Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku 810 A, (bedacego mieszanina kwasów o ogólnyim wzorze 1, w którym R oznacza grupe wodorotlenowa lub sulfoksylowa — OS08H.Zwiazki o ogólnym wzorze 1 maja budowe po¬ dobna do zwiazków szeregu ceMosporyn. Cefalo- sporyna C ina podstawnik D^-aniimo-5-kaiiboksy- waleramidowy w pozycji 7 pierscienia oefemowego, natomiast zwiazki o wzorze 1 oprócz tego podstaw- nika w pozycji 7 maja takze podstawnik metoksy- lowy. W pozycji 3 pierscienia cefialosporyna C jest podstawiona grupa acetoksymetylowa, natomiast zwiazki o wzorze 1 maja w tej pozycji girupe metxkisy-p^sulfcteyic^inaimoilowa albo a-metoksy-p- -hydroksycynamoilowa. Wytwarzane sposobem we¬ dlug wynalazku zwiazki o ogólnym wzorze 1 maja podstawnik 5^aniino-5-kaiit)olkBywaleramiidow^ w konfiguracji |3 w stosunku do pierscienia cefemo- wego.Sjposobem wedlug wynalazku antybiotyk 810 A otrzymuje sie na dirodze aerobowej hodowli w kon- trolowiainych waipunkiach wodnych pozywek zaszcze¬ pionych nowym miikrooti^anizmem z gatunku Strep- tomyces griseus, którego kulltuiry sa zdeponowane w Northen UMUzaition Research and Development Branch of ithe UJS. Department of Agriculture Peo- ria, Illinois, Stany Zjedn. Amer., pod numerami NRRL 3851, NRRL 3031, NRRL 3053 i NRRL 3952.Jedna z glównych trudnosci, napotykanych w te¬ rapii antyrriikrobowej, jest isMonnosc do degradacji 2 enzymatycznej, wykazywana przez wiekszosc zna¬ nych antybiotyków. Na przyklad, ipenicyliinia G jest skuteczna w zwalczaniu wielu miikirooiigianizmów Gram^dodaitnich i Gram-ujemnych, lecz w obecnosci penicyliny rozklada sie produkt, który w stosunku do wiekszosci organizmów chorobotwórczych nie wykazuje wlasciwosci antybiotyamrych. Cefalospo- ryna C jest wprawdzie odporna na dzialanie peni¬ cyliny i jest aktywna w stosunku do bakterii Gram- -dodatnich i Gram-ujemnych, ale aktywnosc ta nie jest duza. Poza tym istnieja enzymy inne niz pe¬ nicylina, zwane cefaloaporynazanii, które dezakty- wuja cefalosporyne.Antybiotyk »10 A jest odporny nie tylko na pe- nicyflioaze, ale i na cefalosporynazy i równocze¬ snie jest aktywny w stosunku do bakterii Grarn- -dodatnich i Gram ujemnych. Przejawia on aktyw¬ nosc in vivo w stosunku do (mikroorganizmów Gram-ujemnych takich, jak Proteus vulgaris, Pro- teus mirabilis, Salmonella pullorum, Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae oraz w stosunku do miknx)organizmów Gram^dodatnich takich, jak Sta- phylococcus aureus, Streptococcus pyogenes i Di- plococcus pneumoniae.Sposród zwiazków, wchodzacych w sklad anty¬ biotyku 810 A, szczególnie cenne wlasciwosci ma kwas 7 P-(D-5HamiinD-54can1bakB^ metoitesy-p-suilfciksycynam^ 3-cefemokarboksylowy-4 o wzorze 2. Zwiazek ten jest zwiazkiem o wzorze 1, w którym R oznacza 85 57685 576 grupe sulfoksylowa. Cenne wlasciwosci maja rów¬ niez sole tego zwiazku. Zwiazek o wzorze 2 jest bardziej odporny na [rozkladowe dzialanie cefalospo- rynaz, a doswiadczenia wykonane ma myszach wy¬ kazaly, ze jego toksycznosc jest ibairdizo mala. Wpro¬ wadzony doustnie obroni przed infekcjami Proteus vul"garis, zas podawany podskórnie jest sikuteczny przy zwalczaniu infekcji ibakteriami CkianiHujemny- mi i Gram-dodalnimi.Mikroorganizm, wytwarzajacy antybiotyk 810 A, zostal wyodrebniony z gleby jako pojedyncza ko¬ lonia. Kolonie te przeniesiono na plyte iz pozywka o nastepujacym skladizie: Pozywka A-.r ekstrakt drozdzowy dekstroza woda destyflowana g g g 1000 ml Po kilku dniach wizrostu mikroorganizm wytwa¬ rzal antybiotyk 810 A. Antybiotyk (reprodukowano nastepnie w kolbach, umieszczonych na wytrzasar¬ ce, a na podstawie porównawczych badan biolo¬ gicznych i chemicznych, przeprowadzonych z tym antybiotykiem i z innymi, znanymi, stwierdzono, ze 810 A jest antybiotykiem nowym.Taksonomia i morfologia antybiotyku 810 A.Mikroorganizm, wytwarzajacy antybiotyk 810 A, zidentyfikowano jako Streptomyces gsriseus, a kul¬ tury jego sa zdeponowane pod numerami NRRL 3851, NRRL 3951, NRRL 3953 i NRRL 395(2. Takso¬ nomia, która posluzono sie w identyfikacji jest opi¬ sana w „Bergey's Manual of Determinaitdve Baote- iiology", wydanie VII oraz w 'ksiazce S. A. Wak- smana „The Actinomycetes" Vol. 2 (19611). Opis, wy¬ twarzanie melaininy i przyswajanie wegla przypo¬ minaja Strepitomyces griseinus — -wedlug danych „International Journal of Systemie Baoteriology", wydanie VII (1957), poniewaz grupa Streptomyces griseus zostala podzielona w r. 1959, dwa lata po wydrukowaniu tego wydania. Jednakowoz zarów¬ no w dziele Waksmiana, jak i w „International Journal of Systemie Bacteriology", Srtreptomyces griseinus jest zdefiniowany jako „wyttwarzajacy gry- zaine szczep Streptomyces griseus" lub jako „wy¬ twarzajacy gryzeirie lub substancje gryzeino-po- dobne".Streptomyces griseus, NRRL 3851 jest szczepem rózniacym sie od klaJsycznego opisu w dzielach Bergey'a i Waksmana tym, ze ma powietrzna grzyb¬ nie o zabarwieniu glównie zóltym, a na niektórych pozywkach zielonawo-zóltym oraz nieco innym przyswajaniem wegla. Na stronach 111—133 „The Actinomycetes" Waksman opisuje te rodzine Strep¬ tomyces griseus jako obejmujaca wiele pokrewnych gaituinków i szczepów, chairakteiy^ujacych sie wzro¬ stem substratu bezbarwnego lub o zalbarwieniu oliwkowym, grzybni powietrznej o barwie zólta¬ wej o odcieniu zieionawym lub zielonawo-szarej, melanina ujemna, sporoforanii prostymi ldb zgie- tymi, produkowanymi w kepkach, zarodnikami owalnymi. W ponizszych tablicach scharakteryzo¬ wano kultury szczepów, wytwarzajacych antybiotyk 810 A oraz kultury szczepów Streptomyces griseus i Streptomyces griseinus.W tablicach 1 i la porównano szczep NRRL 3851 z opisanym przez Bergey'a i Waksmana szczepem Streptomyces griseus oraz z opisanym przez Wak¬ smana szczepem Streptomyces griseinus.Tablica 1 Porówinawcza charakterystyka szczepu NRRL 3851 NRRL 3851 Streptomyces griseus (Bergey1) Streptomyces griseus (Waksman2) Streptomyces griseinus (Waikstman2) Sporofory w postaci mono podialnie rozgalezionych | wiazek, lancuchy zarodni ków proste, do lekko fali stych. Zarodniki kuliste doi lowalnych, srednica 0,9 \i do 0,9 X 1,2 \jl w lancuchach] |po okolo 10-^15 jednostek, Strzepki grzybni wegeta-l tywmej szerokosci 0,9 \i\ (agar z gliceryna i aspara gina — 970 X) [Grzybnia powietrzna: obfi¬ ta, pudrowata, o barwiel zielonej (water green). Spo¬ rofory produkowane w| wiazkach. Zarodniki kuli- |ste do eUpsoidalnych, 0,8 do 1,7 X 0,8 \i.Wzrost wegetatywny: kolo tnie gladkie lub pofaldowa¬ ne bezbarwne (colorless), pózniej przechodzace w| loliwkowe (olive-ibu±f) Sporofory proste, produko¬ wane w wiazkach.Zarodniki kuliste do owal¬ nych, 0,8 X °8 d° 17 \* Po¬ wierzchnia gladka Sporofory proste, produ¬ kowane w gronach lub| wiazkach, bez spiral.Zarodniki paleczkowatel 1,0 do 1,8X0,8 do 1,0 \jl\ fcBergej^s Manual of Determinative Bacteriology", wydanie VII (1957) IWaksman, S.A., „The Actinomycetes", vol. 2 (1961) Jezeli nde podano inaczej, powyzsze obserwacje poczyniono po uplywie 3 tygodni inkubacja w tem- peraiturze 28°C. Odczyn stosowanych w 'badaniach pozywek byl mniej wiecej obojetny, to jest war-^ tosc pH byla w granicach 6,8—7,2. Próby fizjolo- 65 giczne przeprowadzano po uplywie 7 i 22 dni. Sto¬ sowane w opisie barwy sa zgodne ze zdefiniowa¬ nymi w „Color Harmony Manual", wydanie IV, 1958, Comtadner Corporation of Ameriica.Antybiotyk 810 A. Utylizacja weglowodanów.5 85 576 6 Tablica la Porównawcza charakterystyka szczepu NRKL 38(51 Pozywka 1 Agar z pasta pomidorowa i maka owsiana Agar iz gliceryna i aspajragina Agar Czapek-Doxa (agar z sachairoiza i azotanami) X Agar z albumina jaja Agar odzywczy Agar NRRL 3851 2 Wzrost wegetatywny: spód o barwie brazowej, plaskie irozpiize- stiizendajacy sie.Grzybnia powietrzna: srodek o barwie brazowej do szairawozól- tej, krawedzie o barwie brazowo- zóltej.Brak rozpuszczalnego pigmentu.Wzrost wegetatywny: spód o bar¬ wie brazowej, plaski, rozprze¬ strzeniajacy sie.Grzybnia powietrzna: pudrowa¬ la, o Rozpuszczalny pigment: jasny o barwie brazowawo-zóltej.Wztrost wegetatywny: spód o bar¬ wie zóltawo^rjoniaranczonej, pla¬ ski, rozprzestrzeniajacy sie.Grzybnia powietrzna: pudmowaita, o barwie brazowawo-zóltej (kilka odcieni, glównlie na krawedziach barwa brazowawe-zólta), wzrost jasny w cenitrum, ciemniejszy na krawedziach. Rozpuszczalny pig¬ ment: jasny, o barwie brazowa¬ wo-zóltej.Wzrost wegetatywny: spód o bar¬ wie szarawo-brazowej, plaski, rozprzestrzeniajacy