Uprawniony z patentu: Merck and Co., Inc. Rahway, New Jersey (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowego antybiotyku, kwasu 7P-[D-5-amino-5-karboksywaleramido]- 3-karbamoiloksymetylo-7-metoksycefemo-3-karboksylowego-4 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowego antybiotyku, kwasu 7p-/D-5-amino-5- -karboksywaleramido/-3-karbamoiloksymetylo-7- -metoksycefemo-3-karboksylowego-4 o wzorze 1, zwanego w dalszej czesci opisu antybiotykiem 842A, jak równiez soli tego antybiotyku.Zwiazek o wzorze 1 jest pod wzgledem budowy spokrewniony ze zwiazkami szeregu cefalosporyn, lecz w odróznieniu od cefalosporyny C, która w po¬ zycji 7 pierscienia cefemowego ma jedynie grupe D-5-amino-5-karboksywaleramidowa, w zwiazku o wzorze 1 w pozycji 7 znajduje sie takze grupa me- toksylowa. W pozycji 3 cefalosporyna zawieraNgru- pe acetoksymetylowa, natomiast zwiazek o wzorze 1 ma w tej pozycji grupe — CH2OOCNH2.Sposobem wedlug wynalazku, antybiotyk 842 A otrzymuje sie w drodze hodowli w wodnych po¬ zywkach w kontrolowanych warunkach aerobo- wych nowego szczepu z gatunku Actinomycete, nazwanego Streptomyces lactamdurans, zdeponowa¬ nego w Northern Utilization Research and Deve- lopment Branek of the U.S. Department of Agri- culture, Peoria, Illinois, Stany Zjedn. Am. pod numerem NRRL 3802.Antybiotyk 842 A wykazuje aktywnosc w sto¬ sunku do mikroorganizmów Gram-ujemnych wie¬ ksza od aktywnosci znanych antybiotyków szeregu cefalosporyny. In vivo jest on aktywny w stosunku do takich bakterii, jak Proteus morganii, Escheri- 10 15 20 25 chia coli, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Sal¬ monella schottmuelleri, Klebsiella pneumoniac AD, Klebsiella pneumoniae B i Paracolobactrum arizo- niae. Poza tym antybiotyk 842 A jest w porównaniu ze znanymi antybiotykami takimi, jak cefalotyna, znacznie odporniejszy na rozkladowe dzialanie ce- falosporynaz i cechuje go niska toksycznosc oraz zdolnosc szybkiej akumulacji we krwi. W ciagu 6 godzin po wprowadzeniu do organizmu antybio¬ tyk ten jest prawie calkowicie wydalany z moczem.Poza tym antybiotyk 842 A chroni przed infekcjami Paracolobactrum arizoniae 3270, Proteus vulgaris 1810 i Salmonella schottmuelleri 3010, a wprowadzo¬ ny podskórnie jest 2—10 razy skuteczniejszy, niz cefalotyna, w zwalczaniu tych bakterii.Zwiazek o wzorze 1 stanowi równiez produkt wyjsciowy do wytwarzania zwiazków o wzorze 2, w którym R oznacza grupe wodorotlenowa, acylo- ksylowa lub karbamyloksylowa. Zwiazki o wzorze 2 maja równiez cenne wlasciwosci antybiotyczne.Do hodowli, prowadzonej sposobem wedlug wy¬ nalazku w celu otrzymania antybiotyku 842 A, stosuje sie nowy szczep z gatunku Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 z gatunku Actinomycete, wyodrebniony z gleby w postaci pojedynczej kolo nii na agarze skosnym i wyhodowany na pozywce o nastepujacym skladzie: ekstrat drozdzowy 10,0 g glikoza 10,0 g 82 9033 fosforanowy roztwór buforowy 2 ml MgS04.7H2O 0,05 g woda destylowana 1000 ml wartosc pH=6,5 Stosowany tu fosforanowy roztwór buforowy ma sklad nastepujacy: KH2PO4 91,0 g Na2HP04 95,0 g woda destylowana 1000 ml Po kilku dniach hodowli stwierdzono brak spo- rulacji. Mikroorganizm wytwarzal antybiotyk, któ¬ ry róznymi metodami biologicznymi i chemicznymi porównano ze znanymi antybiotykami stwierdza¬ jac, ze antybiotyk 842 A jest antybiotykiem nowym. 842 A. Taksonomia. Szczep Streptomyces lactam- durans NRRL 3802.Poslugiwano sie taksonomia opisana w „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", wydanie VII i w „The Actinomycetes" vol. 2, „Classification, Identification and Description of Genera and Spe- cies" S.A. Waksman (1961). Stosujac powyzsza pro¬ cedure stwierdzono, ze szczep nalezy do rodzaju Streptomyces i ma wiele cech znanych gatunków Streptomyces fradiae. Biochemicznie odpowiada im zasadniczo w sposób doskonaly, jednak znacznie rózni sie morfologicznie. Np. barwa grzybni powie¬ trznej S. fradiae jest rózowa, podczas gdy hodowla NRRL 3802 ma zwykle barwe kremowa. Równiez wegetatywny wzrost szczepu NflRL 3802 wykazuje róznice w pigmentacji na róznych pozywkach i, jak stwierdzono ponizej, nie sporuluje na zwyklych pozywkach taksonomicznych. Na podstawie tych róznic szczepowi nadano odrebna nazwe: Strepto¬ myces lactamdurans. W tablicy 1 przedstawiono wlasnosci biochemiczne Streptomyces lactamdurans i znanych szczepów Streptomyces fradiae. Dane przedstawione w tablicy 1 zostaly odczytane po trzy¬ tygodniowej inkubacji w temperaturze 28°C, chyba ze zaznaczono inaczej. Stosowane w badaniach po¬ zywki byly w przyblizeniu obojetne, ich wartosc pH wynosila 6, 8—7, 2. Testy fizjologiczne przepro¬ wadzano po 7 i po 21 dniach hodowli.Tablica 1 Antybiotyk 842 A. Porównanie biochemiczne Próba grzybnia powietrzna konidia rozpuszczalny pigment optymalna temperatura inwertaza redukcja azotanów uplynnianie zelatyny utylizacja celulozy mleko lak¬ musowe Streptomyces lactamdurans prosta, nieco rozgaleziona nie wykryto brak 23°C ujemna ujemna dodatnie ujemna alkaliczna peptonizacja Streptomyces fradiae prosta, wlóknis- cie rozgaleziona paleczkowate brak 25°C ujemna ujemna dodatnie ujemna alkaliczna peptonizacja 2 903 4 Antybiotyk 842 A. Morfologia.W kulturach na pozywkach wymienionych w opisie charakterystyk nie wykryto sporofor, pomi¬ mo prowadzenia obserwacji w ciagu 8 tygodni. 5 Stwierdzono jednak obecnosc dlugich wlókien, wie¬ lu z nich segmentowanych na podjednostki o róznej wielkosci, wiekszosc z nich o wymiarach 0,9x1,7 u..Grzybnia powietrzna jest krótka, prosta, malo rozgaleziona. Mniej wiecej tej samej wielkosci, co j!0 grzybnia wegetatywna, szerokosci 0,9u,. Lekka, pudrowata, latwo daje sie zdrapac.Grzybnia wegetatywna jest Gram-dodatnia, nie jest kwasoodporna. Przylega do agaru, a w przypad¬ ku niektórych pozywek jest w nim pograzona. W 35 przypadku hodowli w kolbach na wytrzasarce wy¬ stepuje nieznaczna fragmentacja na paleczki. Grzy¬ bnia wegetatywna z naczyn wytrzasanych i z po¬ zostawionych w spoczynku kolb (pozywka posie- wowa, 4—6 dób, temperatura 28°C) wykazuje obec- 20 nosc „paczków" oraz krótkich, zgrubialych, prawie maczugowatych segmentów na grzybni, lecz twory te sa nieliczne, a ich znaczenie, jezeli jakiekolwiek one posiadaja, nie jest znane.Agar z pasta pomidorowa i maka owsiana. 25 Wzrost wegetatywny — spód o barwie pomaran¬ czowej, plaski, o suchym wygladzie, pomarszczony.Grzybnia powietrzna — rzadko rozsiana, o barwie kremowej. Brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar Czapek-Doxa. 30 Wzrost wegetatywny — plaski, o barwie ciemno- -kremowej. Grzybnia powietrzna — pudrowata, o barwie kremowo-bialej. Brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar z gliceryna i asparagina. 