PL89778B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu N5-metyloczterowodorohomofoliowego o wzo¬ rze 2, jednego z antagonistów kwasu foliowego, pokrewnych kwasowi 5,6,7,8-czterowodorofoliowemu, który z powodu nietrwalosci ma ograniczone zastosowanie.Zwiazki a ntagonistyczne wobec kwasu foliowego byly poprzednio badane przez J.R. Bertino, Folate Antagonists as Chemotherapeutic Agents, Annais of New York Academy of Science, tom 186, 1971 oraz Goodmana i Gilmana Pharmacological Basis for Therapeutics wyd. 4,1970, str. 1431-1444.Wytwarzanie soli kwasu czterowodorohomofoliowego jest przedmiotem opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3468886 i 3637695.Czasteczka kwasu foliowego jest przedstawiona wzorem 1. Jak widac sklada sie ona z trzech segmentów.Pierwszy segment stanowi pierscien pterydyny, który sklada sie z polaczonych dwuazyn: pirymidyny i 1,4-dwu- 'azyny. Mostek metylenowy C9 laczy segment pierwszy z drugim. Drugi segment stanowi reszta kwasu paraaminobenzoesowego, a trzeci reszta kwasu glutaminowego. Wzór 1 przedstawia budowe kwasu foliowego, czyli pteroiloglutaminowego z zaznaczeniem poszczególnych segmentów.Kwas homofoliowy rózni sie od kwasu foliowego tym, ze w podstawowej czasteczce kwasu miedzy atomem wegla C9 i atomem azotu N10 wystepuje dodatkowa grupa CH2=. Kwas czterowodorofoliowy jest pochodna kwasu foliowego, w którym pozycje 5, 6, 7 i 8 sa uwodornione.Najwazniejszymi pochodnymi kwasu foliowego, które mozna wyodrebnic z organizmów zywych sa kwasy -metylo-, 5,10-metyleno- i 5,10-metylidenoczterowodorofoliowe. Analogiczne do tych zwiazków pochodne kwasu homofoliowego sa przeto wysoce prawdopodobnymi kandydatami do syntetyzowania antagonistów kwasu foliowego, które wspólzawodnicza z kwasem foliowym oddzialywaniem pojedynczego atomu wegla.Wzór 2 okresla budowe kwasu N5-metyloczterowodorohomofoliowego.Wytwarzanie pochodnych kwasu 5-metyloczterowodorofoliowego opisywano w literaturze co najmniej od roku 1963, kiedy to W.Sakami w Biochem. Prep. 10, 103 (1963) opisal sposób wytwarzania 5,10-metylideno- czterowodorofolianów na drodze reakcji kwasu czterowodorofoliowego z aldehydem mrówkowym i nastepnie2 89 778 redukcji metylenoczterowodorofolianu borowodorkiem potasu. Surowy 5-metyloczterowodorofolian oczyszcza sie na drodze stopniowej elucji chromatograficznej z celulozy DEAE. V.S. Cupta i F.M. Huennekens w Arch.Biochem., Biophys. 120, 712—718 (1967) zastosowal podobne postepowanie z pochodnymi kwasu czterowodo- rofoliowego, które polegalo równiez na kondensacji pochodnej kwasu czterowodorofoNowego z aldehydem mrówkowym, przy czym otrzymywano 5,10-metylenoczterowodorofolian podawany nastepnie redukujacemu rozszczepieniu borowodorkiem. Cupta i in. stwierdzili, ze rozszczepienie nastepuje w niewielkim stopniu lub nie nastepuje zupelnie w pozycji N5 mostka metylenowego, a wiec wytwarzanie ta metoda pochodnych 5-metylo- wych jest praktycznie niemozliwe.Sposób wedlug wynalazku rózni sie od opisanych powyzej sposobów znanych tym, ze jako zwiazek wyjsciowy stosuje sie kwas homofoliowy, zamiast foliowego oraz, ze sposób wedlug wynalazku eliminuje trudnosci zwiazane z nietrwaloscia kwasu czterowodorohomofoliowego.Sposób wytwarzania kwasu N5-metyloczterowodorohomofoliowego wedlug wynalazku polega na redukcji katalitycznej kwasu homofoliowego w obecnosci tlenku platyny jako katalizatora. Katalizator usuwa sie nastepnie w atmosferze gazu obojetnego, np. argonu, a otrzymany czterowodorohomofolian w postaci roztworu wodnego poddaje sie natychmiast reakcji z aldehydem mrówkowym bez dostepu swiatla. Otrzymany zwiazek posredni 5,11 -metylenoczterowodorohomofolian redukuje sie ponownie, bez oddzielania borowodorkiem metalu alkalicznego, np. takiego jak borowodorek sodu. W wyniku reakcji otrzymuje sie kwas 5-metyloczterowodoroho- mofoliowy w postaci soli dwusodowej. Opisane postepowanie uwypukla dodatkowo róznice miedzy znanym procesem wieloetapowym a szybkim, ciaglym sposobem wedlug wynalazku.Stosujac kwas octowy zamiast kwasu solnego i doprowadzajac wartosc pH do 3,8 oddziela sie zwiazki nieorganiczne, takie jak octan sodu i kwas borowy dzieki ich dobrej rozpuszczalnosci w alkoholu, np. etanolu.Kwas 5-metyloczterowodorohomofoliowy wytraca sie.ilosciowo z roztworu alkoholowego. Wedlug korzystnego postepowania zanieczyszczony roztwór oziebia sie wciagu nocy do temperatury 3—10°C, a nastepnie odsacza sie zanieczyszczenia. Produkt w roztworze mozna traktowac weglem drzewnym, odparowac do postaci oleju i wytracac alkoholem absolutnym. Po wysuszeniu uzyskuje sie wydajnosc okolo 68%.Ten sposób oddzielania kwasu 5-metyloczterowodorohomofoliowego eliminuje czasochlonny etap rozdzia¬ lu metoda chromatografii kolumnowej DEAE, a równoczesnie zapewnia wydajnosc koncowego produktu wyzsza o okolo 5 w stosunku do znanych procesów.Postepowanie przy realizacji sposobu wedlug wynalazku oraz wyniki analizy strukturalnej kwasu N5-mety- loczterowodorohomofoliowego i zwiazków posrednich sa opisane dokladniej w dalszej czesci opisu.Dotychczas, metodami Sakami, Cupta i Huennekensa kwas N5-metyloczterowodorohomofoliowy byl wytwarzany na drodze obróbki zwiazków foliowych. Sposobem wedlug wynalazku kwas N5-metyloczterowodo- rohomofoliowy otrzymuje sie na drodze kondensacji czterowodorohomofolianu z aldehydem mrówkowym i redukcyjnego rozszczepienia wytworzonego N5, N1! -metylenoczterowodorohomofolianu borowodorkiem. Roz¬ szczepienie to jest wysoce selektywne i nie nastepuje wcale lub tylko w niewielkim stopniu w pozycji N5 mostka metylenowego. Wyjsciowy zwiazek, kwas czterowodorohomofoliowy wytwarza sie na drodze katalitycznego uwodornienia kwasu homofoliowego pod lekko zwiekszonym cisnieniem i przy uzyciu tlenku platyny jako katalizatora. Katalizator odsacza sie i natychmiast dodaje sie aldehyd mrówkowy* Po ogrzaniu roztworu do temperatury 55°C dodaje sie borowodorek sodu, po czym mieszanine utrzymuje sie w temperaturze 55°C wciagu 2 godzin. W celu dokonania identyfikacji otrzymana mieszanine reakcyjna rozdzielano w kolumnie chromatograficznej napelnionej celulozowa DEAE za pomoca octanu amonowego. N5-metyloczterowodorofolian zostal zidentyfikowany jako glówny pik, a nastepnie oddzielony przez wytracenie absolutnym etanolem.Produkt otrzymano w postaci bialego proszku z wydajnoscia 46%. Produkt oznaczono za pomoca analizy elementarnej, chromatografii bibulowej i cienkowarstwowej oraz widma absorpcji przy wartosciach pH 1,7 i 13.Cykliczny N5, IM11 -metylenoczterowodorohomofolian, który jest zwiazkiem posrednim przy wytwarzaniu N5-metyloczterowodorohomofolianu wytwarza sie i oddziela w nastepujacy sposób. Kwas homofoliowy reduku¬ je sie do kwasu czterowodorofoliowego w wyzej opisany sposób, po czym natychmiast dodaje sie aldehyd mrówkowy i mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w temperaturze 55°C w ciagu 30 minut. Nastepnie mieszanine reakcyjna rozdziela sie na kolumnie chromatograficznej wypelnionej celuloza DEAE za pomoca kwasnego weglanu trójetyloamoniowego TEAB, który zawiera 1% aldehydu mrówkowego i 0,5% merkaptoetanolu.Nastepnie produkt wytraca sie etanolem w postaci bialego proszku. Produkt oznaczono za pomoca analizy elementarnej, widma absorpcji przy róznych wartosciach pH oraz chromatografii bibulowej i cienkowarstwowej.Redukcja bromowodorkiem powoduje wytwarzanie kwasu N5-mety loczterowodorohomofoNowego.Pochodne kwasu czterowodorohomofoliowego otrzymanego sposobem wedlug wynalazku wykazuja, jak stwierdzono wybitna aktywnosc przeciw bialaczce, przeciw nowotworowi L1210-FR8 u myszy, a jego zalety terapeutyczne podnosi fakt, ze wytworzone zwiazki wykazuja wieksza odpornosc na utlenianie. Aktywnosc tych89 778 3 zwiazków jest przynajmniej czesciowo zwiazana z ich zdolnoscia hamowania syntezy tymidylanów. Kazdy z tych zwiazków moze byc otrzymany w postaci wolnego kwasu, albo korzystnie w postaci dwusoli metalu alkalicznego, np. soli dwusodowej czesci glutaminowej.Wytwarzane zwiazki istnieja w postaci racematów, co jest spowodowane obecnoscia asymetrycznego atomu wegla w pozycji 6 czasteczki zwiazku. Stereoizomery oznacza sie jak zwykle literami dii.W przykladzie ilustrujacym sposób wedlug wynalazku stosowano jako metode badan analize elementarna, widmo absorpcji w swietle ultrafioletowym i chromatografie cienkowarstwowa.Przyklad. Wytwarzanie kwasu 5-metyloczterowodorohomofoliowego w postaci soli sodowej. 