sde.Grzybnia powietrzna: barwa bra- zowo-zólta z zielonym odcieniem, wzrost jasny w centrum, ciem¬ niejszy na krawedziach.Wzrost wegetatywny: spód o bar¬ wie brazowawo-zóltej.Grzybnia powietrzna: aksamitna, o barwie brazowawo-zóltej, kra¬ wedzie o barwie brazowawo-zól¬ tej... S. gmiiseus (Bergey) 3 , '' Obfity, 'kremowy prawie przezroczy¬ sty wzrost. Grzyb¬ nia powietrzna pu- drowaita, o barwie] bialej do jasnosza¬ rej. Brak rozpusz¬ czalnego pigmen¬ tu.S. girfiiseus (Waksman) 4 Wzrost rzadki, roz¬ przestrzeniajacy sie, bezbarwny, nastepnie przecho¬ dzi w oliwkowy.Grzybnia po¬ wietrzna : gesta, pudrowaita, o bar¬ wie zielonej, pig¬ ment nierozpusz- czaliny. * o'' ' ; .' o .Wzrost obfity, pra¬ wie przejrzysty, kremowy. Grzyb¬ nia powietrzna pudrowata, o bar¬ wie bialej do ja¬ snoszarej. Erakf rozpuszczalnego pigmenitu.S. Msednuis (Waksman) 1 Wzrost suibstrato- wy pomarszczony, spód o barwie kre¬ mowej do brazo¬ wawej.Grzybnia powiet¬ rzna o barwie bia-' lej do kremowej z odcieniem jasno¬ zielonym.Brak rozpuszczal¬ nego pigmentu.7 8 Tablica lia (ciag dalszy) 1 1 Agar syntetyczny Skos zelatynowy Agar odzywczy z zelatyna /* Mleko lalkmosowe Mleko odtluszczone Agar z odtluszczonym mlekiem Agar ¦z glukoza Bulion z glukoza Agar .skrobiowy 2 Platkowaty, kremowy wzrost, opadajacy ma dno probówki. Cal¬ kowite uplynnienie.Wzrost wegetatywny: /kremowy.Grzybnia -powietrzna: jasna o barwie brazowawo-zóltej. Brak rozpuszczalnego pigmentu. Uplyn¬ nienie zelatyny dobre.Czesciowy pierscien.Wzrost wegetatywny: brazowa¬ wy. Grzybnia powietrzna: skapa, bialawa. Peptonizacja, nastepnie alkalizacja.Czesciiowy pierscien.Wzrost wegetatywny: 'brazowa¬ wy. Brak grzybni powietrznej.Rozpuszczalny pigment: jasno - brazowy. Peptonizacja, nastepnie alkalizacja.Wzrost wegetatywny: kremowy, plaski. Grzybnia powietrzna: ska¬ pa, o barwie zóltowo-bialej do kremowej.Rozpuszczalny pigment: bardzo jasmobrazowy. Hydroliza kazeiny: 1 3 Rzadki, 'rozprze¬ strzeniajacy sie bezbarwny wzrost pózniej przecho¬ dzacy w oliwko¬ wy. Grzybnia po¬ wietrzna gesta* pu¬ drowana, o barwie pielonej.Obfite, zóltawe oble otwory z ztie- lonawym odcie¬ niem, silne sfaldo- wanie.Rzadka, rozprze¬ strzeniajacy sie, przezroczysty wzrost.Hydroliza skrobi. | 4 | 5 TAelonawo-zólty wzrost powierzch¬ niowy iz brazowa¬ wym odcieniem.Szybkie uplynnie¬ nie.Kremowy pier¬ scien. 'Koagulacja z szybka peptoni¬ zacja, nastepnie alikaldizaqja.Wzroist podwyz¬ szony w centrum, promienisty o bar¬ wie kremowej do pomaranczowej, brzegi uniesione.Wzrost skapy, mofc- przesitrizeniajacy sie, przezroczysty, silna hydroliza.Wzrost [kremowy z oddaniem brazom wawym. Grzybnia powietrzna nie wystepuje, wzgled¬ nie skapa:, o bar-1 wie bialej. Szyb¬ kie uplynnienie.Wzrost kremowy.Koagulacja i pep- toniaaicja.Wzrost bezbarwny do kremowego.Grzybnia po¬ wietrzna o barwie szarawo - oliwko¬ wej. Szybka hy- droOiiaa.85 576 Tablica la (ciag dalszy) • 1 1 Agar odzywczy ze skrobia Skos ziemniaczany Agar z jablczainem wapnia ' Agar odzywczy z tyrozyna X Agar z zelazem, pepttonem li ekstraktem* drozdzowym Produkcja H^S Skosy Loefflera Iz osoczem krwi Zakres 1 temperatury (skosy agarowe Iz ekstraktem / dirozdzowym, dekstroza i solami) Wzrost mikroaerodnlny (skos o glebokosci 40 mm) Z ekstraktem drozdzowym, dekstroza i solami Redukcja azotanów |do azotynów 2 ^ I Wzrost wegetatywny: kremowy.Grzybnia (powietrzna: jasna, oj barwie brazowawo-zóltej. Drak rozpuszczalnego pigmentu, hydro¬ liza dobra.Wzrost wegetatywny: jasnobrazo- wy. Grzybnia powietrzna: umiar¬ kowanie obfiita* brazowa.Slabe zbrazowanie ziemniaka.- Wzrost wegetatywny: plaski, roz¬ przestrzeniajacy sie, przeswieca¬ jacy, bezbarwny na krawedziach, a nieprzejrzysty i (kremowy w centrum.Grzybnia powietrzna; umiarko¬ wanie obfita, o barwie kremowej do zóltej.Brak rozpuszczalnego pigmentu.Wzrost wegetatywny: plaski, roz¬ przestrzeniajacy sie, 'kremowy.Grzybnia powietrzna o barwie zóltawo-brazowej z zielonawym odcieniem, brzegi o barwie bra¬ zowawo-zóltej .Rozpuszczalny pigment: bardzo jasnobrazowy.Rozlozone krysztaly tyrozyny.Wzrost wegetatywny: kremowy.Grzybnia powietrzna: brak.Rozpuszczalny pigment: brak.Melanina negatywna negatywna Wzrost wegetatywny: o barwie brazowej.Grzybnia "powietrzna: o barwie lekko zóltawej.Rozpuszczalny pigment: brazowa¬ wy.Calkowite uplynnienie. 28°C — doibry wzrost 37°C — dobry wzrost 50°C — btrafc wzrostu.Dobry wzrost pokrywajacy cala powierzchnie skosu. negatywna 3 1 Zóltawy, .pomarsz¬ czony wzrost, poJ kryty biala, pu- drowata grzybnia powietrzna. ' i Optymalna temperaitura — 37°C Aecofoowy pozytywna 4 I 5 1 i L 1 Wzrost pomarsz¬ czony, zóltawy do brazowawego, po¬ kryty biala, pudro- wata grzybnia po¬ wietrzna.Zielony lub zólty rozpuszczalny pig¬ ment w pozyw-- kach z jaiblczanem i bursztynianem wapnia.Czesto procjuko- wany ciemny pig¬ ment. negatywna • pozytywna Wzrost pomarsz¬ czony, zóltatwo- bialy. Grzybnia powietrzna o bar¬ wie szarawo-bia- lej z odcieniem oliwkowym.Brak rozpuszczal¬ nego pigmentu na pozywkach z jabl- czanem i burszty¬ nianem wapnia.Brak pigmentu. negatywna ' ipozytywna85 57S li 12 Szczep streptomyces griseus NRRL 3851 zbadano równiez na zdolnosc utylizacji wzglednie asymilacji róznych weglowodanów, hodujac oiigandizmy na za¬ sadowej syntetycznej pozywce (T. G. Pnidham, D. Gottlieb, 1948), zawierajacej 1% weglowodanów, w ternperaituirze 28°C, w oiajgu 3 tygodni. W tabli¬ cy 2 przedstawiono utylizacje wzglednie asymilacje weglowodanów przez Streptomyces griseus NRRL 3851. Znaczenie symboli uzytych w tablicy 2 jest ¦nastepujace: + dobry warost, ± slaiby wzrost, — bna&^warostiu.Charakterystyka przedstawiona w tablicach 1, la i 2 miala na celu sklasyfikowanie szczepu Strepto- myces griseus NRRL 3651 wedlug klucza opisanego w „Bergey's Manual of Determiiinaibive Bacteriolo- gy", wydanie VII, str. 694—829 (1957) oraz w „The Actinomycetes" vol. 2, str. 61—292 (1961). Porów¬ nanie szczepu NKRL 3851 ze znanymi gatunkami wskazuje na jego podobienstwo do Streptomyces griseus.Wystepuja pewne róznice morfologiczne, jak np. w zabarwieniu igrzybni powietrznej,'która w przy¬ padku Streptomyces griseus ma barwe glównie zól- ta lub zielonawo-zólta, lecz w swietle znacznej licz¬ by cech podobnych i jedynie nieznacznych róznic, nie ma podstaw do nadania szczepowi NRRL 3851 odrebnej nazwy gatunkowej. Tak wiec mikroorga¬ nizm z kultury NiRiRL 3851, wytwarzajacy antybio- tyk 810 A zostal zidentyfikowany jako gatunek Streptomyces griseus.Charakterystyka kultur NRRL 3951, NRRL 3053 i NRRL 395i2 irnikroorganiamu z gatunku Strepto¬ myces griseus jest przedstawiona w talblicy 2a.Weglom wodan glukoza arabinoza ktsiyfcTza maltoza mannoza fruktoza mannitol Tabl Kultura NRRL 3851 + + -I- + .+ — + lica 2 Weglo¬ wodan laktoza inozytol sacharoza ramnoza iratffrnotza celuloza Kultura NRRL 3851 + ± + ± + — Tablica 2a Charakterystyka kultur gatunku streptomyces griseus wytwarzajacych antybiotyk 810 A Pozywka NRRL 3951 .NRRL 3953 NRRL 3952 Morfo¬ logia Agar z pasta pomidoro¬ wa i maka owsiana Agar z gliceryna Sporofary tworza wiazki z lancuchami zarodników prostymi do lekko sfaldowanych.Zarodniki kuliste do owalnych — srednicy 0,9 \i do 0,9 X !