35 Wzrost wegetatywny — plaski, spód o barwie zloto-zóltej do pomaranczowej. Grzybnia powie¬ trzna — pudrowata, o barwie kremowej z odcie¬ niem jasnobrzoskwiniowym. Rozpuszczalny pig¬ ment — barwa jasnobursztynowa. 40 Agar z albumina jaja.Wzrost wegetatywny — plaski, barwa kremowa do zóltej. Grzybnia powietrzna — pudrowata, bar¬ wa kremowa. Brak rozpuszczalnego pigmentu.Agar z jablczanem wapnia. 45 Wzrost wegetatywny — plaski, spód o barwie zóltej z brzegami o barwie pomaranczowej. Grzy¬ bnia powietrzna — pudrowata, o barwie bialej do kremowej, brzegi o barwie brzoskwiniowej. Brak rozpuszczalnego pigmentu. 50 Agar odzywczy z tyrozyna.Wzrost wegetatywny — plaski, barwa brazowa do pomaranczowej. Grzybnia powietrzna — rzadko rozsiana, barwa kremowa z bialym. Bcak rozpusz¬ czalnego pigmentu. Rozklad krysztalów tyrozyny. 55 Agar z melasa i hydrolizatem drozdzy.Wzrost wegetatywny — plaski, spód o barwie pomaranczowej. Grzybnia powietrzna — pudrowata, barwa kremowo-biala. Brak rozpuszczalnego pig¬ mentu. 60 Agar odzywczy.Wzrost wegetatywny — plaski, barwa zloto-zólta.Grzybnia powietrzna — pudrowata, barwa kremo¬ wa. Brak rozpuszczalnego pigmentu.Mleko lakmusowe.G5 Rzadko rozsiany pierscien wzrostu — wzrost we-5 82 903 6 getatywny o barwie brazowej — brak grzybni po¬ wietrznej.Peptonizacja: odczyn alkaliczny.Wartosc pH= 7,3 — 7,4 (wartosc pH próby kontro¬ lowanej — 6,7).Odtluszczone mleko.Rzadko rozsiany pierscien wzrostu — barwa bra¬ zowa do pomaranczowej. Wzrost wegetatywny — brak grzybni powietrznej. Peptonizacja — odczyn alkaliczny. Wartosc pH=7,2 (pH próby kontrolowa¬ nej — 6,6).Agar z odtluszczonym mlekiem.Wzrost wegetatywny — plaski, barwa pomaran¬ czowa. Grzybnia powietrzna — umiarkowanie ob¬ fita, barwa kremowa do jasnokoralowej. Rozpusz¬ czalny pigment o barwTie jasnobrazowej. Hydroliza kazeiny.Skos zelatynowy.Rzadki, o barwie kremowTej do pomaranczowej wzrost wegetatywny zawieszony w calej objetosci probówki. Brak rozpuszczalnego pigmentu. Calko¬ wite uplynnienie.Agar odzywczy z zelatyna.Wzrost wegetatywny — plaski, o barwie poma¬ ranczowej. Grzybnia powietrzna — rzadko rozsiana, pudrowata, o barwie kremowej. Brak rozpuszczal¬ nego pigmentu. Uplynnianie zelatyny.Agar odzywczy ze skrobia.Wzrost wegetatywny — plaski, o barwie poma¬ ranczowej. Grzybnia powietrzna — rzadko rozsiana, o barwie rózowo-kremowej. Brak rozpuszczalnego pigmentu. Umiarkowana hydroliza skrobi.Syntetyczny agar skrobiowy.Wzrost wegetatywny — plaski, spód o barwie kremowej z krawedziami o barwie pomaranczowej.Grzybnia powietrzna — pudrowata, o barwie bialej z krawedziami o barwie brzoskwiniowej. Brak roz¬ puszczalnego pigmentu. Umiarkowana hydroliza skrobi.Agar Loefflera z osoczem krwi.Wzrost wegetatywny — barwa kremowa do po¬ maranczowej. Grzybnia powietrzna — brak. Brak rozpuszczalnego pigmentu. Uplynnianie nie wyste¬ puje.Agar z peptonem, zelazem i ekstratem drozdzo¬ wym.Wzrost wegetatywny — barwa kremowa. Grzy¬ bnia powietrzna — rzadko rozsiana, o barwie bia¬ lawej. Brak rozpuszczalnego pigmentu.Wzrost mikroaerofilny.(Ekstrat drozdzowy z dekstroza, skos o glebo¬ kosci 40 mm). Dobry wzrost na górnej 1/4 powierz¬ chni skosu. 5 Temperatura — skosy dekstrozowe z ekstraktem drozdzowym.Dobry wzrost w temperaturze 28°C. Rzadko roz¬ siany wzrost w temperaturze 37°C. Brak wzrostu w temperaturze 50°C. i© Agar z ekstratem drozdzowym i dekstroza.Wzrost wegetatywny — plaski, . o barwie zloto- -zóltej. Grzybnia powietrzna — pudrowata, o bar¬ wie kremowej do jasnorózowej. Brak rozpuszczal¬ nego pigmentu. 15 Skos ziemniaczany.Wzrost wegetatywny — suchy, plaski, o barwie kremowej do pomaranczowej. Grzybnia powie¬ trzna — rzadko rozsiana, o barwie kremowej. Brak rozpuszczalnego pigmentu. Redukcja azotanów do 2© azotynów — ujemna.Odczyty robiono po 3 tygodniach inkubacji w temperaturze 28°C, chyba ze zaznaczono inaczej.Testy fizjologiczne przeprowadzano po 7 i 21 dniach.Róznice morfologiczne miedzy Streptomyces lac- 2D tamdurans i Streptomyces fradiae przedstawiono w tablicy 2. Obserwacje przeprowadzano na po¬ zywkach podanych w tablicy 2, po 1, 3 i 8 tygod¬ niach hodowli. Grzybnia powietrzna S. lactamdu¬ rans jest krótka, z nielicznymi rozgalezieniami. Jest 30 tych samych rozmiarów, co grzybnia wegetatywna, to jest szerokosci 0,9. Jest lekka, pudrowata i latwo daje sie zeskrobac. Grzybnia wegetatywna jest Gram-dodatnia, nie jest kwasoodporna. Przylega do agaru, a w przypadku niektórych pozywek jest 35 w nim pograzona. W przypadku hodowli w kolbach na wytrzasarce wystepuje nieznaczna fragmentacja na paleczki. Grzybnia wegetatywna z wytrzasanych i pozostawionych w spoczynku kolb (pozywka po- siewowa, 4—6 dób, temperatura 28°C) wykazuje 40 obecnosc „paczków" oraz krótkich, zgrubialych, prawie maczugowatych segmentów na grzybni, lecz twory te nie sa liczne. Podane w tablicy 1 odczyty robiono po 3 tygodniach inkubacji w temperaturze 28°C, chyba ze zaznaczono inaczej. Stosowane w 45 badaniach pozywki byly prawie obojetne, ich war¬ tosc pH wynosila 6,8—7,2. Testy fizjologiczne prze¬ prowadzano po 7 i 21 dniach. Uzyte w opisie okre¬ slenia barw sa zgodne z definicjami podanymi w „Color Harmony Manual" wydanie IV (1958), Con- 50 tainer Corporation of America.Tablica 2 Antybiotyk 842 A. Porównanie morfologiczne Streptomyces lactamdurans i Streptomyces fradiae Pozywka 1 Agar Czapek-Doxa Streptomyces lactamdurans 2 Wzrost wegetatywny: plaski, o bar¬ wie ciemno- kremowej Grzybnia powietrzna: pudrowata, o barwie kremo- wo-toialej Brak rozpuszczalnego pigmentu Streptomyces fradiae 3 Wzrost wegetatywny: bezbarwny Grzybnia powietrzna: | barwa rózowa ) ¦ ¦82 903 7 8 1 1 Agar odzywczy Agar z gliceryna i aspara- gina Agar z ekstraktem droz¬ dzowym i dekstroza Syntentyczny agar skro¬ biowy Skos ziemniaczany Skos zelatynowy 1 2 Wzrost wegetatywny: plaski, barwa kremowa do zloto-zóltej Brak rozpuszczalnego pigmentu Wzrost wegetatywny: plaski, spód o barwie zloto- -zóltej do po¬ maranczowej Grzybnia powietrzna: pudrowata, barwa kremo¬ wa z jasno- brzoskwinio- wym odcie¬ niem Rozpuszczalny pigment: barwa jasno- bursztynowa Wzrost wegetatywny: plaski, barwa zloto-zólta Grzybnia powietrzna: pudrowata, barwa kremo¬ wa do jasno- rózowej Brak rozpuszczalnego pigmentu Wzrost wegetatywny: plaski, spód o barwie kremo¬ wej z krawe¬ dziami o bar¬ wie pomaran¬ czowej Grzybnia powietrzna: pudrowata, o barwie bia¬ lej z krawe¬ dziami o bar¬ wie brzoskwi¬ niowej Brak rozpuszczalnego pigmentu Umiarkowana hydroliza skrobi Wzrost wegetatywny: suchy, plaski, barwa kremo¬ wa do poma¬ ranczowej Grzybnia powietrzna: skapa, barwa kremowa Brak rozpuszczalnego pigmentu Wzrost wegetatywny: skape platki o barwie kre¬ mowej do po¬ maranczowej, zawieszone w calej objetosci probówki Brak rozpuszczalnego pigmentu Calkowite