Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych interferonowych, a cecha tego sposobu jest to, ze koncowa jednostke galaktozy w asialo- interferonach utlenia sie enzymatycznie za pomoca galaktozooksydazy.Proces ten prowadzi sie sposobem stosowanym do utleniania koncowych reszt galaktozy w glikopro- teinach, stosujac mianowicie dostepny w handlu enzym galaktozooksydaze. Proces przebiega w ty- powych warunkach, np. przy wartosci pH 7,0—6,0, np. z uzyciem fosforanu jako substancji buforowej.Stopien utleniania mozna sprawdzac prowadzac nastepnie redukcje wytworzonej grupy aldehydo¬ wej C9, za pomoca np. znaczonego, zawierajacego jo tryt wodorku borosodowego. Gdy zredukowany pro- 88 69788 697 dukt hydrolizuje sie, np. za pomoca kwasu solnego, znaczona galaktoze mozna okreslac w produkcie hydrolizy za pomoca chromatografii bibulowej.Otrzymane pochodne interferonu mozna zatezac i oczyszczac w znany sposób, np. na drodze ultra- 5 wirowania, elektroogniskowania lub chromatografii.Asialointerferony bedace interferonami, w któ¬ rych koncowe reszty sialowe zostaly uwolnione cal¬ kowicie lub czesciowo, stosowane jako produkty wyjsciowe w sposobie wedlug wynalazku, sa albo 10 znane [K. Schonne i in. Symp. Series Immunobiol.Standard 14, 61(1969)] lub moga byc wytwarzane w sposób znany, stosowany do usuwania konco¬ wych reszt kwasu sialowego z glikoprotein. Mozna je wytwarzac droga lagodnej, kwasnej hydrolizy ^ interferonów, np. rozcienczonym kwasem siarko¬ wym w temperaturze podwyzszonej, na przyklad przez dlugotrwala inkubacje przy wartosci pH = 2 na zimno, na przyklad w temperaturze 4°C w ciagu tygodnia. Moga tez byc wytwarzane przez trakto- a0 wanie interferonów neuraminidaza pochodzenia bakteryjnego lub zwierzecego, np. otrzymana z Vi- brio cholerae. Clostridium perfringens lub Diploco- ccus pneumoniae [R. Drzenieck, Current Topics in Microbiology and Immunology 59, 35 (1972)] lub 2| z serca szczura. Warunki hodowli sa zwykle i zale¬ za od rodzaju uzytej neuraminidazy. Na przyklad, w przypadku neuraminidazy z V. cholerae wartosc pH 5,5 wydaje sie najkorzystniejsza, przy czym jako substancje buforowa stosuje sie np. octan, a w przy- ^ padku neuraminidazy z D. pneumoniae korzystna jest wartosc pH 6,5.W razie potrzeby mozna w celu uzyskania lepszej desialilacji stosowac oba wyzej opisane sposoby.Otrzymane asialointerferony mozna wyodrebniac 85 i oczyszczac w znany sposób.Oczyszczanie preparatów interferonów, stosowa¬ nych do wytwarzania asialointerferonów, polega na chrpmatografowaniu preparatu na unieruchomionej aglutyninie i nastepnie desorbowanie interferonu ze 40 zwiazana aglutynina, asialointerferonu lub zmody¬ fikowanego interferonu. Ten proces chromatografia cznego oczyszczania mozna prowadzic w zwykly sposób. Tak np. ligand aglutyninowy korzystnie unieruchamia sie w zasadniczo obojetnym, stalym 45 nosniku. Dobór tego nosnika zalezy w pewnej mie¬ rze od uzytej aglutyniny, ale korzystnie jako nos¬ nik stosuje sie agaroze, aktywowana w znany spo¬ sób i kowalencyjnie zwiazana z aglutynina (P.Cuatrocasas i in., Biochemistry 11, 2291—2299). 50 Interferony zostaja specyficznie zaadsorbowane do aglutyniny poprzez swój skladnik weglowo¬ danowy, podczas gdy zanieczyszczenia przechodza w wiekszej czesci. Zaadsorbowany interferon eluuje sie nastepnie odpowiednim eluentem. Jako agluty- 55 niny stosuje sie w tym celu aglutyniny, które moz¬ na stosowac do oczyszczania glikoprotein, np. fito- hemaglutyniny z Lens culinaris, Triticum vulgaris, Lotus tetragonolobus, Ricinus comunis, a zwlaszcza z Phaseus vulgaris. Eluent do desorpcji zwiazanego 60 interferonu zalezy od rodzaju uzytej aglutyniny, ale ogólnie nadaja sie do tego celu cukry proste, oligo- sacharydy lub polisacharydy, albo glikcproteiny, korzystnie glikoproteina lub jej fragment otrzyma¬ ny z ludzkich erytrocytów [S. Komfeldt i