Sposób mikrobiologicznego odwodorniania kortikosteroidów w polozeniu C—1,2 Przedmiotem wynalazku jest sposób mikrobiologicznego odwodorniania kortikosteroidów w polozeniu C-1,2.Znane jest odwodornienie pierscienia A steroidów w pozycji 1, 2 i dzisiaj jeszcze jest najwazniejsza mikro¬ biologiczna reakcja, przeprowadzana w skali przemyslowej. Sposób ten zastosowano przy wytwarzaniu androsta- diendionu (opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 2844513), prednisonu (szwedzki opis patentowy nr 212999) i wielu innych podstawionych, odwodornionych w polozeniu 1, 2 kortikosteroidów (np. opisy patentowe'St. Zjedn.Am. nr 2938834 i 3037912).Ze wzgledu na duze znaczenie reakcji mikrobiologicznej opracowano, wlasnie dla niej szereg sposobów postepowania, które w zasadzie róznia sie miedzy soba jedynie uzytym szczepem drobnoustroju. Nastepujace drobnoustroje posiadaja zdolnosc odwodorniania steroidów w polozeniu 1, 2: Arthrobacter simplex, Corynebac- terium Hoagii (opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 2837464), Bacterium cyclooxidans (opis patentowy St. Zjedn.Am. nr 3022226), Bacterium mycoides (opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 3037013), Bacterium havaniensis (opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 3037914), Alcaligenes faecalis (wegierski opis patentowy nr 151374).Wspólna cecha wymienionych sposobów jest przeprowadzenie przemiany substratu steroidowego w glównym naczyniu fermentacyjnym jednoczesnie z zalozeniem w nim hodowli, lub bezposrednio po tym.Innymi slowy, po odpowiednim przygotowaniu podloza zaszczepia sie je drobnoustrojem, posiadajacym zdol¬ nosc odwodorniania jak równiez wprowadza sie, równoczesnie z zaszczepieniem hodowla lub bezposrednio po tym substrat steroidowy, wysycony w polozeniu 1,2.W przypadku Arthrobacter simplex i Corynebacterium enzym dehydrogenaza 1,2-steroidowa ze wzgledu na swój indukcyjny charakter nie znajduje sie pierwotnie w komórkach bakteryjnych (wegierski opis patentowy nr 149062) lecz.powstaje dopiero w obecnosci steroidu pod wplywem dodania steroidu. Dodany substrat steroi¬ dowy wywoluje najpierw synteze enzymu. Po wytworzeniu odpowiedniej ilosci enzymu rozpoczyna sie reakcja odwodorniania, której szybkosc narasta proporcjonalnie do syntezy enzymu. W przypadku, gdy hodowla drobno¬ ustroju, synteza enzymu i odwodornienie steroidu przebiegaja równolegle zdarza sie czesto, ie hodowla bakte¬ ryjna wykazuje najwyzsza aktywnosc enzymu po zakonczeniu reakcji odwodorowania. W ten sposób przeksztal¬ cenie nastepuje przy znacznie nizszych, niz optymalne lub maksymalne. stezeniach enzymu.2 81032 Te strate podwyzsza Jaszcze znany fakt, ze w przypadku gdy do hodowli dodaje sie steroidu, wówczas inne enzymy bakteryjne rozkladaja go do polaczen o nizszej liczbie.atomów wegla w nastepstwie czego cala czastecz¬ ka zostaje wykorzystana w przemianach metabolicznych jako zródlo wegla (np Z. Naturforsch. 18b, 988,1963).Rozklad przebiega z duza szybkoscia,Wobec tego jednym z istotniejszych etapów mikrobiologicznego odwod^r- nienia steroidów w polozeniu 1, 2 jest przerwanie reakcji w ciagu paru minut w okreslonym momencie, w którym nastapilo calkowite odwp^rnjenie natomiast rozpad jeszcze nie osiagnal istotnych wartosci. Szybkie okreslenie odpowiedniego momentu i szybkie przerwanie reakcji wiaza sie z wieloma zagadnieniami.Dla zmniejszenia wystepujacego, w czasie odwodornienia, rozkladu steroidu proponuje sie, w podanych nizej opisach patentowych, zastosowanie odpowiednich substancji dodatkowych. W istocie hamuja one prze¬ miane drobnoustroju, a zwlaszcza funkcji powodujacych rozklad enzymów i zmniejszaja w ten sposób metaboli¬ zowanie steroidu. Takimi substancjami dodatkowymi sa np. alkohol, lub 0-fenylo-naftyloamina (brytyjski opis patentowy nr 908976), antybiotyki (opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 3010876), azydek sodowy, kwas mono- jodooctowy i inne inhibitory aktywnosci enzymatycznej (japonski opis patentowy nr 25644/67).Przy zastosowaniu tych inhibitorów uzyskiwano stale podwyzszone ilosci produktu, odwodornionego w po¬ lozeniu 1, 2. W ten sposób wykazano, ze bez substancji dodatkowych w zasadzie zwiazek steroidowy jest rozkla¬ dany przez enzymy bakteryjne. Ujemna strona zastosowania substancji hamujacych funkcje komórkowe polega na tym, ze w ich obecnosci jednoczesnie ulega zahamowaniu synteza 1,2-dehydrogenazy steroidowej, lub oslabie¬ nie jej czynnosci, nastepstwem czego jest znaczne przedluzenia czasu przemiany substratu. Zgodnie z japonskim opisem patentowym odwodornienie hydrokortizonu uzyskuje sie dopiero po uplywie 48—60 godzin.W porównaniu ze znanymi sposobami wegierski opis patentowy nr 149062 stanowi istotny postep. Zgodnie z tym opisem po stwierdzeniu indukcyjnego charakteru enzymu wprowadza sie poczatkowo niewielka ilosc steroidu indukujacego. W ten sposób zapoczatkowana zostaje synteza enzymu, 1,2-dehydrogenazy, a majacy ulec przeksztalceniu substrat steroidowy wprowadza sie do hodowli, juz zawierajacej aktywny enzym. Do indukcyji 1,2-dehydrogenazy steroidowej nadaja sie w jednakowym stopniu zwiazki szeregu androstanu i pregnanu. Odwo¬ dornienie kortikosteroidu przez hodowle, zawierajaca enzym, ulega po indukcji przyspieszeniu i dokonuje sie szybciej. Umozliwilo to wprowadzanie majacego ulec przemianie steroidu nie do stezonej hodowli lecz do rozcienczonej w stosunku 1 :10 do 1 : 20. Zastosowanie rozcienczonej hodowli jest bardzo korzystne, gdyz w ten sposób mozna wyeliminowac zakladanie hodowli w duzym rozmiarze. Dzieki temu zmniejsza sie równiez nie¬ korzystne, rozkladajace steroidy, dzialanie hodowli. Ten ostatni efekt osiaga sie czesciowo przez to, ze w pod¬ lozu, w którym odbywa sie przemiana, ulega zmniejszeniu liczba bakterii, powodujacych rozklad. Dzieje sie to czesciowo dzieki temu, ze resztkowe substancje odzywcze, w pierwszym rzedzie zwiazki zawierajace azot, sprzyjajace wykorzystaniu steroidu jako zródla wegla, zawarte w podlozu sa rozcienczone. Z rozcienczonej, nie zawierajacej dodatkowych substancji, hodowli mozna latwiej wyekstrahowac odwodorniony produkt. Uzyskany krystaliczny zwiazek praktycznie nie zawiera zadnych obcych zanieczyszczen.Wegierski opis patentowy nr 149062 obok wyliczonych istotnych korzysci zawiera równiez szereg nieroz¬ wiazanych problemów. Przy zastosowaniu, zgodnie z ustalonym sposobem postepowania, rozcienczonej hodowli mozna przeprowadzic odwodornienie jedynie w stosunkowo niskim stezeniu. Uzyskany produkt nie zawsze odpowiada wymogom jakosciowym, zawierajac nieodwodorniony, wysycony w polozeniu 1, 2 substrat steroi¬ dowy w wyzszym odsetku niz 2% dopuszczalne wedlug farmakopei. Jest to szczególnie niekorzystne, gdyz usuniecie, na drodze chemicznej, nieprzereagowanego substratu, rózniacego sie jedynie jednym wiazaniem pod¬ wójnym od uzyskanego produktu, jest polaczone z duzymi stratami, w rezultacie wiec wydajnosc produktu odpowiedniej jakosci jest bardzo niska.W sposobie wedlug wynalazku uzyskuje sie korzysci, wynikajace z zastosowania oddzielnie przeprowadzo¬ nej indukcji 1,2-dehydrogenazy steroidowej przy jednoczesnym wyeliminowaniu szkodliwych skutków. Zgodnie