uplynnienie 3 Wzrost wegetatywny: barwa poma- ranczowo-zól- ta Wzrost wegetatywny: barwa ciemno¬ zólta Wzrost wegetatywny: barwa ciemno¬ zólta Wzrost wegetatywny: bezbarwny Grzybnia powietrzna: barwa rózowa Wzrost wegetatywny: barwa poma¬ ranczowa Wzrost wegetatywny: barwa kremo¬ wa do brazo¬ wej82 903 9 | 1 i Mleko lakmusowe 2 Wzrost wegetatywny: Grzybnia powietrzna: Peptonizacja: pierscien wzrostu o bar¬ wie brazowej brak reakcja alka¬ liczna, wartosc pH=7,3—7,4 (kontrola war¬ tosci pH=6,7) 10 3 ' Wzrost wegetatywny: "i barwa kfemo- ; wa j ' Wykorzystanie weglowodanów.Szczep Streptomyces lactamdurans (NRRL 3802) zbadano równiez na zdolnosc do utylizacji wzgle¬ dnie przyswajania róznych weglowodanów, hodujac mikroorganizmy na zasadowej syntetycznej pozyw¬ ce (T. G. Pridham i D. Gottlieb, 1948) zawierajacej l°/o weglowodanu, w temperaturze 28°C, w ciagu 3 tygodni. W tablicy 3 przedstawiono utylizacje, wzglednie asymilacje weglowodanów przez szczep Streptomyces lactamdurans (NRRL 3802).Znaczenie symboli uzytych w tablicy 3 jest na¬ stepujace: + dobry wzrost; ± slaby wzrost; — brak wzrostu.Weglowo¬ dan glukoza arabinoza maltoza rafinoza sacharoza ksyloza mannitol laktoza mannoza Tabl 1 Kultura NRRL | 3802 1 1 ++I+ + + +- i ca 3 Weglowo¬ dan ramnoza celuloza fruktoza inozytol octan cytrynian .parafina gliceryna Kultura NRRL 3802 1 l+l | +1 +1 |+l Charakterystyka przedstawiona w tablicach 1—3 ma na celu zaklasyfikowanie szczepu Streptomyces lactamdurans NRRL 3802 wedlug klucza opisanego w „Bergey's Manual of Determinative Bacteriolo- gy", wydanie VII, str. 694 — 829 (1957) oraz w „The 15 20 35 40 Actinomycetes" vol. 2, str. 61—292 (1961). Porów¬ nanie szczególowej charakterystyki szczepu Strep¬ tomyces lactamdurans z charakterystykami zna¬ nych gatunków wykazuje, ze biochemicznie jest on podobny do Streptomyces fradiae, jakkolwiek, jak wykazano powyzej, wystepuja znaczne róznice morfologiczne, np. w zabarwieniu grzybni powietrz^ nej, która w przypadku S. fradiae ma barwe rózo¬ wa a w przypadku S. lactamdurans barwe kremowa.Ponadto wzrost wegetatywny S. fradiae wykazuje róznice pigmentacji na róznych pozywkach, nato¬ miast w przypadku S. lactamdurans nie stwierdzo- no sporulacji. Na podstawie tych róznic i charak¬ terystyki, przedstawionej w wyzej podanych ta1 blicach, mikroorganizmowi, wytwarzajacemu anty¬ biotyk 842 A, NRRL 3802 nadano nowa nazwe gatunkowa Streptomyces lactamdurans.Badania in vitro i in vivo.Biologiczna charakterystyke antybiotyku 842 A in vitro prowadzono metoda krazkowo-dyfuzyjna na plytkach z agarem. Krazki o srednicy 7 cm zwil¬ zono roztworem antybiotyku, umieszczano na po¬ wierzchni plytek Petriego, na które nalewano po 5 ml agaru odzywczego (Difco) z dodatkiem 0,2°/t ekstratu drozdzowego, z posiewem 5 lub 10 ml zawiesiny komórek hodowli posiewowej (CD=0,22 przy 660 milimikronach) na 150 ml pozywki i pro¬ wadzono hodowle w temperaturze 25°C lub 37°C w ciagu 16 godzin. Metoda ta jest opisana w pracy Cross Resistance Studies and Antibiotic Identyfi- cation, Applied Microbiology, tom 6, str. 392—398 (1958). Wyniki podano w nastepujacych tablicach.Tablica 4 Antybiotyk 842 A spectrum antybakteryjne.Aktywnosc in vitro Organizm stosowany w badaniach 1 Escherichia coli Bacillus species Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginose Serratia marcescens Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Sarcina lutea Waminki testu Posiew ml/150 ml 2 5 5 5 5 5 5 5 5 Temperatura inkubacji °C 3 25 25 37 25 25 25 25 25 Srednica strefy zahamowania mm*) Surowy 842 A 8 mg/ml 4 16 7 21 7 7 7 16 9 Wolny kwas 166u. g/ml 5 20 8 22 7 7 7 13 10 Sól sodowa ] 192n g/ml ¦ 6 18 7 24 7 7 7 18 982 903 11 12 1 Staphylococcus aureus (odporny ma sitreptany- cyne i streptotrycyne) Streptococcus faecalis Alcaligenes faecalis Brucella bronchiseptica Salmonella gallinarum Vibrio percolans Xanthomonas vesicatoria 2 5 15 5 10 10 10 5 3 37 37 37 37 25 27 25 4 7 7 22 28 20 37 12 5 11 7 27 24 21 30 19 6 10 7 7 26 25 38 17 *) 7 mm=srednica krazka (brak strefy zahamowania) Tablica 5 Antybiotyk 842 A opornosc krzyzowa; badania in vitro Szczep Escherichia coli*) Wrazliwy szczep wyjscio¬ wy odporny na: streptomycyne streptotrycyne oksymycyne pleocydyne chloramfenikol chlortetracykline oxytetracykline neomycyne tetracykline [ wiomycyne polimycyne gryzeine Warunki badania Posiew ml/150 ml 5 * 5 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5 Temperatura inkubacji °C 25 25 25 25 37 25 25 25 37 25 37 25 25 Srednica strefy zahamowania mm **) Surowy 842 A 8 mg/ml 16 14 13 13 15 13 21 20 18 16 15 23 18 Wolny kwas 166u. g/ml 20 19 14 13 18 17 20 23 17 20 16 21 21 Sól sodowa 192jx g/ml 18 16 18 17 17 16 23 24 17 20 30 7 16 *) Próby wykonane z seria szczepów E. coli izolowanych z tej samej kultury wyjsciowej a nastepnie wystawionych na dzialanie indywidualnych antybiotyków. **) 7 mm srednica krazka (brak strefy zahamowania) Tablica 5a Antybiotyk 842 A. Badania efektów specjalnych in vitro Escherichia coli W-MB-60 l(ze specjalnymi dodatkami, jak zaznaczono) Kontrola (bez dodatków) 0,1 m bufor fosforanowy — PH=5 0,1 m bufor fosforanowy — pH=7 0,1 m bufor fosforanowy — pH=9 20% plazma krwi ludzkiej *) Zywica kationitowa (Dow RT 91) lVt *) (stezenie agaru obnizone do 1% jedynie w przy¬ padku plyt z zywica) Warunki badania Posiew ml/150 ml 5 5 5 5 5 5 Temperatura inkubacji°C 25 25 25 20 25 25 Srednica strefy zahamowania mm*) Surowy 842 A 8 mg/ml 16 19 22 21 17 20 Wolny kwas 166u. g/ml 20 20 29 22 22 21 Sól sodowa 192|m g/ml 18 15 25 24 21 1813 82 903 14 Antybiotyk 842 A in vivo.Podawany myszom podskórnie antybiotyk 842 A jest na ogól aktywniejszy od cefalotyny i mniej wiecej tak samo aktywny, jak cefalorodyna, am- plicylina i chloromycetyna, w dzialaniu ochronnym przeciwko infekcjom organizmami gram-ujemnymi.Jest w stopniu godnym uwagi nietoksyczny i szyb¬ ko wydalany z moczem, w ilosci okolo 79% w cia¬ gu 4 godz.W badaniach prowadzonych in vivo antybiotyk 842 A chroni przeciwko infekcjom, wywolanym trzema gatunkami Proteus, dwoma Salmonella, jed¬ nym szczepem Escherichia coli, dwoma Klebsiella oraz przeciwko Paracolobactrum arizoniae, Aero- bacter aerogenes, Pasteurella multocida i Diplococ- cus pneumoniae E 400.Badania przeprowadzono ta sama metoda, co opisana powyzej w odniesieniu do charakterystyki in vivo antybiotyku 810 A. Wyniki przedstawiono ponizej w tablicy 5 b.Tablica 5b KH2PO4 Na2HP04 woda destylowana Organizm stosowany w badaniach Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morganii 3202 Salmonella schottmuelleri Klebsiella pneumoniae AD Klebsiella pneumoniae B Paracolobactrum arizoniae Escherichia coli Aerobacter aerogenes Pasteurella multocida Salamonella Typhosa Diplococcus pneumoniae E400 ED50 Przy wprowadzaniu podskórnym x 2 dawki w mikrogra- 1 mach 51 276 276 103 125 125 125 200 49 57 34 566 Jak wyzej wspomniano, zgodnie z wynalazkiem antybiotyk 842 A wytwarza sie na drodze aerobo- wej hodowli, w kontrolowanych warunkach, odpo¬ wiednich wodnych pozywek, szczepionych kultura Streptomyces lactamdurans NRRL 3802. Mozna w tym celu stosowac rózne pozywki, bedace zródlem wegla i azotu. Zawartosc weglowodanów i azotu zalezy od innych skladników pozywki, a przewaznie zawartosc weglowodanów stanowi 1—6% wagowych pozywki, a ilosc dostepnego azotu, w postaci jedy¬ nego zródla lub w postaci mieszaniny, wynosi zwykle 0,2—6% wagowych pozywki. Nizej podano przyklady takich pozywek, ale wynalazek nie jest ograniczony do ich stosowania. 