Sposób otrzymywania P-D-glikozydu 4 -demetyloepipodofilotoksyny Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia //-D-glikozydu 4'-demetyloepipodofilotoksyny o wzorze 1.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze od ^-D-glikozydu cztero-0-acetylo-4'-karbobenzoksy-4'- -demetyloepipodofilotoksyny o wzorze 2 albo naj¬ pierw odszczepia sie hydrogenolitycznie grupe kar- bobenzoksylowa i tak otrzymany ^-D-glikozyd czte- ro-0-acetylo-4'-demetyloepipodofilotoksyny o wzo¬ rze 3 poddaje sie alkoholizie w obecnosci bezwod¬ nego octanu cynkowego albo najpierw grupy ace- tylowe odszczepia sie alkoholitycznie w obecnosci bezwodnego octanu cynkowego albo mieszaniny bezwodnego octanu cynkowego i octanu sodowego, a nastepnie usuwa sie grupe karbobenzoksylowa droga hydrogenolizy.Poszczególne etapy sposobu prowadzi sie naste¬ pujaco. Hydrogenolize prowadzi sie w znany spo¬ sób. Przy stosowanym tutaj wodorowaniu celowe jest uwodornianie bez nadcisnienia i w tempera¬ turze od 20° do maksymalnie 40° w obecnosci katalizatora palladowego, jak na przyklad, palla¬ du osadzonego na weglu albo na siarczanie baru.Jako rozpuszczalnik stosuje sie korzystnie alko¬ hole, takie jak na przyklad metanol lub etanol, z dodakiem 0,5—5% objetosciowych lodowatego kawsu octowego i 10—50% objetosciowych aceto-' nu. Ilosci katalizatora wynosza 1—5% wagowych w stosunku do wprowadzonej substancji. 20 25 Bylo nieoczekiwane, ze od ,/?-D-glikozydu cztero- -0-acetylo-4'-karbobenzoksy-4'-demetyloepipodofilo- toksyny ewentualnie od ^-D-glikozydu cztero-0-ace- tylo-4'-demetyloepipodofilotoksyny mozna odszcze- piac hydrolitycznie grupy acetylowe w typowych zasadowych i kwasowych warunkach, otrzymujac odpowiedni wolny glikozyd. Jak wiadomo glikozy¬ dy lignanowe pod wplywem zasad ulegaja epi- meryzacji, a podczas dzialania kwasami ulegaja rozpadowi przy równoczesnym odszczepieniu resz¬ ty cukrowej.Stwierdzono niespodziewanie, ze z /?-D-glikozy- du catero-0-aceitylo-4'-karbobe[nzoiksy-4/-demetyloepi- podofilotokisyny ewentualnie z /?-D-glikozydu czte- ro-0-acetylo-4'-demetyiloepipO!do!fi(loitak!syiny mozna usunac grupy acetylowe bez równoczesnej epime- ryzacji aglikonu na atomie wegla-3 i bez odszcze- piania calej reszty cukrowej, gdy zwiazki te pod¬ daje sie alkoholizie, zwlaszcza za pomoca metanolu, w obecnosci bezwodnego octanu cynkowego.Metanolize prowadzi sie w bezwodnym metano¬ lu w temperaturze wrzenia mieszaniny pod chlod¬ nica zwrotna. Ilosc katalizatora wynosi okolo 20—50% wagowych w stosunku do wprowadzo¬ nego /?-D-glikozydu cztero-0-acetylo-4'-demetyloe- pipodofilotoksyny. Czas trwania reakcji wynosi 15—30 godzin. Podczas metanolizy ,^-D-glikozydu cztero-0-acetylo-4'-demetyloepipodofilotoksyny two¬ rzy sie osad gdy zastosowuje sie octan cynku jako katalizator. W celu dalszej obróbki przeprowadza 831313 83 131 4 sie ten osad w roztwór przez dodanie kwasu octo¬ wego i lekkie ogrzanie.Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostalosc roz¬ puszcza sie w mieszaninie chloroformu i butanolu, a sole cynkowe usuwa sie wytrzasajac z woda.Z fazy organicznej otrzymuje sie po odparowaniu surowy ^-D-glikozyd 4'-demetyloepipodofilotoksy- ny, który oczyszcza sie w znany sposób, na przy¬ klad przez chromotografie i/lub krystalizacje.Jak podano wyzej, mozna przeprowadzic od- szczepianie grup chroniacych takze w odwrotnej kolejnosci, przy czym najpierw ogrzewa sie i/?-D- -glikozyd cztero-0-acetylb-4'-karbobenzoksy-4'deme- tyloepipodofilotoksyny pod chlodnica zwrotna w metanolu w obecnosci bezwodnego octanu cynko¬ wego i ewentualnie dodatku bezwodnego octanu sodowego tak dlugo, az zakonczy sie odszczepia- nie grup acetylowych, przy czym równoczesnie odszczepiaja sie czesciowo równiez grupy karbo- benzoksylowe. Z tak otrzymanej mieszaniny sklad¬ ników udaje sie wyizolowac nieznany dotad fi- -D-glikozyd 4'-karbobenzoksy-4'-demetyloepipodofi- lotoksyny o wzorze 4, który dalej droga hydroge- nolizy grupy karbobenzoksylowej przeprowadza sie w /?-D-glikozyd 4'-demetyloepipodofilotoksyny.Stosowany jako zwiazek wyjsciowy do otrzy¬ mywania //-D-glikozydu 4'-demetyloepipodofiloto- ksyny (3-D-glikozyd cztero-0-acetylo-4'-karboben- zoksy-4'-demetyloepipodofilotoksyny otrzymuje sie w nastepujacy sposób: Stwierdzono, ze 2, 3, 4, 6-cztero-O-acetylo-D-gli- koza w postaci czystego |3-anomeru reaguje zarów¬ no z 4'-karbobenzoksy-4'-demetylopodofilotoksyna o wzorze 5, jak i z 4'-karbobenzoksy-4'-demety- loepipodofilotoksyna o wzorze 6, to znaczy nie¬ zaleznie od stereochemii grupy OH w polozeniu C-l aglikonu w obecnosci kompleksu trójfluorku borowego i eteru etylowego w temperaturze po¬ nizej 0° w obojetnym w warunkach reakcji roz¬ puszczalniku, przy czym otrzymuje sie z duza wydajnoscia 0-D-glikozyd cztero-0-acetylo-4'-kar- bobenzoksy-4/-demetyloepipodofilotoksyny.Stosowana jako produkt wyjsciowy do otrzymy¬ wania P-D-glikozydu cztero-0-acetylo-4'-karboben- zoksy-4'-demetyloepipodofilotoksyny 4'-karbobenzo- ksy-4'-demetylopodofilotoksyne lub 4'-karbobenzo- ksy-4'-demetyloepipodofilotoksyne otrzymuje sie w nastepujacy siposób: 4'-demetylopodoMotoksyne o wzorze 7 lub 4'-demetyloepilpodofilo)toksyne o wzorze 8 poddaje sie reakcji z estrem benzylowym kwasu chloromrówkowego w obecnosci trzeciorze¬ dowej zasady organicznej w bezwodnym, obojet¬ nym w warunkach reakcji organicznym rozpusz¬ czalniku w temperaturze od —20 do —5° otrzy¬ mujac 4'-karbobenzoksy-4'-demetyloepipodofiloto- ksyne lub 4'-karbobenzoksy-4'-demetylopodofiloto- ksyne.Stosowana jako produkt wyjsciowy 4'-demetylo- epipodofilotoksyne mozna otrzymac przez epimery- zacje 4'-demetylopodofilotoksyny (patrz przyklad I).Otrzymywanie 4'-karbobenzoksy-4'-demetylopodofi- lotoksyny prowadzi sie w analogiczny sposób, wy¬ chodzac z 4'-demetylopodofilotoksyny, przy czym na 1 mol 4,-demetylopodofilotoksyny stosuje sie 1- -1,6 mola chlorku karbobenzoksylowego. 