£ V — w lancuchach skladaja¬ cych sie z 10—16 jednostek.Wzrost wegetatywny: dobry, plaski, rozprzestrzeniajacy sie, o barwie brazowej.Grzybnia powietrzna: pudrowata, o barwie brazowej z zielonawym odcieniem Grzybnia powie^ma;:7• <.v~ pudrowata, o barwie brazowej z silnym zielonym nadtonem Grzybnia powietrzna: pudrowata, o barwie brazowej z silnym zielonym nadtonem Grzybnia powietrzna: zielonymi.Rozpuszczalny pignient: barwa jasnobrazowa Wzrost wegetatywny: dobry, plaski, brazowy pudrowata* o barwie brazowej z zielonym odcieniem i* pasmami szaro-l Agar Gzapek- Doxa Rozpuszczalny pdgmemf: barwa jasnobrazowa Wzrost wegetatywny: plaski, (rozprzestrzeniajacy sie, przezroczysty Rozpuszczalny pigment: barwa gasnobrazowa Grzybnia .powietrzna: umiarkowanie obfita, wie brazowej o bar- Grzybnfia powietrzna: umiarkowanie obfita, wie brazowej o bar- Grzybnia powietrzna: umiarkowanie obfitai,. o wie brazowej bar- z ekstraktem drozdzo¬ wym, de- kstroza i solami Rozpusz¬ czalny pig^ ment na agarze z peptonem, zelazem i ekstraktem drozdzo¬ wym .Wzrost wegetatywny: plaski, rozprzestrzeniajacy sie, barwa brazowa Grzybnia powietrzna: dobra, pudrowata, barwa •bezowa Rozpuszczalny pigment: barwa jasnobrazowa brak brak brak85 576 13 14 Badania in vitro i in vivo. BioLogiczna charakte- rysttyke a/ntyfbioitykiu 810 A iin viitro prowadzono me¬ toda kranko«woHdyEu Krazki zwilzone roztworem anirtybitatyfcu umieszcaaa- no na powiemzchmi plyftek Petriego, ina które wle- wainio po 5 ml agam odzywczego (Difco) z 0,2% do¬ datkiem ekstraktu drozdzowego z posiewem 5 lub ml hodowli posiewowej na 150 'ml pozywki, pro¬ wadzac inkubacje w temperaturze 25°C lub w tem¬ peraturze 37°C, w ciagu 16 godzin.Powyzsza metoda opisana jest w publikacji „Cross 10 Resistance Studies aind Anitibioctic Identification", Applied Microbiology, vol. 6, str. 392—398 (1'958).W ponizszych tablicach 3—5 pirizedsrt&wioino wyniki badan wlasnosci anitybaMeryjnych i badan opor¬ nosci krzyzowej, z podaniem orjgandlzimów, stosowa¬ nych do badan i wanunków badan.Do badan stasowano plytki Amaltech G. F. Pla- tes. Sa to plytki z zelu krzemionkowego z sdarcza- .nem wapnia jako srodkiem wiazacym, o grubosci 0,25 mm. AnaMech Inc., 100 Souith Jusitdsan Street, wiknimgton, Delaware, 19801.Tablica 3 Antybiotyk 810 A spefctirum antybakteryjne. Aktywnosc in vitro Organizm stasowany do badan Escherichia ooild Barcillus spedes Protteus yuigairis Pseudomoinas aeruginoisa Serraitaa marcesceais Staphylooaccus auireus BaoMuis s/ubtilis Sarcilna kitea Staphylocoocus auneus (odporny na streptamycyne i stoeptotirycyne) Streptococous faeealis Alcaligenes faecaliis Brucella bronchiiseptiica Salmonella galMoaimn Vibirio pemcolans Xan1homoinas vesNcaitaria Warunki badania r Posiew** | 150 ml/ml " 5 ' .10 Temperatura inkubacji °C '25 *' 25 ' 37 37 37 "¦ 37 .37 27 | Srednica strefy zahamowania mm* 810 A | 5 mg/ml ' 15 22 29 7 7 26 33 26 19 7 21 36 1 * 7 mm srednica krazka (brak strefy zahamowania) ** Hodowla prowadzona w ciagu nocy rozcienczona do odczytu mu ha kolorymetrze Lumetrbn Tablica 4 Antybiotyk 810 A — opooinosc krzyzowa; -badania in vidiro *: Szczep Esoherichda coli** Wrazliwy szczep wyjsciowy Od|porny na: streptamycyne streptatrycyne oksamycyne pleocydyne " chloramfenikol chlortelmcylldjme oksjrtetjracykliLne neomycyne tetracykldne wiomycyne poiLLmytasyne 1 gryzedne Wairunki badania , Posiew*** ml/150 ml " Temperatura inkubacji °C . 37 37 37 Srednica strefy zahamowania mm* 810 A . mg/ml 13 17 26 7 7 7 7 17 | * 7 mm = srednica krazka (brak strefy zahamowania).** Próby wykonane z seria szczepów E. coli, izolowanych z tej samej kultury wyjsciowej, a nastep¬ nie wystawionych na dzialanie indywidualnych antybiotyków.*** Hodowla prowadzona w ciagu nocy, rozcienczona do odczytu 60 m na kolorymetrze Lumetron.15 85 576 16 Tablica 5 Antybiotyk 810 A spektrum efektów specjalnych; badania im vitro Escherichia coli W-MB-60 (ze specjalnymi dodatfcairni, jak zaznaczono) Kontrola (bez dodatków) 0,1 m bufor fosfeitajnowy — pH == 5 0,1 tm bufor fosforanowy — pH =i 7 0,1 m feufor fosforanowy — pH e= 9 % plazma krwi ludzkiej Zywica kaitiontitowa (Dow ET 91—1%; stezenie agaru obnizane do 1% jedynie w przypadku - | plyt z zywtLca) % Warunki badania Posiew** ml/150 ml Temperatea inkubacji °C Srednica strefy zahamowania mm* 810 A mg/ml 13 13 16 . 18 " 15 12 * Srednica krazka 7 mm ** Hodowla prowadzona w ciagu nocy, rozcienczona do odczytu m na kolorymetrze Lumetron Antybiotyk 810 A in vivo. Charakterystyka biolo¬ giczna in vivo wykazuje, ze antybiotyk 810 A ma szerokie spektrum, dirondace przeciwko infekcjom trzema gaitunkamd Pmoteuis, dwoma Salmonella, jed¬ nym szczepem Escherdiohia coli, dwoma Klebsiella i trzema gramHdadatnimi organizmami: Staphylo- coccus aureus, Streptococcus pyogenes i Diplococ- cus pneumoniae.Sposób prowadzenia badan. Samice bialych myszy 0 przecietnej wadze 20—23 g zaikazono dootrzewno- wo 'mikrooriganazniami w ilosci 3—20-forotnie prze¬ wyzszajacej wartosci okreslane jako smiertelne dla 50% zakazanych zwierzat kontrolnych (3^20 Ll3i0).W momencie zakazenia i w 6 godzin po zakazeniu stosowano okreslona terapie. Badano równiez zjadliwosc szczepu i "toksycznosc, przejawiana przez antybiotyk w stosunku do niezakazonych myszy.W 7 dni po infekcji badanie zakonczono i obliczo¬ no ilosc antybiotyku, potrzebna do ochrony 50% zakazonych i poddanych terapii zwierzaj;, stosujac sposób Knudsena i Curtisa; J. Amer. Stait. Assoc. vol. 42 str. 202 (1947).Wyniki. Wyndki powyzszych badan przedstawione sa w tablicy 6. Wykazuja one, ze antybiotyk 810 A, otmzymany z hodowla szczepu (NiRKL 3851, jest an¬ tybiotykiem o szerokim spektrum, chroniacym przed mdkrooirganizmaimi zairówno giram^dodatnimi, jak i igram^ujemnynii.Antybiotyk 810 A przejawia aktywnosc przy wprowadzeniu doustnym (p.o.), jednak najlepsze wyniki uzyskuje sie przy podawaniu podskórnym (s.c.) lub dootrzewnowym (i.p.). Kompleks antybio- tyczny nie zabija myszy przy dwóch dawkach po 1 mg produktu, wprowadzonych dootrzewnowo lub przy dwóch dawkach po 18 mg, wprowadzanych podskórnie kib doustnie.Jak wyzej wspomniano, antybiotyk 810 A wytwa¬ rza sie na.dirodjze aerobowej hodowli, w kontrolo¬ wanych warunkach, pozywek zaszczepionych kultu¬ rami Streptoimyces griseusNRRL 38i51, NBRL 3951, NRRL 3953, NRRL 3952.Do wytwarzania antybiotyku 810 A nadaja sie równiez pozywki, stosowane do wytwarzania in¬ nych antybiotyków. Pozywki takie zawieraja zró- 40 45 50 55 dla wegla i azotu przyswajalnego przez mikroorga¬ nizmy oraz nieorganiczne, sole.Tablica 6 Antybiotyk 81fr A. Aktywnosc in vivo Mikroorgandzm stosowany do badan Proteus vul@airiB Proteuis rniralbillis Salmonella schottmuelleri Escherichia coli Eschefriichia coli Klebsiella pneumoniae Salmonella @al Sataon^la pidlorum Diploccoccus pneumoniae Staphylococeus aiareus Streptococous pyogenes Sposób wprowa¬ dzania i.p. s.c. p.o. i.p. p.o. i.p.S.C. i.p. i.p. i.p. i.p. i.p. i.p. i.p. i.p.ED60X X2 dawka 33 500 12100 200 000 419 9000 3 750 1330 2 500 1670 625 258 927 625 65 Ogólnie jako zródlo przyswajalnego wegla moz*- na stosowac osobno lub w mieszaninie weglowo¬ dany takie, jak cukry, mp. iglukoze, arabinoze, mal¬ toze, ksyloze, mannitol itp., skrobie w postaci ziar¬ na np .owsa czy ryzu, skrobi kukurydzianej, maki ¦kukurydzianej. Ilosc zródla wzglednie zródel weglo¬ wodanów jest czesciowo zalezna od innych skladni¬ ków, na ogól jednak wynosi 1^6% wagowych tej pozywki. Jako zródlo azotu w procesie fermenta¬ cyjnym moze byc stosowany w zasadzie kazdy ma¬ terial bialkowy. ^\ Odpowiednimi zródlami sa np. hydrolizaty droz¬ dzowe, maka sojowa, hydrolizaty kazeiny, wyciag z namoku kukurydzianego* oleje fuzlowe, pasta pomidorowa itp. Zródla azotu, osobno lub w mie¬ szaninie, stosowane sa w ilosciach od okolo 0,2 do 6% wagowych wodnej pozywki.17 85 576 18 Tyipawe pozywki, nadajace sie do wytwarzania antybiotyku 810 A, sa podane ponizej. Pozywki te, jak równiez pozywki, opasane w przykladach, ma¬ ja charalster jedynie alustetywiny i inie ogranicza¬ ja 'zakresu wynalaizku. woda destylowana 1000,0 ml pH doprowadzone ^do 6,5 przy pomocy NaOH Pozywka I ekstrakt drozdzowy Difco glukoza ?bufor fosforanowy MgS04.7 HjjO woda destyOowaina agar Difco * bufor fosforanowy KH*P04 NajjHP04 woda destylowana Pozywka n , ekstrakt wolowy *NZ Amiine defcstroaa NaCl woda destylowana ,0 g ,0 g 2,0 ml 0,05 g 1000,0 ml ,0 g 91,0 g 95,0 g 1000,0 g 3,0 g ,0 g ,0 g ,0 g 1000,0 ml pH doprowadzone do 7,2 pnzy pomocy NaOH * enzymatycznie zhydrolizowana* kazeina Pozywka III dekstroiza asparagina KjHPC^ MgSO*.7 H20 ekstrakt drozdzowy ?mieszanina pierwiastków sladowych Nr 2 woda destylowana * mieszanina pierwiastków sladowych Nr 2: EeSo4.7 H20 MmS04 • H20 CuCl2 • 2 H«?0 CaClf H8BOs (NH4)6Mo7024.4H20 ZnS04.7 H20 woda destylowana v Pozywka IV . sok pamidorowy z dodatkiem soku z marchwi, buraka i pietruszki maka sojowa Staley 4S dekstroca ,0 g 1,0 g 0,1 g 0,5 g 0,5 g ,0 ml 1000,0 ml « 1,0 g 1,0 g 26,0 mg 100,0 mg 56,0 mg 19,0 mg 200,0 mg 1000,0 ml 100,0 ml ,0 g 2,0 g woda destylowana Pozywka V autolizat drozdzowy (Ardamine) glukoza ?bufor fosforanowy MgS04.7H2O ,0 g ,0 g 2,0 ml 0,05 g 40 45 50 55 60 65 91,0 g 95,0 g 1000,0 ml * bufor fosforanowy KH2P04 NaHP04 woda destylowana Pozywka VI wyciag z inamolku kukurydzianego (w odmesieniiu do cieczy) 40,0 g dekstroza 20,0 g NaCl 2,5 g MgS04. 