Uprawniony z patentu: Merck Patent Gesellschaft mit beschrankter Haftung, Darmstadt (Republika Federalna Niemiec) Sposób wytwarzania biologicznie czynnych kompleksów dwuskladnikowych Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych biologicznie czynnych kompleksów dwuskladni¬ kowych, skladajacych sie z kwasu poliryboinozynowego (skladnik A), o wzorze 1, w którym k oznacza liczbe calkowita 1-3, a symbol b oznacza liczbe calkowita 1—2000 lub tez jego soli amonowych lub soli metali i z kwasu polirybo-2-tiocytydylowego (skladnik B), o wzorze 2, w którym m oznacza liczbe calkowita 1—3, a n oznacza liczbe calkowita 1—2000, lub tez jego soli amonowych lub soli metali.Wyzej wymienione zwiazki kompleksowe moga byc stosowane do ochrony lub do leczenia zwierzat kregowych przeciw zakazeniom spowodowanym przez wirusy, bakterie i pierwotniaki, przy czym zwiazki te wykazuja równiez zdolnosci hamowania wzrostu tkanki nowotworowej jak i charakteryzuja sie zdolnoscia wzmacniania immunologicznych mechanizmów obronnych. Kompleksy dwuskladnikowe (A + B) lub ich sole amonowe wzglednie sole metali dzialaja na zwierzeta kregowe wzglednie na kultury tkankowe zwierzat krego¬ wych antymikrobowo, a zwlaszcza antywirusowo, jak równiez onkostatycznie.Kompleksy dwuskladnikowe wedlug wynalazku moga byc wiec stosowane jako srodki lecznicze lub sluzyc do otrzymywania srodków leczniczych.Kompleksy dwuskladnikowe wedlug wynalazku skladaja sie z kwasu pol iryboinozy nowego o wzorze 1, lub jego soli amonowej wzglednie soli metali i z kwasu polirybo-2-tiocytydylowego o wzorze 2, lub jego soli amonowej wzglednie soli metali.Korzystne sa przede wszystkim kompleksy dwuskladnikowe, w których symbol k oznacza wartosc liczbowa 1 i kompleksy dwuskladnikowe, w których symbol m oznacza wartosc liczbowa 1, a zwlaszcza kompleksy dwuskladnikowe, w których k = m = 1.Celowe jest aby w tych wyrózniajacych sie kompleksach dwuskladnikowych wartosc liczbowa oznaczona symbolem b byla wieksza od 2, korzystnie wieksza od 10, a zwlaszcza wieksza od 100. Równie korzystne jest, gdy symbol n oznacza wartosc liczbowa wieksza od 2, a zwlaszcza wieksza od 10, a przede wszystkim wieksza od 100. Szczególnie preferowane sa wiec kompleksy dwuskladnikowe,w których k = m = 1, a b oznacza wartosc liczbowa wieksza od 10, a zwlaszcza wieksza od 100, jak równiez jesli n oznacza wartosc liczbowa wieksza od 10, a zwlaszcza wieksza od 100.2 83667 Stwierdzono, ze mozna wytworzyc kompleksy dwuskladnikowe, skladajace sie z oznaczonego symbolem A kwasu poliryboinozynowego o wzorze 1, lub jego soli amonowej lub soli metali i z oznaczonego symbolem B kwasu polirybo-2-tiocytydylowego o wzorze 2, lub jego soli amonowej lub soli metali, jesli miesza sie roztwory, przede wszystkim roztwory wodne o okreslonym stezeniu jonowym homopolinukleotydów o wzorze 1 i o wzo¬ rze 2, lub tez jeden ze skladników wytwarza sie w roztworze innego skladnika. Sposobem wedlug wynalazku moga byc przede wszystkim wytwarzane szczególnie cenne kompleksy dwuskladnikowe.Kompleksy dwuskladnikowe wedlug wynalazku moga byc stosowane w postaci preparatów farmaceutycz¬ nych zawierajacych skladniki czynne ewentualnie w postaci ich soli amonowych lub soli metali razem z co najmniej jednym stalym, cieklym, pólcieklym i/lub gazowym srodkiem pomocniczym, nosnym lub pednym jak i ewentualnie równiez z co najmniej jednym innym zwiazkiem czynnym.Zalecane preparaty farmaceutyczne zawieraja 0,001 do 200 mg substancji czynnej wytwarzanej sposobem wedlug wynalazku i co najmniej jeden staly, plynny, pólplynny i/lub gazowy srodek pomocniczy nosny lub pedny.Mozna równiez osiagnac dzialanie antymikrobowe i/lub onkostatyczne u zwierzat kregowych, za pomoca podania czynnej dawki kompleksu dwuskladnikowego, skladajacego sie ze skladnika oznaczonego wyzej •symbolem A okreslonego wzorem 1 i ze skladnika okreslonego symbolem B o wzorze 2 lub ich soli amonowych lub soli metali.Kompleks dwuskladnikowy, skladajacy sie ze skladnika A o wzorze 1 iB o wzorze 2 lub ich soli amonowych lub soli metali mozna stosowac jako srodek inicjujacy interferon. Mozna równiez otrzymac interferon, jezeli kultury komórkowe poddaje sie dzialaniu kompleksów dwuskladnikowych, skladajacych sie z kwasu poliryboinozynowego o wzorze 1 i kwasu polirybo-2-tiocytydylowego o wzorze 2 lub ich soli amono¬ wych lub soli metali, po czym z kultur komórkowych izoluje sie interferon.Pod nazwa kompleksu dwuskladnikowego nalezy rozumiec agregaty utworzone ze zwiazku okreslonego wyzej symbolem A o wzorze 1 i ze zwiazku okreslonego symbolem B o wzorze 2, które okresla sie jako kompleks A + B, przy czym w kompleksie tym skladniki moga wystepowac w róznych proporcjach molowych, a same kompleksy moga charakteryzowac sie rózna budowa. Kompleks moze na przyklad istniec w formie podwójnego lancucha, z których kazdy sklada sie z jednego homoplinukleotydu a oba sa jednakowej dlugosci, to znaczy posiadaja te sama liczbe zasad a poniewaz homopolinukleotydy te maja charakter polimeru o nieujedneliconym ciezarze czasteczkowym, tj. liczba zasad w polimerze o tej samej dlugosci lancucha moze byc wartoscia zmienna, polimery te moga wystepowac wiec równiez w postaci zespolów o innym skladzie.Liczba zasad dopelniajacych sie wewnatrz jednego kompleksu przy tym moze nie byc równa. Ze wzgledu na niejednolity ciezar molowy, jeden lancuch zwiazku oznaczonego symbolem A moze wiazac sie z dwoma lub kilkoma zbyt dlugimi lub zbyt krótkimi lancuchami B albo tez moze byc odwrotnie. Moze to zachodzic równiez i w tym przypadku, gdy stezenia ogólne kwasu i nozynowego i 2-tiocytydylowego sa równe. Sa równiez mozliwe struktury, które moga byc najlepiej przedstawione za pomoca potrójnego lancucha.We wszystkich wiec przypadkach ze wzgledu na stechiometrie czynnego kompleksu która w obecnej chwili nie jest jeszcze dokladnie znana, obok kompleksu w roztworze reakcyjnym moze ewentualnie wystepowac w nadmiarze wolny homopolinukleotyd i w wielu przypadkach nie bedzie mógl byc od niego oddzielony, co jednak w zasadzie nie wplywa na czynnosc kompleksu. Szczególnie waznym aspektem wynalazku jest to, ze zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku powoduja indukowanie tworzenia substancji w szczególnosci interferonów, które powstrzymuja wzrost wirusów w zwierzat kregowych wzglednie w kulturach komórkowych zwierzat kregowych.Znaczenie interferonów, które sa okreslone równiez innymi nazwami, jak „czynnik hamujacy wzrost wirusów" i „substancje hamujace dzialanie wirusów", jest dyskutowane w literaturze i polega na tym, ze sa one do dzis jedynym znanym czynnikiem antywirusowym o szerokim spektrum dzialania.* Wedlug dzisiejszego stanu wiedzy interferony sa okreslane jako bialka pochodzenia komórkowego o róznych ciezarach molekularnych. Hamuja one rozmnazanie wirusów, który wymaga mechanizmu syntezy kwasu rybonukleinowego i bialka, za pomoca wewnatrzkomórkowego. Interferony sa specyficzne rodzajowo, to znaczy dzialaja tylko w komórkach tego samego lub blisko spokrewnionego rodzaju zwierzat, z których pochodza. Sa jednak wiruso- niespecyficzne, to znaczy dzialaja przeciw róznym nie spokrewnionym rodzajom wirusów. Nie posiadaja zadnego bezposredniego dzialania dezaktywujacego wirus. Jako bialka moga byc one rozkladane przez trypsyne, a wiec pozbawione czynnosci.Ochrona wzglednie leczenie zwierzecia kregowego zaatakowanego przez infekcje wirusowa, moze nastapic przez bezposrednie podanie kompleksu A + B lub jego soli metali lub soli amonowych, na przyklad doustnie, w formie kapsulek lub za pomoca zastrzyków (dozylnie, domiesniowo lub doodbytniczo) ich sterylnego83667 3 roztworu lub przez zastosowanie domiejscowe, np. w formie kropli, masci, czy aerozoli. Mozna tez wzbudzac wytwarzanie interferonów w kulturach komórkowych za pomoca kompleksu A + B zwlaszcza w danym rodzaju zwierzat leczonych i ewentualnie podawac interferony otrzymane z tych kultur komórkowych.Poza tym podawanie kompleksu A + B lub ich soli amonowych lub soli metali powoduje równiez ochrone przeciw infekcjom, np. wywolanym przez bakterie lub pierwotniaki. Mozna przy tym przyjac, ze swoiste i nieswoiste mechanizmy obronne organizmu przeciw infekcjom sa równiez wzmocnione. Wzmocnienie swoistych tzn. immunologicznych mechanizmów obronnych opiera sie np. na wzmozonym wytwarzaniu przeciwcial. Efekt ten moze byc wykorzystany równiez do polepszania efektu szczepienia przy szczepieniach szczepionkami nie zawierajacymi zarazków zdolnych do rozmnazania.Wywolane przez szczepionke wytwarzanie przeciwcial moze byc wzmozone przez równolegle podawanie kompleksów A + B lub ich soli metali lub soli amonowych.W ten sposób mozna osiagnac ten sam efekt przy mniejszej ilosci szczepionki, a tym samym przy zmniejszonym ryzyku — lub tez przy tej ilosci szczepionki moze byc osiagniete lepsze dzialanie szczepionki.Homopolinukleotydy stosowane do otrzymywania kompleksów A + B lub ich soli amonowych lub soli metali posiadaja szkielet pantozanofosforanowy, w którym pentoza jest ryboza. Jako zasady zawieraja one hypoksantyne lub 2-tiocytozyne. Sa one otrzymywane znanymi metodami np. przez poddawanie dwu- itrójfosforanów nukleozydowych dzialaniu enzymu polimeryzujacego.Wytwarzanie kompleksów A + B lub ich soli metali lub soli amonowych ze skladnika oznaczonego symbolem A o wzorze 1 i ze skladnika oznaczonego symbolem Bo wzorze 2 odbywa sie wedlug znanych metod, np. przez zmieszanie wodnych roztworów obu homopolinukleotydów w temperaturze 10°—95°.Na ogól ustawia sie przy tym odpowiednie stezenie jonów przez dodanie nieorganicznych i/1ub organicz-' nych soli, przede wszystkim halogenków metali alkalicznych, w szczególnosci NaCI, a które to stezenie korzystnie jest utrzymac miedzy 0,001 a 1,0. Wielkosci pH roztworów moga lezec miedzy 5,0 a 11,5; najkorzystniej jest pracowac przy wielkosciach pH miedzy 6,5 a 11.Aby osiagnac utrzymanie odpowiedniej wartosci pH pracuje sie przewaznie ze zbuforowanymi roztworami homopolinukleotydów. Jako substancje buforujace stosuje sie np. organiczne lub nieorganiczne sole metali alkalicznych, przede wszystkim sole sodowe, w szczególnosci kakodylan sodu. Obok tego mozna stosowac jako substancji buforujacych wzgl. w mieszankach buforujacych ogólnie uzywanych soli, jak np. octanu sodu, KH2P04, Na2HP04, kwasnego winianu potasu lub cytrynianu sodu; i np. równiez chlorowodorku trój-(hydro- ksymety lo)-aminometanu. Ewentualnie mozna równiez dodawac rozpuszczalników organicznych, mieszajacych sie z woda np. jedno- lub wielowodorotlenowych alkoholi, jak metanolu, propanolu, glikolu etylenowego lub gliceryny, lub np. aprotycznych rozpuszczalników dwupolarnych jak dwumetylosulfotlenku, formamid?lub dwumetyloformamidu.Aby osiagnac pozadane i korzystne dla wytworzenia kompoleksu stezenie jonowe, mozna zmieszac jednakowe objetosci roztworów, które przede wszystkim zawieraja jednakowe stezenia skladników (w przelicze¬ niu na zasady) i w kazdym przypadku posiadaja pozadane stezenie jonowe. Mozna jednak równiez mieszac rózne objetosci roztworów o róznej koncentracji i róznym stezeniu jonów w taki sposób by mieszanina reakcyjna posiadala w koncu odpowiednie stezenie jonowe. Przede wszystkim nalezy wtedy zwazac na to, by i w tym przypadku istnialy w mieszaninie reakcyjnej równomolowe ilosci (w przeliczeniu na zasady) obu skladników.Kompleksy mozna jednak równiez wytwarzac przy stosowaniu niejednakowych ilosci molowych obu skladników, przy tworzeniu kompleksów, poniewaz rodzaj tworzacych sie kompleksów dwuskladnikowych w zasadzie jest niezalezny od stosunku molowego skladników, a glównie jest okreslony przez stezenie jonowe i wartosc PH srodowiska reakcyjnego.Inny sposób otrzymywania kompleksów A + B lub ich soli metali lub ich soli amonowych polega na tym, ze jeden ze skladników otrzymuje w mieszaninie reakcyjnej w obecnosci drugiego. Przykladowo mozna w wodnym roztworze skladnika oznaczonego symbolem A i kwasu polirybo-2,4-dwutiourydylowego ten ostatni homopolinukleotyd przeksztalcic za pomoca dzialania jonami siarczynowymi i/lub dwusiarczynowymi w obec¬ nosci srodka utleniajacego najkorzystniej przy wartosciach pH miedzy 4, 5 a 9, w szczególnosci przy pH 7 w kwas polirybo-4 sulfo-tiourydylowy, a ten przeksztalcic dzialaniem amoniaku i/lub jonów amonowych przy wartos¬ ciach pH miedzy 7 a 10,a szczególnie przy pH 8,5 w skladnik B, który albo natychmiast lub tez po ustawieniu odpowiedniego stezenia jonów, wzglednie pozadanej wartosci pH stworzy z drugim juz istniejacym w mieszaninie reakcyjnej czynnikiem kompleks dwuskladnikowy wedlug wynalazku.Jako zródlo jonów siarczynowych wzglednie dwusiarczynowych stosuje sie przede wzystkim siarczyny metaii alkalicznych i/lub kwasne siarczyny, a zwlaszcza siarczyn sodu. Jako zródlo jonów amonowych mozna stosowac sole amonowe, korzystnie halogenki amonowe, a zwlaszcza chlorek amonu.4 83667 Dalszy sposób polega na tym, ze roztwór wodny/zawierajacy juz jeden skladnik w formie homopolinu- kleocytydu, natomiast drugi skladnik jako monomeryczny dwu- lub trójfosforan nukleozydu zadaje sie enzymem polimeryzujacym. Takze tutaj drugi skladnik wytwarzany jest im situ, przy czym nie jest bez znaczenia, czy monomeryczne fosforany nuklezydowe sa zasocjowanc z juz istniejacymi skladnikami polimerycznymi, np, wodorowymi wiazaniami mostkowymi, czy tez nie.Uklad fizjologiczny zwierzat kregowych charakteryzuje sie jak wiadomo szeroka zdolnoscia buforowania jak i regulowania zawartosci soli, a tym samym utrzymywania okreslonej wartosci pH jak i okreslonego stezenia jonów i dlatego tez jest w szerokich granicach obojetne w jakich warunkach otrzymany zostal kompleks A + B.Dzialanie i tak zostanie na ogól wywolane przez kompleks najbardziej stabilny w warunkach fizjologicznych.Równiez inne kompleksy otrzymane ewentualnie w warunkach niefizjologicznych przeksztalcaja sie dopiero w organizmie zwierzecym lub w kulturze komórkowej w kompleks czynny.Mozliwe jest nawet osiagniecie dzialania ochronnego przy osobnym podawaniu obu homopolinukleotydów i w ten sposób tworzenie kompleksu nastepuje dopiero w organizmie, wzglednie w kulturze komórkowej.Kompleks A+B moze byc charakteryzowany albo za pomoca metod fizycznych, jak oznaczenie przesuniecia hyperchromowego w widmie absorpcyjnym w nadfiolecie, widma ORD, stalej Svedberga, Tm, frakcjonowanie gradientu stezen sacharozy, chromatografii lub takze za pomoca metod biologicznych takich jak zdolnosc indukowania wytwarzania interferonu. W warunkach prób opisanych nizej zaden z pojedynczych lancuchów polinukleotydów nie wykazuje tej czynnosci. Wytwarzanie interferonu jest najwazniejsza mozliwoscia dla scharakteryzowania kompleksów dwuskladnikowych wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku poniewaz czulosc metod fizycznych czesto nie wystarcza do charakteryzacji.Poniewaz widmo kompleksu w nadfiolecie wykazuje przesuniecie hyperchromowe w stosunku do widma sumarycznego obu skladników (na przyklad otrzymane przez graficzne sumowanie widm roztworów, które w kazdym przypadku posiadaja jednakowe stezenia wynoszace jednak tylko 50% stezenia kompleksu obu skladników), mozna tworzenie A+B stwierdzic przez pomiar hyperchromii (w procentach) przy szczególnie wielu dlugosciach fal.Szczególnie dobra mozliwosc charakteryzowania takiego dwuskladnikowego kompleksu jest stwierdzenie jego dzialania biologicznego, które moze byc najprosciej stwierdzone przez pomiary jego dzialania ochronnego przeciw infekcji wirusowej, mierzonego w kulturze komórkowej. Przygotowuje sie na przyklad szereg rozciencze- niowy kompleksu w medium podtrzymujacym kulture komórkowa i tymi przygotowanymi o róznych rozcien- czeniach roztworami pokrywa sie na przyklad scisla warstwe komórek, drugorzedowych komórek z nerek królika i poddaje sie je dojrzewaniu wciagu okolo 18—24 godzin w temperaturze 35°—37°C. Nastepnie usuwa sie ciecz z naczyn z kultura komórkowa, a komórki zakaza odpowiednim wirusem, na przyklad wirusem Herpes — simplex i pokrywa agarem i tak dlugo poddaje dojrzewaniu az wskutek zakazenia wirusowego wystepujace zniszczenie komórek w nietraktowanych plytkach kontrolnych nie doprowadzi do widocznych dziur w scislej warstwie komórek tzw. ,,plaques". Po zabarwieniu komórek dziury liczy sie i ustala to stezenie kompleksu, które prowadzi do 50% zmniejszenia ilosci „dziur" w stosunku do kultur kontrolnych, niepoddanych dzialaniu kompleksu.W analogicznym szeregu prób mozna udowodnic przez zastosowanie róznych rodzajów komórek i róznych rodzajów wirusów, ze dzialanie ochronne kompleksu nie jest zwiazane ani z okreslonym rodzajem komórek, ani z okreslonym rodzajem wirusów. Dla udowodnienia indukcji interferonu za pomoca kompleksu A + B pokrywa sie scisla warstwe komórek, na przyklad z nerek królika lub z komórek embrionalnych myszy, roztworem kompleksu A + B w medium podtrzymujacym.W ten sposób komórki sa pobudzone do wydzielania interferonu. Ten interferon mozna znanymi sposobami izolowac z wierzchniej warstwy cieczy i scharakteryzowac go.Dla stwierdzenia hamujacego dzialania interferonu na wirusy poddaje sie np. dojrzewaniu warstwy komórek z komórek nerkowych królika z interferonem króliczym przez noc, a nastepnie zakaza wirusem. Dalszy przebieg próby jest identyczny z opisanym uprzednio testem redukcyjnym „plagues". Tym sposobem mozna zmierzyc zawartosc interferonu. Przez stosowanie róznych rodzajów wirusów np. Herpes-simplex, Vaccinia, Vesicular-Stomatitis ustala sie brak swoistosci wirusa.Specyficznosc rodzajowa jest udowodniona gdy np. komórki embrionalne myszy poddaje sie dzialaniu inerferonu króliczego. W tej próbie nie jest hamowane rozmnazanie wirusa. Mozna równiez wykazac ze interferon, potraktowany trypsyna przestaje dzialac ochronnie.Zaleznosc dzialania interferonu od syntezy RNA i protein komórkowych mozna udowodnic np. w ten sposób, ze poddaje sie dzialaniu interferonu komórki, w których aparat syntezy zostal zablokowany aktynomy- cyna D. W komórkach tych na przyklad rozmnazanie wirusa Vesicular-Stornatitis nie jest hamowane.83667 5 Uwalnianie interferonu u^wierzat kregowych wzglednie u czlowieka po podaniu kompleksu A_+ B mozna np. udowodnic przez dozylne wstrzykniecie królikowi lub myszy roztworu kompleksu w rozpuszczalniku fizjologicznym np. roztworze buforowym Hanks'a, nastepne pobranie krwi u zwierzecia np. po uplywie 2—6 godzin i scharakteryzowaniu interferonu w surowicy krwi wedlug metod wyzej podanych. Dowód dzialania ochronnego kompleksu A + B przeciw wirusom mozna przeprowadzic równiez bezposrednio w próbie na zwierzetach, gdy np. myszy podaje sie dootrzewnowo roztwór kompleksu A + B w rozpuszczalniku fizjologicz¬ nym, a nastepnego dnia zakaza np. wirusem Herpes-simplex. W zaleznosci od dawki leczenie prowadzi do przedluzenia czasu przezycia, podczas gdy nie leczenie myszy kontrolne gina na skutek zakazenia. Podobnie mozna wykazac dzialanie ochronne kompleksu w stosunku do znacznej liczby wirusów jak Vaccinia, Vesicular- Stomatitis, czy wirus grypy.Analogicznie mozna stwierdzic dzialanie ochronne przeciw innym infekcjom np. spowodowanym przez drozdze jak Cryptococcus neoformans, przeciw bakteriom, jak penumokoki lub przeciw pierwotniakom jak Plasmodium berghei lub Eperythrozoon coccoides.Szczególna wlasnoscia kompleksu A + B jest podwyzszenie specyficznych procesów obronnych. Stwierdzo¬ no np. przy zaszczepianiu morskich swinek szczepionka wirusa grypy, ze jesli czesc zwierzat leczy sie kompleksem A + B, wówczas w surowicy krwi zwierzat leczonych przeciwciala sa wykrywane wczesniej i osiagaja wyzsze miano niz u zwierzat kontrolnych. Przeciwciala mierzy sie znanym sposobem za pomoca reakcji hamowania hemaglutynacji lub reakcji wiazania dopelniacza.Podwyzszenie ochrony przy szczepieniu moze byc udowodnione równiez bezposrednio, np. za pomoca zaszczepienwl myszy szczepionka wirusa grypy i nastepnie poddanie leczeniu czesci zwierzat za pomoca kom¬ pleksów A + B i np. po 14 dniach od szczepienia zakazenie wszystkich zwierzat wirusem grypy. Sposród zwie¬ rzat leczonych kompleksem A + B przezywa zakazenie wiekszy procent niz sposród zwierzat nie leczonych.Kompleks A + B wykazuje dzialanie nie tylko przy zakazeniach lecz równiez i przy nowotworach. Mozna to wykazac np. na myszach, którym wszczepiono komórki nowotworowe Ehrlich-Ascites. Zwierzeta leczone* kompleksami A + B zyja w tej próbie dluzej niz nie leczone. Kompleks A + B lub jego sole metali lub amonowe mozna podawac droga pozajelitowa lub domiejscowo, szczególnie na sluzówke, jak donosowo, uospojówkowo i na drogi oddechowe. Dawka czynna zalezy od rodzaju zwierzecia i w pewnym stopniu od wirusa, w stosunku do którego ma dawac ochrone. U myszy dawka progowa wynosi okolo 0,5 mg/kg, podczas gdy u królika okolo 0,05/zg/kg.Ponizej podany jest sposób otrzymywania kompleksów dwuskladnikowych wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku jak równiez ich zastosowanie. Podane ponizej stezenia dla polinukleotydów odnosza sie zawsze do nukleotydów moYiomerycznych, z których buduje sie polimery, a dla których ciezar czasteczkowy (molowy) przyjety jest obliczony ciezar molowy (nukleozydomonofosforan minus woda). Powstajacy przy tym blad, pochodzacy z nieuwzgledniania grup koncowych moze byc pominiety.W miejsca nizej wymienionych mediów podtrzymujacych kultury komórkowe moga byc oczywiscie stosowane równiez inne media, poniewaz nie maja one wplywu na dzialanie kompleksu dwuskladnikowego, a istotne znaczenie maja jedynie dla samych kultur komórkowych. Stosowany w nizej podanych przykladach kwas poliryboinozynowy oznaczany symbolem A jest zwyklym produktem handlowym i posiada wartosc S20w = 5,3.Kwas polirybo-2-tiocytydylowy oznaczany symbolem B, który zostal zastosowany w ponizszych przykla¬ dach, mozna otrzymac wedlug znanych metod, opisanych w niemieckim wylozeniowym opisie patentowym (Deutsche Offenlegungsschrift) nr 2041735, zwlaszcza w przykladzie I tego opisu. I tak 4 ml wodnej mieszaniny (pH 8,3) zawierajacej 0,4 mM chlorowodorku trój-(hydroksymetylo)-aminometanu (Tris.HCI), 0,008 mM MgCI2 0,04 mM soli dwusodowej 2-tiocytydyno-5-dwufosforanu 0,04 mM dwutiotreitolu i 10 jednostek enzymatycz¬ nych polinukleotydofosforylazy (aktywnosc swoista 0,165 mM UDP/godz. X mg bialka w temperaturze 37°) inkubowano 4 godziny w temperaturze 37°. Po oddzieleniu bialka i 48 godzinnej dializie w temperaturze 3° zatezonej do 1,5 ml wodnej fazy w stosunku do 0,01 M (Tris.HCI) (pH 7,0) otrzymano skladnik B, który wykazal wartosc S20w = 8,3 i byl zastosowany w ponizszych przykladach. (Oczywiscie mozna zastosowac równiez preparaty A wzglednie B z innymi wartosciami S20w)- Przyklad I. Do 0,53 ml 0,01 M roztworu buforowego chlorowodoru trój-(hydroksymetylo)-aminome- tanu (pH = 7) który zawiera 0,19jtiM/ml skladnika B, dodaje sie 1,37 ml roztworu soli Hanks'a (patrz np.: J.M.Hoskins, Virological Procedures, London 1967, strona 313) i miesza nastepnie z 0,10 ml roztworu soli Hanks'a (pH7,0), który zawiera 1 fiM/ml skladnika A. Mieszanine, która zawiera po 0,1 juM/ml skladnika A i B, pozostawia sie na 1 godzine w temperaturze pokojowej i otrzymuje sie w ten sposób roztwór kompleksu A + B.Hyperchromia w stosunku do widma sumarycznego skladnika przy 250 nm wynosi 18%, przy 260 nm 18,2% przy 270 nm 20,8%, przy 280nm 17%. A max= 247,5 nm; Amin = 226 nm; (M)340 = L2' 103,(M)320 =0;6 83667 (Wsoa - 1,4- 103, (M)297 =0; {M)262 =21,8- 103, (M)242 =0; (M)232 = 18,8- 103, pozorna pK - 11,6; punkt izozbestyczny = 230 nm w temperaturze 0° — 100° kompleks A + B nie wykazuje w wodzie zadnego Tm7 w wodnej mieszaninie zawierajacej 30% glikolu etylenowego i 0,05 M jonów Na+ pojawia sie ostre przejscie przy Tm = 77°. Srednia wartosc S20w kompleksu A + B wynosi 12,4; integralny rozdzial wartosci S20w A + B podano w tablicy 1 (pomiar w 0,1 molarnym buforze fosforanowym, pH 7, po 97 minutach przy 20 000 obr/min.). W przeciwienstwie do wolnego kwasu polirybo-2-tiocytydylowego, kwas ten w kompleksie dwusklad¬ nikowym nie jest atakowany przez polinukleotydofosforylazy.Tablica 1 S20,w 5,5 6,5 7.5 8.5 9.7 10,5 11,5 12,5 13,5 14,5 15,5 C/c 0,02 0,04 0,08 0,13 0,20 0,28 0,39 0,50 0,83 0,93 1,00 Przyklad II. Rozpuszcza sie 0,32 mg skladnika A w 10 ml 0,001 M roztworu kakodylanu sodu (pH = 7) zawierajacego 59 mg NaCI, po czym dodaje sie 1 ml 0,001 M roztworu skladnika Bi calosc pozostawia w temperaturze pokojowej. Tworzenie kompleksu obserwuje sie spektrometrycznie. Otrzymuje sie roztwór kompleksu A+B, którego wlasnosci sa identyczne z podanymi dla kompleksu A + Bw przykladzie I.Przyklad III. 5 ml wodnej mieszaniny (pH = 8,3) zawierajacej 0,5 mM buforu chlorowodorku trój-(hydroksymetylo)-aminometanu, 0,01 mM MgCI2, 0,05 mM skladnika B i 0,16 mg 2-tiocytydyno-5-dwufos- foranu dwusodowego zadajesie 5 jednostkami enzymatycznymi polinukleotydofosforylazy (aktywnosc swoista 0,165 mM UDP/godz. mg bialka w temperaturze 37°) i calosc pozostawia na 4 godziny w temperaturze 37°. Po usunieciu bialka za pomoca wielokrotnej ekstrakcji za pomoca CHCL3) alkohol izoamylowy zateza sie faze wodna w temperaturze 15° do objetosci 2 ml i dializuje 48 godzin w temperaturze 3° w stosunku do 0,01 M buforu chlorowodorku trój-(hydroksymetylo)-aminometanu. Otrzymuje sie roztwór kompleksu A + B, który ma te same wlasnosci jak kompleks otrzymany wedlug przykladu I.Przyklad IV. Do 4 ml 0,001 M roztworu kakodylanu sodu, zawierajacego 24 mg NaCI, 0,1 mM kwasu polirybo-2,4-dwutiourydylowego i 0,1 mM skladnika B, dodaje sie 20/im odczynnika siarczynowego, skladaja¬ cego sie z 3 czesci objetosciowych 1 M roztworu Na2S03 i 1 czesci objetosciowej 1 M roztworu NaHS03 i po 1 godzinie dodaje sie ponownie 20/il odczynnika siarczynowego. Po uplywie 1 godziny reakcje przerywa sie, dodaje sie 0,5 ml 0,2 M roztworu NH4CI, odczyn mieszaniny doprowadza sie do wartosci pH 8,5 za pomoca wodnego roztworu amoniaku i pozostawia calosc na okres 1 godziny w temperaturze pokojowej po czym zateza do objetosci 2 ml, a nastepnie dializuje wciagu 60 godzin w temperaturze 3° w stosunku do 0,01 M bufora chlorowodorku trój-(hydroksymetylo)-aminometanu. Otrzymuje sie roztwór kompleksu A + B, który wykazuje identyczne wlasnosci jak kompleks otrzymany wedlug przykladu I.Przyklad V. Z roztworu kompleksu A+B, wytworzonego wedlug przykladu I przygotowuje sie roztwór podstawowy przez dodanie 18 ml medium podtrzymujacego kultury komórkowe, a skladajacego sie z handlowego Tissue culture medium (TCM) 199 z dodatkami 0,168% NaHC03 jak równiez 100 IE penicyliny i 100 jug streptomycyny na 1 ml. Po czym przez wielokrotne rozcienczenie roztworu w stosunku 1 :10 za po¬ moca wyzej wymienionego medium podtrzymujacego kulture otrzymuje sie szereg rozcienczeniowy. Kazdymi 10 ml rozcienczonych roztworów zalewa sie 7-mio dniowe scisle kultury komórkowe pierwszorzedowych komórek nerkowych królika w czworokatnych butelkach. Dla kazdego stopnia rozcienczenia uzywa sie 3 butelek oraz 3 butelek kontrolnych, które zalane sa jedynie medium podtrzymujacym-bez kompleksu A+B. Butelki poddaje sie dojrzewaniu w temperaturze 35°C przez noc w termostacie, zakaza nastepnie wirusem HerpesSim-83667 7 plex wedlug znanego sposobu zalewa agarem, po czym poddaje dojrzewaniu wciagu nastepnych 48 godzin w temperaturze 35° i otrzymuje sie druga warstwe agarowa do wybarwiania komórek. Po dalszych 24 godzinach dojrzewania widoczne juz golym okiem „dziury wirusowe" (Virusplaques) sa liczone pod lupa. Z trzech pojedynczych wartosci dla kazdego stopnia rozcienczenia oblicza sie wartosc srednia i ustawia w stosunku do wartosci sredniej kontrolnej. Na drodze graficznej uzyskuje sie z tych wartosci PRD50, tzn 50% dawke reakcyjna „dziury" (50% Plaqie-Reduktions-Dosis), która dawalaby zredukowanie liczby dziur o 50%. W dalszych próbach z tym samym roztworem kompleksu A + B wytworzono szeregi rozcienczeniowe w stosunku 1 :2 i 1 :4. Poza tym z pózniejszych próbach byly stosowane drugorzedowe zamiast pierwszorzedowych komórek nerkowych królika, a w jednym przypadku wirus Vaccinia zamiast Herpes-simplex. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabli¬ cy 2.Tablica 2 Próba Komórki Wirus PRD50/ug/ml 1 Pierwszorzed. nerkowe królika 2 3 Drugorzedowe 4 Drugorzedowe Zostaly równiez sprawdzone osobno skladniki A i B; nie zaobserwowano przy tym zadnej reakcji liczby „dziur", az do stezen 0,61 jug/ml.Przyklad VI. Przeprowadzono badania aktywnosci biologicznej kompleksu otrzymanego wedlug przykladu II, za pomoca testu obnizania ilosci „dziur". Badania prowadzono wedlug sposobu opisanego w przykladzie V, z ta róznica, ze uzyto wylacznie komórki drugorzedowe nerek króliczych. Medium podtrzy¬ mujace kultury komórkowe zastosowane w doswiadczeniach 3 i 4 nie zawieralo streptomycyny. Uzyskane wyniki ilustruje tablica 3.Tablica 3 Próba Komórki 1 Drugorzed. nerkowe królika 2^ ri it tt 11 «•* n tt tt 4 Herpes simpl.H Vaccinia Herpes-simpl. 0,0035 0,0065 0,0030 0,0061 Wirus Horpes-simpl.Vaccinia Herpes simpl.Herpes simpl. patentowe PRD50A/g/ml 0,013 0,00067 0,0015 0,0057 PL