5 Pozywka II 10 91,0 95,0 1000,0 3,0 10,0 10,0 5,0 g g g g g g g ekstrakt wolowy * Amina NZ dekstroza NaCl woda destylowana 1000,0 ml pH doprowadza sie do wartosci 7,2 za pomoca NaOH ?enzymatycznie zhydrolizowana kazeina 30 35 Pozywka III dekstroza asparagina K2HPO4 MgS04 • 7HaO ekstrakt drozdzowy * mieszanina pierwiastków woda destylowana * mieszanina pierwiastków FeS04. 7H20 MnS04. H2O CuCl2 • 2H20 CaCl2 H3BO3 (NH4) 6M07024.4H20 ZnS04. 7H20 woda destylowana Pozywka IV V8 Juice maka sojowa Staley 4S dekstroza agar woda destylowana wartosc pH=7,9 — 8,0 Pozywka V 10,0 g 1,0 g 0,1 g 0,5 g 0,5 g sladowych Nr 2 10,0 ml 1000,0 ml sladowych Nr 2 1,0 g 1,0 g 25,0 mg 100,0 mg 56,0 mg 19,0 mg 200,0 mg 1000,0 ml 100,0 ml 20,0 g 2,0 g 25,0 g 1000,0 mi 45 50 55 autolizat drozdzowy (Ardamine) glukoza * fosforanowy roztwór buforowy MgS04. 7H20 woda destylowana pH doprowadza sie do wartosci moca NaOH ?fosforanowy roztwór buforowy KH2P04 NaHP04 woda destylowana 10,0 10,0 2,0 g g ml 0,05 g 1000,0 6,5 za 91,0 95,0 1000,0 mg po- g g ml Pozywka I ekstrakt drozdzowy Difco 10,0 g glukoza 10,0 g ?fosforanowy roztwór buforowy 2,0 ml MgS04.7H2O 0,05 g woda destylowana 1000,0 ml agar Difco 25,0 g ?fosforanowy roztwór buforowy Pozywka VI wyciag z namoku kukurydzianego 60 (w odniesieniu do cieczy) 40,0 g dekstroza 20,0 g NaCl 2,5 g MgS04.7H20 0,5 g Polyglycol 2000 0,25% 66 objetosci (dodac do kazdej kolby indywidu-15 $2 90.3 1$ alnie) woda destylowana 1000,0 ml pH doprowadza sie do wartosci 7,0 za pomo¬ ca NaOH Pozywka VII L-asparagina L-histydyna DL-fenyloalanina glutaminian jednozasadowy NaCl K2HP04 CaClg • 2H20 MnS04. H20 FeS04. 7H20 ZnS04. 7H20 MgS04 • 7H20 gliceryna sacharoza woda destylowana *pH doprowadza NaOH **pH doprowadza NaOH Pozywka VIII wyciag miesny NaCl Amina NZ dekstroza * sie sie Posiew Produkcja 5,0 g 4,0 g — — 5,0 g 2,0 g 0,4 g 0,1 g 0,1 g 0,05 g 1,0 g 20,0 g 2,5 g 5,0 g 4,0 g 2,0 g 1,5 g 5,0 g 2,0 g 0,4 g 0,1 g 0,1 g 0,05 g 1,0 g 20,0 g 2,5 g 1000,0 ml ** 1000,0 ml do wartosci 7,0 do wartosci 7,1 za pomoca za pomoca 0,3 % 0,5% 1% 1% wartosc pH=7,0 Pozywka IX wyciag drozdzowy 10,0 g oleje fuzlowe 20,0 g dekstroza 10,0 g woda destylowana 1000,0 ml wartosc pH=7,0 Pozywka X maka sojowa Staley 4S 30,0 g oleje fuzlowe 7,5 g glukoza 20,0 g NaCl 2,5 g CaCOa (po nastawieniu wartosci pH do 7,0) woda destylowana 1000,0 g Pozywka XI autolizat drozdzowy (Amber Yeast 300) 10,0 g oleje fuzlowe 20,0 g woda destylowana 1000,0 g wartosc pH=7,0 Hodowle prowadzi sie w temperaturze 20—37 UC.W celu uzyskania optymalnych wyników pozadane jest utrzymywanie temperatury 24—32°C. Wartosc pH pozywki do hodowli Streptomyces lactamdu- rans NRRL 3802) i wytwarzania antybiotyku 842 A winna wynosic okolo 6,0—8,0.Na mala skale hodowle antybiotyku 842 A ko¬ rzystnie jest prowadzic, szczepiac odpowiednia po- 10 15 30 25 35 50 55 60 65 zywke kultura wytwarzajaca antybiotyk i nastepnie utrzymywac ja w stalej temperaturze okolo 28°C, na wytrzasarce, w ciagu kilku dni. Po zakonczeniu inkubacji usuwa sie grzybnie, a plyn pofermenta¬ cyjny poddaje sie badaniom.W praktyce hodowle prowadzi sie w wyjalowio¬ nym naczyniu, przeprowadzajac posiew jedno-, dwu-, trzy lub czterokrotnie. W stadium posiewu pozywka moze byc jakakolwiek odpowiednia kombinacja zródel wegla i azotu taka, jak np. jedna z wyzej opisanych pozywek IX-XI. Naczynie z posiewem wytrzasa sie w termostatowej komorze utrzymywa¬ nej w temperaturze okolo 28°C, w ciagu 1 do 3 dni, a uzyskana hodowle badz to wykorzystuje sie do drugiego posiewu, badz tez szczepi sie nia pozywke produkcyjna. Jezeli stosuje sie posiew posredni, to kolby z tym posiewem traktuje sie zasadniczo w taki sposób, to znaczy zawartosc kolby uzywa sie do szczepienia pozywki produkcyjnej, szczepione kolby wytrzasa sie w stalej temperaturze w ciagu kilku dni, a po zakonczeniu inkubacji zawartosc kolb odwirowuje sie w celu usuniecia grzybni.Pozostala ciecz pofermentacyjna zateza sie i oczysz¬ cza, otrzymujac antybiotyk 842 A.Przy produkcji na wieksza skale korzystnie jest przeprowadzac hodowle w odpowiednich zbiorni¬ kach wyposazonych w mieszadlo i urzadzenie do napowietrzania pozywki. Wedlug tego sposobu po¬ zywke przygotowuje sie w zbiorniku w którym na¬ stepnie wyjalawia sie ja przez podgrzanie do tem¬ peratury okolo 120°C. Po ochlodzeniu wyjalowiona pozywke szczepi sie hodowla szczepu produkcyj¬ nego i prowadzi hodowle w ciagu kilku, np. 2—4 dni, mieszajac i/lub napowietrzajac pozywke, utrzymujac temperature okolo 28°C. Zmiany w rozwoju hodowli posiewowej i w pozywce hodo¬ wlanej umozliwiaja kilkakrotny wzrost ilosci wy¬ produkowanego antybiotyku oraz wzrost jego mo¬ cy.Oznaczanie antybiotyku 842 A z zastosowaniem Vibrio percolans.Oznaczenia przeprowadza sie metoda krazkowo- -plytowa, stosujac krazki bibuly o srednicy 12,7 mm.Plytki testowe przygotowuje sie, stosujac agar odzywczy Difco z dodatkiem ekstratu drozdzowego Difco w ilosci 2,0 g/litr. Nalewa sie po 10 ml po¬ zywki na plytke. Hodowle badanego organizmu — Vibrio percolans (MB-1272) prowadzi sie w ciagu nocy w bulionie odzywczym z 0,2% dodatkiem ekstraktu drozdzowego, po czym rozciencza sie ja sterylnym roztworem soli do zawiesiny o 40% przepuszczalnosci swiatla o dlugosci fali 660 m u..Zawiesine te dodaje sie do pozywki w ilosci 20 ml/litr, a nastepnie pozywke nalewa sie na plytki.Plytki do badan przechowuje sie nie dluzej, niz 5 dni w temperaturze 4°C. Nasycone roztworem antybiotyku krazki naklada sie na plytki, które nastepnie inkubuje sie w temperaturze 28°C, w ciagu 8—24 godz. Wyniki wyraza sie w mm sredni¬ cy strefy zahamowania. Okresla sie aktywnosc wzgledna, lub w przypadku odniesienia do oczysz¬ czonego wzorca, aktywnosc w u, g/ml. Przeprowa¬ dzajac test w sposób ilosciowy, mozna wykryc- antybiotyk w ilosci 1—2 u. g/ml.17 Dezaktywacja bakteryjna antybiotyku 842 A.Przeprowadzone in vitro badania mialy na celu okreslenia odpornosci antybiotyku 842 A na dezak¬ tywacje bakteryjna w porównaniu z odpornoscia ce- falosporyny