3-D-Glikozyd 4,-demetyloepipodofilotoksyny wy¬ kazuje in vitro wysokie dzialanie cytostatyczne na komórki mastocytomowe i kultury fibroblasltów.Poza tym charakteryzuje sie silnym dzialaniem 5 przeciwko eksperymentalnie wytworzonym nowo¬ tworem, zwlaszcza leukemii myszy L-1210.P-D-Glikozyd 4'-demetyloepipodofilotoksyny moz¬ na stosowac w lecznictwie do zwalczania proce¬ sów patologicznych, w których zachodzi zwiekszo- 1° ny podzial komórkowy na przyklad w nowotwo¬ rach zlosliwych. |3-D-Glikozyd 4'-demetyloepipodofilotoksyny sto¬ suje sie w dawkach okolo 1—50 mg dziennie.Nowy zwiazek znajduje dalsze zastosowanie jako 15 produkt przejsciowy w syntezie innych cytostatycz¬ nie wysokoatkywnych zwiazków jak na przyklad odpowiedniego zwiazku aryloalkilidenowego, które¬ go otrzymywanie opisane jest w opisie patentowym 63140. 20 (3-D-Glikozyd 4'-demetyIlo-epiipodofilotoksyny moz¬ na stosowac jako srodek leczniczy w odpowied¬ niej postaci leczniczej do stosowania doustnego, dojelitowego i pozajelitowego. W celu otrzymania odpowiednich postaci leczniczych miesza sie go 25 z organicznymi lub nieorganicznymi farmakologicz¬ nie nieczynnymi substancjami pomocniczymi.W 'podanych nizej przykladach, które wyjasniaja sposób wedlug wynalazku nie ograniczajac jego za¬ kresu, dane temperaturowe podaje sie w stopniach 30 Celsjusza. Temperatury topnienia ewentualnie roz¬ kladu oznaczono w bloku Koflera.Przeklad I. 4,-demetyloepipodofilotoksyna. 2 g 4,-demetylopodofilotoksyny rozpuszcza sie W 25 ml acetonu i 15 ml wody i po dodaniu 5 ml stezo- 35 nego kwasu solnego ogrzewa sie w ciagu 2 godzin pod chlodnica zwrotna. Nastepnie kwas zobojet¬ nia sie za pomoca stalego weglanu barowego, prze¬ sacza sie i z przesaczu aceton odpedza sie pod próznia w temperaturze 40°. Wytracony produkt rozpuszcza 40 sie w chloroformie zawierajacym 5% acetonu, roz¬ twór suszy sie nad siarczanem sodu i odparowuje pod próznia. Pozostalosc chromatografuje sie na zelu krzemionkowym eluujac chloroformem zawie¬ rajacym 1% metanolu, przy czym najpierw otrzy- 45 muje sie male ilosci zanieczyszczen, a potem czy¬ sta 4"demetyloepipodofilotoksyne, a nastepnie nie- przereagowany produkt wyjsciowy. Do krystaliza¬ cji czystych frakcji 4'-demetyloepipodofilotoksyny stosuje sie chloroform i metanol. Temperatura to- 50 pnienia produktu wynosi 288—230°, ( (c=0,630 w chloroformie).Przyklad II. 4'-karbobenzoksy-4'-demetyloe- pipodofilotoksyna. Z 60 g dokladnie sproszkowanej 4'-demetyloepipodofilotoksyny sporzadza sie zawie- 55 sine w 1000 ml bezwodnego chlorku etylenu i po zadaniu 19 ml bezwodnej pirydyny ochladza sie do temperatury —10°. Mieszajac pod zamknieciem za¬ bezpieczajacym przed dostepem pary wodnej wkra- pla sie w temperaturze —10° w ciagu 2,5 godzin 60 roztwór 34 g estru benzylowego kwasu chloromrów¬ kowego w 100 ml chlorku etylenu i nastepnie po¬ zostawia sie mieszanine reakcjna na dalsze pól godziny. Nastepnie mieszanine reakcyjna przemywa sie woda, faze organiczna suszy sie nad siarcza- 65 nem sodowym, odparowuje pod próznia, a pozo-5 83131 6 stalosc suszy w wysokiej prózni w temperaturze 70—80°. W wyniku krystalizacji surowego produk¬ tu z mieszaniny acetonu i eteru, a potem dwukrot¬ nej krystalizacji z metanolu otrzymuje sie 4'-kar- bobenzoksy-4'-demetyloepipodofilotoksyne. Przez su¬ szenie w wysokiej prózni najpierw w tempera¬ turze 95—110°, a potem w temperaturze 130°, albo przez krystalizacje z mieszaniny acetonu i e- teru otrzymuje sie postac wolna od rozpuszczal¬ nika o temperaturze topnienia 201—204°, ( —43,9° (c=0,535 w CHCb).Przyklad III. 4'-karbobenzoksy-4'-demetylo- podofilotoksyna. 15,0 g 4'-demetylopodofilotoksyny rozpuszcza sie w 450 ml cieplej mieszaniny bez¬ wodnego chlorku etylenu i czterowodorofuranu zmieszanych w stosunku 1:1, traktuje sie 6,0 ml bezwodnej pirydyny i chlodzi do temperatury —10°.Mieszajac i chlodzac wkrapla sie w ciagu 1,5 go¬ dziny 8 ml estru benzylowego kwasu chloromrów- kowego rozpuszczonego w 55 ml chlorku etylenu, a potem miesza sie w ciagu 1 godziny w tempe¬ raturze od —5 do —10°. Nastepnie odparowuje sie pod próznia w temperaturze lazni 40° do objetosci 200 ml, rozciencza 250 ml chlorku etylenu i prze¬ mywa roztwór 100 ml 1 n kwasu solnego, a po¬ tem woda do odczynu obojetnego. Po osuszeniu nad siarczanem sodowym odparowuje sie pod próz¬ nia i pozostalosc chromotografuje sie na 20-krotnej ilosci zelu krzemionkowego.Chloroform zawierajacy 1% metanolu eluuje naj¬ pierw male ilosci produktów ubocznych, potem czysta 4'-karbobenzoksy-4'-demetylopodofilotoksyne.Po krystalizacji z metanolu otrzymuje sie zwiazek o temperaturze topnienia 113—114°, (a) £ = —88,3° (chloroform).Przyklad IV. |3-D-glikozyd cztero-0-acetylo- -4'-karbobenzoksy-4'-demetyloepipodofilotoksyny. 10,7 g 4'-karbobenzoksy-4'-demetylopodofilotoksyny rozpuszcza sie ogrzewajac w 30 ml chlorku etyle¬ nu, roztwór chlodzi sie do temperatury +15° i do¬ daje 14,0 g 2,3,4,6-cztero-O-acetylo-p-D-glikozy. Po 5 minutach mieszania przy zabezpieczeniu przed dostepem pary wodnej chlodzi sie do temperatury —15° i w ciagu 5 minut Wkrapla 7 ml ochlodzo¬ nego do temperatury —10° kompleksu trójfluorku borowego i eteru etylowego (48% BF3). Nastep¬ nie miesza sie w ciagu 1 godziny w temperaturze —15°, a potem wkrapla roztwór 7 ml bezwodnej pirydyny w 20 ml chlorku etylenu. Po rozcien¬ czeniu 100 ml chloroformu przemywa sie 5 razy po 50 ml wody. Faze oraniczna suszy sie nad siarczanem sodowym, odparowuje sie pod próz¬ nia i pozostalosc suszy sie w temperaturze 60° pod próznia.Otrzymany pienisty produkt rozpuszcza sie w 50 ml goracego etanolu, chlodzi sie do tempera¬ tury okolo 50°, traktuje sie 150 ml zimnej wody i miesza sie tak dlugo, dopóki wystepujacy po¬ czatkowo w formie grudek ciagliwy osad nie prze¬ ksztalci sie w proszek w rodzaju piasku. Pro- dukgt odsacza sie, przemywa 40 ml 25% etanolu i suszy sie pod próznia w temperaturze 60°. Na¬ stepnie rozpuszcza sie w 200 ml oracego metanolu, przesacza sie i klarowny przesacz odparowuje sie pod próznia i suszy pozostalosc do stalej masy w wysokiej prózni w temperaturze okolo 80°. Otrzy¬ many w ten sposób |3-D-glikozyd cztero-0-acetylo- -4'-karbobenzoksy-4'-demetyloepipodofilotoksyny 5 jest identyczny z opisanym w przykladzie III.Przyklad V. 0-D-glikozyd cztero-0-acetylo- -4/-demetyloepipodofilotoksyny W celu odszczepiania reszty karbobenzoksylowej od P-D-glikozydu cztero-0-acetylo-4'-kafbobenzo- 0 ksy-4'-demetylioepidofilotoiksyny rozpuszcza sie 13,4 g tego zwiazku w 100 ml mieszaniny acetonu i etanolu w stosunku 1 :2, zadaje sie 0,5 ml lo¬ dowatego kwasu octowego i 2 g 10% palladu osadzonego na weglu i uwodarnia sie w tempe- 5 raturze 20°. Nastepnie odsacza sie katalizator, przemywa go ciepla mieszanina acetonu i meta¬ nolu i odparowuje sie przesacz pod próznia. Po¬ zostalosc zalewa sie 100 ml wrzacego etanolu, po- zostalwia krystalizacji, krysztaly odsysa sie, prze- 0 mywa metanolem i suszy pod próznia. Czysty |3- D-glikozyd cztero-0-acetylo-4'-demetyloepipodofilo- toksyny krystalizuje w postaci drobnych igiel ó temperaturze topnienia 225—227°, ( (c=l,024 w chloroformie). 5 Przyklad VI. P-D-GHkozyd 4'-demetyloepipo- dofilotoksyny. 25 g czystego p-D-glikozydu cztero- -0-acetylo-4'-karbobenzoksy-4'-demetyloepipodofilo- toksyny 3,6 g bezwodnego octanu cynkowego i 1,45 g bezwodnego octanu sodowego mieszajac ogrzewa sie w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w 150 ml metanolu. Po 2 i 4 godzinach oddesty- lowuje sie kazdorazowo po 12,5 ml metanolu. Na¬ stepnie kazdorazowo po uplywie 2 godzin dodaje sie 12,5 ml metanolu i ponownie oddestylowuje. Po 5 18 godzinach lacznie odszczepianie grup acetylo- wych jest zakonczone, a mieszanina zawiera okolo 60% (3-D-glikozydu 4'-karbobenzoksy-4'-demetyloe- pipodofilotoksyny i okolo 40% B-D-glikozydu 4'-. -demetyloepipodofilotoksyny. Przebieg reakcji sledzi D sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na plytkach z zelu krzemionkowego stosujac jako elu- ent nasycona woda mieszanine octanu izopropylo¬ wego i metanolu w stosunku 4:1; wywolywano przez spryskanie 0,2% roztworem siarczanu cero¬ wego (IV) w 50% kwasie siarkowym i ogrzewanie w temperaturze 110—130°.W celu dalszej przeróbki zadaje sie 5 ml lodo¬ watego kwasu octowego, odparowuje pod próznia w temperaturze lazni 50° i suszy w ciagu 15 minut w wysokiej prózni w temperaturze 50°. Pozostalosc rozpuszcza sie w 250 ml mieszaniny chloroformu i izopropanolu w stosunku 4 :1 i 25 ml wody, od¬ dziela faze wodna i przemywa warstwe organicz¬ na jeszcze raz 25 ml wody. Obie warstwy wodne ekstrahuje sie 50 ml mieszaniiny chloroformu i izo¬ propanolu i polaczone fazy organiczne po osusze¬ niu nad siarczanem sodu odparowuje sie pod próz¬ nia. Pozostalosc przemywa sie 3 razy kazdorazowo po 30 ml acetonu i nastepnie suszy dwie godziny w wysokiej prózni w temperaturze 75°.Z mieszaniny (3-D-glikozydu 4'-karbobenzoksy-4'- -demetyloepipodofilotoksyny i p-D-glikozydu 4'- -demetyloepipodofilotoksyny mozna otrzymac przez . krystalizacje z metanolu j3-D-glikozyd 4'-karboben-7 zoksy-4'-demetyloepipodofilotoksyny w niezbyt czy¬ stej postaci. Przez chromatografie na 100-krotnej ilosci zelu krzemionkowego stosujac eluowanie na¬ sycona woda mieszanina octanu izopropylu i me¬ tanolu w stosunku 9:1, otrzymuje sie czysty 0- -D-glikozyd 4'-karbobenzoksy-4'-demetyloepipodofi- lotoksyny, który po krystalizacji z acetonu topi sie w temperaturze 155—156°, (a)^ =—92,0° (c= =1,00 w chloroformie).W celu odszczepienia grupy karbobenzoksylowej rozpuszcza sie mieszanine fJ-D-glikozydu 4'-karbo- benzoksy-4'-demetyloepipodofilotoksyny i 0-D-gli- kozydu 4,-demetyloepipodofilotoksyny w 200 ml a- cetonu, dodaje roztwór do zawiesiny 3 g 10% palladu osadzonego na weglu w 50 ml wody i u- wodarnia sie do zakonczenia odszczepienia grupy chroniacej (1,5 godziny). Reakcje kontroluje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej w spo¬ sób, jak to bylo podane wyzej. Nastepnie odsacza sie katalizator, przemywa sie go 100 ml miesza¬ niny acetonu i wody w stosunku 4 :1 i odparo¬ wuje przesacz pod próznia do objetosci' okolo 40— 45 ml, przy czym wykrystalizowuje natychmiast P-D-glikozyd 4'-demetyloepipodofilotoksyny. Do cal¬ kowitego zakonczenia krystalizacji pozostawia sie jeszcze mieszanine na 20 minut w kapieli lodowej, odsacza otrzymane krysztaly, przemywa sie je 25 ml wody i suszy w wysokiej prózni w temperatu¬ rze 70°. Przez krystalizacje z metanolu otrzymuje sie czysty P-D-glikozyd 4'-demetyloepipodofiloto- ksyny o temperaturze topnienia 225—227° (a) ^ = = —88,6° (c=l,05 w metanolu).Przyklad VII. (3-D-gldikozyd 4'-demetyloepi- podofilotoksyny. 2,0 ig otrzymanego wedlug przykla¬ du V |3-D-glikozydu cztero-0-acetylo-4'-demetyloe- pipodofilotoksyny i 1 g bezwodnego octanu cyn¬ kowego ogrzewa sie pod chlodnica zwrotna w 30 ml bezwodnego metajnolu w ciagu 25 godzin Nastepnie otrzymany bialy osad rozpuszcza sie w kilku mililitrów lodowatego kwasu octowego i lek- 1131 8 ko ogrzewa, rozpuszczalniki odpedza sie pod pró¬ znia w temperaturze 40°, a pozostalosc rozpuszcza sie w 50 ml mieszaniny chloroformu z butano¬ lem 4:1. Faze organiczna przemywa sie dwukrot- 5 nie po 10 ml wody, po osuszeniu nad siarczanem sodu odparowuje pod próznia i chromatografuje pozostalosc na zelu krzemionkowym. Nasycona woda mieszanina octanu izopropylu i metanolu w stosunku 9 :1 eluuje najpierw niepolarne sklad- 15 niki, potem czysty P-D-glikozyd 4'-demetyloepipo- dofilotoksyny. Poszczególne frakcje bada sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na plyt¬ kach z zelu krzemionkowego stosujac jako roz¬ puszczalnik rozwijajacy nasycona woda mieszanine 20 octanu izopropylu i metanolu w stosunku 8:1.Frakcje zawierajace glikozyd laczy sie i dwukrot¬ nie przekrystalizowuje z metanolu. (3-D-Glikozyd 4/-demetyloepipodofilotoksyny topi sie w temperaturze 222—230°, (a) ^ = —88° (c= 25 =0,507 w metanolu). PL PL