7H20 0,5 g Polyglycol 2000 0,25% otojeto&aiowych (dodaje sie do kazdej koilby indywidualnie) woda destylowania 1000,0 ml pH — doprowadza sde do 7,0 za pomoca NaOH Polyglycol 2000 jest to srodek pirzeciwkb pienieniu, bedacy polimerem glikolu propylenowego o prze¬ cietnym ciezarze czasteczkowym 2000. Dow Chemi¬ cal Company Midland, Michigan.Pozywka VII L-asparagina L-histydyna DL-fenyloalainina ^uilaminaan jedno- sodowy NaCl K^PO* OaCl2.2 H^O MnS04 • Tl/D FeS04.7H20 ZnS04.7 H20 MgS04.7H20 gliceryna sacharoza woda destylowana Posiew ,0 g 4,0 g ,0 g 2,0 g 0,4 g 0,1 g 0,1 g 0,05 g 1,0 g ,0 g 2,5 g Wytwarzanie ,0 g 4,0 g 2,0 g 1,5 g ,0 g 2,0 g 0,4 g 0,1 g 0,1 g 0,05 g 1,0 g ,0 g ' 2,5 g *1000,0 rni **1000,0 ml * pH doprowadzone do wartosci 7,0 za pomoca NaOH ** pH doprowadzone do wartosci 7,1 za pomoca NaOH Pozywka VIII wyciag miesny NaCl NZ Amkie dekstroiza pH = 7,0 0,3% 0,5% 1% 1% Fermentacje prowadzi sie w temperarbuiiize 20— 37°C. Optymalne wyniki uzyskuje sie prowadzac fermenitacje w temperaturze 22°C—30°C. pH po¬ zywek do hodowli Strepitomyces griseus NRRL 3851 i wytwarzania antybiotyku 810A winno wynosic ,5—8,0.Na mala skale wytwarzanie antybiotyku 810 A korzystnie jest przyprowadzac, szczepiac odpowied¬ nia pozywke kultura, wytwarzajaca antybiotyk, po85 576 19 czyim ^utrzymywac ja w stalej temperaturze 24— 28°C ima wytrzajsairoe, w ciagu diuzsaego okiresu. cza¬ su* np. w ciagu (kilku dmd. Po zaikonczentiu okresu inkubacji usuwa sie grzybnie, a przesaczona brzecz¬ ke (poddaje sie badaniom.W praktyce wytwarzanie antybiotyku 810 A pro¬ wadzi sie w steryldizowanym naczyniu, przeprowa¬ dzajac .posiew jedno-, dwu-, trzy- lub czterokrot¬ nie. W stadium posiewu pozywka moze byc jaka¬ kolwiek odpowiednia kombinacja zródel wegla i azotu taka, jafc mp. jedna z wyzej opasanych po¬ zywek I—VIII. Naczynie z posiewem wytrzasa sie w teimiostatowej komorze, utrzymywanej w tem- peraturze okolo 28°C w ciagu 1—3 dni, a uzyskana hodowle badz to wykorzystuje sie do drugiego po¬ siewu, badz tez szczepi sie nia pozywke produkcyjna, jezeli stosuje sie posiew posredni, ito naczynie z tym posiewem .traktuje sie zasadniczo w taki sam spo¬ sób, to znaczy izawartosc naczynia stosuje sie do szczepienia ,"pozywki produkcyjnej, szczepione na¬ czynie^ wytrzasa sie w stalej temperaturze w ciagu kilku lcmi', a po zakonczeniu okresu inkubacji za¬ wartosc naczyn poddaje sie wirowaniu w celu (usu¬ niecia grayflbmd. Pozostala ciecz aateza sie i oczysz- oza, olrizymarjac lantybiotyk 810 A.T^rzy produkcji na wieksza skale korzystnie jest przeprowadzac wytwarzanie anlybdotyffcu 810 A w odpowiednich zbiornikach, wyposazonych w mie¬ szadlo d urzadzenia do napowietrzania pozywki. We¬ dlug tego sposobu, pozywke praygotowuje sie w zbiorniku, w którym nastepnie wyjalawia sie, ja przez podgnzainie do temperaitUTy okolo 120°C. Po ochlodzeniu wyjalowiona pozywke szczepi sie szcze¬ pem produkcyjnym i prowadzi fermentacje w ciagu kilku, np. 2—4 dni, mieszajac i/lub napowietrzajac pozywke, utrzymuje sie temperature w zakresie 24—28f°C. Zmiany w rozwoju posiewu i w pozywce produkcyjnej umozliwiaja kilkakrotny wzrost ilosci wyprodukowanego awtytodotyku ouaz wzrost jego mocy.' : Oznaczanie antybiotyku 810 A z zastosowaniem Proteus Yulgaris, Dogodnym sposobem oznaczania antybiotyku 8i0 A jest metoda 'krazkowo-plytowa z zastosowa¬ niem szczepu Proteus vulgairis MB-838 (ATCC 21100 i NRRL B-3361),-hodowanego na agarze skosnym (Ddfco) z 0,2% dodatkiem ekstraktu drozdzowego (Difco). Zaszczepiane • skosy inkubuje sie w tempe- ratuirze 37ÓC, w ciagu 18—24 godzin, a nastepnie az do uzycia przechowuje sie w lodówce. Zaszcze¬ pione skosy mozna przechowywac w ciagu tygod¬ nia.Posiew dla plyt testowych przygotowuje sie co¬ dziennie, szczepiac w kolbie Erlenmayera 50 ml bulionu odzywczego (Difco) z 0,2% dodatkiem eks¬ traktu drozdzowego (Ddfco) kultura zeskrobana ze skosów. Inkubacje prowadzi sie na wytrzasarce Wgj^ye^ucze 37°C, w ciagu 18—24 godzin. Na¬ stepnie bulion rozciencza sie do 40% przepuszczal¬ nosci swiatla o dlugosci fali 660 mu, mierzonej na przyrzadzie Ba^sch and Lomb Spectrondc 20, 0,2% (roztworem" ekstraktu drozdzowego. Jako odniesie¬ nie stosuje sie i^eszczepiony bulion. Odpowiednio rozcienczony bulion (30 ml) sluzy do szczepienia 1 litra .pozywtki.Jako pozywke testowa stosuje sie agar odzyw¬ czy. (Difco) z 0,2% dodatkiem ekstraktu drozdzowe¬ go (Ddfco), wyjalowiony w autoklawie i ochlodzony do temperatury 50°C. Zaszczepiona pozywke rozle- wa sie na plytki Petriego, w ilosci po io ml na plytke i pozostawia -do zastygniecia.Na tak przygotowanych plytkach przeprowadza sie test krazkowo-plytkowy, stosujac krazki bibu¬ ly o srednicy 0,5 cala. Plytki testowe imkubuje sie w ciagu 20—24 godzin w .temperaturze 37°C. Wy¬ niki wyraza sie w mm srednicy strefy zahamowa- ^nia. Okresla sie aktywnosc wzgledna, odniesiona do wzorca (roboczego (reference standard), wyrazajac ja w iig/ml. Przeprowadzajac badania w sposób ilosciowy mozna wykryc antybiotyk w ilosci 2—4 lig/ml.Oznaczanie antybiotyku 810 Az zastosowaniem Vibrio„percolans.Oznaczanie antybiotyku 810 A z zastosowaniem Vibrio percolans (MB-1272) przeprowadzano rów¬ niez metoda krazkowo-plytowa, stosujac kraiki bi¬ buly o srednicy* 0,5 cala. Plytki do badan przygo¬ towywano stosujac agar odzywczy (Ddfco) z do¬ datkiem ekstraktu drozdzowego Ddfco w ilosci" 2,0 g/l. Na plytki wylewano po 10 ml pozywki. Pro¬ wadzona w ciagu nocy hodowle organizmu testo¬ wego Vdibrio percolans (MB-1272) w bulionie odzyw¬ czym z 0,2% dodatkiem ekstraktu drozdzowego roz¬ cienczano wyjalowionym fizjologicznym roeitworem soli do zawiesiny o 40% przepuszczalnosci swiatla o dlugosci fali 660 m^i. Zawiesine te wprowadzano do pozywtki w ilosci 20 ml/1, a nastepnie pozywke rozlewano na plytki.Plytki do badan przechowywano nie dluzej niz 5 dni, w temperaturze 4°C. Po nalozeniu krazków nasyconych antybiotykami, plytki ankubowano w temperaturze 28°C, w ciagu 3—24 godzin. Wiel¬ kosc strefy zahamowania wyrazano w mm srednicy Jnaktywaeja bakteryjna antybiotyku 81fr A. c ; 40 Prowadzone on vitro badania mialy na celu—po¬ równawcze okreslenie odpornosci antybiotyku 810 A na inaktywacje przez bakterie w stosunku do od¬ pornosci cefaiosporyny C, cefalosporydyny i cefalo- tyny. Badania te wykazaly, ze antybiotyk 810 A jest 45 bardziej niz wyzej wymienione odporny na dziala¬ nie pewnych mikroorganizmów. * ; Badanie przeprowadzono z zastosowaniem bak¬ teria, które calkowicie inaktywuja cefaiosporyne C, mianowicie Alcaligenes faecalis (MB-9). 50 a) Hodowla komórek bakteryjnych. Komórki Alcaligenes faecalis (MB-9) wyhodowano w sposób nastepujacy: zawartosc probówki wymieszano z kilkoma ml bulionu odzywczego, zawierajacego 0,2% dodatek ekstraktu drozdzowego. Zawiesine 55 w ilosci jednego oczka naniesiono na powierzchnie skosu agarowego i inkubowano w ciagu 18 godzin w temperaturze 37°C. Skosy .przechowywano w tem¬ peraturze 5°C, nie dluzej niz tydzien po inkubacji: Oczko powierzchniowego wzrostu z kazdej kultury 60 przenoszono aseptycznie do 50 ml bulionu z 0,2% dodatkiem ekstraktu drozdzowego i inkubowano na wytrzasarce w ciagu 18 godzin w temperaturze 28°C. Nastepnie hodowle poddano wirowaniu z predkoscia 4000 obrotów na minute, w ciagu es 10 minut. Ciecz zdekantowano, a pozostale w osa-21 85 576 dzie komórki dwukrotnie przemyto wyjalowionym 0,1 m buforem fosforanowym o wartosci pH = 7,5 (6,8 g KHjjlPC^ + 7,1 g Na^HPOt ina litr wody desty¬ lowanej). Przemyte komórki zawieszono w roztwo¬ rze 4 mg/ml antybiotyku w 0,1 m buforze fosfo¬ ranowym, uzytym w ilosci równej 0,1 poczatkowej objetosci hodowli bakiteryjnej. Mieszanine testowa inkubowano, bez wytrzasania, na lazni wodnej, utrzymywanej w temperaturze 37°C, w ciagu 4 go¬ dzin. Nastepnie mieszanine te poddano wirowaniu z predkoscia 2000 obrotów ma min/ute, w ciagu minut, a no do wyjalowionych probówek, (natychmiast za¬ mrozono w suchym lodzie i przechowywano w tych warunkach do badan biologicznych, które zwykle przeprowadzano ipo 3 godzinach. Próby kontrolne inkubowano w identyczny sposób, nie wprowadza¬ no jednak komórek bakteryjnych. b) Zakres inaktywacji antybiotyku 810 A^ Ba¬ dania aktywnosci antybakteryjnej plynów pofer¬ mentacyjnych przeprowadzano w nastepujacy spo¬ sób: ikrazki bibuly o srednicy 6 mm wysycano cie¬ cza i umieszczano na powierzchna plytek pokrytych agarem z dodatkiem ekstraktu drozdzowego (0,2%); zakazonym odpowiednim mikroorganizmem stoso¬ wanym do badan. W przypadku B. subtilis (MB-964) plytki do badan przygotowywano w na stepujacy sposób: 5 ml zawiesiny przemytych za¬ rodników w 0,9% roztworze soli wprowadzano do 150 ml agaru z 0,2% dodatkiem ekstraktu drozdzo¬ wego, a zakazona