C, cefalosporydyny i cefalotyny. Ba¬ dania te wykazaly, ze antybiotyk 842 A jest bar¬ dziej, niz wyzej wymienione, odporny na dzialanie pewnych mikroorganizmów.Badania przeprowadzone z zastosowaniem bak¬ terii, które calkowicie dezaktywuja cefalosporyne C, mianowicie z Alcaligenes faecalis (MB-9) i Al- caligenes viscosus (MB-12): a) Hodowla komórek bakteryjnych.Komórki Alcaligenes viscosus (MB-12) i A. Fa¬ ecalis (MB-9) wyhodowano w nastepujacy sposób: zawartosc probówki wymieszano z kilkoma ml bu¬ lionu odzywczego, zawierajacego 0,2% dodatek eks¬ traktu drozdzowego. Zawiesine w ilosci jednego ocz¬ ka naniesiono na powierzchnie skosu agarowego i inkubowano w ciagu 18 godz. w temperaturze 37°C.Skosy przechowywano w temperaturze 5°C, nie dluzej niz tydzien po inkubacji. Oczko powierz¬ chniowego wzrostu z kazdej kultury przeniesiono aseptycznie do 50 ml bulionu z 0,2% dodatkiem ekstraktu drozdzowego i inkubowano na wytrza¬ sarce w ciagu 18 godz. w temperaturze 28°C. Na¬ stepnie hodowle odwirowywano z szybkoscia 4000 obrotów na minute w ciagu 10 minut, dwukrotnie przemywano wyjalowionym 0,1 n buforem fosfo¬ ranowym o wartosci pH=7,5 (6,8 g KH2P04+7,1 g Na2HP04 na litr wody destylowanej). Z przemy¬ tych komórek wytworzono zawiesine w roztworze 4 mg/ml antybiotyku w 0,1 m buforu fosforano¬ wego, uzytym w ilosci równej 0,1 poczatkowej objetosci hodowli bakteryjnej. Mieszanine testowa inkubowano, bez wytrzasania, na lazni wodnej, utrzymywanej w temperaturze 37 °C, w ciagu 4 godz. Nastepnie poddana badaniom mieszanine od¬ wirowywano z szybkoscia 2000 obrotów na minute, w ciagu 10 min., a uzyskana klarowna ciecz zde- kantowano do wyjalowionych probówek i natych¬ miast zamrozono w suchym lodzie i przechowywano w tych warunkach do badan biologicznych, które zwykle przeprowadzano po 3 godz. Próby kontrolne inkubowano w identyczny sposób, nie wprowadzano jednak komórek bakteryjnych. b) Zakres dezaktywacji antybiotyku 842 A.Badania aktywnosci plynu pofermentacyjnego przeprowadzano w nastepujacy sposób: krazki bi¬ buly o srednicy 6 mm nasycano plynem i umiesz¬ czano na powierzchni plytek pokrytych agarem z dodatkiem ekstraktu drozdzowego (0,2%), zakazo¬ nym odpowiednim organizmem stosowanym w ba¬ daniu. W przypadku B. subtilis (MB-964) plytki przygotowywano w nastepujacy sposób: 5 ml za¬ wiesiny przemytych zarodników w 0,9% roztworze soli dodawano do 150 ml agaru zawierajacego 0,2% ekstraktu drozdzowego, a zakazona pozywke nale¬ wano na plytki Petriego o wymiarach 15x100 mm, w ilosci po 5 ml pozywki na plytke. Plytki do ba¬ dan przechowywano w temperaturze 5°C i stoso¬ wano w ciagu 3 dni. Przed badaniami plytki inku¬ bowano w ciagu nocy w temperaturze 25°C, a na¬ stepnie mierzono strefy zahamowania wokól krazków. 18 W celu wykreslenia krzywej wzorcowej, prze¬ prowadzano próby kontrolne z wolnym od komó¬ rek bakteryjnych antybiotykiem w rozcienczeniach: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 i 1:32. Roztwory antybiotyków 5 badano w pelnej ich mocy, po inkubacji w obecnos¬ ci przemytych komórek bakteryjnych. Wszystkie próby przeprowadzano trzykrotnie, c) Wyniki.Procent dezaktywacji obliczano w ten sposób, ze na podstawie wielkosci strefy zahamowania (sredniej z trzech pomiarów), poslugujac sie krzy¬ wa wzorcowa, obliczono ilosc antybiotyku pozosta¬ lego w badanym roztworze, wartosc te odejmowano od stezenia wyjsciowego (4 mg/ml), a reszte dzie¬ lono przez stezenie wyjsciowe i mnozono przez 100.W tablicy 6 przedstawiono wartosci dezaktywacji cefalosporyny C i antybiotyku 842 A, zmierzone w wyzej opisany sposób.Tablica 6 Procent dezaktywacji po inkubacji z przemytymi komórkami bakteryjnymi Próby na plytkach zakazonych B. subtilis (MB-964) Organizm degradujacy Alcaligenes faecalis MB-9 A. viscosus | MB-12 4 godziny inkubacji Cefalospory- na C 99+ 99+ Antybiotyk 842 A 0 54,4 Zbadano równiez odpornosc antybiotyku 842 A i cefalosporyny na degradacyjny wpyw 4 innych mikroorganizmów, mianowicie Escherichia coli 236, Proteus morganii 251, Proteus morganii 356 i Pro- teus mirabilis 241. Kazdy z tych mikroorganizmów jest gram-ujemny i oporny na cefalosporyne C.Sporzadzono mieszaniny mikroorganizmu z anty¬ biotykiem, które inkubowano w ciagu 4 godz., a nastepnie badano na aktywnosc antybiotyczna. Me¬ toda ta jest identyczna z opisana powyzej dla Alca¬ ligenes faecalis MB-9 i A. viscosus MB-12. W ta¬ blicy 7 przedstawiono procent dezaktywacji cefa¬ losporyny C i antybiotyku 842 A, zmierzony przy uzyciu B. subtilis (MB-964), za pomoca tej metody.Tablica 7 Mikroorganizm Escherichia coli 236 Proteus mor¬ ganii 251 Proteus mor¬ ganii 356 1 Proteus mira- | bilis 241 Cefalospory- na C ) 99 ) 99 ) 99 72 Antybiotyk 842 A 38 80 69 5 1 Z powyzszych danych wynika, ze antybiotyk 842 A iest odporniejszy od cefalosporyny C na deza¬ ktywacje przez A. faecalis, A. viscosus, Escherichia 82 903 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6019 82 903 20 coli 236, Proteus morganii 251, Proteus morganii 236 i Proteus mirabilis 241.Antybiotyk 842 A otrzymany w procesie fermen¬ tacyjnym jest zwiazkiem amfoterycznym o pozor¬ nym punkcie izoelektrycznym przy wartosci pH okolo 3,5. Jest nietrwaly przy wartosci pH powy¬ zej 9,0 lecz wzglednie trwaly przy wartosci pH=l,5.Antybiotyk 842 A oraz jego sole skutecznie in- hibituja wzrost róznych gatunków Salmonella, dlatego tez zwiazki te moga byc stosowane jako srodki dezynfekujace w gospodarstwie domowym i w przemysle. Np. antybiotyk 842 A wykazuje aktywnosc w stosunku do Salmonella schottmu- elleri 3010, S. gallinarum i S. typhosa.Otrzymany antybiotyk 842 A mozna oczyscic, stosujac adsorpcje na zywicy jonitowej, np. na zy¬ wicy, w sklad której wchodza czwartorzedowe za¬ sady amoniowe albo kwasy sulfonowe. Zaadsor- bowany antybiotyk eluuje sie z zywicy roztworami wodnymi lub roztworami wodno-alkoholowymi od¬ powiednimi soli takich, jak chlorek amonowy, chlorek sodowy itp. Odpowiednimi do prowadzenia tego zabiegu zywicami jonitowymi sa np. sulfono¬ wane zywice polistyrenowe (45 lub 53°/a wody) lub zywice polistyrenowe z grupami trójmetylobenzylo- amoniowymi (43% wody) o nazwach handlowych odpowiednio: Dowex 1 i Dowex 50. W razie potrze¬ by otrzymany eluat mozna dalej oczyscic, stosujac druga i trzecia adsorpcje i elucje. Z koncentratów powyzszych eluatów otrzymuje sie oczyszczony an¬ tybiotyk 842 A.Antybiotyk 842 A moze byc stosowany sam lub w mieszaninie, jako aktywny skladnik róznorod¬ nych preparatów farmaceutycznych. Antybiotyk ten i jego sole moga byc stosowane w postaci kapsulek, tabletek, proszków lub cieklych roztworów, jako zawiesiny lub eliksiry. Wprowadzane moga byc do¬ ustnie, dozylnie lub domiesniowo. Odpowiednimi nosnikami, które mozna stosowac do zestawiania mieszanin sa