PL89101B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia podstawionych w pozycji 3 ryfamycyn o ogól¬ nym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodo¬ ru, rodnik alkilofenylowy lub fenyloalkilowy, a R1 i R2 stanowia lacznie lancuch karbocykliczny, który lacznie z podwójnym wiazaniem przylegaja¬ cego pierscienia imidazolowego tworzy pierscien benzenu, niepodstawiony lub podstawiony jedno- lub wielokrotnie atomem chlorowca, rodnikiem al¬ kilowym, grupa alkoksylowa, karboksylowa, kar- boalkoksylowa, sulfonowa, sulfamylowa, nitrowa, trójflourometylowa, karbamylowa, jedno- lub dwu- alkilokarbamylowa lub podstawiony lub niepod- stawiony aromatyczny rodnik skladajacy sie z 2—3 skondensowanych pierscieni, w sklad któirych wchodzi po 5—6 atomów wegla oraz odpowiednich pochodnych 25-desacetylo i 16, 17, 18, 19, 28, 29 — szesciowodoro.

Rodniki alkilowe i alkaksylowe posiadaja pro¬ sty lub rozgaleziony lancuch zbudowany zwykle z 1—6 atomów wegla, a skladajacy sie z 2—3 skondensowanych pierscieni aromatyczny rodnik skondensowany z pierscieniem imidazolowym w pozycji 3 zwiazków o wzorze 1 to rodnik nafta¬ lenu, antracenu, fluorenU, acenaftenu lub feman- trenu. Rodniki te moga byc podstawione grupa¬ mi keto, wodorotlenowymi lub sulfonowymi.

Zwiazki o wzorze 1' otrzymuje sie dzialajac na 3-formyloryfamycyne lub jej pochodna 25-deza- cetylo lub szesciowodoro airomatyczna amina o ogólnym wzorze 2, w którym R, R1 i R2 maja wy¬ zej podane znaczenie. Otrzymana zasade Schiffa lub jej izomeryczna postac imidiazolinowa utle¬ nia sie do pochodnej limidazolowej, wedlug sche¬ matu 1. Schemat 1 ilustruje przypadek, gdy sub- t Tsitiratam reakcji jest 3-formyloryfamycyna SV. Je¬ zeli w trakcie utleniania fragment ryfaimycynowy ulega przemianie "w chinon, przemywaniem roz¬ tworem kwasu askorbinowego lub równowaznego odczynnika redukuje sie go do odpowiedniego hy¬ drochinonu. Jako srodki utleniajace stosuje sie po¬ wietrze, sole miedziowe, sole rteciowe, dwutlenek manganu, azotyn izoamylowy, zelazicyjanek potasu lub czterooctan olowiu.

W pewnych przypadkach w obecnosci powietrza lub innego akcejrtora wodoru nastepuje utlenienie powstajacej zasady Schiffa lub izomerycznej imi- dazoliny do imidatzolu. W takich przypadkach wy¬ odrebnianie produktu przejsciowego* nie jest ko- W korzystnym wariancie sposobu wedlug wy¬ nalazku stechiometryczna ilosc wybranej orto- -dwuaminy. o ogólnym wzorze 2 dodaje sie do utrzymywanego w temperaturze pokojowej roz¬ tworu 3-fomayloryfiatmycyny SV lub jej pochodnej ^dezacetyio lub sizesciowodoro. Mieszanine utrzy¬ muje sie w temperaturze od pokojowej do tem¬ peratury . wrzenia rozpuszczalnika^az do zakon¬ czenia reakcji, to jest w ciagu 20 minut do 3 go- 89 1013 dzin. Pozadany produkt wyodrebnia sie przez od¬ parowanie rozpuszczalnika.? Korzystnym rozpuszczalnikiem jest czterowodo- rofuran, mozna jednak stosowac równiez inne roz¬ puszczalniki, takie jak dioksan lub nizsze alka- noie." Surowy produkt mozna oczyscic w drodze krystalizacji lub chromatografii. Jezeli produkt reakcji nie jest imidazolem, to mozna go utleniac bez oczyszczania.

/. Utlenianie korzystnie przeprowadza sie w mie¬ szaninie kwasu octowego z chlorowanym nizszym we^owodóirem,' za pomoca czterooctanu olowiu, w temperaturze —5 do K)°C. Koncowy produkt wyo- . drebnia sie po uplywie 1—3 godzin z warstwy organicznej, odparowujac ja po uprzednim prze- tmyciu ¦ l0°/« roztworem wodnym kwasu askorbino¬ wego, dla przeprowadzenia chiinonowej postaci ry- laimycyny w postac hydrochinowa.

Jezeli kondensacje aromatycznej dwuaminy z 3-formyloryfacyna lub przerób produktów reakcji przeprowadza sie przy dostepie powietrza, w tem¬ peraturze pokojowej, nie jest konieczne poddanie produktu utleniajacej cyklizacji i przemywania kwasem askorbinowym, poniewaz w takim przy¬ padku uzyskuje sie bezposrednio w powyzszej re¬ akcji imidazol o ogólnym wzorze 1.

Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku maja postac barwnych cial stalych, krystalizuja¬ cych z metanolu, acetonu, octanu etylu, cztero- wodorofuranu, dioksanu lub z mieszanin powyz¬ szych rozpuszczalników.

Zaleznie od rodzaju podstawników R1 i R2, po¬ wyzsze zwiazki rozpuszczajace sie lepiej lub go¬ rzej w wiekszosci rozpuszczalników organicznych.

Na przyklad R1 i R2 stanowia pierscien benzeno¬ wy, zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wy¬ nalazku bardzo dobrze rozpuszczaja sie w octanie etylu, gdy natomiast R1 i R2 stanowia wiekszy uklad aromatyczny, konieczna jest stosowanie silniejszych rozpuszczalników, takich jak chloro¬ form lub dwumetyloformamid.

Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wyna¬ lazku wykazuja silna czynnosc w stosunku do Gram-dodatnich i Gram-ujemnych bakterii, a szczególnie Staphylococcus aureus, Streptococcus faecallis, Streptococcus hemolytious, Diplococcus pneumoniae i Mycobacterium tuberculosis H37RV.

Najnizsze stezenie hamujace wynosi 0,001—0,05 fig/ml. Gzj^nosc przejawiana jest równiez w obec¬ nosci plynów biologicznych, takich jak surowica krowia. Zwiazki otrzymywane sposobem wedlug ^^malazku wykazuja równiez czynnosc w stosun- ¦-¦^Bft- do opornych na ryfampicyne szczepów Stap¬ hylococcus aureus. W reprezentatywnych bada¬ niach in, vitro zwiazki opisane w przykladach IV, V, VI i VIII w stezeniu 1^5 jig/ml hamowaly wzrost Staphylococcus aureus Tour. Omawiane zwiazki wykazuja bardzo niska toksycznosc.

Inna bardzo cenna wlasciwoscia zwiazków wy¬ twarzanych sposobem wedlug wynalazku jest ha¬ mujace dzialanie, przejawiane w stosunku do poli- ,, meraz DNS, charakterystycznych dla limfóblastów z "krwi ludzi chorych na bialaczke i w stosunku do $ransferaz nukleotylowych (polimeraz) wirusów, ^Jctóre nie biora udzialu w metabolizmie komórek 1101 4 normalnych. Z badan nad reprezentatywnymi przedstawicielami grup wirusów wiadomo, ze w znacznej czesci cyklu reprodukcji w komórkach zywiciela sa one nosicielami lub wytwarzaja poli- merazy.

Tak wiec na przyklad wirusy Picorna, czy Polio wytwarzaja zalezna od RNS polimeraze RNS, podr czas gdy wirusy innych grup, na przyklad wirus/ bialaczki sa nosicielami zaleznej od RNS polime- io razy DNS. Obecnosc i niezwykle wazna rola jaka spelnia zalezna od RNS polimeraza DNS (przeciwr trainskryptaza) w przypadku rakotwórczych wiru¬ sów RNS zostaly odkryte przez B. Baltimore^, Nature 226, 1209 (1970) i przez H.M; Temina i wspólpracowników, Nature 226, 1211 (1970). Wy¬ stepowanie zaleznej od RNS pólimerazy DNS w zwierzecych rakotwórczych wirusach RNS zostalo stwierdzone równiez przez innych badaczy.

Zagadnienia te sa omówione w nastepujacych publikacjach: Green i wspólpracownicy, „Mecha¬ nizm of carcinogeneses by RNS tumor viruses. I.

An RNA-dependent DNA-polymerase in murine sarcoma viruses", Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 67, 385-^393, 1970, Spiegelman i wspólpracownicy, „Characterization of the products of RNA directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses", Na¬ ture, London, 227 536, 1970, Hanaka i wspólpraco¬ wnicy, „DNA polymerase activity associated with RNA tumor virusefs", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 67, 143,1970, Scolnick i wspólpracownicy, „DNA syn- thesis by RNA containing tumor viruses", Proc.

Nat. Acad. Sci. USA 67, 1034, 1970.

Obecnosc wirusów RNS w pewnych nowotworach potwierdzaja równiez dalsze fakty: w mleku ko- biet, w rodzinach, w których wystepowaly przypad¬ ki raka piersi i w malzenstwach osób spctaaw- nionych znaleziono przeciwtranskryptaze (Scholn i wispólpr., Nature 231, 97, 1971), a Priori i wspól¬ pracownicy, (Nature New Biology, 232, 16, 1971) 40 z komórek plynu oplucnej dziecka z zapaleniem wezlów chlonnych wyodrebnili wirusa ESP-1, który zawiera przeciwtranskryptaze i który daje sie rozmnazac w hodowli tkankowej.

Axel i wspólpracownicy, Nature 235, 32, 1972, 45 w drodze hybrydyzacji molekularnej wykazali wy¬ stepowanie w przypadkach raka piersi kobiet wi¬ rusa RNS homologicznego z wirusem RNS nowor tworu sutki myszy. Mozliwosc wirusowego pocho¬ dzenia raka i piersi wykazuja przeprowadzone 50 technika mikroskopii elektronowej badania mleka kobiecego (N.H. Sarkar i wspólpracownicy, Natu¬ re, 236, 104, 1972). Równiez z komórek ludzkiego miesaka miesni prazkowanych wyodrebniono czyn¬ na w stosunku do RNS polimeraze DNS i wiruso- 55 podobne czastki. (Mc Allister. i wspólpracownicy, Nature New Biology, 235* 3, 1972).

Dotychczas nie ma leków skutecznie zwalczaja¬ cych schorzenia wirusowe, poniewaz warunki prze¬ miany materii wirusów i komórek sa takie same. so Najbardziej obiecujaca droga chemioterapii chorób wirusowych jest opracowanie odpowiednich zwiaz¬ ków wybiórczo laczacych sie z polimerazariii wi¬ rusowymi, lufo i polimerazami komórkowymi trans¬ formowanymi przez wirusy, a nie laczacymi sie z ** polimerazami normalnych komórek iywiciela, co5 daloby mozliwosc kontroli informacji genetycznej wirusów. Wybiórcze inhibitory enzymów wirusa lub enzymów komórkowych trensformowanych przez wirusa, a w szczególnosci inhibitory poli¬ meraz rakotwórczych wirusów RNS odgrywaja znaczna role w lekach do terapii bialaczki i innych schorzen nowotworowych.

Zbadano hamujaca czynnosc zwiazków wytwa¬ rzanych sposobem wedlug wynalazku w stosunku do oczyszczonej, zaleznej od RNS polimerazy DNS endogennego wirusa Muridae i w stosunku do oczyszczonej, zaleznej od DNS polimerazy wirusa Poly d-(A-T) (jako „Template"). W badaniach posluzono sie sposobami opisanymi przez C. Gar- go i wspólpracowników (Nature, New Biology, 229, 111, 1971). Dzialanie leków w róznych steze¬ niach na czynnosc polimerazowa okreslano na¬ stepnie w stosunku do fosforan tyminodezoksyrybozy) polaczonego z frakcja nierozpuszczalna. * ' Ponizej przedstawiono typowy przyklad postepo¬ wania doswiadczalnego.

Wyodrebnianie wirusa i oczyszczanie polimera¬ zy wirusowej.

Sposobem, opisanym przez Greena i wspólpra¬ cowników, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 67, 385—393, 1970 i przez Rokutande i wspólpracowników, Na¬ ture, 227, 1026—1028, 1970, wyodrebnia sie wirusa Muridae z nowotworowych komórek szczura (szczep Moloney'a) oraz z nowotwprowych komó¬ rek myszy (szczep Harvey'a), a nastepnie oczysz¬ cza. Polimeraze wirusowa otrzymuje sie w wyniku inkubacji oczyszczonego wirusa 0,5°/o NP-40 (noni- det P-40) w 0,1 M NaCl, 0,01 M buforze Tris (pH 7,6) i 0,001 M EDTA, w ciagu 5 minut, w temperaturze pokojowej i 20—40-krotnie oczyszcza przez wirowanie strefowe w ciagu 24 godzin w roztworze sacharozy o stezeniu wzrastajacym od 1,5 do 30°/a, 10 mM buforze Na-fosforanowym (pH 7,4), 2,5 flaM MgCl2, 10 mM ditiotreicie i 5% glicerynie, z szybkoscia 38 000 obrotów na minute, w ultrawirów«e Spinco S^ 41. Zebrano 22 frakcje, a wykazujace najwyzsza czynndsc enzymatyczna frakcje 13—17 polaczono i przechowywano w tem¬ peraturze —70° w *30°/« glicerynie.

Oznaczanie polimerazy DNS.

Inkubacje enzymu prowadzi sie w ciagu godziny w 37°C, w 100 |ml mieszaniny skladajacej sie z 40 mM buforu Tris (pH 8,0), 5 mM ditiotreicie, mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP i 10 liCi *H-dTTP (12-^18 Ci/mmol), spo¬ sobem opisanym^przez Greena i Mitaro, Proc. Nat.

Sci. USA, 67, 385—393, 1970. Reakcje przerywa sie dodajac 150 ul 1 M kwasu nadchlorowego. W cha¬ rakterze nosnika dodaje sie DNS grasicy cielecia (100 fig). Radioaktywny produkt DNS przerabia sie w sposób opisany w obu powyzej cytowanych po¬ zycjach literaturowych. Endogenna czynnosc za¬ leznej od RNS polimerazy DNS okresla sie po do¬ daniu 0,01f/e NP-40 do oczyszczonego wirusa w momencie przeprowadzania doswiadczenia. Czyn¬ nosc polimerazowa1 oczyszczonej polimerazy wiru¬ sowej oznacza sie 2 yg Poly d (A-T) (jako tem¬ plate) i bez NP-40. 101 Oznaczanie hamujacego dzialania pochodnych ryfamycyny.

Sporzadza sie roztwór pochodnej ryfamycyny w dwumetylosulfotlenku (DMSO), o stezeniu 5 mg/mol i przechowuje go w tempenaiturze 4°C.

Hamujacy wplyw na czynnosc endogennej zalez¬ nej od RNS polimerazy DNS okresla sie w ten sposób, ze 2 ul roztworu antybiotyku w DMSO lub 2 \d DMSO (kontrola) dodaje sie do badanej próby, zawierajacej 15—30 ng bialka wirusowego, a nastepnie do próby wprowadza sie oslabionego wirusa. Inkubacje enzymu prowadzi sie w ciagu 70 minut w 37°C Nastepnie dodaje sie 7Q \d mieszaniny substratów i mieszanine inkubuje i przerabia w wyzej opisany sposób.

W reprezentatywnych badaniach zwiazki wytwa¬ rzane sposobem wedlug wynalazku w stezeniu 2—100 [ig/ do ponizej 10°/o wartosci oznaczonej w badaniach kontrolnych. W ten oczywisty sposób wykazano, ze wplywaja one hamujaco na mechanizm nowo- twórczy nowotworowych wirusów RNS, zgodnie z najnowszymi pogladami biochemicznymi.

Hamujace dzialanie w stosunku do przeciwtrans- kryptaz okresla sie równiez w badaniach na wi¬ rusach Muridae. Zalezna od RNS polimeraze DNS wirusa Muridae otrzymuje sie w sposób opisany przez Callo i wspólpracowników. KNature New Bio- logy, 232,141,1971 z wirusa oslabionego Tritoinem X 100. Wirusy szczepów Rauschera i Moloney'a oczyszcza sie wiazac je w zakresie 146 g/mol gra¬ dientu gestosci sacharozy, po wstepnym wirowaniu przy ograniczonej szybkosci, w Toztworze sacha¬ rozy o stezeniu malejacym^ od 60 do 20Vt, dla oddzielenia fragmentów komórek. Koncowe steze¬ nie preparatu wirusowego wynosi 1011 czastek w ml. Jako ,.Template stosuje sie 70 SR.IJ.S. Stwier¬ dzono, ze stezenie 50 ng/ml i nizsze skutecznie hamuje czynnosci enzymatycznie.. Podobne wyniki 40 otrzymuje sie stosujac polimerazy z komórek no¬ wotworowych pochodzenia ludzkiego. W tym przy¬ padku dla scharakteryzowania selektywnego wply-, wu bada sie dzialanie hamujace równie? w sto¬ sunku do polimeraz komórek normalnych. Badano 45 czynnosc reprezentatywnych .pochodnych ryfamy- cyny w wzorze ogólnym Iw stosunku do 2 oczysz¬ czonych polimeraz DNS, wyodrebnionych z nor¬ malnych ludzkich limfocytów, krwi (stymulowa¬ nych PHA), z komórek limfoblastów krwi zdro- 50 wego dawcy i z limfoblastów krwi Waleczkowej.

Stosowano syntetyczne iAu,b naturalne „Tempiete".

Ponizej opisano typowy przyklad- przeprowadze¬ nia oznaczenia.

Limfoblasty krwi ludzkiej, 55 Bialaczkowe limfoblasty wyodrebnia,sie z obwp- dowej krwi pacjentów z ostra bdialac^avKom£riki przemywa sie, a erytrocyty usuwa. przez, podejsc nieniowe rozpuszczenie. Normalne limfocyty otrzy¬ muje sie z obwodowej krwi zdrowych dawców:po 60 oddzieleniu granulocytów w drodze chromatografii kolumnowej na tworzywie poliamidowym. Poddaje sie je obróbce opisanej przez Qallo i wsp^pra- cowników, Nature 228, 927, 1970 A, Science 1$§. 400,' 1968, dzialajac w ciagu 72 godzin^ fjtchen^- glutyiiina. (PHA), w celu mozliwie najwiek^rr^ «89101 s wzmocnienia ich czynnosci DNS-polimerazowej.

W niektórych orientacyjnych badaniach wstepnych stosowano slabiej oczyszczona polimeraze .DNS, otrzymana z hodowli „normalnych" tkanek ludz¬ kich (1788). Interesujace zwiazki zbadano nastep¬ nie na lepiej oczyszczonych enzymach z normal¬ nych i bialaczkowych limfocytów. Kultury tkanek otrzymano z Associated Biomedic Systems, Inc.

Preparaty polimerazy DNS.

Polimeraizy DNS otrzymuje sie z normalnych (sty¬ mulowanych PHA) i bialaczkowych limfocytów oraz z komórek limfoidalnych 1788, w drodze ho¬ mogenizowania w hipotonicznych roztworach bu¬ forowych i nastepnego traktowania Tritonem X 100 i/lub ekstrakcji roztworami soli zewnetrznych lizozomalnych blon komórkowych. Po róznicujacym wirowaniu w roztworach soli ekstrakty komórko¬ we oczyszcza sia dalej w drodze chromatografii kolumnowej na celulozie DEAE, fosfocelulozie i dekstranie Sephadex G 200.

Badanie polimerazy DNS.

Badanie polimerazy DNS przeprowadza sie w koncowej objetosci 100 \n. Badana mieszainina za- 'wiera 50 mM buforu Tris-HCl o pH 8,3, 6,0 mflC octanu magnezu, 8,0 mM ditriotreitu i 60 mM NaCL Wartosc pH nastawia sie po dodaniu roz¬ puszczonych w E)MSO inhibitorów. Koncowe ste¬ zenie DMSO wynosi 0,5% i taka ilosc zawieraja wszystkie próby kontrolne. W badaniach stosuje sie enzymy w stezeniu katalizujacym przylaczanie okolo 1 pM w ciagu godziny. *W wiekszosci przy¬ padków enzym inkubuje sie wstepnie inhibitorem w ciagu 5 minut. Nastepnie przeprowadza sie pod¬ stawienie dodatkiem syntetycznego DNS (Poly d/AT/ Miles Lab.) i hybrydy DNS.RNS (Oligo dT. poly rA) w ilosci 5 ^q/ml lub naturalnego, akty¬ wowanego DNS jiasienia lososia, w ilosci 50 n-g/nil i RNS endogennego wirusa 70S, 10 [xCi (8H-mety- lo)-TTP (New England Nuclear, 18,6 mCi/^iM, lio¬ filizowany i ponownie rozpuszczony w 0,01 M HC1 bezposrednio przed uzyciem) i ATP (8 X 10~5M, z substancja syntetyczna) lub dodatkiem wszystkich trzech trójfosforanów dezoksynukleozydów (8 X "5 M z RNS lub DNS).

W pewnych przypadkach nie przeprowadza sie wstepnej inkubacji enzymu inhibitorem, lecz przeprowadza sie reakcje wprowadzajac do goto¬ wej mieszaniny enzym lacznie z inhibitorem. Na poczatku inkubacji i po 30 minutach pobiera sie próby, przerywa w nich reakcje dodatkiem 2 ml 0,08 M pirofosforanu sodu i przeprowadza wytra¬ cenie dodatkiem 12,5% zimnego kwasu trójchloro- octowego (TCS) z 400 |xg RNS drozdzy jako nosni¬ kiem. Produkty odsacza sie na mikroporowatym filtrze, dokladnie przemywa 5% kwasem trójchlo¬ rooctowym i 1 ml mieszaniny DMSO-etynol-0,1 M NaCl (0,5:70:29:5), suszy, rozpuszcza w 2 ml BBS3 (Beckman) i 10 ml liauifluoru fNew England Nuclear) i iiczy za pomoca cieczowego licznika scyntylacyjnego produkcji Packard.

Stwierdzono, ze stezenie 5—20 \ig/ml powoduje przy syntetycznym „DNS-Template" 50°/* zaha¬ mowanie aktywnosci polimerazy bialaczkowej. Przy syntetycznym „RNS-Template" (Poly rA; rU) re¬ akcja byla jeszcze czulsza. 65 Reprezentatywne badania, przeprowadzone z na¬ turalnym „Template" na polimerazach komórek normalnych i nowotworowych wykazaly, ze enzy¬ my nowotworowe sa czulsze na .dzialanie testowa¬ nych zwiazków.

Sposród innych wlasciwosci biologicznych no¬ wych pochodnych ryfamycyn nalezy wymienic hamowanie powstawania ognisk nowotworowych w komórkach myszy, szczurów i ludzi zakazonych szczepem Moloney'a i Kirstena wirusa Muridae., selektywne hamowanie wytwarzania wirusów przez zmienione komórki mysie i ludzkie, odtwarzanie komórek normalnych przez zmienione przez wiru¬ sa Muridae komórki mysie i .szczurze.

Ponadto, pochodne hydrazonowe sa selektywnie toksyczne w' stosunku do zmienionych przez wiru¬ sy komórek mysich, szczurzych i ludzkich, co wynika z badan ich zdolnosci do tworzenia kolonii.

Biadania czynnosci hamujacej ^ywolywianie ognisk nowotworowych przez szczep Moloney'a w hodowli tkankowej przeprowadza sie w nastepu¬ jacy sposób.

* Komórki BALB/3T3 hoduje sie w 250 ml po¬ jemnikach z tworzywa sztucznego na pozywce Eagle'a zawierajacej surowice krowiego plodu.

Lodzenie komórek przeprowadza sie za pomoca licznika Soultera po zawieszeniu ich w nosniku trypsynowym i rozcienczeniu pozywka.

Jako homogenat nowotworowy stosuje sie szczep Moloney'a. Poddaje sie go czterokrotnemu pasazo- waniu komórkowemu na wielokrotnie pasazowa- nym zarodku myszy rasy szwajcarskiej i bada wlasciwosci l tworzenia ognisk nowotworowych w ^ komórkach BALB/3T3. Stosuje sie zmodyfikowany sposób opracowany przez Hatleyla i Rowe'a, Proc.

Nat. Acad. Sci., 55, 780, 1966. Zawarta w pojemni¬ kach pozywke szczepi sie komórkami w ilosci 1—2 X 10« na 25 ml i inkubuje w ciagu 24 godzin w 37°C. Po oddzieleniu plynu wprowadza sie wi¬ rusa w okreslonej liczbie jednostek nowotworo- twóiozych.

Nastepnie w ciagu 30 minut, w l37°C przepro¬ wadza sie adsorpcje na pojedynczej wagnsitwie komórek, po czym do 25 ml pozywki wprowadza sie okreslona ilosc, zwykle 5—10 \ig/ml, alkenylo- wej pochodnej ryfamycyny, w postaci roztworu w dwumetylosulfotlenku o stezeniu 1 . mg/ml i ho¬ dowle ponownie umieszcza w inkubatorze. Kon¬ trole stanowi dodany do odrebnej hodowli dwu- metylosulfotlenek w pozywce. Po trzydniowej in¬ kubacji obserwuje sie zmiany w plynie hodowla¬ nym, a nowotworowo zmienione komórki liczy sie po 7 dniach prowadzenia hodowli.

W podobny sposób przeprowadza sie badania wirusa pecherzykowatego zapalenia jamy ustnej.

Sposoby mnozenia i badania tego wirusa opisali Hackett i wspólpracownicy,-Virology, 34, 114, 1967.

Powyzsze wlasciwosci wykazuja, ze zwiazki otrzymywane sposobem wedlug wynalazku dzia¬ laja hamujaco na rozwój wirusowych nowotworów zwierzat.

Wynalazek ilustruja nizej podane przyklady; Przyklad I. 3-/2-benzoimidazoilo/ryfamy cy¬ naSV. ' .

Roztwór 2,7 g 3-formyloryfamycyna SV i 0,33 g 40 45 5589 101 o-fenylenodwuaminy w 30 ml czterowodorofuranu miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze 0^5°C. Produkt otrzymany po odparowaniu roz¬ puszczalnika przerabia sie w dalszym etapie bez oczyszczania (próba przekrystalizowana z metano¬ lu topnieje w przedziale 252—255°C). Wydaj¬ nosc 80*/o. 1 g otrzymanej zasady Schiffa rozpuszcza sie w mieszaninie 10 ml kwasu octowego i 20 ml cztero¬ chlorku wegla, a do chlodzonego woda z lodem roztworu dodaje 0,5 g czterooctanu olowiu. Roz¬ twór -utrzymuje sie w ciagu 2 godzin w tempera¬ turze 0—5°C, a nastepnie rozciencza czterochlor¬ kiem wegla i przemywa 10°/o roztworem wodnym kwasu askorbinowego, po czym suszy i odparo¬ wuje rozpuszczalnik. Pozostalosc przekrystaldzo- wuje sie z acetonu lub metanolu, otrzymujac pro¬ dukt o temperaturze topnienia 189—193°C (z roz¬ kladem). Wydajnosc 40fl/o. Widmo absorpcji w nadfiolecie przedstawia sie nastepujaco: (nm) jjnax 325 1% 1 cm 322,5 E 460 174,4 Przyklad II. 25-desacetylo-3-/2-benzoimida- zoilo/ryfamycyna SV.

Roztwór 5 g 25-desacetylo-3-formyloryfamycyny SV i 7 g o-fenylenodwuaminy w 100 ml cztero¬ wodorofuranu miesza sie w ciagu 2 godzin w otwartym naczyniu, w temperaturze pokojowej.

Po odparowaniu rozpuszczalnika otrzymuje sie surowy produkt, który po przekrystalizowaniu z metanolu topnieje w temperaturze 195—196°C.

Wydajnosc 2,5 g. Widmo absorpcji w nadfiolecie przedstawia sie nastepujaco: (nm) xmax E : l»/o 1 cm 326 351 462 191 Przyklady III — VIII. Sposobem opisanym w poprzednim przykladzie otrzymuje sie, stosujac odpowiednie o-dwuaminy i 3-formyloryfamycyny SV nastepujace podstawione w pozycji 3 pochodne ryfamycyny SV.

Przyklad IX. 3-/lH-9-keto-fluoreno (2,3-d) imidazol-2-ilo/ ryfamycyna SV.

Roztwór 4,2 g 2,3-dwuaminofluorenonu-9 i 14 g formyloryfamycyny w 200 ml czterowodorofuranu ogrzewa sie w ciagu 3 godzin w temperaturze, wrzenia. Po ochlodzeniu odsacza sie produkt top¬ niejacy w temperaturze 230°C (rozkladem). Wy¬ dajnosc 12,5 g. Widmo absorpcji w nadfiolecie przedstawia sie nastepujaco: E (nm) ^max 470 1% 1 cm 139,2 310 357,1 256 388,3 Przyklad X. 3-/5-karboksy-2-benzoimidazo- lilo/ryfamycyna SV.