pozywke rozlewano na plytki Petriego o wymiarach 15 X100 mm, w ilosci po mil pozywki na plytke. Plytki do badan inkuibo¬ wano w ciagu nocy w temperaturze 25°C, a nastep¬ nie mierzono strefy zahamowania wokól krazków.W celu wykreslenia krzywej dla wzorca robocze¬ go, przeprowadzono*próby kontrolne z wolnym oó^ komórek bakteryjnych antybiotykiem w rozcien- czeniach 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 i 1:32. Roz¬ twory testowanych antybiotyków badano w pelnej ich mocy, po inkubacji w obecnosci przemytych komórek bakteryjnych. Wszystkie próby przeprowa¬ dzano trzykrotnie. c) Wyniki. Procent inaktywacji obliczano w ten sposób, ze na podstawie wielkosci strefy zahamo¬ wania (sredniej z trzech pomiarów), poslugujac sie krzywa wzorcowa, obliczano ilosc antybiotyku po¬ zostalego w badanym roztworze: wartosc te odej¬ mowano od stezenia wyjsciowego (4 mg/ml), a resz¬ te dzielono przez stezenie wyjsciowe a mnozono przez 100. W tablicach 7 i 8 przedstawiono wartosci inaktywacji cefalosporyny C, cefalotyny i antybio¬ tyku 810 A, zmierzone w wyzej opisany sposób.Tablica 7 Procent inaktywacji po inkubacji z przemytymi komórkami bakteryjnymi Próby na plytkach zakazonych B. subtilis (MB-964).Antybiotyk 810 A Cefalosporyna C Cefalotyna 3 godziny inkubacji Alcaligenes faecalis 0 99+ 62,5 Tablica 8 Procent inaktywacji po inkubacji z przemytymi komórkami bakteryjnymi Próby na plytkach zakazonych V. percolans (MB-1272).Antybiotyk 810 A Cefalosporyna C Cefiadotyna 3 godziny inkubacji Alcaligenes faecalis 0 99+ 50 Zbadano równiez odpornosc aintyJbiotyiku 810 A i cefialosporyny C na degraclacyjny wplyw kultury Aerobacter cloacae (MB-264i8). Mikroorganizm jest gram^ujemny i odporny na cefelosporyne C. Spo¬ rzadzono mdeszanihy mikroorganizmu z antybioty¬ kiem, /które inkubowano w ciagu 2 godzin i nastep¬ nie badano na aktywnosc antybiotyczna. Metoda jest identyczna z opisana powyzej dla Alcaiigenes faecalis. Zródlem materialu inaktywujacego jest roz¬ cienczony w stosunku 1 :160 przesacz hodowli Ae-f robacter cloacae (MB-2646) w bulionie z 0,2% do- daiMem etestralktu drozdzowego, wytrzasanej w cia¬ gu 13 godzin w temperaturze 37°C. W tablicy 9 przedstawiono zmierzony w powyzszy sposób przy uzyciu Yiibrio percolans (MB-1272), procent inakrty¬ wacji antybiotyku 810 A, cefailotyny, caMorydyny i cefalosporyny C.Tablica 9 Procent inafetyiwacji po inkubacji z ekstraktem pozbawionym komórek Próby na plytach zakazonych V. percolans (MB-1272).Antybiotyk 810 A Cefalotyna - Cefalorydyna | Cefialosporyna C 2 godziny iLniktubacji Aerobacter cloacae - W ' ' ¦ . ¦•¦¦¦ «$ -'¦ - 99 . ' 96 Stosujac wyzej opisana metode^ zbadano przed¬ stawiona w tablicy 10 wzgledna odpornosc anty¬ biotyku 810 A na enzymatyczna inaktywaeje przez Aerobacter cloacae. Stezenie wyjsciowe wynosi 250 |xg/ml, wyniki wyrazono w ^ig/ml.Tablica 10 Pozostala aktywnosc antyWotyczna (ng/ml) Stezenie wyjsciowe 250 jig/ml Antybiotyk " 810 A Cefalotyna Cefalorydyna 810 A Cefalotyna | Cefalorydyna Organizm stosowany do badan B. subtilis B. subtilis B. subtilis V. percolans 1272 V. percolans 1272 V. percolans 1272 2 godizuny BJrtkubacji z Aero¬ bacter i cloacae* 190 140 <10 210 85 <10 | 65 * ekstrakt pozbawiony komórek85 5T8 23 U W swietle powyzszych danych jest oczywiste, ze antybiotyk 810 A jest bardziej juiz cefalosporyna C, oefialotyna i oefalorydyna odporny na inaktywacje przez Aerobacter cloaeae.Poniewaz antybiotyk 810 A oraz jego sole sku¬ tecznie irihiibiituja wzrost róznych gatunków Salmo¬ nella, przeto zwiazki te moga byc stosowane jako srodki dezynfekujace w gospodarstwie domowym i w przemysle. Antybiotyk 810 A wykazuje np. ak¬ tywnosc w stosunku do SaJknonellia schottmuellerii i S. gallinairum, Wyosabnianic i oczyszczanie antybiotyku 810 A.Antybiotyk 810 A mozna oczyszczac droga adsorp¬ cja ma zywicy jonitowej -takiej, jak np» syntetycz¬ na zywica anaonitowa wytworzona z dekstranu, ko¬ polimery akrylowe lub -niejonowe, usieciowane poli¬ mery. Zaadsorbowtany antybiotyk eluuje sie z zy¬ wicy, wzgledme polimeru woda lub wodno-alkoho- lowym roztworem odpowiedniej soli takiej, jak chlorek amonu, chlorek sodu dtp. (Przykladami zywic jonitowych i polimerów, które nadaja sie do sto¬ sowania sa opasane ponizej DEAE Sephadex A-25, Amberlite IRA-68 i Amberlite XAD-2. W razie po¬ trzeby otrzymany eduat mozna oczyscic po raz drugi i trzeci, w drodze adsorpcji i ekicji. Z koncentra¬ tów ekiatów otrzymuje sie .produkt oczyszczony.Antybiotyk 810 A mozna rozdzielic chromatogra¬ ficznie na nastepujace sMadndki: kwas 7g^(D-5- -iaimimo-S^fiajrbctoywa^ -8-i(a- foksycynamoiloldsymetylo)-7-m€rtoksyceifemo-3-kar- botósylowy-4 i kwas 7p-^D-5Hamdno-5^karboksywa- leramidofr-Mai^efok^ tylo)-7^netokeyic»femo-3^flar!boksylowy-4. Stosuje sie nastepujace metody chromatograficzne: 1) Chromatografia na silnie hydrofilowych zywi¬ cach anlc^fowych .takich, jak DEAE Sephadex A-25 z zastosowaniem ukladu eluujacego: bromek amonu + kwas mrówkowy. Stosowac mozna uklady o róznym stezeniu, w praktyce jednak korzystnie jest stosowac iroztwór 0,5 m bromku amonu + 0,1 kwasu* mrówkowego. 2) ChiTomatograf ia na slabo zasadowej zywicy anionditowej itaMej^ rozdzial grupowy, w którym surowy material adsor- bowany jest iprzy waitfosci pH^3 — 3,5, a eluo- wany jest poczatkowo kwasem o wartosci pH oko¬ lo 2, a* nastepnie mieszanina NaO/HCl przy war¬ tosci pH okolo 1. 3) Chromatografia ma niejonowych, usieciowa- nych polimerach polistyrenowych takich, jak Am¬ berlite XADh2. Eluuje sie odpowiednim ukladem wodnym, pi^y czym na ogól karzystoae jest stoso¬ wac mdeszanline wody i nizszego allkiloketonu. Ty¬ powymi eiuenitami, które moga byc w tym przy¬ padku stosowane sa np. 10% wodny roztwór me¬ tanolu, a nastepnie (roztwór 50%. Zamiast 50% wodnego roztworu metanolu stosowac mozna 20% wodtny roztwór acetonu. tlndywiduaHne skladniki otrzymane tym sposobem moga byc oczyszczane takze na drodze chromato¬ grafii. Taknp. kwas 7fl-i(D-5HamMo-5-kiairboksywale- ramiido)-3-(a-metoksy^pJsulfoksycynamodiloksymety- lo)-7Hmetoiksyce(emo^-!kaii^boto (Ic) mozna dalej oczyscic sposobem (1) uzupelnionym odsole- ndem na adsorbencde Amberloite XAD-2. Kwas 70-(D-5^mino-5-karboksywalera(mido)-3-(a-meto- iksy-p^ydroksycynamo^loksymetylo)-7-lmetoksycefe- mo-3^karboksylowy-4 mozna dodatkowo oczyscic, stosujac chromatografie na zywicy anioniix)wej Sep- hadex A-25, eluujac 0,5 m bromkiem amonu i 0,05 m kwasem octowym.Podane wyzej nazwy handlowe srodków stosowa¬ nych w tych procesach miaja nastepujace znaczenia: DEAE Sephadex A^25 jest syntetyczna zywica anibnitowa oparta na polisacharydzie, dekstranie, w postaci chlorkowej, to jest, obsadzona jonami chlorkowymi. [Producent: Phartmacia Pine Chemi¬ cals, Inc.Amberlite IRA-08 jest to syntetyczna zywica amo¬ nitowa; usdeciowany kopolimer akrylowy, zawiera¬ jacy slabo zasadowe ;trzedorzedowe grupy aminowe.Producent: Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pen¬ sylwania.Amberloite XAD-2 jest to sorbent niejonowy, usie- ciowany polimer styrenowy. Producent: Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pensylwania, Antybiotyk 810 A i jego skladniki oraz sole moga byc stosowane pojedynczo lub w mieszaninie, jako aktywna grupa skladników 'róznorodnych prepara¬ tów fairmaceutycznych. Moga \byc one stosowane w postaci kapsulek, (tabletek, proszków lub cieklych roztworów, jako zawiesiny lub eliksiry. Wprowadza sie je doustnie, dozylnie lub domiesniowo. Odpo¬ wiednimi nosnikami, mogacymi stanowic skladniki mieszanin sa np. mannitol, sacharoza, glukoza lub wyjalowione ciecze tafcie, jak woda, fizjologiczny noztwór soli, glikole lub oleje — pochodzenia naf¬ towego, zwierzecego, roslinnego lub syntetyczne takie, jak np. olej arachidowy, olej parafinowy lub sezamowy. Mieszaniny obok nosników moga zawie¬ rac równiez inne skladniki takie, jak stabfiflizaitory, srodki wiazace, piraeciwutlendaicze, srodki konserwu¬ jace, srodki smarnie, srodki dyspergujace, srodki zmieniajace lepkosc, srodki zapachowe itjp. Miesza¬ nina zawierac moze równiez inne aktywne sklad¬ niki, zwiekszajace spektrum aktywnosci antybio- tycznej.Wielkosc dawki w znacznej mierze zalezna jest od wairunków leczenia i wagi zywiciela. Przy zaka¬ zeniach ogólnych wskazane jest wprowadzanie po¬ zajelitowe* doustne przy zakazeniach jelitowych.Ogólnie dawka dzienna wynosi od okolo 15 do oko¬ lo 175 mg aktywnego skladnika na kg wagi ciala, przy czym