np. mannit, sacharoza, glikoza lub wyjalowione ciecze takie, jak woda, fizjologiczny roztwór soli, glikole lub oleje — pochodzenia naf¬ towego, zwierzecego, roslinnego lub syntetyczne takie, jak npt olej arachidowy, olej parafinowy lub sezamowy. Obok nosników mieszaniny te moga za¬ wierac równiez inne skladniki takie, jak stabiliza¬ tory, srodki wiazace, srodki zapobiegajace utlenia¬ niu, srodki konserwujace, srodki smarne, srodki dyspergujace, srodki zmieniajace lepkosc, srodki zapachowe itp. Mieszanina zawierac moze równiez inne aktywne skladniki, zwiekszajace zakres ak¬ tywnosci antybiotycznej.Wielkosc dawki jest w znacznej mierze zalezna od warunków leczenia i masy ciala pacjenta. Przy zakazeniach ogólnych wskazane jest wprowadzanie pozajelitowe, doustne przy zakazeniach jelitowych.Ogólnie dawka dzienna wynosi okolo 15—175 mg aktywnego skladnika na kg masy ciala, przy czym dawka ta moze byc wprowadzana jednorazowo lub rozdzielana na mniejsze i wprowadzana kilkakrot¬ nie w ciagu dnia. Korzystna dawka dzienna anty¬ biotyku 842 A wynosi okolo 40—80 mg aktywnego skladnika na kg masy ciala.Mieszaniny te moga byc stosowane w rózny spo¬ sób, np. w postaci stalej lub cieklej i moga byc wprowadzane doustnie. Jednostkowe dawki, zarów¬ no w postaci cieklej jak i stalej, zawieraja na ogól okolo 15—700 mg aktywnego skladnika. Zazwyczaj korzystne jest stosowanie dawek wielkosci okolo s 80—320 mg. Przy wprowadzaniu pozajelitowym je¬ dnostke leku stanowi zwykle czysty skladnik w sterylnym roztworze wodnym lub w postaci roz¬ puszczalnego proszku, przeznaczonego do rozpusz¬ czenia.Napelniane na sucho kapsulki, zawierajace po 40 mg antybiotyku 842 A, wytwarza sie, stosujac nastepujace skladniki na 1 kapsulke: kwas 7|3-/D-5-amino-5-karboksywaleramido/-3-kar- bamoiloksymetylo-7-metoksycefemo-3-karboksylo- wy-4 40 mg laktoza 100 mg stearynian magnezowy 5 mg kapsulka nr3 145 mg Substancje czynna rozciera sie na proszek i prze¬ siewa przez sito nr 60, a nastepnie przez sito nr 60 dodaje sie laktoze i stearynian magnezowy. Sklad¬ niki te miesza sie w ciagu 10 minut, po czym mieszanina napelnia sie sucha zelatynowa kapsulke nr 3.Tabelka, zawierajaca kwas 7(3-/D-5-amino-5-kar- boksywaleramido/-3-karbamoiloksymetylo/-7-me- toksycefemo-3-karboksylowy-4.Na tabletke kwas 7p-/D-5-amino-5-karboksywaleramido/-3-kar- bamoiloksymetylo-7-metoksycefemo-3-karboksy- lowy-4 125 mg skrobia kukurydziana, U.S.P. 6mg fosforan dwuwapniowy 192 mg laktoza,U.S.P. 190mg Aktywny skladnik miesza sie z fosforanem dwuwapniowym, laktoza i mniej wiecej polowa skrobi kukurydzianej. Mieszanine granuluje sie z 15% pasta ze skrobi kukurydzianej i przesiewa, suszy sie w 45°C i ponownie przesiewa przez sito nr 16. Dodaje sie reszte skrobi kukurydzianej i ste¬ arynianu magnezowego, po czym mieszanine pra¬ suje sie w tabletki o srednicy okolo 12,5 mm i wa¬ dze 800 mg.Roztwór injekcyjny, zawierajacy w ampulce.500 mg antybiotyku 842 A, wytwarza sie, stosujac na 1 ampulke 500 mg kwasu 7|3-/D-5-amino-5-karbo- ksywaleramido/-3-/a-metoksy-p-karbamoiloksy- metylo-7-metoksycefemo-3-karboksylowego-4 i 2 ml wyjalowionej wody.Sposób wedlug wynalazku jest dokladniej wyjas¬ niony w nizej podanych przykladach.Przyklad I. Etap A. Hodowla w kolbach.Probówke z liofilizowana hodowla szczepu Streptomyces lactamdurans otwarto aseptycznie.Zawartoscia probówki zaszczepiono przewezona kolbe Erlenmayera o pojemnosci 250 ml, zawieraja¬ ca 50 ml pozywki V, rozbijajac probówke w wyja¬ lowionej gazie i aseptycznie przenoszac okruchy szkla do kolby.Pozywka V ma nastepujacy sklad: autolizat drozdzowy (Ardamine) 10,0 g glukoza 10,0 g 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6082 903 21 22 ?bufor fosforanowy 2,0 g MgS04.7H20 0,05 g woda destylowana 1000,0 ml wartosc pH=6,5 * bufor fosforanowy KH2P04 91,0 g Na2HP04 95,0 g woda destylowana 1000,0 ml Kolbe posiewowa umieszczono na okres 3 dni Errata Lam 19, 21 wiersz od góry Jest: powiedmiim Powinno byc: powiednich Lam 21, 53 wiersz od góry Jest: rociienczoinym Powinno byc: rozcienczonym Lam 28, 18 wiersz od góry Jest: Biordan Powinno byc: Biorad Lam 28, 21 wiersz od góry Jest: Mildan Powinno byc: Midland wartosc pH=7,0 Kolby hodowlane umieszczono na okres 4 dni na wytrzasarce obrotowej z wykorbieniem 5 cm, obra¬ canej z szybkoscia 145 obrotów na minute, utrzy¬ mujac temperature 28°C. Po zakonczeniu inkubacji odwirowano grzybnie z polaczonej zawartosci 10 kolb.Obecnosc w brzeczce antybiotyku 842 A, to jest kwasu 7|3-/D-5-amino-5-karboksywaleramido/-3- -karbamoiloksymetylo-7-metoksycefemo-3-karbo- ksylowego-4, o wzorze 1 stwierdzono metoda kra- zkowo-dyfuzyjna nakladajac krazki bibuly o sre¬ dnicy 12,7 mm, nasycone brzeczka, na plytki zawie¬ rajace po 10 ml, agaru odzywczego (Difco) oraz 0,2% ekstraktu drozdzowego (Difco), zakazonego posiewem bakteryjnym. Po inkubacji prowadzonej w ciagu nocy w temperaturze 28°C zmierzono sred¬ nice stref zahamowania. Dla brzeczki z hodowli prowadzonej w ciagu 4 dni strefa zahamowania wynosila 31,5 mm na plytkach zakazonych hodowla Vibrio percolans (MB-1272).Etap B. Adsorpcja na zywicy amonitowej. 2900 ml przesaczonej brzeczki, której wartosc pH=7 dostosowano rocienczonym kwasem solnym, przepuszczono przez 100 ml silnie zasadowej zywi¬ cy anionitowej na bazie kopolimeru stylenu z dwu- winylobenzenem (Dowex 1 w cyklu chlorkowym) z szybkoscia 10 ml/min. Wyciek zbierano frakcja¬ mi o objetosci 500 ml. Kolumne przemyto woda, a nastepnie eluowano 3% roztworem NH4CI w 90°/o metanolu. Eluat zbierano frakcjami o objetosci 100 ml.Wszystkie frakcje przebadano na plytach zaka¬ zonych Vibrio percolans (MB-1272). Srednice stref zestawiono ponizej w tablicy. 10 30 40 45 50 55 60 Przesaczona brzeczka Rozcien czenie — 1:2 1 1:4 0 Wielkos strefy 26,5 mm 24 20 Wyciek Frakcje 1 2 3 4 5 6 0 Wielkos strefy 0 16 23 23 27 27 Eluat Frakcj s 1 2 3 4 5 6 7 8—10 »o Wielkos strefy 25 29 29 29 22 18 15 0 I Badania wykazaly, ze okolo 60% substancji ak- wnej znajdowalo sie w wycieku, a okolo 18°/o w lacie. Pojemnosc zywicy wynosi zaledwie 2 frakcje zeczki wzglednie 10 objetosci kolumny. Frakcje latu 1—4 polaczono i odparowano z nich metanol, akcje 3—6 wycieku polaczono, otrzymujac 1960 . roztworu. 1860 ml tego roztworu doprowadzono zcienczonym roztworem wodorotlenku sodu do irtosci pH=7,2 — 8,0 i przepuszczono przez 100 . silnie zasadowej zywicy anionitowej na bazie polimeru styrenu z dwuwinylobenzenem (Dowex w cyklu chlorkowym) z szybkoscia 14 ml/minute, „yciek zebrano w 4 frakcjach jednakowej obje¬ tosci. Analiza wykazala, ze wyciek zawiera 5Vo substancji aktywnej. Kolumne przemyto woda i eluowano 5°/o wodnym roztworem chlorku sodu, zbierajac frakcje o objetosci po 50 ml. Analiza wy¬ kazala, ze 90% substancji aktywnej znajdowalo sie we frakcjach 3—16, i frakcje te polaczono.Etap C. Adsorpcja na zywicy kationitowej. 