Tytulowy zwiazek otrzymuje sie sposobem opi¬ sanym w przykladzie IX, z tym, ze w miejsce 2,3-dwuaminofluorenonu-9 stosuje sie kwas 3,4- -dwuaminobenzoesowy. Temperatura toDnienia 215°C (z rozklademj: Widmo absorpcji w nadfiole¬ cie przedstawia sie nastepujaco: (nm) ?,max V 1°/° Elcm 462 161 328 310,1 Wyniki mikroanalizy elementarnej zwiazków opisanych w powyzszych przykladach sa zgodne z wartosciami teoretycznymi.

Sposobami opisanymi w przykladach I — X o- trzymuje sie nastepujace przedstawione w pozycji 3 pochodne ryfamycyny, 25-desacetyloryfamycyiny i szesciowodororyfamycyny.

Przy¬ klad III IV V VI VII VIII Amina 3,4-toluilodwuamina 4,5-dwumatylo-o-fe- nylenodwuamina 4,5-acenaftenodwua-; mina 4-chloro-o-fenyleno- dwuamina 2,3-fluorenadwuairfina 1,2-dwuaminoantrachi- non Podstawnik w pozycji 3 ryfamycyny SV -metylo-2-benzoimidazolil ,6-dwumetylo-2-benzoimidazolil 4,5^dwuwodoro 7H-acenafto (4,5-d) imidazol-8-il -€hloro-2-benzoimidazolil 1,9-dwuwodorofluoreno (2,3-d) imidazol-2-il 6,11-dwuketo-antra (l,2^d) imidazol-2-il Temperatura topnienia °C 13B —7 180 220 z rozkladem 215 — 6 z roz¬ kladem 200 z rozkladem 230 z rozkladem i max nm 464 328 465 332 485 360 465 328 485 358 429 1% 1 E 1 cm 165,5 316,4 149 296,5 140,4 246,1 166,1 v 326 132,5 348,1 179 ""I89101 li 12 Wyjsciowa amina 1 4-nitro-o-fenylenodwu- amina 4-dwumetylokarba- mylo-o-fenylenodwu- [ amina 4-butylo-o-fenyleno- dwuamina 4-peotylo-o-fenyleno- dwuamina 3-nitro-o-fenyleno- - dwoamina 4-bromo-o-fenyleno- dwuamina 4-fluoro-o-fenyleno- dwuamina 4,5-dwuchloro-o-feny- lenodwuamina 4,5-kiwumetoksy-o-fe- nylenodwuamina 4,5-dwuetoksy-o-feny-, lenodwuamina 4,5-metylenodwuketo- -o-fenylenodwuaimiina 4,5-dwunitro-o-feny- 1 lenodwuamina 4Hsulfamoilo-o-fenyle- nodwuamina N-etylo-o-fenyleno- dwuamina i N^-metylo-4-trójfluo- rometylo-o-fenyleno- dwuamina N1-metylo-4,5-dwume'- f toksy-o-fenylenodwu- amina N-benzylo-o-fenyleno- dwuamina N-fenylo-o-fenyleno- f dwuamina ester etylowy kwasu 1 3,4-dwuaminobenzo- esowego kwas 2-chloro-4,5- 1 -dwuatninobenzeno- [ sulfonowy 9,10-fenantrenodwua- amina * 1,2-naftalenodwuamina t kwas 1,2-dwuaminona- j ftalenosulfonowy-4 { kwas 1,2-dwuaminofe- 1 nantrenosulfonowy-4 Podstawnik w pozycji 3 ryfamycyny SV 2 -rritro-2-benzimidazolil -dumetylokarbamylo-2- -benzoimidazolil -butylo-2-benzoimida- zolil -pentylo-2-benzoimida- zolil 4-ndtro-2-benzoimi- dazoiil -farorno-2-benzoimiida- ^aolil -fluoro-2-benzoimida- zolil ,6-dwuchloro-2-benzo- I imidazolil ,6-dwumetoksy-2-ben- zoimidazolil ,6-dwuetoksy-2-benzo- imidazolil ,6-metylenodwuketo-2- -benzoimidazolil ,6-dwunitro-2-benzo- imidazolil -sulfamoilo-2-benzo- imidazolil l-etylo-2-benzohnidazo- 1U 1-metylo-5-trójfluoro- metylo-2-benzoimidazo- lil l-metylo-5,6-dwumeto- ksy-2-benzoimidazolil \ l-benzylo-2-benzoimida- > zolil 1-fenylo-2-benzoimida- zolil -karboetoksy-2-benzo- imidazolil 6-chloro-5^sulfo-2-ben- zoimidazolil feniantreno{94(-d)pmi- dazol-2-il nafto (l,2-id)im|idiazo,l-2-il 5nsulfo-niafto [l,2-d]imi- 1 dazol-2-il 3-sulio-fenantreno (1,2- -d)imidazol-2-il

Claims (3)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania podstawionych w pozycji 3 ryfamycyn o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, rodnik alkilofenylowy lub fenyloalkilowy, a R1 i R2 razem, stanowia lancuch karbocykliczny, który lacznie z podwójnym wia- 10 15 20 45 30 35 40 45 50 60 65 zaniem przylegajacego pierscienia imidazolowego tworzy pierscien benzenu, niepodstawiony lub podstawiony jedno- lub wielokrotnie atomem chlo¬ rowca, rodnikiem alkilowym, grupa alkoksylowa,. karboksylowa, karboalkóksylowa, sulfonowa, sul¬ famylowa, nitrowa, trójfluorometylowa, karbamy- Iciwa, jedno- lub dwualkiloikiairbamyliowa lub pod¬ stawiony lub niepodstawiony rodnik skladajacy sie z 2—3 skondensowanych pierscieni, w sklad których wchodzi po 5—6 atomów wegla, znamien¬ ny tym, ze 3-formyloryfamycyne, poddaje sie re¬ akcji z o-dwuamina o ogólnym wzorze 2, w któ¬ rym R, R1 i R2 maja wyzej podane znaczenie i otrzymany zwiazek poddaje dzialaniu akceptora wodoru, takiego jak powietrze, sole miedziowe, sole rteciowe, dwutlenek manganu, zelazicyjanek potasu lub czterooctan olowiu, z tym, ze w przy¬ padku gdy otrzymany w tej reakcji zwiazek ma postac chinonu, redukuje sie go kwasem askorbi¬ nowym do odpowiedniego hydrochinonu.

2. Sposób wytwarzania podstawionych w pozy¬ cji 3 ryfamycyn o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, rodnik alkilofenylowy lub fenyloalkilowy, a R1 i R2 razem, stanowia lan¬ cuch karbocykliczny, który lacznie z podwójnym wiazaniem przylegajacego pierscienia imidazolo¬ wego tworzy pierscien benzenu niepodstawiony lub podstawiony jedno- lub wielokrotnie • atomem chlorowca, rodnikiem alkilowym, grupa alkoksy¬ lowa, karboksylowa, toarboalikoksylowa, sulfonowa, sulfamylowa, nitrowa, trójfluorometylowa, karba- mylowa, jedno- lub dwualkilokarbamylowa lub podstawiony albo niepodstawiony rodnik sklada¬ jacy sie z 2—3 skondensowanych pierscieni, w sklad których wchodzi po 5—6 atomów wegla, znamienny tym, ze 25-desacetylopochodna 3-for- myloryfamycyny poddaje sie reakcji z o-dwuami¬ na o ogólnym wzorze 2, w któryn^ R, R1 i R* maja wyzej podane znaczenie i otrzymany zwia¬ zek poddaje dzialaniu akceptora wodoru, takiego jak powietrze, sole miedziowe; sole rteciowe, dwu¬ tlenek manganu, zelazicyjanek potasu lub cztero¬ octan olowiu, z tym, ze w przypadku otrzymany w tej reakcji zwiazek ma postac chinonu, redu¬ kuje sie go kwasem askorbinowym do odpowied¬ niego chydrochinonu.

3. Sposób wytwarzania, podstawionych w pozy¬ cji 3 ryfamycyn o ogólnym wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, rodnik alkilofenylowy lub fenyloalkilowy, a R1 i R2 razem, stanowia lan¬ cuch karbocykliczny, który lacznie z podwójnym wiazaniem przylegajacego pierscienia imidazolo¬ wego tworzy pierscien benzenu, niepodstawiony lub podstawiony jedno- lub wielokrotnie atomem chlorowca, rodnikiem alkilowym, grupa alkoksy¬ lowa, karboksylowa, karboalkóksylowa, sulfonowa, sulfamylowa, nitrowa, trójfluorometylowa, Carba- mylowa, jedno- lub dwualkilokarbamylowa lub podstawiony albo niepodstawiony rodnik skladaja¬ cy sie z 2-3 skondensowanych pierscieni, w sklad których wchodzi po 5—6 atomów wegla, znamien¬ ny tym, ze 16,17,18,19,28,29-szesciowodoropochodna podstawionej w pozycji 3 ryfamycyny poddaje sie reakcji z o-dwuamina o ogólnym wzorze 2, w któ-89 101 13 rym R, R1 i R2 maja wyzej podane znaczenie i otrzymany zwiazek poddaje dzialaniu akceptora wodoru, takiego jak powietrze, sole miedziowe, sole rteciowe, dwutlenek manganu, zelazicyjanek 14 potasu lub czterooctan olowiu, z tym, ze w przy¬ padku gdy otrzymany w tej reakcji zwiazek ma postac chinonu, redukuje sie go kwasem askorbi¬ nowym do odpowiedniego hydrochinonu. Me Me HO. i MeC00M< MeX 9H 0HUY^Me Wzdr {89 101 Me Me H0XX. MeCOO^ OH n M*L OH OH YXMe MeO^M^Y^VNH CH=N & Me o HN- R' ZO Dr 3 R 1) utlenienie 2) kwas askorbinowy -o Me Me HO MeCOO Maj 0H MeY> OH°TXMe XN-V Schemat Me 6 WZGr-af., Z-d Nr 2, aam. 397/77, A4, 110 Cena 10 zl