3,0 g tlenku platyny przemywa sie czterokrotnie porcjami po 20 ml wody i uwadarnia sie w 130 ml wody, w temperaturze pokojowej i pod cisnieniem zwiekszonym o 4 om, mieszajac energicznie roztwór. Po 2 godz. 40 minutach i zaabsorbowaniu 410 ml wodoru reakcja jest zakonczona.Z 5,5 g kwasu homofoliowego wytwarza sie zawiesine w 200 ml wody i mieszajac w ciemnosci dodaje sie w ciagu godziny kroplami 22 ml 1 molowego roztworu wodorotlenku sodowego do osiagniecia wartosci pH = 7,0. Mieszanie kontynuuje sie w ciagu dalszej godziny, a nastepnie otrzymany zólty roztwór wstrzykuje sie do naczynia do uwodorniania. Uwodornianie jest zakonczone po 2 godz. 50 minutach i zaabsorbowaniu 590 ml wodoru. Mieszanine reakcyjna saczy sie w atmosferze argonu przez lejek ze spiekiem szklanym i przesacz przenosi sie do 2-litrowej kolby trójszyjnej przemywanej argonem.Do przemywanego argonem przesaczu wprowadza sie 2,9 ml 37% roztworu aldehydu mrówkowego i mieszanine reakcyjna miesza sie i ogrzewa do temperatury 55°C w ciemnosci. Do roztworu dodaje sie szybko 90 ml 1 molowego roztworu borowodorku sodu i mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w temperaturze 55°C w ciagu 2 godzin, az do zahamowania absorpcji wodoru.Mieszanine reakcyjna chlodzi sie do temperatury pokojowej, dodaje sie 8 ml merkaptoetanolu i otrzymuje sie roztwór zabarwiony na jasnozólty kolor. Wartosc pH roztworu mierzona pehametrem doprowadza sie do 3,8 za pomoca lodowatego kwasu octowego. Otrzymany metny roztwór oziebia sie w ciagu nocy do temperatury 3°C.Zanieczyszczony bezowy osad odsacza sie na lejku Buchnera. Zabarwiony bladoslomkowo przesacz miesza sie z 500 mg Noritu A w ciagu 20 minut, a nastepnie odsacza. Po odparowaniu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymuje sie lepki olej, który dokladnie rozciera sie z 900 ml zimnego etanolu. Uzyskana biala mieszanine, która oziebia sie wciagu 1 godziny, a nastepnie miesza sie wciagu 1 godziny chlodzac w lodzie. Wytracony bialy, klaczkowaty osad zbiera sie na lejku Buchnera, przemywa sie kilkakrotnie zimnym etanolem i suszy wciagu 5godzin pod mocno zmniejszonym cisnieniem. Produkt przechowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem.Otrzymany produkt odpowiada wymaganym kryteriom czystosci.Widmo w swietle ultrafioletowym Xmin X maks. 285 291 mju pH 1 pH7 pH 13 X mm 245 247 246,5 X maks 266 291,5 287,5 Chromatografia cienkowarstwowa na celulozie przy zastosowaniu systemu rozpuszczalników 0,1 molowego buforu fosforanowego o wartosci pH = 7, 1% merkaptoetanolu Rf = 0,8 (oziebienie) Analiza elementarna: obliczono: C 45,5 H 5,25 N 17,0 Na 8,3 znaleziono: C 45,4 H 4,8 N 17,7 Na 8,4 PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania kwasu N5-metyloczterowodorohomofoliowego o wzorze 2 z kwasu homofoliowego, znamienny tym, ze kwas homofoliowy redukuje sie katalitycznie do kwasu czterowodorohomofoliowego, który natychmiast poddaje sie reakcji z aldehydem mrówkowym, przy czym otrzymuje sie kwas 5,11-metyleno- czterowodorohomofoliowy i wytworzony kwas redukuje sie niezwlocznie do kwasu Ns -metyloczterowodoroho- mofoliowego.
2. 2. Sposób, wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze kwas homofoliowy redukuje sie wodorem w obecnosci tlenku platyny.
3. 3. Sposób, wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze kwas 5,11-metylenoczterowodorofoliowy redukuje sie borowodorkiem sodu w ciemnosci.89 778 O COOH I CH, i L CH, ^^-C-NH-CH k»va5 paraamino- bemoesoHy I COOH NH2 2tA,6 podstantona pterydyna knas, pteroHOny _ kwas poraomtnobenzonjglutaminony Nzór 1 itr^M(3-C-NH-CH COOH i CH, i L CH2 i L OH WV* XH i COOH Wzór 2 Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl PL