50 ml koncentratu z etapu B rozcienczono do objetosci 500 ml, rozcienczonym kwasem solnym doprowadzono wartosc pH z 8,8 do 2,0 i przepusz¬ czono z szybkoscia 2,5 ml/min. przez 25 ml silnie kwasnej zywicy jonitowej typu sulfonowego, na bazie kopolimeru styrenu z dwuwinylobenzenem (Dowex 2 w cyklu wodorowym). Kolumne przemyto 25 ml wody, a nastepnie eluowano 2% roztworem pirydyny tak dlugo, dopóki wartosc pH eluatu nie wzrosla do 7/54 ml). Analiza wykazala 9% zawar¬ tosc substancji aktywnej w wycieku i 90% w elu- acie. Eluat zidentyfikowano jako sól pirydoniowa antybiotyku 842 A.Antybiotyk 842 A jest zwiazkiem amfoterycznym o pozornym punkcie izoelektrycznym przy wartosci pH okolo 3,5. Zwiazek ten jest nietrwaly przy wartosci pH powyzej 7, natomiast jest trwaly przy wartosci pH=l,5. Otrzymany w powyzszy sposób eluat doprowadzono rozcienczonym wodorotlenkiem sodu do wartosci pH=8 i zatezono pod zmniejszo¬ nym cisnieniem w celu usuniecia pirydyny. Otrzy¬ many produkt zidentyfikowano jako sól jednosodo- wa antybiotyku 842 A. Ciezar czasteczkowy, obli¬ czony na podstawie wzoru sumarycznego CioH2iN4- S09Na wynosi 468.Analiza elementarna Wartosci obliczone dla CielLiraSOsNa C — 41,0%, H — 4,5% N — 12,0°/o, S — 6,8%,,O — 30,8%, Na — 4,9°/o82 963 23 Znalezione C — 39,31%, H — 4,76%, N — ll,18Vo, S — 6,64Vo, O — 34,12o/o, Na — 4,19%, W badaniach in vitro powyzszy produkt, to jest antybiotyk 842 A, powstrzymywal wzrost nastepuja¬ cych Gram-ujemnych bakterii: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Alcaligenes faecalis, Brucella bronchiseptica, Salmonella gallinarum, Vibrio per- 24 colans i Xanthomonas vesicatoria oraz nastepuja¬ cych bakterii Gram-dodatnich: Staphylococcus au- reus, Sarcina lutea i Bacillus subtilis.W badaniach in vivo antybiotyk 842 A wykazal ponizej podana aktywnosc. Antybiotyk wprowadzo¬ no droga injekcji podskórnej. Po zakonczeniu prób, zwykle 7 dni po wprowadzeniu, obliczano ilosc an¬ tybiotyku potrzebna do 50% ochrony myszy (ED50) Mikroorganizm stosowany do infekcji Proteus vulgaris Proteus mirabilis Proteus morganii 3202 Salmonella schottmuelleri Klebsiella pneumoniae AD Klebsiella pneumoniae B Paracolobactrum arizoniae Escherichia coli Aerobacter aerogenes Pasteurella multocida Salmonella typhosa Diplococcus pneumoniae E400 Cefalorydyna i cefalotyna nie chronily przy ilosci 4000 mg w dwóch dawkach ED50 przy wprowa¬ dzaniu podskórnym w dwóch dawkach 51 g 276 g 276 g 103 g 125 g 125 g 125 g 200 g 49 g 57 g 34 g 566 g Oprócz wyzej przedstawionych badan produktu in vivo, przeprowadzono w wyzej opisany sposób badania na myszach, zakazonych klinicznie izolo¬ wanym szczepem Proteus vulgaris 356, który jest odporny na cefalosporyne C. W badaniach tych uzyskano nastepujace wartosci ED50.Mikroorganizm stosowany do infekcji Proteus morganii 356 Proteus morganii 356 Proteus morganii 356 Antybiotyk 842 A Cefalotyna Cefalorydyna ED50 Pr2y wprowa dzaniu podskórnym w dwóch dawkach (srednia z dwóch prób) 273 g 20,000 g 9,270 g Przyklad II. Antybiotyk 842 A. Hodowla w kolbach.Posiew przygotowywano w sposób, opisany w 45 przykladzie I. Brzeczka, zebrana z dwóch kolb dru¬ giego stadium posiewu, zaszczepiono 62 kolby Erlen- mayera o pojemnosci 250 ml, zawierajace po 50 ml pozywki X, wprowadzajac do kazdej kolby po 1 ml posiewu. Pozywka X ma nastepujacy sklad: 50 maka sojowa Staley 4S 30,0 g oleje fuzlowe 7,5 g glikoza techniczna 20,0 * g NaCl , 2,5 g CaCo3 (po doprowadzeniu pH do 7) 10,0 g 55 woda destylowana 1000,0 ml Kolby umieszczono na okres 5 dni na wytrzasar¬ ce z wykorbieniem 5 cm, obracanej z szybkoscia 220 obrotów na minute, utrzymujac temperature 28°C. Po zakonczeniu inkubacji dowirowano grzyb- 60 nie z polaczonej zawartosci kolb.Obecnosc antybiotyku 842 A stwierdzono sposo¬ bem opisanym w przykladzie I — metoda krazko- wo-dyfiizyjna na agarze, stosujac krazki bibuly o srednicy 12,7 mm. W ciagu 4 dni po inkubacji pró- es ba z brzeczka wykazala strefe zahamowania wzro¬ stu Vibrio percolans (MB-1272) o srednicy 33 mm.Przyklad III. Antybiotyk 842 A. Hodowla.Etap 1. 50 ml pozywki V w przewezonej kolbie Erlenmayera o pojemnosci 200 ml zaszczepiono za¬ wartoscia probówki z liofilizowana kultura Strep- tomyces lactamdurans (MA-2908).Pozywka V autolizat drozdzowy (Ardamine) 10,0 g glukoza 10,0 g fosforanowy roztwór buforowy 2,0 g woda destylowana 1000,0 ml wartosc pH=6,5 dostosowana NaOH fosforanowy roztwór buforowy ma sklad: KH2P04 91,0 g Na2HP04 95,0 g woda destylowana 1000,0 ml Zaszczepione kolby umieszczono na okres 72 go¬ dzin w wytrzasarce obrotowej z 5 cm wykorbie¬ niem, obracanej z szybkoscia 220 obrotów na mm., utrzymujac temperature 28°C.Etap 2. 50 ml wyjalowionej pozywki V w dwu¬ litrowej przewezonej kolbie Erlenmayera zaszcze-82 963 25 26 piono 10 ml otrzymanej hodowli. Zaszczepiona kol¬ be umieszczono na okres 48 godzin na wytrzasarce obrotowej, obracanej z szybkoscia 220 obrotów na minute, utrzymujac temperature 28°C.Etap 3. Zbiornik ze stali nierdzewnej o pojem¬ nosci 200 litrów, zawierajacy 160 litrów V, zaszcze¬ piono zawartoscia kolby posiewowej. Zaszczepiona pozywke inkubowano w ciagu 48 godzin w tempe¬ raturze 48°C, mieszajac i przepuszczajac powietrze z szybkoscia 0,085 m3/minute. W czasie fermentacji dodawano male ilosci srodka zapobiegajacego pie¬ nieniu Polyglycol 2000.Etap 4. 43 litrami otrzymanej hodowli zaszczepiono zbiornik ze stali nierdzewnej o pojemnosci 800 li¬ trów, zawierajacy 467 litrów wyjalowionej pozywki XI o nastepujacym skladzie: Pozywka XI autolizat drozdzowy (Amber Yeast No 300) 10,0 g oleje fuzlowe 20,0 g woda destylowana 1000,0 ml wartosc pH=7,0 Fermentacje prowadzono w ciagu 72 godzin w temperaturze 28°C, przepuszczajac powietrze z szybkoscia 0,28 m3 na minute. W czasie fermentacji dodawano male ilosci poliglikolu 2000 zapobiegaja¬ cego pienieniu. Aktywnosc otrzymanej brzeczki zbadano metoda krazkowo-plytowa. Nastepnie brzeczke przesaczono przez ziemie okrzemkowa o wartosci pH=7,8 i otrzymany produkt zidentyfiko¬ wano metoda krazkowo-plytowa jako antybiotyk 842 A. Przy rozcienczeniu w stosunku 1:10 otrzy¬ mano strefe zahamowania wzrostu Vibrio percolans (MB-1272) o srednicy 21,5 mm.Przyklad IV. Oczyszczanie.Jednosodowa sól kwasu 7|3-0D-5-amino-5-karbo- ksywaleramido/-3-karbamoiloksymetylo-7-meto- ksycefemo-3-karboksylowego-4.Adsorpcja na weglu. 