dawka ta moze byc wprowadzana jed- nomazowo lub rozdzielana na mniejsze i wprowa¬ dzana kilkakrotnie w ciagu dnia.Mieszaniny moga byc stosowane w róznych po¬ staciach, np. jako stale lub ciekle, wprowadzane do¬ ustnie formy leków. Jednostkowe dawki, ciekle lub stale, zawieraja na ogól od okolo T5 do okolo 700 mg aktywnego skladnika. Na ogól korzystne jest stosowanie dawek wielkosci od okolo 80 do 320 mg. Przy wprowadzaniu pozajelitowym jed¬ nostka leku jest zwykle czysty skladnik w wyjalo¬ wionym roztworze wodnym lub w postaci rozpuisz- czakiegb proszku, przeznaczonego do rozpuszcze¬ nia.Typowa jednostkowa dawka leku jest zelatynowa kapsulka Nr 3, zawierajaca 100 mg antybiotyku 810 A lub 120 mig jednego z jego skladników lub 40 45 50 55 6085 576 26 jego soli, 20 mg laktozy i 5 mg stearynianu magne¬ zu. Stosujac wieksza ilosc aktywnego skladnika i mniejsza ilosc laktozy mozna do kapsulki Nr 3 wprowadzac wieksze dawki, a jezeli konieczne jest zmieszamie wiecej nilz 145 mg skladników, mozna stosowac wieksze kapsulki. W podobny sposób moz¬ na sporzadzac inne jednostkowe dawki Hakie, jak sprasowane italblertM i pigulki. Ilustruja ito ponizsze- przepisy. napelniane na sucho kapsulki, zawierajace po 120 mg zwiazku o wzorze 2. ma kapsulke kwas 7P^(D-5Hamiino-5Hkairboksy- waleramiido) -3-J(anmetdksy-ip-sul- Mcsycynamoiloiksymetylo)-7-meito- ksycefemo-3nka laktoza steairyiniain magnezu tycznie i zawartoscia jej szczepi sie 4 skosy pozywki o nastepujacym skladzie: Pozywka I ekstrakt drozdzowy Difco glukoza ?bufor fosforanowy woda destylowana agar Difco kapsulka iNir 3 120 mg mg mg 145 mg Kwas 7P^(D-5Ha!rnmo^5-kaiiboksywaleTamido)-3-(pi- ^mertxksyip-sulfcteycynamoilokisymetyio) -7-metoksy- refenio-3^air1baksyllowy-4 rozciera sie na proszek Nr 60, do którego przez sito Nir 60 dodaje sie lakto¬ ze i stearynian magnezu. Skladniki miesza sie w ciagu 10 minut, a mieszanina napelnia sucha ka¬ psulke Nr 3.Tabletki, zawierajace po 250 mg zwiazku o wzo¬ rze 2, wyttwairza sie, stosujac ma 1 taibleitke naste¬ pujace skladniki: kwas 7P-(D-5-am!imo-54sarboksy- waderaniido)-S-iCa-metoksy-pnSud- foksycynaimoiloksymetylo)-7-meto- ksycefemo-3Hkairboksylowy-4 fosforan dwuwapmiowy, U.SJP. stearynian magnezu ,0 g ,0 g 2,0 g 1000,0 ml ,0 g 91,0 g 95,0 g 1000,0 ml 1 bufor fosforanowy KH2P°4 Na2HP04 woda destylowana Skosy przygotowano w probówkach 14 ml/22 X X 75 mm. Probówki zamyka sie korkiem z waty, po czym wyjalawia, ogrzewajac w temperaituirze 120°C w ciagu 15 minut i odstawia do wystygnie¬ cia pozywki w polozeniu skosnym. Zaszczepione skosy inkulbuje sie w temperaltuirze 28°C w ciagu tygodnia, a nasltepmie az do uzycia przechowuje w temperaiturze 4°C. Hodowla na jednym z tych skosów szczepi sie przewezone koliby Erlenmayera 0 pojemnosci 250 ml, zawierajace po 50 ml po¬ zywki II. Szczepienia dokonuje sie w ten sposób, ze do pozywki ze skosem wprowadza sie 5 ml wyjalowionej pozywki, zesfcrobuje sie z powierzchni skosu hodowle, a nastepnie odpipetowuje sie po 1 ml cieczy do kazdej z (trzech kolb posiewowych, Pozywka II ma nastepujacy sklad: 250 mg 192 mg mg Pozywka II wyciag wolowy NZ Amine (enzymatycznie zhydrolizowana kazeina) dekstroza NaO woda destylowana 3,0 g ,0 g ,0 g ,0 g 1000,0 ml TT Ar. fi laktoza, U.S.P. 65 mg Aktywny skladnik miesza sie z fosforanem dwu- wapniowym i laktoza. Mieszanine 'granuluje sie % pasta ze skrobi kukuirydzoanej (6 mg) i prze¬ siewa. Suszy w tempera/turze 45°C i ponownie prze- siewa przez silo Nr 16. Dodaje sie stearynian ma¬ gnezu i sprasowujje w tableitke o srednicy okolo 12,5 mm.Roztwór injekcyjny, zawierajacy w ampulce 500 mg zwiazku o wzorze 2, wyitwamza sie, stosu¬ jac na 1 ampulke 500 mg kwaisu 7|MDJ5-amino-5- -karboksywaleramido)-3^(anmeitoksyHp-sulfioksycyna- moiloksymeitylo)-7-meto-ksyl(^emo^4Qa^italffiylowe- go-4 i 2 ml wyjalowionej wody.Kwas 7pH(D^5Hamino-54^Tiboksywal€tramido) -3-( -mertxksy-p-Bulfoksycynamoiloksymetylo)-7-meto^ cefemo-3-kaffiiboksylowy-4 mozna stosowac sam lub w • mieszaninie z dirmymi 'biologicznie aktywnymi skladnikami, nip. z innymi amtybiotykaimi takimi, jak Mnkomycytna, dowoflna penicylina, streptomycy¬ na, nowobiocyma, igeautoamycyna, neomycyna, koli- styna, czy kainamycyna.Nizej podane przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Probówke z liofilizowana kulituira Streptomyces griseus NRRL 3851 otwiera sie asep- 40 45 50 55 Kolby posiewowe umieszcza sie na okres 3 dni na obracanej z predkoscia 220 obrotów na minufte wytrzasarce obrotowej o 5 cm wykorbieniu. Hodow¬ le z kolb posiewowych szczepi sie 11 przewezonych kolb JMenniayera o pojemnosci po 2 litry, zawie¬ rajacych po 350 ml pozywki III, wprowadzajac po¬ siew w ilosci 2—3% w stosunku do pozywki. 65 Pozywka III dekstroza aspamagiina K2HPC4 MgS04.7H20 ekstrakt drozdzowy ?mieszanina pierwiastków sladowych Nr 2 woda destylowana ,0 g 1,0 g 0,1 g 0,5 g 0,5 g ,0 ml 1000,0 ml watttosc ptH doprowadzona NaOH do 7,2 * mieszanina pierwiastków sladowych Nr 2 FeS04 . 7 H20 MnS04 . HO CuCl2 . 2 HJO CaCl2 H3B°3 (NH4)6M07024.4H20 ZnS04 . 7 H20 woda destylowana 1,0 g 1,0 g ,0 mg 100,0 mg 56,0 mg 19,0 mg 200,0 mg 1000,0 ml85 576 27 Kolby umieszcza sie na okres 4 dni na obracanej z predkoscia 135—450 Obrotów ma (minute wytrza¬ sarce obrotowej o 5 cm wykorbieniu, ^utrzymujac temperature 28°C. Po zakonczeniu inkubacji za¬ wartosc kolb miesza sie razem i .poddaje badaniom.Odwirowana brzeczka wykazuje 22 mm strefe za¬ hamowania (krazki o srednicy 12,7 mm) na plycie badawczej, zakazonej kultura Piroteus vulgairis. Pro¬ dukt stanowi antybiotyk 810 A, to jest mieszanina kwasów 7P-(D-5namiiino-5-kafl1xksywa^ -onetoksy-p-hydroksycynaim^ -7-meto- ksycefemo-3-kairbofcsylowego-4 i 7P^(D-5-amino-5-; -kamboksywaleramddo)-3H(a-metoksy-p-sulfioksycyna- moiloksyimetyilo)-7-metofcsycefemo-3^k»rbcteylowe- go-4 (wzór 1).Przyklad II. Probówke z liofilizowana kultu¬ ra Streptcmyces griseus NRRL 3851 otwiera sie aseptycznie, a zawartoscia szczepi sie skosy, opisa¬ ne w przykladzie I jako pozywka I. Skosy imkubu- je sie w temperaturze 28°C w ciagu tygodnia, a na¬ stepnie przechowuje w temperaturze 4°C. Czescia hodowli na jednym ze skosów szczepi sie przewe¬ zona kolbe Erlenmayera o pojemnosci 250 ml, za¬ wierajaca 50 ima pozywki M, opisanej w przykla¬ dzie I. Zaszczepiona pozywke iinkubuje sie w tem¬ peraturze 28°C w ciagu 2 dni, na wytrzasarce obro¬ towej z 5 om wykorbieniem, obracanej z predkoscia 220 obrotów na minute. Nastepnie posiew przemywa sie aseptycznie odwkowuje grzybnie, zlewa ciecz .pofermentacyjna, zawiesza grzybnie w takiej samej Objetosci fizjologicznego roztworu soli, ponownie odwirowuje i zawiesza w 0,9% roztworze chlorku sodowego. (Przemyta grzybnie szczepi sie (posiew w ilosci 2%) 2 przewezone -koliby Erlenmayera o pojemnosci 250 ml, zawierajace po 50 ml pozywki produkcyjnej, wyjalawianej w temperaturze 120°O w ciagu 15 minut. Pozywka produkcyjna ma na¬ stepujacy sktad: Pozywka produkcyjna L-prolina 15,0 g ^Mceryna 20,0 g sacharoza 2,5 g glutaminian jednosodowy 1,5 g NaOl 5,0 g K,HP04 2,0 g OaClt 0,4 g MnCl^HjO 0,1 g FeCIl-6H10 0,1 g ZnCli 0,05 g MgS04.7H,0 1,0 g woda destylowana 1000,0 mi wartosc pH (niekorygowana) = 7,1.Kolby produkcyjne umieszcza sie na okres 4 dni na wytrzasarce obrotowej z 5 cm wykorbieniem, obracanej z predkoscia 220 obrotów na minute, utrzymujac temperature 28PC. Zawartosc odwiro¬ wuje sie, a ciecz pofermentacyjna bada metoda krazkowo-plytowa. Na krazkach o srednicy 0,5 cala, strefa zaheropwenia po 3 dniach inkube&ji wynosi 21 mm, a po 4 dniach 26 mm. Produkt stanowi an¬ tybiotyk aio a.Przyklad III. Wytwarzanie antybiotyku 810 A i rozdzial na skladniki, Stadium A. Hodowla. 13 40 45 55 60 28 Etap 1. Zawartosc probówki z liofilizowana kul¬ tura Streptomyces griseus NRRL 3851 miesza sie z 2 ml pozywki I, opisanej w przykladzie I, po czym otrzymanym posiewem szczepi sie skosy z tej samej pozywki. Skosy inkubuje sie w temperaturze 28°C w ciagu 5 dni, wzglednie do osiagniecia in¬ tensywnej sporulacji, a nastepnie do skosów doda¬ je sie po 10 ml pozywki VIII.Pozywka Vm wyciag miesny NiaCl NZ Amme dekstroza wartosc pH =' 7,0. 