PL88864B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia szczepionki przeciwko pomorowi swin, zawie¬ rajacej zywy wirus.Stosowanie srodków immunizujacych przeciwko pomorowi swin na bazie zywego wirusa, oslabio¬ nego pasazami przez króliki, znane jest z publi¬ kacji W. H. Hagen i D. W. Brunner „The In- fectious Diseases otf Domestic Aininnals", III Wy¬ danie (1957) strona 829, Comstock Publ. Ass, Ithaca N.Y. Znane srodki immunizujace skladaja sie z krwi i wyciagów z narzadów królików, zakazonych wirusem pomoru swin, przy czym wirus w za¬ leznosci od szczepu poddaje sie zmiennej ilosci pa¬ sazy. Od roku 1947, kiedy J. A. Baker, Jour. Am.Vet. Med. Ass. (1947) 3, strona 503 uzyskal przy¬ stosowanie wirusa do królików, wytworzono sze¬ reg szczepionek tego typu. Chociaz wirus, osla¬ biony pasazowaniem przez króliki, nie jest pato- genny w stosunku do mlodych i doroslych swin, J. H. Sauter, G. A. Young, A. J. Luedke i R. L.Kitchell, Proc. 90th Ann. Meeting, Am. Vet. Med.Ass. (1953), strona 147, podali, ze moze on infeko¬ wac plód, co wywoluje obrzek, puchline brzuszna i wrodzone znieksztalcenie. Zmiany te zostaly opi¬ sane takze przez autorów hiszpanskich (M. Coride- ro i A. Sanches Franco, Anales de la Facultad de VetaTinaria de Leon, strony 183—194 (1956); M. Cordero, Memoria de la Estación Pecuaria Re- gional de Leon (1956). Fakty te oraz trudnosci z uzyskaniem krwi królików zwrócily uwage przy wytwarzaniu szczepionek przeciwko pomorowi 39 swin na nowoczesne metody kultury komórkowej.W zwiazku ze scislym powinowactwem wirusa pomoru swin do swin i spokrewnionych gatunków pierwsze kultury komórkowe, zastosowane do pro¬ dukcji szczepionek przeciwko tej chorobie, byly kulturami komórkowymi rozmaitych narzadów swin (W. A. Hagen i D. W. Brunner „The Infec- tious Diseases of Domestic Animals, III-cie wy¬ danie (1057), strony 829—830, Comstock Publ. Ass.Ithaca N.Y.).W ostatnim czasie, jak podano przez R. Lang, E. Lefteriotis, E. i C. Mackowiak, C.R.hebd.Seanc.Acad. Sci. Paryz, 253 (1960) strona 1593, udalo sie wyhodowac zmodyfikowany wirus pomoru swin w kulturach komórek nerkowych królika w ilosci, wystarczajacej do produkcji szczepionek. Szcze¬ pionki, otrzymane zarówno na kulturach komórko¬ wych swin, jak tez na kulturach komórkowych królika, maja rózne wady. Moga one przenosic in¬ ne choroby swin, wywolane wirusem, rózne od pomoru swin, np. afrykanski pomór itd., lub wy¬ kazuja takie same wady, jak szczepionki, uzyska¬ ne przez pasazowanie.Szczepionka wedlug wynalazku nie wykazuje wyzej podanych wad, odznaczajac sie zaletami do¬ skonalej szczepionki. Jest ona wytwarzana przy stosowaniu komórek zwierzat przezuwajacych, co zapobiega przenoszeniu jakiegokolwiek specyficz¬ nego wirusa swini. Podatnosc komórek zwierzat przezuwajacych na zmodyfikowany wirus pomoru swin jest wystarczajaca, aby uzyskac stezenie wi- 88 8643 rusa, potrzebne do otrzymania szczepionki o wyz¬ szej zdolnosci immunizacyjnej, niz wiekszosc sto¬ sowanych dotychczas szczepionek.