in., Proc. «s Nat. Acad. Sci. (USA) 63, 1439—1446]. Desorpcje- interferonu mozna spowodowac równiez przez zmia¬ ne pH do wartosci 2,0.Interferony stosowane jako produkty wyjsciowe sa opisane w literaturze i moga byc wytwarzane pod wplywem induktorów, takich jak wirusy RNS. i DNS, a takze pod wplywem induktorów niewi- rusowych, takich jak naturalne lub syntetyczne dwupasmowe RNS z komórkami in vivo i in vitro.Jako specyficzne interferony wymienia sie induko¬ wane rozmaitymi induktorami interferony królika,, kury, malp, cielat, swini, myszy, kaczki lub tez czlowieka.Interferony zmodyfikowane sposobem wedlug wy¬ nalazku maja wlasciwosci przeciwwirusowe podo¬ bne do wlasciwosci interferonów nie poddawanych modyfikowaniu, ale ich okres polowicznego roz¬ kladu jest dluzszy. W szczególnosci sa one sku¬ teczne przeciwko wirusowi Herpes Simplex, jak: to wykazaly badania przeprowadzone na bialych królikach z Nowej Zelandii o masie ciala 1,0—2,0' kg, którym wstrzykiwano wirus Herpes Simplex o stezeniu 10* Jednostek. Po uplywie 3—6 dni od zabiegu u wszystkich królików wystepowal paraliz postepowy, a u 2/3 zwierzat wystepowalo zapalenie mózgu ze zwyklymi objawami smiertelnymi. Kró¬ likom tym wstrzykiwano 106 jednostek preparatu interferonu w postaci jednorazowej dawki lub w 4 dawkach co 6 godzin, poczawszy od wystapienia zakazenia i obserwowano wyniki.Interferony zmodyfikowane sposobem wedlug wy¬ nalazku sa przeto wskazane jako srodki przeciw- wirusowe, zwlaszcza zapobiegawcze. Korzystna daw¬ ka dzienna wynosi od 5*10* do 200*10€ jednostek, stosowana w postaci dawek podzielonych 2—4 razy dziennie. Zmodyfikowane interferony mozna ko¬ rzystnie mieszac z obojetnymi, cieklymi rozcien¬ czalnikami i stosowac pozajelitowo w postaci wy¬ jalowionych roztworów lub zawiesin do wstrzyki¬ wania.Podane nizej przyklady ilustruja wynalazek. W przykladach jest mowa o izoelektrycznym ognis¬ kowaniu. Zabieg ten prowadzi sie w ukladzie IKB Uniphor Column Electrophoresis, o objetosci 220 ml, stosujac jako nosnik amfolinowy amfoteryczne elektrolity o wartosci pH 3—10. Izoelektryczne og¬ niskowanie prowadzi sie wedlug podrecznych in¬ strukcji IKB. Wszystkie zabiegi prowadzi sie w temperaturze 2°C. Po uplywie 36 godzin zbiera sie frakcje po 5 ml i niezwlocznie rejestruje wartosc pH.Przyklad I. Wytwarzanie interisronu. Inter¬ feron wytwarza sie w pierwotnych komórkach ne¬ rek królika metoda Tan i in., Proc. Nat. Acad. Sci. 67, 464—471, stosujac nastepujaca modyfAkacje. Po¬ jedyncze warstwy hoduje sie z 200 ug/ml poly(l) poly(C) w ciagu 1 godziny w temperaturze 37°C.Po usunieciu induktora komórki plucze sie dwu¬ krotnie buforowanym roztworem solanki Hanksa i dodaje 10 ug/ml cykloheksimidu w minimalnym, zasadniczym czynniku Eagle'a zawierajacym 2%* plodowej surowicy cielecej. Kultury hoduje sie w ciagu 3 1/2 godzin w temperaturze 37°C, po czym dodaje 3 ^g/ml aktynomycyny D i prowadzi dalej hodowle w ciagu 1/2 godziny. Nastepnie usuwa sie-5 antymetabolity, komórki przemywa pieciokrotnie roztworem Hanksa i przykrywa swiezym czynni¬ kiem bez surowicy. Po uplywie 8—10 godzin zbiera sie ciecze znad osadu, odwirowuje i przechowuje do dalszego uzytku w temperaturze —70°C. litrów tej cieczy steza sie dwustokrotnie na drodze ultrafiltracji przez przepony Diaflo PM-10 (Amicon), dializuje rozcienczonym kwasem octo¬ wym (wartosc pH 3,0) i odwirowuje w celu usu¬ niecia wytraconych protein.Do badania interferonu stosuje sie próbe plytko¬ wej redukcji na pierwotnych komórkach nerek kró¬ lika. Pojedyncze warstwy komórek w szalkach Pe- triegp o 6 cm srednicy traktuje sie w ciagu okolo 18 godzin 2 ml roztworów interferonu i nastepnie dziala 50—80 jednostkami wirusa Vesicular stoma- titis tworzacymi plytki. Miana okresla sie jako rozcienczenie interferonu powodujace zmniejszenie plytek o 50%. Do kazdego szeregu prób stosuje sie wzorzec miedzynarodowy i wszystkie wyniki kory¬ guje sie do tego wzorca i wyraza w jednostkach miedzynarodowych na 2 ml.Przyklad II. Proces oczyszczania. Stosowana w procesie fitoaglutynine z Phaseolus vulgaris, to jest baktofitohemaglutynine, oczyszcza sie w spo¬ sób opisany przez T. Webera i in., Scand. J. Hemat 4, 77—80. Skladnik erytroaglutynujacy odsacza sie jako zel na Sephadex G-150 i nastepnie sprzega z estrem N-hydroksyimidu kwasu bursztynowego acylowanej kwasem bursztynowym aminoalkiloaga- rozy (P. Guatrocasas i in., Biochemistry 11, 2291— —2299). Aglutynina ta wykazuje specyficzna reakcje z sekwencja oligosacharydowa galaktoza -? N-ace- tyloglikozamina -+ mannoza, wystepujaca jako cha¬ rakterystyczna cecha strukturalna u wielu glikopro- tein. Jak widac z rysunku, asialointerferon ozna¬ czony symbolem [8H] jest bardzo silnie adsorbowa- ny na tej laktynie_ sprzezonej z agaroza.Stosowano w sumie 10000 jednostek interferonu o aktywnosci 120000 dpm PH]. Okolo 50% radio¬ aktywnosci nie zostaje zaadsorbowane, a dalsze % mozna eluowac za pomoca 0,1 m galaktozy, ale material ten nie wykazywal aktywnosci biologicz¬ ne}. Calkowita desorpcje osiaga sie stosujac frag¬ ment glikoproteiny z ludzkich erytrocytów. Ten fragment otrzymuje sie z blony ludzkich erytrocy¬ tów po dzialaniu trypsyna wedlug metody opisanej przez S. Kornfelda i in., Proc. Nat. Acad, Sci. (USA) 63, 1439—1446. Po dodaniu tego fragmentu glikopro¬ teiny do srodka eluujacego, otrzymuje sie ostre maksimum. Calkowita pozostala radioaktywnosc zo¬ staje wyeluowana, to znaczy, ze interferon ulega desorpcji w wyraznie ograniczonym zakresie.Przyklad III. Enzymatyczne utlerianie asia- lointerferonu. Roztwór 40 ml interferonu króliczego zawierajacy 5.10« jednostek interferonu w 5,05 m roztworze buforowym octanu sodowego c wartosci 88 697 6 pH 5,5, 0,15 m NaCl i 20 milimoli Ca Cl,, traktuje sie jedna miedzynarodowa jednostka neuraminidasy pochodzenia bakteryjnego lub zwierzecego. Po uply¬ wie 4 godzin dializuje sie material 0,1 n kwasem octowym i nastepnie woda. W cieczy nad osadem znajduje sie asialointerferon. Jezeli taki preparat poddaje sie izoelektrycznemu ogniskowaniu, to oka¬ zuje sie, ze jak to juz wczesniej opisano (K. Schon- ne i in., Symp. Series Immunobiol. Standard, 14, m 61—68), zanikla róznorodnosc ladunku i utworzyl sie jednorodny produkt o p I 6,3. Ten asialointer¬ feron utlenia sie za pomoca enzymu kalaktozooksy- dazy. 2,101 jednostek interferonu w 0,05 m roztwo¬ rze buforowym o wartosci pH 7,8, 0,05 m Na Cl, inkubuje sie z 500 jednostkami galaktozooksydazy w ciagu 20 godzin. Po dializowaniu 0,1 n kwasem octowym produkt odwirowuje sie.Przebieg reakcji sprawdza sie droga redukcji no¬ wo utworzonej grupy aldehydowej 0* w koncowej *o galaktozie za pomoca Na BH4 znaczonego trytem.Jezeli zredukowany produkt poddaje sie elektry¬ cznemu ogniskowaniu, wtedy frakcja interferonu p I 6,3 wykazuje wysoki stopien wbudowania try- tu. Produkt ten hydrolizuje sie w ciagu 2 godzin M 2n kwasem solnym w temperaturze 100'C, zoboje¬ tnia za pomoca Ag2CO« i uwalnia od jonów za pomoca zywicznego wymieniacza jonowego.W produkcie hydrolizy mozna niewatpliwie wykryc za pomoca chromatografii bibulowej obecnosc ga- *• laktozy znaczonej trytem (patrz tabela). Tabela ta wykazuje wyniki otrzymane z interferonem i asialo- interferonem nie poddawanymi procesowi i pod¬ dawanymi procesowi wedlug wynalazku Tabela o ¦—¦ ? * cd co 1 w cd Z* 3 cd* 'O « Interferon Interferon Asialo¬ interferon Asialo¬ interferon 1 Hodowla z galak- tozooksydaza + — + Calkowite wbu¬ dowanie [3H] w proteinie w dpm/ 39,115 24,765 26,593 113,135 Wbudowanie [3H] w galaktozie w dpm/iig proteiny 2,182 1 6,224 1 4,080 77,724 1 '" I S -, ?" , 1 \ 0.1 m galaktcza j glikoproteina y j ~.Z~^=» | _i i 1 oi i ui a jednostki interferonu/2ml x1(P WDL. zam. 3324 nakl. 105 Cena 10 zl PL