0,3% 0,5% 1% 1% Wzrost z kazdego ze skosów zeskrobuje sie do po¬ zywki, a otrzymana zawiesine uzywa sie jako .po-, siew w etapie 2.Etap 2. Zawiesina, otrzymana w etapie 1, szczepi sie przewezona kolbe Erlenmayera o< pojemnosci 250 ml, zawierajaca 50 ml wyjalowionej pozywki VIII. Zaszczepiona kolbe umieszcza sie na okres 48 godzin na wytrzasarce obrotowej, obracanej z predkoscia 220 obrotów na minute, utrzymujac temperature 28°C Etap 3. Hodowla z etapu 2 szczepi sie kolbe Erlenmayera p pojemnosci 2 litrów, zawierajaca 500 ml pozywilei VIII, opisanej w etapie 1. Zaszcze¬ piona ktolbe umieszcza sie na wytrzasarce obrotowej, obracanej z predkoscia 220 obrotów na minute i in¬ kubuje sie w ciagu 48 godzin w (temperaturze 28°C.Etap. 4 500 ml hodowli z etapu 3 stosuje sie do zaszczepienia zbiornika fermentacyjnego ze stall kwasoodjpornej o pojemnosci 760 lutrów, zawieraja¬ cego 407 litrów wyjalowionej pozywki VIII (opisa¬ nej w etapie 1). Fermentacje prowadzi sie w ciagu 65 godzin w temperaturze 26°C, mieszajac z pred¬ koscia 130 obrotów na minute i przepuszczajac po¬ wietrze z predkoscia 0,28 m* na minute. W celuj zapobiezenia nadmiernemu pienieniu, w czasie fer¬ mentacji dodaje sie w malych ilosciach srodek prze¬ ciwko pienieniu Polyglycol 2000.Etap 5. 400 liitrów hodowli z etapu 4 stosuje sie do szczepienia zbiornika fermentacyjnego ze stali kwasoodpomej o pojemnosci 6000 laltrów, zawiera¬ jacego 4600 litrów pozywki IX.Pozywka IX wyciag riamoku kukurydzianego 4% dekrtroza 2% wartosc pH doprowadzono NaOH do 7,2.(Fermentacje prowadzi sie, mieszajac zawartosc zbiornika z predkoscia 120 obrotów na minute, przepuszczajac powietrze iz predkoscia 1,5 m* na minute, w ciagu 30—36 godzin, w temperaturze 28°C. W celu zapobiezenia nadmiernemu pienieniu w czasie fermentacji dodaje sie w malych ilosciach srodka przeciwko pienieniu Polyglycol 2000. Po 31 godzinach fermentacji krazki o srednicy 12,7 mm wysycone brzeczka daja na plytkach zakazonych kultura Piroteus vuftgaris MBh836 strefe zahamowa¬ nia o srednicy 3(2,5 mm.Stadium B. Wyosahnianie kompleksu antybiotycz*85 57Ó te nego 810 A. Po 36 godzinach. fermentacji brzeczke ze stadium A, etapu S zakwasza sie w zbiorniku fermentacyjnym kwasem fosto^wym, doprowadza¬ jac wartosc pH do 3 z 7—i. Grzybnie usuwa sie na prasie filtracyjnej i odrzuca, otrzymujac 4300 li¬ trów pmzeMtrowanej ibrzeczki, która przepuszcza Glie przez zloze adsorbentu — zywicy Amberlfte XAD~2 o objetosci 400 litrów z predkoscia 40 litrów na minute. Wyciek analizuje sie i odrzuca, a zloze przemywa dwiema objetosciama wody. Antybiotyk - eluuje sie z zywicy 60% wodnym roztworom meta¬ nolu, paizepuszczanyim z predkoscia 20 litrów na minute. Zbiera sie i analizuje 40 frakcji o obje¬ tosci po 20 litrów. Z polaczonych frakcji 2—40 od¬ parowuje sie metanol pod zmniejszonym cisnieniem.Wartosc pH koncentratu 1166 litrów doprowadza sie wodorotlenkiem amonu do 3,5 i koncentrat zamra¬ za sie.Pobrane próbki poddaje sie badaniom biologicz¬ nym metoda ikrajzkowo-plytowa, stosujac do badan szczep Proteus vulgaris.Przesaczona Rzeczka. Piróby przeprowadzone z przesaczona brzeczka o objetosci 4240 litrów daja nastepujace (wartosci strefy zahamowania.Przesaczona brzeczka Rozcienczenie 1:2 .1 :4 1 :8 Wielkosc strefy zahamowania 26,8 mm 23,8 imm 21,1 mm | Wyciek i popluczyny. 10 frakcji po 400 Mtrów wykazuje wartosci zerowe ibez rozcienczenia. War¬ tosc zerowa wykazuja równiez popluczyny.Frakcje eluatu. Przebadano wszysflcie frakcje.Srednice stref zahamowania zestawione sa ponizej.| Frakcje eluatu | Frakcja 1 2 3 4 ¦ 6 7 8 9 1 - 10 ' ¦ U 12 ¦ .13- . 14 - 16 17 18 19 : < ' Wielkosc strefy 0 '28 mm 34 '36 36. 36 06 ¦38 "36 36 38 '40 r37 36 137 r38 86 36 ""*' 315 Frakcja 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 33 34 36 37 38 39" 40 ' Wielkosc strefy 03 mm * 33 34 34 33 \ ** ' ** 33 32 92 132 1 30 -28 27 -28 26 26 : -26 1 39 Eluat 1 koncentrat eluatu. Zbadano równiez eluat (780 litrów) i koncentrat eluatu (166 litrów), za¬ wierajace antybiotyk 810 A.Rozcien¬ czenie . 1 :5. ' .. 1 :10 1:20 1:40 Wielkosc strefy 28,8 mm 27,0 mm 03,8 mm £1,0 mm Rozcien¬ czenie 1 :16 1:32 Wielkosc strefy 27,25 mm 24,5 mm Oznaczenie suchej masy Przesaczona brzeczka 119 kg 780 litróweluatu 7,23 kg 166 litrów koncentratu eluatu 7,20 kg Studium C. Adsorpcja na zywicy anionitowej. 83 litry koncentratu ze Stadium 8 rozciencza sie woda do objetosci 124 Jotiry i przepuszcza przez zlo¬ ze slabozasadowej zywicy anionitowej (Aniberliite IRA-68 w postaci chlorkowej) o objetosci 22,5 li¬ tra. Koncentrat o wartosci pH = 4 przepuszcza sie 23 przez zloze z predkoscia 8 litrów na minute. Na¬ stepnie zloze przemywa sie 46 litrami wody, po czym przeprowadza sie elucje roztworem 1 m azo¬ tanu sodu i 0,1 m octanu sodu o wartosci pH = 7,5.Zbiera sie 10 frakcji o objetosci po 20 litrów, które zakwasza sie kwasem solnym do wartosci pH = 4.Wszystkie frakcje poddaje sie badaniom biologicz¬ nym metoda fcrajzfcowo-plyrtawa z zastosowaniem do badan szczepu Proteus vulgaris. Otrzymuje sie na¬ stepujace wyniki: Roztwór (zasilajacy Roz- oien- cze- nie 1:10 1:20 1:40 Wielkosc strefy 28,5 mm 26,5 mm 24 mm ;— —4 — Erekcje eluatu; rozcienczenie 1:10 | E\ra- Woja 1 2 3 4 -t Wielkosc strefy 27 mm mm 28,5 mm 26 mm 26 mm.Fra¬ kcja 6 7 8 9 40 Wielkosc strefy mm 23 mm 22 mm 21 mm 17,6 mm Dla wycieku uzyskuje sie /wartosc strefy zahamo¬ wania 25 mm bez iroejcienczeife, a dla popluczyn 23 miti bez rozcienczania.' Stadium D. Adsorpcja ma zywicy anionitowej. Po- 55 laczone firafcoje 1—40 ze stadium C, o wartosci pH 3,0 przepuszcza sie przez zloze adsorbentu Am- 7 beriite XAD-2 o objetosci 45 Jdtrów, z predkoscia litrów/min. Zloze przemywa sie nastepnie 90 li¬ trami wody, przepuszczanej z taka sama predfco- 60 sda. Nastepnie efluuje sie antybkrtyfc 25% wod¬ nym roztworem acetonu, z predkoscia 5 lJtrówAnain.Zbiera sie 16 frakcji o objetosci po 23 litry. . v Wszystkie firafccje analizuje sie metoda krazko- 05 wo-plytowa, stosujac do badan szczep Proteus wA?/?.85 57<5 31 32 garis. Dla roztworu zasilajacego (190 lalrów) uzy¬ skuje sie nastepujace srednice stref zahamowania: 1 Roztwór zasilajacy Rozcienczenie 1:5 1 :10 | 1 :20 Wielkosc strefy imm 27,5 mm 24,2 imm Srednice stref zahamowania frakcji eluatu zesta¬ wione sa w ponizszej (tablicy. 1 Eraikcje eluatu Frakcja 1 2 3 4 6 7 8 9 11 12 13 14 1 16 Roizcienczenie 1 :10 1 :10 1 :10 1 :10 ii : 10 1:10 1 :10 .1 :10 1 :10 1 :10 1:5 1 :5 1 :5 1 :5 1 :5 1 :5 Wielkosc strefy ,5 mim 29 mim 29 mim 29 ram 28 ram 27 mm i 26 ram 26 mm mim 26,5 mm 26 m 28 mim 27,5 mm imim mm 24,5 mim | Frakcje 2-16 laczy sie i odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem aceton, otrzymujac 17,4 liiteia koncentratu, którego wartosc pH doprowadza sie wodorotlenkiem amonu do wartosci 4,0. Nastepnie koncentirajt liofilizuje sie, otrzymujac 620 g amfty- bdotyiku 810 A, to jest mieszaniny kwasów 70-(D-5- -amiinD-S-kairfboto -3-)(a-metofcsy^p-sulr foksycynamoiloksytmetylo)-7-m^ bdksylowego-4 i 7P-.(D-5Hamino-5^karboksywaieriami- do)-3-(a-metdksy-p^hydax)Qnsy«y!naimoiloksymetylo)-7- -metoksycefemo^^k^rljoksylowego^. Suchy pirodiulklj daje przy stezeniu 320 pg/ml strefe zahamowania o srednicy 25 ram.Stadiom E. Kwas 7Pn((D-5Haimiino-5-lkattibok!sywaile- ramido)-3H(a-metoksy-p^ydiio(ksyeyinan^ lo)-7nme1x)lkisytcefemo-3^adx)!ksylowy-4.Kolumne chrornaix)gDa£iC23na o srednicy 2,5 cm napelnia sie do wysokosci 100 cm zywica amonito¬ wa DEAE Sephaidex' A-25. Stosuje sie uklad elu- ujacy 0,5 m bromku amonu -|- 0,05 m kwasU octo¬ wego. 10,0 g kompleksu anitybiotyiczmego 810 A, otaymanego w stadium D, rózpuszcza sie w 18 ml itego ukladu i wprowadza ma kolumune. Roztwór elu- ujaey p^epompowruje sie przez zloze z predkoscia 18 ml/gocMne, odbierajac autanaityaznie frakcje o objetosci 10 mi. Strumien eluaiu kontroluje sie refraktometrem (róznicowym. Zapite irefrakitometryicz- my wykazuje maksima masowe dlia próbek 19, 36, 79, 109 i 206. Co trrccia frakcje poddaje sie bada¬ niom biologkazmym metoda fcrazkowo-plytowa z uzyaiem kultury Proteus vulgaris (MB-838), sto¬ sujac krazki o srednicy 12^7 mm, wysycone bufo- irem o wartosci pH = 7. W ponizszej (tablicy zesta¬ wione sa srednice stref zahamowainia (dla frakcji 1—66 otrzymano waiiitosci zerowe). 1 Rrakcja r - 69 72 75 78 81 83 86 89 92 95 98 101 104 107 110 113 116 119 122 125 128 131 134 137 140 150 160 170 180 183 186 189 192 195 198 201 204 207 210 - 213 216 219 (222 225 228 231 234 237 240 243 246 249 252 | Srednica strefy"" 18 mm 24 26 31 — 37 38 38 40+ ¦ 40+ 40+ 40+ 40+ 40+ 40 38 33 29 28 27 26 24 21 18 29 38 40 40+ 40+ 40+ 40+ 40+ 40+ 40+ 40+ 40+ 40+ 40 38 32 31 27 24 23 19 17 0 o 1 Laczy sie frakcje 80—133 oraz frakcje 170—230.Powtarza sie powyzszy sposób rozdzialu i laczy sie frakcje 82—130 oraz 180—234. 