z wynalazkiem w okresie fazy indukcyjnej przez wywolanie wtórnego wzrostu uzyskuje sie taki poziom enzymu, który przekracza poprzednio osiagalny o rzad wielkosci i który równiez umozliwia podwyzszenie stezenia sub¬ stratu w fazie odwodornienia jak i pozwala na uzyskanie produktu odpowiedniej jakosci z dobra wydajnoscia.Podwyzszenie rzedu wielkosci zawartosci 1,2-dehydrogenazy steroidowej w hodowli w fazie indukcji osiaga sie w sposób nastepujacy.Hodowle wybranego drobnoustroju przeprowadza sie na odpowiednim, znanym podlozu, korzystnie pod¬ lozu zawierajacym glukoze i aminokwasy tak dlugo, az wzrost ulegnie zahamowaniu (gestosc optyczna osiagnie najwyzsza wartosc), gdy ulegna wyczerpaniu niezbedne skladniki podloza sluzace jako zródlo wegla cukry, kwasy organiczne lub aminokwasy, lub uzyte jako zródlo azotu aminokwasy, sole amonowe lub azotowe.W hodowli, doprowadzonej w ten sposób do fazy stacjonarnej, wywoluje sie wtórny wzrost dodajac nowe zródla wegla i azotu w takiej ilosci, która bakterie zuzyja w ciagu 2-5 godzin. (Okreslanie skladników odzywczych81032 3 wedlug: H.J. Conn: Manual of Microbiological Methods-Soc. Am. Bact. 1957). Wybór zródla wegla lub azotu, które nalezy dodac nastepuje po stwierdzeniu braku wyczerpanej substancji, odzywczej. Zródlo wegla i/lub azotu dodaje sie w postaci wodnego roztworu, którego objetosc nie moze przekraczac 1/5 objetosci hodowli.Jednoczesnie z dodaniem nowego zródla wegla i/lub azotu wprowadza sie do hodowli steroid indukujacy.Pod jego wplywem zawartosc 1,2-dehydrogenazy steroidowej w hodowli osiaga maksymalna wartosc wciagu 2-5 godzin wtórnego wzrostu. Induktor mozna dodawac w dwojaki sposób: badz w postaci zawiesiny steroidu, w postaci stalej, w wodnym roztworze skladników odzywczych badz tez rozpuszcza sie go w organicznym rozpuszczalniku. W ostatnim przypadku obydwa roztwory to znaczy wodny roztwór skladników odzywczych i roztwór steroidu w ograniczonym rozpuszczalniku miesza sie razem i dopiero wówczas wprowadza do hodowli.W przypadku, gdy z powodu malej ilosci wody indukujacy steroid wytraca sie w postaci grubych krysztalów wówczas rozpuszcza sie on w hodowli wolnej. W ten sposób uniemozliwia sie szybki rozklad induktora, a tym samym zabezpiecza sie staly jego poziom w czasie trwania okresu indukcji. W okresie indukcji hodowle inkubuje sie w temperaturze 20°—40°C przy stalym napowietrzaniu.Poziom dehydrogenazy steroidowej okresla sie, w czasie trwania okresu indukcji, metoda Sih i Benetta (Bioch. Bioph. A. 56.584.1962). Zgodnie z tym sposobem postepowania poziom enzymu wzrasta wciagu 2—5 godzin do wartosci 150—400 jednostek/ml w przeciwienstwie do 25—40 j/ml uzyskiwanych w metodzie we¬ dlug wegierskiego opisu patentowego nr 149062, uzyskuje sie wiec 3—15-krotne podwyzszenie poziomu enzy mu.Wynalazek polega na stwierdzeniu, ze szybkosc indukcji 1,2-dehydrogenazy steroidowej i wysokosc dajace go sie osiagnac poziomu enzymu sa wówczas najwyzsze, gdy hodowle indukuje sie w fazie przyrostu, to znaczy, w fazie zarówno aktywnego pobierania substancji odzywczych jak i aktywnej przemiany materii drobnoustrojów.Na podlozu z niedoborem skladników odzywczych, w fazie stacjonarnej i przy obecnosci jedynie steroidu nie mozna uzyskac znacznej ilosci enzymu.Jednoczesnie stwierdzono, jak równiez wykazano to ilosciowo, ze aktywna faza przemiany materii wywiera wprawdzie wyjatkowo korzystne dzialanie na synteze enzymu, ale z innego punktu widzenia jest ona niekorzyst¬ na dla odwodornienia steroidu w polozeniu 1, 2. W tej fazie bowiem rozklad steroidu jest najintensywniejszy