4 porcje brzeczki, otrzyma¬ nej w sposób, opisany w przykladzie I, zaadsorbo- wano na silnie zasadowej zywicy anionitowej na podstawie kopolimeru styrenu z dwuwinyloben¬ zenem (Dowex 1 w cyklu chlorkowym), stosujac po 100 ml zywicy na kazda porcje brzeczki. Eluo- wano 1% roztworem wodnym chlorku sodowego.Eluat zbierany frakcjami o objetosci po 50 ml, pod¬ dano badaniom. Frakcje eluatów ze wszystkich 4 partii doprowadzono rozcienczonym kwasem sol¬ nym do wartosci pH=5 i polaczono, otrzymujac 4300 ml roztworu. Do 4200 ml tego roztworu dodano 42 g wegla aktywowanego (Darco G-60) i calosc mieszano w ciagu 1/2 godziny. Nastepnie odsaczono wegiel i przemyto woda. Przesacz i popluczyny byly pozbawione aktywnosci. Odsaczony wegiel dwukrotnie eluowano 1 litrem 60% wodnego roz¬ tworu acetonu, za kazdym razem mieszajac w cia¬ gu 1/2 godziny i odsaczajac wegiel. Eluaty zatezono odpowiednio do objetosci 108 i 100 ml. Badania wy¬ kazaly, ze pierwszy eluat zawieral 76% aktywnosci ogólnej, przy aktywnosci jednostkowej 18 razy wie¬ kszej od aktywnosci wyjsciowej, drugi eluat za¬ wieral 17% aktywnosci przy aktywnosci jednostko¬ wej 14 razy wiekszej od aktywnosci wyjsciowej.Obydwa koncentraty polaczono, zatezono do obje¬ tosci 61 ml i za pomoca rozcienczonego wodoro¬ tlenku sodu doprowadzono wartosc pH do 4—5 Powyzszy koncentrat zawieral 40 mg/ml suchej po¬ zostalosci i w stosunku do MB-1272, przy rocien- czemiu 1 : 100 (400 p, g/ml), wykazal strefe o sred- 5 nicy 25 mm. Produkt zidentyfikowano jako jedno¬ sodowa sól kwasu 7p-/D-5-amino-5-karboksywale- ramido/-3-marbamoiloksymetylo-7-metoksycefe- mo-3-karboksylowego-4 o wzorze 1.Przyklad V. Oczyszczanie. Jednosodowa sól 10 kwasu 7|3-/D-5-amino-5-karboksywaleramido/-3- 4tarbamoiloksymetylo-7-metoksycefemo-3-karbo- ksylowego-4.Absorpcja na zelu. 22 ml eluatu otrzymanego sposobem wedlug przykladu I doprowadzono roz- 15 cienczonym roztworem wodorotlenku sodu do war¬ tosci pH=7,0 i poddano rozdzialowi chromatogra¬ ficznemu w kolumnie, wypelnionej zelem Biogel P-2. Kolumne eluowano woda, kontrolujac eluat w sposób ciagly refraktometrem róznicowym, zbie- 20 rajac frakcje o objetosci 5 ml, które poddano ba¬ daniom biologicznym. Aktywnosc biologiczna stwierdzono we frakcjach 47—63, natomiast chlorek sodowy znaleziono we frakcjach 62—72. Polaczone frakcje 50—60 ponownie zbadano i odparowano do 25 sucha, otrzymujac 10,8 mg pozostalosci, zidentyfi¬ kowanej jako jednosodowa sól kwasu 7|3-/D-5-ami- no-5-karboksywaleramido/-3-karbamoiloksymety- lo-7-metoksycefemo-3-karboksylowego-4. W próbie z Vibrio percolans produkt wykazal strefe hamo- 30 wania 25 mm przy stezeniu 8 g/ml.Przyklad VI. Kwas 7p-/D-5-amino-5-karbo- ksywaleramido/-3-karbamoiloksymetylo-7-meto- ksycefemo-3-karboksylowy-4. Zmodyfikowany spo¬ sób hodowli. 35 Etap A. Skosy. Probówke z liofilizowana hodowla Streptomyces lactamdurans otwarto aseptycznie i zawartosc jej przeniesiono na pozywke o nastepu¬ jacym skladzie: Pozywka XII 1%melasy (Blackstrap Molasses) l%i autolizatu drozdzowego (National Bre- wer'a Yeast) 2,5% agatu Difco o wartosci pH=7,0 woda do 100% 45 Skosy inkubowano w ciagu 7 dni w temperaturze 28°C. Przychowywane w chlodni, skosy sa trwale w ciagu 13 tygodni.Etap B. Stadium posiewowe — sposób dwusto- 50 pniowy.Pierwszy posiew: hodowle ze skosów z etapu A szczepi sie 40 ml pozywki z 1% zawartoscia suszo¬ nych drozdzy (Primary Dried Yeast N.F. produkcji Yeast Producet Corporation) o wartosci pH^7,0, 55 w przewezonej kolbie Erlenmayera o pojemnosci 250 ml. Kolby umieszcza sie na okres 2-3 dni na obrotowej wytrzasarce z 5 cm wykorbieniem, obra¬ canej z szybkoscia 220 obrotów na minute.Drugi posiew: hodowle z pierwszego etapu 60 wprowadzono, w ilosci 2,5% do kolby, zawierajacej 2% autolizat drozdzowy Fleischmanna S-150 o war¬ tosci pH=7,0. Wzrost w tym stadium jest charakte¬ rystycznie jasny. Inkubacje prowadzi sie w sposób analogiczny, jak w pierwszym etapie i nie przedlu- 65 za sie jej ponad 48 godzin.27 82 903 28 Etap C. Pozywka hodowlana.Pozywka hodowlana zawiera w 1 litrze wody destylowanej 30 g olejów fuzlowych, 7,5 g suszo¬ nych drozdzy (Primary Dried Yeast N.F.) oraz 0,25% (objetosciowo) srodka przeciwpiennego Mo- bilpar-S. Mala iloscia stezonego NaOH doprowadza sie wartosc pH pozywki do 7,0, pozywke rozlewa do kolb Erlenmayera i wyjalawia w autoklawie w temperaturze 121°C, w ciagu 15 lub 20 minut.Po ochlodzeniu do kolb wprowadza sie otrzymany w etapie B posiew w ilosci 2,5%. Czas inkubacji moze wynosic 50—100 godzin, a korzystnie wynosi 72 godziny. Objetosc pozywki w kolbie wynosic moze 30—50 ml, srednio stosowano 40 ml. Ilosc po¬ siewu moze wynosic 1%—5%, na ogól stosowano 2,5%.Etap D. Badania.Po zakonczeniu fermentacji grzybnie odwirowano, a przesaczony plyn pofermentacyjny rozcienczono buforem fosforanowym o wartosci pH=7,0. Stezenie kwasu 7|3-/D-5-amino-5-karboksywaleramido/-3- -karbamoiloksymetylo-7-metoksycefemo-3-karbo- ksylowego-4 okreslono znormalizowana metoda biologiczno-krazkowa. Jako szczep poddany bada¬ niom zastosowano Vibrio percolans (ATTC-8461).Krazki bibuly zanurza sie w rozcienczonej brzeczce i umieszcza na powierzchni plytek Petriego pokry¬ tych agarem zaszczepionym Vibrio percolans (AT TC-8461). Na plytkach umieszcza sie równiez krazki nasycone znormalizowanym roztworem antybiotyku 842 A. Inkubacje prowadzi sie w ciagu nocy w temperaturze 28°C i notuje sie zmiany srednie stre¬ fy zahamowania. Stezenie antybiotyku 842 A w brzeczce oblicza sie z typowych krzywych zaleznos¬ ci srednicy strefy od stezenia roztworu antybiotyku 842 A. W hodowli prowadzonej zmodyfikowanym sposobem, Streptomyces lactamdurans wytwarza antybiotyk 842 A z wydajnoscia 78,6 g/ml.Podane ponizej mikroorganizmy sa zdeponowane w Culture Collection of the American Type Cul- ture Collection, gdzie sa dostepne pod nastepuja¬ cymi oznaczeniami ATCC.Escherichia coli W-MB-60 ATCC 9637 Proteus vulgaris MB-838 ATCC 21100 Alcaligenes faecalis MB ATCC 212 Alcaligenes viscosus MB-12 ATCC 337 Vibrio percolans MB-1272 ATCC 8461 Bacillus subtilis MB-964 ATCC 6633 Szereg podanych w opisie materialów okreslono nazwami handlowymi. Maja one nastepujace skla¬ dy i sa wytwarzane przez nastepujacych producen¬ tów: 5 Amber Yeast No 300: frakcje autolizowanych drozdzy browarnianych; Amber Laboratories, Ju- neau, Wisconsin.Mobil par-S: srodek zapobiegajacy pienieniu otrzymywany z ropy naftowej (sklad nieznany); Mobil Oil Company; 150 E. 42nd Street, New York Polyglycol 2000; srodek przeciwko pienieniu; po¬ limer glikolu propylenowego o przecietnym cieza¬ rze czasteczkowym 2000; Dow Chemical Company. 15 Midland, Michigan.Biogel P-2: sorbent zelowy; przestrzennie usie- ciowany kopolimer akrylamidu z metyleno-bis- -akrylamidem; Biordan Laboratories, Richmond, California. 20 Dowex 50: zywica kationitowa — sulfonowany polistyren; Dow Chemical Company, Mildan, Mi¬ chigan.Analtech G.F.Plates: plytki zelu krzemionkowego z siarczanem wapnia jako srodkiem wiazacym, o 25 grubosci 0,25 mm. Analtech Inc., 100 South Justison Street, Wilmington, Delaware. PL PL