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia szczepionki do uodporniania swin przeciwko pomorowi swin, w którym inokulum szczepu spe¬ cjalnie modyfikowanego i adoptowanego wirusa klasycznej dzumy swinskiej wprowadza sie do za¬ wiesiny zywych komórek w srodowisku odzyw¬ czym, nastepnie zaszczepiona kulture komórek, rozmnaza sie w temperaturze 35—37,5°C do uzy¬ skania ustalonej pozadanej liczby obumarlych ko¬ mórek {to jest do okolo 90%, moment ten ustala si£ %przez( zabarwienie barwnikami witalnymi) po czyni naczynia szklane, zawierajace hodowle wyj- irfuje sie z cieplarki i zawartosc zamraza do tem¬ peratury.*^40°£? potem odmraza i miesza z roz¬ tworem* stabilizatora,; standaryzuje, liofilizuje i do¬ prowadza" do uzycia', polegajacy na tym, ze jako zywe komórki stosuje sie zywe komórki przezu¬ waczy.W sposobie tym jako zywe komórki przezuwa¬ czy stosuje sie komórki sledziony koziej, komórki kostne owcy lub komórki sledziony plodu bydle¬ cego. Skutecznosc szarzy produkcyjnej na szeregu swin zdrowych i podatnych na pomór, ustala sie na próbce hodowli. Badanie na skutecznosc pole¬ ga na oznaczeniu zawartosci ogólnej antygenów lub ustaleniu dawki smiertelnej (LD50). W pierw¬ szej próbie przyjmuje sie jako jednostke miary minimalna dawke ochronna (UMP). Minimalna dawke ochronna (UMP) stanowi najmniejsza ilosc wirusa szczepionki, która chroni wszystkie szcze¬ pione nia swinie przeciw zakazeniu próbnemu 100 000 jednostkami minimalnej dawki smiertelnej wiruletnego wirusa pomoru swin. Tym sposobem oznacza sie stezenie wirusa w kazdej szarzy pro¬ dukcyjnej. Po tym badaniu ciecz zawierajaca wi¬ rus odtaja sie i saczy w celu usuniecia resztek komórek. Na podstawie oznaczenia ogólnej zawar¬ tosci antygenu zestawia sie partie szczepionki przez zmieszanie zawiesiny wirusa z roztworem stabilizatora, otrzymujac mieszanine o jednako¬ wym zawsze stezeniu wirusa.Stwierdzono, ze idealna dawka jednostkowa do szczepien jest dawka, zawierajaca 800 U.M.P. Tak wytworzona mieszanina, to jest roztwór kultury komórkowej, zawierajacej wirus, zmieszany w od¬ powiednim stosunku ilosciowym z roztworem sta¬ bilizatora, stanowi po liofilizacji nowa szczepionke przeciwko pomorowi swin.Przyklad I. Wirus klasycznej dzumy swin¬ skiej (KSP), wysuszony w znany sposób (J. A. Ba¬ ker. J. Am. Vet. Med. Ass. 3.503 <1i947), wprowadza sie w postaci wyciagu sledzion i chlonek zwojów nerwowych zakazonych królików w stosunku obje¬ tosciowym 1 zawiesiny wirusowej do 20 objetosci zawiesimy komórkowej komórek sledziony kozy, miesza sie i wylega w temperaturze 37°C. Codzien¬ nie bada sie ilosc przezycia komórek w próbach poprzez zabarwienie barwnikiem zywotnym, a po obumarciu ©0% komórek, przewaznie w 5-tym dniu, przerywa sie rozmnazanie i zawiesine zamraza sie w temperaturze —40°C. 864 4 Zawiesine komórkowa wytwarza sie poprzez wy¬ jecie w warunkach sterylnych sledziony swiezo ubitej kozy, rozdrabnia sie ten organ poprzez po¬ ciecie na male kawaleczki o srednicy mniej wie- cej 2—3 mm i przez wylugowywanie na cieplo tych kawaleczków w roztworze 0,2% trypsyny w temperaturze 37°C, przy tym komórki z tych ka¬ waleczków zostaja wprowadzone do zawiesiny. Po zakonczeniu traktowania trypsyna oddziela sie ko- 0 morki na drodze odwirowywania od roztworu trypsyny i zawiesza sie je tak w roztworze po¬ zywkowym Parkera 199, zawierajacym 5% suro¬ wicy konskiej, ze 1 ml zawiesiny zawiera 3,108 komórek. W odmrozonej próbce okresla sie za- wartosc antygenów. Otrzymuje sie 2.106 U.MJP. na ml roztworu. Rozmrozony roztwór wirusowy roz¬ ciencza sie roztworem stabilizatora, zawierajacym 2% cukru trzcinowego, w taki sposób, ze w 3 ml roztworu (odpowiadajacym 25 dawkom szczepie- 0 nia) zawartych jest 20.000 U.M.P. Mieszanina na¬ pelnia sie buteleczki, kazda po 3 ml, zamraza sie natychmiast i liofilizuje. Butelki zamyka sie w prózni. Tak otrzymana szczepionke rozpuszcza sie przed uzyciem w 50 ml wody sterylnej i szczepi £ sie nia po 2 ml na 1 swinie.Przyklad II. Ze swiezo ubitej owcy wyjmu¬ je sie w warunkach sterylnych dlugie kosci, jak np. kosc lydkowa, kosc udowa i piszczel, rozlu¬ puje sie je, wydrapuje sie bialy szpik kostny i } zawiesza sie go w zawiesinie pozywkowej Parke¬ ra 199 w 10% surowicy konskiej tak, ze w 1 ml zawiesiny zawartych jest 1.108 komórek. Zawie¬ sine rozlewa sie do naczyn kultury komórkowej i wylega sie w temperaturze 37°C, az komórki zakleszcza sie na powierzchni szklanej i poprzez przemycie utworza calkowita lake komórkowa, co ma miejsce po 6 dniach. Nastepnie zastepuje sie srodowisko pozywkowe srodowiskiem, zawieraja¬ cym pozywke Parkera 199 z 5% surowicy kon- 0 skiej. Dodaje sie do tego 5% objetosci zawiesiny wirusowej (patrz przyklad I). Kultury wylega sie w ciagu dalszych 5 dni w temperaturze 37°C, przy czym wirus rozmnaza sie w komórkach, po czym zostaje zamrozony w temperaturze —40°C i ustala sie w rozmrozonej próbce zawartosc U.M.P. Znajduje sie go do 1.2.108 U.M.P. na 1 ml.Dalsza przeróbke prowadzi sie tak samo, jak w przykladzie I. 0 Przyklad III. 5-letni plód, uzyskany przy ubiciu ciezarnej krowy, zostaje w warunkach ste¬ rylnych otwarty i wyjmuje sie zen nerki i sle¬ dzione. Organy rozdrabnia sie tak, jak opisano w przekladzie I i uzyskuje sie z nich przez trakCo- . wanie trypsyna zawiesine komórkowa, która roz¬ ciencza sie w srodowisku Parkera 199 z dodaniem % surowicy konskiej w taki sposób, ze 1 ml zawiesiny zawiera 1.106 komórek. Zawiesine roz¬ dziela sie do naczyn kultury komórkowej i wylega , sie w temperaturze 37°C, az utworzy sie po 6 dniach zamknieta laka komórkowa. Dalsze trak¬ towanie w sposób, jak opisano w przykladzie II.Otrzymuje sie roztwór' wirusowy, który zawiera ly8.106 U.M.P. na 1 ml i który przerabia sie dalej . analogicznie, jak opisano w przykladzie I,5 8IM4 6 PL PL PL PL PL PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania szczepionki przeciwko pomorowi swin, zawierajacej zywy wirus, pole¬ gajacy na wprowadzeniu inokulum oslabionego wirusa klasycznej dzumy swinskiej do zawiesiny zywych komórek w srodowisku odzywczym, roz¬ mnazaniu w temperaturze 35—37,5°C prowadzo¬ nym tak dlugo, az obumrze do okolo 90% zywych komórek, nastepnie zamrozeniu otrzymanej za¬ wiesiny wirusowej w temperaturze —40°C, jej odmrozeniu i zmieszaniu z roztworem stabilizato¬ ra, standaryzowaniu, liofilizowaniu i doprowadze¬ niu do uzycia, znamienny tym, ze jako zywe ko- i morki stosuje sie zywe komórki przezuwaczy.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako zywe komórki przezuwaczy stosuje sie ko¬ mórki sledziony koziej, komórki kostne owcy lub komórki sledziony plodu bydlecego. PL PL PL PL PL PL PL