40 45 50 55 6086«» 33 W Laczy sie frakcje z obu rozdzialów, zawierajace pierwszy aktywny skladnik i (przepuszcza przez zloze zywicy Amiberlite XAD-2 o objetosci 100 ml.Zloze przemywa sie jedna objetoscia wody, a na¬ stepnie eluuje 90% iroztworem wodnym metanolu.Metanol odparowuje sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem, a wodny koncentrat liocCiilaizuje sie. Otrzy¬ muje sie 810 mg produkitu izadentyffiik0wianego jako kwas 7B-*(D-5HaminOn5^kaa±iokB^ -3-(a- Hmetoksy-p-hydrofcsycynamri -7-meto- ksycefemo-3-kairboksylowy^4. Aktywnosc produktu okreslona metoda kirazkowoiplyitowa w stosunku do Proteus vulgaris wynosi 18 g/ml roztworu, dajacego strefe zaihaniowanua o srednicy 25 mm. Produkt charakteryzuje sie nastepujacymi wskaznikami ab¬ sorpcji w nadfiolecie: roztwór w 0,1 n HOl Xmax 305 m^ e}% om 524 roztwór wJ[ln NaOH Xmax 328 mu e{% cm 564 Stadium F. Kwas 7P-(D^Hamdno-5-kiafl^bokisywa- leramddo) -3-(anmetoksyip-sulfoteycynamoiiloksyme- tylo)-7nmetok&ycefemo^-karb^ Frakcje z rozdzialu na adsorbencie Sephadex A-25, zawierajace drugi aktywny skladnik, laczy sie i przepuszcza przez zloze zywicy Airiberliite XAD-2 o objetosci 100 ml. Zloze przemywa sie 1 objetoscia wody, a nastepnie eluuje 3 otojetosciaimi 90% wod¬ nego (roztworu metanolu. Laczy sie bogate w sklad¬ nik eduaty i odparowuje z nich pod próznia meta¬ nol. Wodny koncenitrat liofiliauje sie otrzymujac 720 mg kwasu 7|3-CD-:5-amiino-5-tejarbo(^^ do)-3-(a-meloksyHp-sulfoksycytna^^ -metokBycefemo-3-karbcteyaowego-4 (Ic). Produkt charakteryzuje sie nastepujacymi wiskaznakami Ab¬ sorpcji w ultrafiolecie: roztwór w 0,1 n HC1 Xmax 287 m\k e{% cm 432 roztwór w 0,1 n NaOH Xmax 280 m^ E*% om 432 Przyklad IV. Wydzielenie z kompleksu anty- biotycznego kwasu 7P- ramido)-3j(a-metoksyip-sul^ lo)-7-metoiksycef€mo-3Jkia(r1boks^ g kompleksu antybiotycznego 810 A z przy¬ kladu XII, Btadaflim D, «wwtera4^ce«o kra©sy 7p-(D-5- ^amijiuHS-tainbofcayw^ fctaycynamoilc&Bym boksylowy-4 walerainido)-3-(a^metoksy-p-hydrctoycynamoiloksy- metylo)-7~m€tolkByce£emo-3~k^ rozpusz- cza sie w 200 ml wody i wartosc pH (roztworu do¬ prowadza sie do 3,5. Roztwór przepuszcza ma pnzez; 200 ml zloza zywicy andonitowej Amlberlite HLA-88 w postaci chlorkowej, po czym izloze przemywa sie 300 ml wody. Elucje zloza praeprowadiza sie 1% (objetoscdbwo) roztworem wodnym kwasu mrówko¬ wego. Nastepnie przez zloze przepuszcza sie 2 por¬ cje TOBCóencaonegp kwasu solnego (pH =0,95). Roz¬ twór zasilajacy, wycieki, popluczyny i eluaity 1, 2 i a anatolje .sie roetoda <*kktro£orezy ma batalie (pH = 4,0, prad stoly o napieciu 1000 V przywozo¬ ny na okres 1 glodzony). Eletatrotoregrarn suszy sie i wystawila na dzialanie par amoniaku w celu zo¬ bojetnienia kwasu, po czym aintaubuje sie na plycie z agarem zakazonym kultura Proteus vul@atris (MB-838). Po inkubacji w ciagu 17 godzin w tem¬ peraturze 37°C stwierdza sie obecnosc dwóch stref zahamowania wzrostu szczepu testowego (przesu¬ niecie w kierunku anody) w przypadku roztworu zasilajacego, jednego tyfbko skladnika (wolniej we¬ drujacego) w przypadku wycieku i eluaitu kwasem mrówkowym i jednego skladnika (szybciej wedru¬ jacego) w przypadku drugiego eluaitu kwasem sol¬ nym. W ponizszej tabeli przedstawione sa dane do¬ tyczace ilosci suchej masy i oznaczen biologicznych.Roztwór izasilajacy Wyciek + popluczyny Eluat kjwa- sem mrów¬ kowym I eluat kwasem solnym 2 eluat kwasem solnym Masa g 11*15 g 4,52 g — V0g Obgelosc 1200 ml i500 ml 1000 ml 500 ml 500 ml Biolo¬ giczne jednostki suma ¦ 60,000 7,500 ,000 1,000 ,000 Pro¬ dukty) la i Ib Ib Ib ^ — la Z powyzszych frakcji wydziela sie kwas 7P-(D-5- -amino-5^ka'rix)ksywaleiiamido)-3-(a-metctey-P-sul- foksycynamoiloksymetylo)-7-mefcoksyoelemo-3-kar- boksylowy-4 (Ic) o wysokiej czystosci, droga adsorp¬ cji na zywicy Amberlite XAD-2 i elucji 50% roz¬ tworem wodnym metanolu.Przyklad V. Wydzielenie z kompleksu anty- biotyoznego 810 A kwasu 70-(D-5-amiitt-54cartoksy- waleramddo)-3-(a-metcteynp-sulfoksycynamodlokB^ metylo)-7Hn^toksycefemo-3-ka^boksylowe@o-4. ,0 g kompleksu antybiotycznego z przykladu III stadium D, zawierajacego kwasy 7P-(D-5^amdno-5- -karfook&ywaleTamiido)-3-(a-meio(kisy^HsulIoksycyna- moilokisymetylo)-7Hmetoflosycefemo-3- i 70-(D-SHamgno-e-kartodksywaleramicto^-3-(a-meto- ksy-p^hydroksycynamodi^^ -7-metotasycefe- mo^34oarboksylowy-4 rozpuszcza sie w 20 ml 20% roztworu wodnego acetonu, a wartosc pH roztworu doprowadza sie do 4,0. Roztwór przepuszcza sie przez zloze adsorbentu Amberlite XAD-2 o srednicy 5 cm i wysokosci 100 cm w 20% roztworze wodnym ace¬ tonu. Taki sam (roztwór przepompowywuje sie na¬ stepnie prtoez zloze z predkoscia 880 ml/^odzine, od¬ bierajac auticffftatycznie frakcje o objetosci 20 ml.Co trzecia frakcje poddaje sie badaniom biologicz¬ nym metoda krazkowonolytowa z Proteus vulgairis (MB-838) jako szczepem testowym, stosujac krazki o srednicy 0,$ cm.{Srednice stref zestawione sa w ponizszej tablicy.| Frakcja 1—41 44 | 47 Srednica strefy 0 12 mm 22 19 40 45 50 55 6085 1 Frakcja 50 53 56 59 62 65 68 71 74 77 80 83 86 89 92 95 m 101 104 . -107 110 113 116 119 122 125 128 131 134 137 140 143 146 149 152 155 158 161 164 167 170 173 .176 179 182 185 188 191 194 197 200 203 206 209 212 ais 210 221 224 227 (230 Srednica strefy 29 31 28 27 24 21 19 16 14 13 13 13 13 14 13 13 11 9 8 8 8 0 0 0 8 11 13 13 16 17 18 17 18 21 21 21 21 22 23 23 23 .22 24 24 .24 24 24 19 18 18 18 17 36 Frakcja 233 236 239 242 245 248 251 254 257 260 263 266 269 272 275 278 281 284 287 290 293 296 299 302 330 | Srednica strefy 17 14 14 14 13 13 12 12 12 11 11 1(P 9 8 0 0 0 0 0 aeno 1 Laczy isiie frakcje 44—90 i pod zmniejszonym cisnienieni odpairoiwuje sie aceton, a widdny koncen¬ trat liofilizuje sie, otrzymujac 3,3 g surowego kwa¬ su 7|3-(iD-5Hamiino-5Hkariboksyrwale(riainMo) -3- (a-meto- ksy-p-sulfoiksycynamoiloksymetylo)-7Hrne'tO(ksycefe- mo-3-kiarboksylowego-4 o wzorze 2.W podobny sposób iz polaczonych frakcji 150— 225 otrzymuje sie 700 mg 'kwasu 7|3- -ikarboksywaleramido)-3-(a-rnetoksy-p-hydroksycy- namoil'oksymetylo)-7-metoksycefemo-3Jkarboksylo- wego-4.W powtórnym irozdziale otrzymuje sie 3,1 g su¬ rowego kwasu 7p-(D-5namioiJo-5Hkarboiksywaleramii- do)-3- (a-metoksy-pnsiuMoiksycyniamoiloIksyTneftylo) -7- -meto'ksycefeimo-3-kar'bo!ksylowego-4 (Ic) i 400 mg kwasu 7(3- (D-5-amino-5-kariboksywaleraniido)-3- ( -metoksy-p-hydroksycynamoiloksymetylo)-7-meto- ksycefemo-3-karbóksylowego-4.Polaczone porcje 6,4 g kwasu 7|3-'(D-5Hamino-5- -kai7bdksywaleramido)-3-!(a-m moiloiksymetylo)-7-meto^^ go-4 marnosi sie na zloze adsorbentu AmberMte XAD-2 w 5% roztworze wodnym metanolu (sred¬ nica 5,7 cm, wysokosc 100 cm). Przez zloze prze¬ pompowuje isie 5 % roztwór wodiny metanolu z pred¬ koscia 880 ml/goidzine, odbierajac laiutomaitycznie frakcje o objetosci 20 ml. Zbiera sie 287 frakcji, poddajac co czwarta z nich badaniom biologicz¬ nym metoda krazkowo-plytowa z Proteuis viulgarls (MBh838) ijiaiko szczepem testowym, stosujac krazkij o srednicy 6,5 mm. Wyniki pa^zedstawtibne sa w po¬ nizszej tablicy. Frakcji 1—50 nie badano.Frakcja 61 | 56 Wielkosc strefy - 23 ¦ mm 268SS7S 31 38 Frakcja 59 63 67 71 75 79 83 87 91 95 99 103 107 111 115 119 123 127 131 135 139 143 147 151 155 150 163 167 171 287 Wielkosc strefy 23 18 12 0 0 0 7 9 13 21 22 22 21 18 19 16 17 16 13 11 9 0 0 zero toksyrefemo-3-karboksylowego-4 nastepujaco: przedstawia sie Laczy sie frakcje 95—159 i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem metanol, a wodny kon¬ centrat liofilizuje sie, otrzymujac 700 mg kwasu 70- -(D^Hamino-5-tkarfeoksywaleramaidio)-3-(anmetofcsy- HP-sulfoksycynamotfoksyimetylo)-7-metoksycefemo-3- Hkarboksylowego-4 o wizorze 2. Widimo w ultrafio¬ lecie kwasu 7P-(D-5-amrno-54oarboksywaleaTamido)- -3-(a-me»to(ksyHp-siulfo^ 40 roztwór w 0,1 n HC1 Xmax 285 m^ Ej/o cim 160 roztwór w 0,1 n NaOH Xmax 277 m\i e}% cm 166 Badany metoda krazkowo-plytowa wobec Proteus vulgamis, przy krazkach o srednicy 12,7 mm, kwas 70-(D-5-amdno-5-karboksywaieraimido)-3-(a^meto- ksyHp-sulfoksycynairrwailoiksy^ mo-3-karboksylowy-4 daje strefe zahamowania o srednicy 25 mm przy stezeniu 88 |i/ml, a kwas 70- -(D-5^amino-5-kaa^bokisywaleaiamijdo)-3-(a-metoksy- -p-hydroksycynamoiloksymetylo)-7-metoksycefemo- -3Hkarboksylowy-4 taka sama strefe przy stezeniu 167 ng/iml. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL