mieszaniny DMF i aceto¬ nu. Jako produkt otrzymuje sie 1,72 g oczyszczo¬ nego i ochronionego Leu12—Tre27 polipeptydu, który wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na¬ stepujace wartosci Rf: DS: Rf/52A/=0,33; Rf/lO0/=0,30; Rf/107^=0,58.I Przyklad VIII. H-Cys-Gli-AspNH2-Leu-Ser- 1 -Tre^Cys-Met-LeunGM-Tre-Leu-Tre-GluNHa-Asp- -Fen-AspNH2-Liz-Fen-His-Tre-Fen-Pro-GluNH2- -Tre-AspNH2-Tre-Gli-Wal-Gli-Ala^Pro-NH2.I 170. mg Boc-Cys-Gli-AspNH^Leu-Ser/tBuZ-Tre- /tBu/-CyB-Met-Leu-Gli-Tret/ltBu/nLeu-Tre/.tBu/- -GluNH2-Asp/OtBu/-Fen-AspNH2nLiz/Boc/-Fen- -His-Tre/tBu/-Fen^Pro-GluNH2-Tre/tBui/-AsipNH2- -Tre/tBu/-Gli-Wal-Gli-Ala-ProJNH2 rozpuszcza sie w 5 ml 90% kwasu trójfluorooctowego i pozosta¬ wia na 90 minut utrzymujac roztwór reakcyjny w temperaturze 25°. Nastepnie wytraca sie trójtfluoro- octan peptydu za pomoca eteru, nie zawierajacego nadtlenków, odsacza, przemywa eterem, suszy i rozpuszcza w 1% kwasie octowym. Otrzymany kwasny roztwór przepuszcza sie przez kolumne wy¬ pelniona wymieniaczem jonowym Mercka /slabo zasadowym, .postac octanowa/, eluuje ,1% kwasem octowym i liofilizuje eluat, otrzymujac 116 mg pro¬ duktu. W celu oczyszczenia surowego produktu rozpuszcza sie go w 5 ml wody, otrzymujac roz¬ twór o wartosci pH=4,2 i dodaje porcjami, mie¬ szajac, 2,8 ml wymieniacza jonowego Nr II Mercka /slabo zasadowy, postac zasadowa/. Wartosc pH roztworu powoli wzrasta i po osiagnieciu wartosci okolo 6,7 zaczyna sie wytracac wolny peptyd. Mie¬ szanine reakcyjna miesza sie w ciagu nastepnych 2 godzin z tym, ze jej wartosc pH dochodzi do 7,1J Nastepnie odsacza sie osad razem z wymienia¬ czem jonowym i przemywa woda, po czyim wpro- s wadza do 90% kwasu octowego, ogrzanego do tem¬ peratury -60°, aby rozpuscic peptyd. Nierozpuszczo- ny wymieniacz jonowy odsacza sie, przemywa 90*/§ kwasem octowym a przesacz liofilizuje. Jako pro^ dukt otrzymuje sie 98 mg octanu Leu12-AspNH2,f- -Tre27-peptydu o wysokiej czystosci. Otrzymany produkt wylkazuje w chromatografii cienkowarst¬ wowej nastepujace wartosci Rf: DC: Rj/IGIA—0,33; DA: Rf/52/=0,47.Stosowany jako substancja wyjsciowa ochronio- ny peptyd otrzymuje sie w nastepujacy sposób. a/ Z-Tre/tBu/-Leu-Tre/tBu/-GluNH2-Asp/OtBu/^ -Fen-AspNH2-Liz/Boc/-Fen-His-Tre/tBui/'-Fen-Pro- -GluNH2-Tre/tBu/-AspNH2-Tre/tBu/HGli-Wal-Gli- -Ala-Pro^NH2. 380 g Z-TreABu/-Leu-TreABu/-GluNH2-Asp- /OtBu/-Fen-NHNH2 otrzymanego w sposób opisany w przykladzie VII rozpuszcza sie w 5 ml DMF, mieszajac i utrzymujac w temperaturze 70°, po czym oziebia sie roztwór do temperatury —20° i kolejno dodaje 0,265 ml 3,71 n roztworu chlorowo¬ doru w dioksanie oraz 0,O5il ml azotynu Illrz.^bu- tylu. Mieszanine reakcyjna pozostawia sie na 10 minut utrzymujac ja w temperaturze —10°. Nastep¬ nie dodaje sie, oziebionego do temperatury —10°, roztworu octanu H-AspNH2-Liz/Boc/-Fen-His-Tre- /tBu/-Fen-Pro-GlaiNH2-Tre/tBu/-AspNH2-Tre/tBu/- -Gli-Wal-Gli-Ala-ProNH2, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie I n, w 5 ml DMF oraz 0,20 ml N-etylodwuizopropyloaminy, po czym miesza sie utrzymujac mieszanine reakcyjna w tempera¬ turze 0°.Po godzinnym mieszaniu dodaje sie jeszcze 0,07 ml N-etylodwuizopropyloaminy, pozwala sie ogrzac mieszaninie reakcyjnej do temperatury pokojowej 40 i kolejno zostawia na 1 godzine utrzymujac ja w temperaturze 25° oraz na 2X) godzin utrzymujac ja w temperaturze 5°. W tych warunkach zaczyna sie wytracac galeretowaty osad, który wytraca sie calkowicie po dodaniu 100 ml wody z lodem. Wy- 45 tracony osad odsacza sie po uplywie 1 godziny w temperaturze 0°, przemywa woda i suszy. Suchy proszek uciera sie z eterem, odsacza i suszy po¬ nownie. Surowy produkt w postaci bezbarwnego proszku oczyszcza sie kolejno wytracajac jedno- 50 krotnie z mieszaniny DMF i wodny oraz dwukrot¬ nie z mieszaniny DMF i acetonu. Oczyszczony pro¬ dukt otrzymany w ilosci 440 mg wykazuje w chro¬ matografii cienkowarstwowej nastepujace wartosci Rf: DS: Rf/70/=0,52; Rf/100/=0,31; Rf/B6/=0,40.M W H-Tre/tBu/-Leu-Tre/tBu/-GluiNH2-Asp/OtBu/- -Fen-AspNH2-Liz/Boc/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen-Pro- -GluNH2-Tre/tBu/-AspNH2-Tre/tBu/-Gli-WaWJli- -Ala-Pro-iNH2. 260 mg zwiazku otrzymanego w sposób opisany 60 w punkcie a rozpuszcza sie w 25 ml 80% kwasu octowego i uwodarnia w znany sposób wobec 50 mg wegla palladowanego /10°/o Pdi/. Produkt reakcji w postaci zywicy otrzymany w ilosci 266 mg oczysz¬ cza sie od kwasu octowego rozpuszczajac go w 65 20 ml butanolu nasyconego woda. Roztwór butano-89 869 33 34 Iowy kolejno przemywa sie kilkakrotnie roztworem weglanu sodowego, rozcienczonym roztworem soli kuchennej oraz woda i odparowuje sie warstwe butanolowa.Oczyszczony produkt, otrzymany w ilosci 199 mg, wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na¬ stepujace wartosci Rf: DS: R1/lO0/=0,13; Rf/96/= =0,38. \— c/ Boc-Cyt5-Gli-Asp(NHl-Iieu-Serylt5Bu/-Tre/tBu/,- -Cys-Met-Leu-GM-TreytBu/-Leu-Tre/tBW^GluNHi- -Asp/OtBuZ-Fen-AspiNH^Liz/Boc/^Fen-His-Tre- /tBu/^FenHRro-GluNHt-Tre/tBu/-AspNHt-Tre/tBu/- -Gli-Wal-Gii-AlaHPro-NH2.I Do mieszaniny 102 mg Boc-Cys-Gli-AspNH2- " 1 -Leu-Ser/tBu/-Tre/HBu/-Cys-Met-Leu-Gli-OH 199 mg H-Tre/tBu/-Leu-Tre/tBu/-GluNH1-Asp/OtBu/-Fen- -Asp(NH2-Liz/Boc/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen-Pro- -GluNH2-Tre/tBu/-Asp(NH£-Tre/tBu/-Gli-Wal-Gli- -Ala-Pro-NH2, 16 mg N-hydroksyimidu kwasu bur¬ sztynowego i 3 ml DMF dodaje sie, mieszajac, 27 mg dwucykloheiksylokarbodwuimidai i miesza sie mieszanine reakcyjna, utrzymywana w temperaitu- rze 45°, w ciagu 6 godzin. Nastepnie wlewa sie ja do eteru oziebionego lodem i odsacza po 2 godzi¬ nach w temperaturze 0° wytracony osad, przemy¬ wa eterem d suszy. Wysuszony proszek rozpuszcza sie, ogrzewajac, w 5 ml DMF, po czym ochladza sie roztwór do temperatury pokojowej i wytraca osad dodajac 50 ml octanu etylu. Wytracony osad odsacza sie, przemywa octanem etylu i suszy. Su¬ chy proszek rozpuszcza sie, ogrzewajac, w miesza¬ ninie DMF d metanolu /1:1/, oziebia lodem i wy¬ traca osad wlewajac do wody z lodem. Po 17 godzi¬ nach odsacza sie w temperaturze 0° wytracony drobny osad, przemywa woda i suszy nad chlor¬ kiem wapniowym pod obnizonym cisnieniem. Jako produkt otrzymuje sie 175 mg tytulowego ochro¬ nionego dotriakontapeptydu. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwowej na¬ stepujace wartosci Rf: DS: Rf/107/=0,60; R/52A/= =0,23; Rf/H00/=*0^22.I Przyklad IX. H-Cys-Glii-AspNH2-Leu-Ser- 1 -Tre-Cys-MetnLeu-Gli-Tre-Tyr-Tre-GluNH2-Asp- -Fen-AspNH2-Liz-Fen-His-Tre^Fen-Pro-GlulNH2- -Tre-AspNH2-Ileu-Gli-W«i-Gli-Ala-Pro-NH2.Do 2,5 ml OO^/o kwasu trójjfhiorooctowego, oziebio¬ nego lodem, wprowadza sie, mieszajac i przedmu¬ chujac azotem, 115 mg drobno sproszkowanego I ' : 1 Boc-Cys-GM-AspNH2-Leu^Sre/tBu/-Tre/tBu/-Cys- -Met-I^u-Gli-Tre/ltBW-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-GluiNH2- -Asp/OtBu/-Fen-Asp(NH2-Iiz/Boc/-Fen-His-Tre- ABu/-Fen-Pro-GluNH2-Tre/tBu/-AspNH2-Ileu- -Gli-Wal-Gli-Ala-Pro-NHj. Po rozpuszczeniu peptydu pozwala sie ogrzac roztworowi do tempe¬ ratury 21° i pozostawia na 90 minut. Nastepnie wlewa sie go do 50 ml eteru nie zawierajacego nad¬ tlenków i oziebionego lodem, odsacza wytracony osad, i suszy. Jako produkt otrzymuje sie 64 mg trojfluorooctanu AspNH2M-peptydu. W celu prze¬ prowadzenia trójfluorooctanu w octan rozpuszcza sie go w l°/o kwasie octowym i przepuszcza roz¬ twór przez kolumne zawierajaca wymieniacz jono¬ wy Nr II Mercka /slabo zasadowy* poatac octano¬ wa/. Po zliofilozowandu eluatu otrzymuje sie 75 mg AspNH228-peptydu w postaci octanu. Otrzymany produkt poddany calkowitej hydrolizie za pomoca 6 n HOl, w temperaturze 110°, w ciagu 24 godzin, wykazuje teoretycznie obliczona zawartosc amino¬ kwasów. W chromatografii cienkowarstwowej na plytkach celulozowych wykazuje on nastepujace io wartosci Rf: W nawiasach podano porównawczo wartosci Rf dla Kalcitoniny M.Rf/101A/»0,56 70,60/; Rf/112A/=0,58 /0,G2v\ Stosowany jako substancja wyjsciowa ochronio¬ ny peptyd wytwarza sie w nastepujacy sposób: a/ Z-AspNH2-Ileu-GJi-OMe Mieszanine 9,1 g chlorowodorku H-Ileu-Gli-OMe, 16,3 g Z-AspNH2-ONp, 50 ml DMF i 4,1 ml N-etylo- morfoliny pozostawia sie na 18 godzin w tempera¬ turze pokojowej. Roztwór reakcyjny zastyga w tych warunkach na galarete. Nastepnie dodaje sie 300 ml eteru, uciera, odsacza osad, suszy, uciera nierozpuszczony proszek z 200 ml wody, ponownie odsacza, suszy i przekrystalizowuje z mieszaniny octanu etylu i heksanu. Jako produkt otrzymuje sie 15 g Z-AspNH2-Ileu-Gli-OMe o temperaturze topnienia 218^-219°. b/ H-AspNH2-Ileu-Gli-OMe Z 14 g Z-AspNH2-Ileu-Gli-OMe sporzadza sie za¬ wiesine w 5O0 ml DMF i uwodarnia wobec 1 g wegla palladowanego i/U0% Pd/. Substancja wyjs¬ ciowa przechodzi przy tym do roztworu. Po zakon¬ czonym uwodornianiu odsacza sie katalizator, a przesacz odparowuje sie do sucha. Jako produkt otrzymuje sie 9,7 g H-AspNH2-Ileu-Gli-OMe, nie zawierajacego substancji wyjsciowej, c/ Z-Tre/tBu/-AspNH2Hlleu-Gli-OMe.Mieszanine 9,5 g H-AspNH2-Ileu-Gli-OMe, 80 ml DMF i 13,6 g Z-Tre/tBu/-OSu, utrzymywana w temperaturze 25°, pozostawia sie na 25 godzin, 40 mieszanina reakcyjna w tym czasie calkowicie sie zestala. Nastepnie uciera sie ja z 300 ml eteru, odsacza osad i suszy. Wysuszony osad uciera sie z 200 ml wody, ponownie odsacza, suszy i prze¬ krystalizowuje z etanolu. Produkt otrzymany w 45 ilosci 12,4 g topnieje w temperaturze 207—208°. d/ H-Tre/tBu/-AspNH2-Ueu- 11,0 g Z-Tre/tBu/-AspNH2-lleu-Gli-OMe rozpusz¬ cza sie, ogrzewajac, w 500 ml DMF i uwodarnia wobec 1 g wegla palladowanego /lWo Pd/. Po za- 50 konczeniu reakcji uwodarniania odsacza sie katali¬ zator, a przesacz odparowuje sie do sucha. Jako produkt otrzymuje sie 8,0* g H-Tre/tBu/-AsipNH2- -Ileu-Gli-OMe. W cienkowarstwowej chromato¬ grafii na plytkach silikazelowych wykazuje on na- 55 stepujace wartosci Rf: Rt/4&AJ= metanol=70:30/=EiO,28. e/ Z-GluNH2-Tre/tBu/-AspNH2-Ileu-Gli-OMe Do roztworu 7,5 g H-Tre/tBu/-AspNH2-Ileu-Gli- -OMe w 100 ml DMF dodaje sie 7,7 g Z-GlufNH2- 60 -ONp i pozostawia na 18 godzin w temperaturze pokojowej. Mieszanina reakcyjna powoli krzepnie na stala mase. Nastepnie uciera sie ja starannie z 375 ml eteru, odsacza osad, suszy, uciera z 250 ml wody i ponownie odsacza oraz suszy, po czym wy- 65 traca z mieszaniny trojfhioroetanolu i wody. Pro-«*£» dukt otrzymany w ilosci 11 g topnieje w tempera¬ turze 275—277° i Jest trudno rozpuszczalny w zwykle stosowanych rozpuszczalnikach organicz¬ nych. tl H-GliiNH2-Tre/1©u/-AspNH2^Ileu-OJi<)Me Z 8,5 g ZwGluINH2-Tre/tBu/^AspNHHleu-Gli-OMe sporzadza sie zawiesine w 500 ml DMF i uwodar- wxbec 1,5 g wegla palladowanego /10°/o Pd/. Sub¬ stancja wyjsciowa przechodzi w wyniku reakcji w zwiazek rozpuszczalny w DMF. Po zakonczeniu re¬ akcji uwodarniania odsacza sie katalizator, a prze¬ sacz odparowuje sie. Jako produkt otrzymuje sie H-GhiNHj-Tre/^^ w posta¬ ci zywicy, w ilosci 6,5 jg. W cienkowarstwowej chromatografii na plytkach ailikazelowych wyka¬ zuje on ^nastepujace wartosci Rf: Rf/43C/=0,20; Rf/lfllA/=<04«, e/ Z-Tre/tBuy-Fen^ProHGluiNHa-Tre/tBu/- -AspNHt-Jleu-Gli-OMe. Do roztworu 6*0 g H- -GluNHf-Tre/tBu/-AspNH2-Ileu-Gli-OMe w 500 ml DMF dodaje sie 5,8 g Z-Tre/tBu/-Fen-Pro-OH,2,3 g Nnbydroksyimidu kwasu bursztynowego i 3 g dwu- cykloheksylokarbodwuimidu. Mieszanine reakcyjna miesza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 16 godzin, po czym odsacza sie dwucykloheksylomocz- nik, a przesacz zateza sie do objetosci 200 ml i wlewa do 1,5 1 eteru. Po 3 godzinach utrzymywa¬ nia mieszaniny poreakcyjnej w temperaturze 0° odsacza sie drobny osad otrzymujac po wysusze¬ niu 16 g proszku. Otrzymany proszek uciera sie z 200 ml wody, odsacza osad i suszy. Surowy pro¬ dukt otrzymany w ilosci 9,6 g oczyszcza sie w ten sposób, ze wstepnie uciera sie go z octanem etylu, a po odsaczeniu i wysuszeniu osadu sporzadza sie jego zawiesine w acetonie, ponownie odsacza i su¬ szy. Nierozpuszczalny produkt otrzymany w ilosci 9,3 g jest wystarczajaco czysty do dalszej syntezy.W chromatografii cienkowarstwowej na plytkach sUJfcazelowych wykazuje on wartosc Rf/102A/=0,66. fe/ Z-Tre/tBu/-Fen-^ro-GluNH2-T,re/tBu/-AspNH2- -Jleu-Gli-OH. 3,1 g Z~Tre/tBu/-Fen-Pro-GluNH2-TreMBu/- -AapiNH2-Ileu~Gli-OMe rozpuszcza sie, ogrzewajac w mieszaninie 155 ml metanolu 45 ml dioksanu i 53 ml iwdy. Otrzymany roztwór ochladza sie do temperatury pokojowej, dodaje 8 ml 1 n NiaOH i pose&tawia na 30 minut w temperaturze pokojowej.Nastepnie oziebia sie mieszanine reakcyjna do tem¬ peratury 0° i dodaje 150 ml wody z lodem oraz 24 mi 1,0 n HQ, ipo czym odsacza sie osad, prze¬ mywa woda z lodem i suszy. Jako produkt otrzy¬ muje sie ?J56 ,g proszku, który nie rozdziela sie w chromatografii cienkowarstwowej i wykazuje nastepujace wartosci Bf: Rf/45/^0,211; Rf/100/=0,19. i/ H-Tre/1fflu/-Fen.-Pr<-GluNH2-Tre/tBu/-AspNH2- -Ileu-Gli-OH. 2,37 g Z-Tre/tBu/-Fen^Pro-GluiNH2-Tre/tBu/- -AspNHjj-Ileu-GM-GH rozpuszcza sie w 60 ml 90% kwasu octowego i uwodarnia wobec 200 mg wegla palladowanego /10*/o Pd/. Po zakonczonej reakcji uwodarniania odsacza sie katalizator, a przesacz odparowuje sie i suszy pozostalosc. Jako produkt otrzymuje sie 2,28 g zywicy, która nie zawiera nie uwodornionej substancji wyjsciowej, co stwierdzo¬ no 2a pomoca chromatografia cienkowarstwowej. 16 nastepujace wartosci Rf: Produkt wykazuje Rf/107/=0,55. k/ Z-AspNH2-Liiz/Boc/-Fen-His-Tre^Sli/-Fen-^FO- -GluNH2-Tre/tBu/-Asip;NH2-Iieu-Gli-OH.Do roztworu 1,41 g Z-AspNH2-Iiz/B©c/-Fen-His- -NHNH2 w 20 ml DMF, oziebionego do tempera¬ tury"—30°, dodaje sie 1,5 ml 3,2 n roztworu chk«« rowodoru w dioksanie i 0,29 ml azotynu IHrz.^bu¬ tylu, po czyim ^pozwala sie mu ogrzac do tempera- io tury —12° i miesza sie utrzymujac go w tej tem¬ peraturze w ciagu 15 minut. Nastepnie wkrapla sie, oziebiony do temperatury 09, roztwór 1,65 g H^Tre/JSu/-^en^r^ -Ileu-GM-OH, 1,2 ml 40°/o roztworu wodorotlenku trójmetylobenzyloamoniowego w metanolu w 30 ml DMF i 6 ml wody. Mieszanine reakcyjna miesza sie, oziebiajac lodem, i dodaje, w ciagu 30 minut, jeszcze 1,1 ml N^etylodwmzopropyloaminy, po czyni pozostawia sie ja, utrzymujac w temperaturze 0Ó, na 5 godzin. Z mieszaniny reakcyjnej zaczyna sie wydzielac galaretowaty osad. Nastepnie wlewa sie ja do 300 mi 1% kwasu octowego, miesza, utrzy¬ mujac w temperaturze 0°, w ciagu 2 godzin i od¬ sacza osad. Odsaczony osad przemywa sie woda, suszy, dodaje 50 ml metanolu i miesza w tempera¬ turze pokojowej w ciagu 2 godzin, po czym odsacza sie nierozpuszczalny w metanolu Z-AspNH2-Liz- /Boc/-Fen-Hi6-Tre/*Bu/-FennPro-GluiNH2-Tre/tBu/- -AstpiNH2-Ileu-Gli-OH w ilosci 399 mg. Otrzymany produkt wykazuje w chromatografii cienkowarstwo¬ wej na plytkach smikazeiowych nastepujace war¬ tosci Rf: Rf/lO0/=0,18; Rf/52/=0,24; R/TO/^0,33. 1/ Z-AspNH2-Liz/iBoc/-Fen-His-Tre/tBu/-Fen- -Pro-GluiNH2-T;re/tBu/-AspNH2-rieu-Gli-Wal-Gli- -Ala-Pro-NH2.Do mieszaniny 420 mg ZiAspNH2-Liz/Boc/-Fen^ -His-Tre/tBu/^,en-Pro«GluNH£-Tre/tBu/-AspNH2- -Ileu-Gli-OH, 55 g hydroksyimidu kwasu burszty¬ nowego i 7 ml DMF dodaje sie, mieszajac, 62 mg 40 dwucykloheksylokaribodwuimidu i 103 m& H-Wal- -Gli-Ala-Pro-INKk. Nastepnie ogrzewa sie mieszani¬ ne reakcyjna do temperatury 45° i irneaza, itfffzy- mujac w tej temperaturze, w ciagu { ,godzin, po czym oziebia sie ja do temperatury 0° i wlewa do 80 ml eteru oziebionego lodem. Wytracony osad odsacza sie, suszy i oczyszcza kolejno wytracajac go z mieszaniny DMF i acetonu oraz z mieszani¬ ny DMF i aeetontitryiu. Jako produkt otrzymuje sie tytulowy heksadetrapeptyd, w ilosci 4#0 wig, który w chromatografii cienkowarstwowej na plytkach sUikazelowych wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf/100/=0,25, R/107/=0,60. m/ H-A«pINH2-.Liz/Boc/-Fen^His--Tre/tBu/-Fen- -Pr^-GluNH^Tre/tBuZ-A^NH^Ileu^GM-Wai-Gli- -Ala-Pro-NH2. 395 mg zwtazku otrzymanego w sposób opisany w przykladzie 1 rozpuszcza sie w 25 ml 80*/o kwa¬ su octowego i uwodarnia wobec 100 m»g wegla pal¬ ladowanego tfl0% Pd/. Po zakonczonej reakcji uwo- 60 darniania odsacza sie katalizator i odparowuje przesacz do sucha. Produkt otrzymany w ilosci 380 mg, nie zawiera substancji wyjsciowej, co stwierdzono za pomoca chromatograffiii cienkowar¬ stwowej na plytkach silikazeiowych i wykazuje m wartosc ©^107/^0^30. 45 50 5589 869 37 38 n/ Z-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-GluiNH2-Asp- /OtBu/-Fen-AspNH2-Liz/!Boc/-Fen-HJis-Tre/tBu/- -Fen^Pro-GluNH2-Tre/tBu/-AspNH2-Ileu-Gli-Wal- -Gli-Ala-Pro-NH2. 358 rag Z-Tre/tBu/-Tyr-/tBu/-Tre/tBu/-GluNH2- -Asp/OtBu/-Fen-NH-NH2 rozpuszcza sie, ogrzewajac, w 3 ml iDMF, po czym oziebia sie otrzymany roz¬ twór do temperatury -^20°, kolejno dodaje 0,26 ml 3,2 n roztworu chlorowodoru w dioksanie oraz 0,045 ml azotynu Illrz.-butylu i miesza, utrzymujac w temperaturze —1'5°, w ciagu 15 minut. Nastep¬ nie dodaje sie oziebiony do temperatury 0°, roz¬ twór 380 mg zwiazku otrzymanego w sposób opasa¬ ny w punkcie m, w mieszaninie 10 ml DMF, 2 ml wody, 1 ml acetonitrylu, 2 ml sulfotlenku metylu oraz 0,2 ml N-etylodwuizotpropyloaminy i miesza, utrzymujac mieszanine reakcyjna w temperaturze 0°, w ciagu 18 godzin. Wytracony produkt odsacza sie i oczyszcza wytracajac dwukrotnie z mieszani¬ ny DMF, i octanu etylu. Wysuszony proszek mie¬ sza sie w 20 ml metanolu, odsacza produkt nieroz¬ puszczalny w metanolu i suszy. Jako produkt o- trzyimuje sie tytulowy peptyd w ilosci 240 mg. W chromatografii cienkowarstwowej na plytkach sili- kazelowych wykazuje on nastepujace wartosci Rf: Rf/43C/=0,40, Rf/100/=0,28, Rf/96/=0,42. o/ H-Tre/(tB'W-Tyr/tBu/-Tre/tBu/-GluiNH2-Asp- /OtBu/-Fen-AsplNH2-Uiz/Boc/-Fen-His-Tre/tBu/- -Fen-Pro-GluNH2-'lrre/tBui/,-AspNH2-Ileu-Gli-Wal- -Gli-Ala-Pro-NH2. 220 mg zwiazku otrzymanego w sposób opisany w punkcie n/ rozpuszcza sie w 15 ml 80% kwasu octowego i uwodarnia wobec 20 mg wegla palla- dowanego /10§/o Pd/. Po zakonczonej reakcji uwo- damiania odsacza sie katalizator i odparowuje prze¬ sacz do sucha otrzymujac 210 mg pozostalosc. W celu usuniecia kwasu octowego pozostalosc rozpusz¬ cza sie w 1<5 ml n-butanolu nasyconego woda i kolejno przemywa roztwór rozcienczonym roztwo¬ rem NaHCOa i kilkakrotnie woda. Nastepnie odpa¬ rowuje sie warstwe buianolowa otrzymujac 202 mg tytulowego peptydu nie zawierajacego kwasu octo¬ wego. Otrzymany produkt wykazuje w chromato¬ grafii cienkowarstwowej na plytkach silikazelowych nastejpujace wartosci Rf: Rf/96/=0,40, Rf/43C/=0,32. i : : p/ Boc-Cys-Gli-AspiNH2-Leu-Se]VtBu/-Tre/itBu/- 1 -CysnMet-Leu^Gli-Tre/tBu/-Tyr/tBu/-Tre/tBu/- -GluNH2-Asp/OtBu/-Fen-AspNH2-Ldzi/,Boc/-Fen- -Hiis-Tre/tBu/-Fen--Pro-GluINH2-Tre/tBu/-AspNH2- -Ileu-Gli-Wal-Gl)i-Ala-Pro-NH2.I Do mieszaniny 97 mg .Boc-Cys-Gli-AspNH2-Leu- 1 -Ser/tBu/-Tre/tBu/-Cys-Met-Leu-Gli-OH, 195 mg peptydu otrzymanego w sposób opisany w punkcie o,. 16'mg N-hydroksybenzotriazolu oraz 3 ml DMF dodaje sie 25 mg dwucykloheksylokanbodwuimidu i miesza calosc, utrzymywana w temperaturze 45° i w atmosferze azotu, w ciagu 5 godzin. Nastepnie wlewa sie mieszanine reakcyjna do 50 ml eteru, nie zawierajacego nadtlenków i oziebionego lodem, i odsacza Wytracony drobny osad. Osad oczyszcza sie kolejno wytracajac go dwukrotnie z mieszani¬ ny DMF i wody oraz dwukrotnie z mieszaniny DMF i octanu etylu. Jako produkt otrzymuje sis tytulowy ochroniony peptyd w ilosci 120 mg.TX/ chromatografii cienkowarstwowej na plytkach s^ikazelowych wykazuje on nastepujace wartosci Rf: Rf/52*A/=0,31, Rf/100/^0,17, Rf/107/=0,65.Nowe zwiazku wykazuja dzialanie regulujace za¬ wartosc wapnia przy jego niedoborze. Obnizaja one zawartosc wapnia w plazmie i zawartosc fosfo¬ ru we krwi u ssaków, co wykazano w doswiadcze¬ niach przeprowadzonych na szczurach. Nowe zwdaz- ki moga byc stosowane przy obnizonej zawartosci wapnia we krwi, zrzeszotnieniu kosci i znieksztal¬ cajacemu zapaleniu kosci. Wydzielanie sie elektro¬ litów w moczu jest takie same jak dla ludzkiej kalodtoniny w przeciwienstwie do salmokalcitoniny, która silnie dziala na nerki.Peptydy, otrzymane sposobem wedlug wynalazku znajduja zastosowanie w postaci preparatów far¬ maceutycznych. Preparaty te zawieraja peptydy w mieszaninie z odpowiednim, organicznym albo nieorganicznym nosnikiem, który umozliwia poda¬ wanie preparatu dozylnie, domiesniowo, podskór¬ nie albo do nosa. Jako nosniki stosuje sie sub¬ stancje nie reagujace z polipeptydarni takie jak zelatyna, agar-agar, tragakant, celuloza taka jak Avicel /mikrokrystaliczna celuloza/ i pochodne ce¬ lulozy takie jak karboksymetyloceluloza, etery ce¬ lulozowe takie jak metylo-albo etyloceluloza, poli- alkilenoglikole, takie jak propylenoglikole, woda, jedno- lub wielowartosciowe alkohole takie jak eta- ,0 nol, izopropanol, gliceryna albo heksyty, oleje ros¬ linne i inne estry kwasów tluszczowych takie jak olej arachidowy, olej z nasion bawelny, olej mig¬ dalowy, z oliwek, olej rycynusowy, oleinian etylu, mirystynian izopropylu, palmitynian izopropylu, 3P „Cetiol" /estry kwasu olejowego cieklych alkoholi tluszczowych/ „Miglyol" albo „Labrafac" /miesza¬ niny trójglicerydów kwasów tluszczowych zawie¬ rajacych 8—12 atomów wegla, „Labrafil M 2735" albo „Labrafac WL 1219" /mieszaniny gliceryny i 4j estrów polioksyetylenowych kwasów tluszczowych/, „Arlacel" /ester sorbitowy kwasu tluszczowego/, „Tween" /oleinian polioksyetylenosorbitowy/ albo oleje silikonowe takie jak olej dwumetylosilikono- wy lub inne znane nosniki leków. 45 Preparaty farmaceutyczne wytwarza sie w po¬ staci liofilizowanej albo w postaci cieklej takiej jak roztwór, zawiesina, emulsja albo roztwór do aerozolowania. Preparaty farmaceutyczne sa ewen¬ tualnie sterylizowane i/albo zawieraja srodki po- 50 mocnicze takie jak srodki konserwujace albo sta¬ bilizujace, zwilzacze albo emulgatory. Moga one równiez zawierac jeszcze inne substancje o ko¬ rzystnych wlasciwosciach farmakologicznych. 55 PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o wzo¬ rze ogólnym, podanym na rysunku w którym linia pomiedzy pierwszym i siódmym aminokwasem o- znacza mostek dwusiarczkowy, R oznacza atom Wo- 60 doru badz tez wolna albo zacylowana grupe ami¬ nowa, X oznacza reszte L-metioninowa albo L-wa- linowa, W oznacza reszte L-alaninowa lub L-aspa- raginowa i/albo A oznacza reszte L-izoieucynowa lub L-treoninowa, i ewentualnie Y Oznacza reszte as L-treoninowa lub L^lizynowa, Z oznacza reszteMM9 19 Lrtyrozynowa lub Inleucynowa, P oznacza reszte L^enyloalaninowa lub L-leucynowa, Q oznacza re¬ szte L*fenyioalaninowa lub L-iyrozynowa, a U o- znacza reszte L^flutatninowa lub Jargminowa, o- raz den soli addycyjnych i zwiazków komplekso¬ wych, znamienny tjm, ie poszczególne aminokwa¬ sy ozoacasene kolejnymi numerami ilustrujacymi ich umiejscowienie w 1—32 sekwencji peptydu o wzorze 1, takie jak L-cysteina, dezamino-L-cysteina albo N-acyk-L-cyateina/l/, glicyna/2/, L-asparagi- na/ftf, L-Ieucyoa&/» L-seryna/5/, L-treonima/6/, L- -cyateina/7/, L^metionina albo L-waIina/8/, L-leu- cyna/9/, glicyfea/lO/, L-treonina albo L-lizynailll/, L-tyrozyna albo L-leucyna/12/, L-»treonina/13/, L- -glutamina/W, kwas L-ospatagin6wy/15/, L-fenylo- alanioa albo L-ieucyna/16/, L-asparagina/n/, L-H- zyna/18/, L^feuyloalandna albo L~leucyna/19/, L-hi- stydynai/20/, L^treonina/ll/, L-fenyloaianina albo L-tyrozyna/!22/, L-prolina/2&/, L-,gluta«mina albo L- -argininavia4/, L-treonkLa/25/, L-asparagina/26/, L- ¦^treonina/27/, *Ucyoa/28/, L-walinai/129/, glicyna/30/, L»alanina/31/ i amid L-proiiny/32/ albo odpowiedni acereg aminokwasów, w którym 26 aminokwasem jest L-4danina albo 27 aminokwasem jest L-izoleu- cyna, albo zaktywowane pochodne tych aminokwa¬ sów, jak zaktywowane estry, azydki albo mieszane bezwodniki, pod posrednia oslona grup funkcyjnych nie bioracych udzialu w reakcji jak grupy karbo¬ ksylowa, aminowa, merkapto d ewentualnie hydro¬ ksylowa, w wymienionej kolejnosci pojedynczo albo po uprzednim utworzeniu mniejszych jednostek peptydowych, w szczególnosci sekwencji 1—6, 7—10, 11—16, 17—£0, *1—28, i 29—32, wzajemnie laczy sie w sekwencji l~-36 i w odpowiednim stadium syntezy, korzystnie po otrzymaniu sekwencji 1—10 albo 1—32, tworzy sie mostek dwusiarczkowy po¬ przez utlenienie i ewentualnie przeprowadza sie o- trzymany amid dotrijfeontapeptydu w addycyjna sól kwasu albo w zwiazek kompleksowy ze zwiaz¬ kami metali.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze I ——— dekapeptyd o wzorze Boc-Cys-^Gly-Asn-iLieu-Ser- •—I /tBu^Thr/tBu/-Cys-Meit-Leu-Gly-OH, w którym linia pomiedzy pierwszym i siódmym aminokwasem osnacza mostek dwusiarczkowy, kondensuje sie z amidem dokozapeptydu o wzorze H-Thr/tBu/-Tyr- /tBu/-Thr/1®u/-Olu^NHt-Asp/Ot)Bu/-Phe-Asn-Ilys- ifóoc/-Fhe»His-Thr/tBuA-Phe-Pro- /tBu/-Asn-Thr/tBu/- szczepia grupy oslaniajace, otrzymujac zwiazek o wzorze 1, w którym R oznacza grupe NHt i X oznacza reszte L-metioninowa, i w którym 11 ami¬ nokwasem jest L-treonina, 12 aminokwasem jest Lntyrozyna, 16, 19 d 22 aminokwasem jest L-feny- loaaina, 24 aminokwasem jeat L-gluUmtaa, 96 ami¬ nokwasem jest L«a¶giina i 27 aminokwasem jest L-treonina. Z.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym. ze I : dekapeptyd o wzorze Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser/tBu/- -Thr/tOu/*Cys-Met-Leu-Gly-OH, w którym Bmp o- snecza reszte P-merkaptopropionylowa i w którym linia pomiedzy pierwszym i siódmym aminokwa¬ sem oznacza mostek dwusiarczkowy, poddaje sie kondensacji z amidem dokozapeptydu o wzorze H-Thff/*Bu/-Tyr/tBu/-Thr/^Bu-Glu-NHrAsp/