jak równiez wysoka jest, niekorzystna, zdolnosc redukujaca hodowli, co ujawnia sie w zmniejszeniu ilosci odwodor- nionego steroidu. Trudnosci te usuwa sposób wedlug wynalazku, w którym hodowli, znajdujacej sie w fazie stacjonarnej, zapewnia sie na okres indukcji, i to dokladnie na ten okres czasu, wtórny wzrost lub ponownie wywolana aktywna przemiane materii. Wlasciwa reakcja mianowicie odwodornienie substratu steroidowego, rozpoczyna sie z chwila wystapienia, po fazie indukcyjnej, okreslonego niedoboru skladników odzywczych i po¬ nownego przejscia hodowli w faze stacjonarna.Sposób wedlug wynalazku sprzyja w znacznym stopniu syntezie enzymu, z jednoczesnym wyeliminowa¬ niem wystepowania odwodorniania substancji odzywczych, zapewniajacych wzrost bakterii. Dzieje sie to na skutek tego, ze przy przemianie substratu steroidowego odwodornienie przebiega wyjatkowo szybko równiez i w hodowli rozcienczonej i nie mozna stwierdzic ani rozkladu steroidu ani tez redukcji steroidu. Stezenie hydro¬ kortizonu, który ma byc odwodorniony, wynosi w hodowli rozcienczonej 1,2—1,6 g/l i reakcja zachodzi w ciagu 3-5 godzin, podczas gdy w hodowli nierozcienczonej wartosci te zgodnie z wegierskim opisem patentowym nr 149062 wynosza odpowiednio 0,8—1,0 g/l i 6^10 godzin. Otrzymany zwiazek odpowiada wymogom farmako- pealnym, a wydajnosc w stosunku do ilosci uzytego hydrokortizonu wynosi do 90%.Inny sposób wykorzystania uzyskanej, wedlug wynalazku wyzszej aktywnosci enzymatycznej 1,2-dehydro¬ genazy steroidowej w hodowli bakteryjnej polega na tym, ze nie rozciencza sie hodowli, która po fazie indukcyj¬ nej weszla w faze stacjonarna, lecz dodaje sie ten sam hydrokortizon w 15—20-krotnie wyzszej ilosci w stosunku do uprzednio podanej. Przy tak wysokim stezeniu substratu przeprowadzaja odwodornienie japonscy autorzy (szwajcarkski opis patentowy nr 364260). Wedlug tych znanych sposobów postepowania mozna otrzymac jed¬ nak tylko prednisolon o wysokiej zawartosci, 5-10% hydrokortizonu (E. Kondo, E. Masuo: J. Gen. Appl.Microbiol. 7,113,1961). Dla zmniejszenia tej resztkowej zawartosci hydrokorizonu sposób wedlug wynalazku zapewnia wysoka aktywnosc dehydrogenazy i niska zdolnosc redukcyjna. Przy tym dla calkowitego przeksztal¬ cenia utrzymuje sie, stosujac stale dozowanie, takie stezenie substratu hydrokortizonowego, uwzgledniajac ewen¬ tualna wartosc dyssolubilizacji, aby zapobiec tworzeniu sie mieszanych krysztalów, zawierajacych substrat i pro¬ dukt. W przebiegu przeprowadzonej sposobem wedlug wynalazku indukcji enzym zostaje wytworzony przed rozpoczeciem przeksztalcania substratu, a pozadana szybkosc stalego dozowania mozna scisle wyliczyc, albo na podstawie, oznaczonej w okresie trwania indukcji, aktywnosci enzymu lub tez na podstawie oznaczenia, w ciagu pierwszych godzin odwodorniania, szybkosci reakcji.Wysoka aktywnosc enzymatyczna hodowli ma szczególne znaczenie w takich przypadkach, kiedy odwodor-4 81032 nianie przeprowadza sie bezposrednio, za pomoca brzeczki po uprzednim przeksztalceniu mikrobiologicznym, ' bez izolowania wytworzonego produktu. W tym przypadku eliminuje sie wiele problemów.Przedmiotem wynalazku jest sposób odwodorniania kortikosteroidów w polozeniu 1,2 przy uzyciu odpo¬ wiednio zaindukowanej hodowli drobnoustrojów typu Arthrobacter i Corynebacterium polegajacy na tym, ie indukcje enzymatyczna 1,2-dehydrogenazy steroidowej wywoluje sie najpierw po zakonczeniu wzrostu bakterii w fazie stacjonarnej, dodajac do hodowli 0,02 do 0,2 g/l steroidu szeregu androstanu lub pregnanu, przy czym jednoczesnie dodaje sie zródlo wegla i/lub azotu w ilosci zapewniajacej 0,01—0,1% stezenia i wywolujac wtórny wzrost w okresie trwania indukcji. Wówczas dodaje sie do hodowli, o podwyzszonej aktywnosci, kortikosteroid, wysycony w polozeniu 1, 2, bezposrednio lub po uprzednim rozcienczeniu. Po zakonczonym odwodornieniu izoluje sie znanym sposobem, wytworzony produkt.Nizej podane przyklady wyjasniaja blizej sposób wedlug wynalazku nie ograniczajac jednak jego zakresu.Przyklad I. 5 litrów wyjalowionego podloza, o wartosci pH 6,8-7,0, zawierajacego 0,5% glukozy, 0,3% bursztynianu amonowego, 0,1% wyciagu drozdzowego i 0,1% fosforanu jednopotasowego zaszczepia sie zawiesine hodowli Corynebacterium fascians. Hodowle prowadzi sie przez 14 godzin w temperaturze 35°C, przy stalym mieszaniu i napowietrzaniu, przez dostarczanie tlenu w ilosci 80 mM/litr/godzine, az do momentu wy¬ korzystania, zawartego w podlozu, bursztynianu amonowego. Wówczas wprowadza sie do hodowli 0,5 I jalowe¬ go, 0,8% roztworu bursztynianu amonowego, w którym zawieszono 0,5 g hydrokortizonu. Hodowle prowadzi sie, w ten sam sposób, przez dalsze 5 godzin. W tym czasie ilosc bakterii wzrasta o okolo 20%, a aktywnosc 1,2-dehydrogenazy steroidowej ksztaltuje sie w sposób nastepujacy: 0 godzin po dodaniu 3,5 j/mi 17,0 „ 40,0 „ 93,0 „ 107,0 <„ 112,0 „ Natomiast, gdy (w mysl wegierskiego opisu patentowego nr 149.062) po takiej samej hodowli wstepnej równolegle z dodaniem hydrokortizonu w ilosci 0,1 mg/ml przeprowadza sie 2-godzinna indukcje uzyskuje sie aktywnosc rzedu jedynie 18 j/ml.Przyklad II. w 750 ml kolbie Erlenmeyera wyjalawia sie 250 ml podloza, zawierajacego 0,4% glu¬ kozy, 0,4% peptonu i 0,4% wyciagu drozdzowego. Podloze zaszczepia sie hodowla Arthrobacter simplex i in- kubuje w temperaturze 35°C na trzesawce tak dlugo, az stwierdzi sie na podstawie okreslenia liczby bakterii (gestosc optyczna) poczatek fazy stacjonarnej. Nastepuje to w 19-20 godzinie hodowli. Wówczas rozpuszcza sie 0,2 g glukozy w 10 ml wody, a 10 mg prednisolonu (steroid indukujacy) rozpuszcza sie w 2 ml metanolu. Oby¬ dwa roztwory sie miesza i dodaje do hodowli, po czym prowadzi sie inkubacje przez dalsze 4 godziny. Po tym czasie aktywnosc hodowli wynosi 189 j/ml. Zawartosc kolby wlewa sie do 4750 ml jalowej wody i t^ rozcien¬ czona, aktywna hodowla przeprowadza sie odwodornienie 8 g (a wiec 1,6 g/l) hydrokortizonu. Dodaje sie go po rozpuszczeniu w metanolu, zawierajacym 10% chlorku potasowego, w 4 porcjach, co dwie godziny. Inkubacje prowadzi sie przy 35°C, przy stalym mieszaniu i przewietrzaniu zapewniajacym dostarczanie tlenu w ilosci 80 mM/litr/godzine. Po 8 godzinach nie stwierdza sie na podstawie chromatografii cienkowarstwowej obecnosci hydrokortizonu w brzeczce. Brzeczke ekstrahuje sie 0,3 objetoscia octanu etylowego, ekstrakt odwadnia sie i zageszcza. Resztkowa zawartosc hydrokortizonu w uzyskanym krystalicznym preparacie prednisolonu (7,1 g) wynosi 1,0%.P r z y k,l a d III. 200 litrów podloza, o wartosci pH w granicach 6,8-7,0, zawierajacego 0,5% glukozy, 0,1% asparaginy, 0,2% wyciagu namokowego kukurydzy wyjalawia sie w tanku fermentacyjnym. Nastepnie zaszczepia sie go 101 hodowli Arthrobacter simplex i prowadzi hodowle w temperaturze 35°C, przy stalym mieszaniu i przewietrzaniu, zapewniajacym doplyw tlenu w ilosci 120 mM/litr/godzine. Po 14 godzinach zawar¬ tosc aminokwasów w hodowli wynosi 0,02%. Wówczas przygotowuje sie roztwór 25 g histydyny w 1000 ml wody i roztwór 25 g hydrokortizonu w 300 ml metanolu, zawierajacego 10% chlorku potasowego. Obydwa roz¬ twory laczy sie i wprowadza do hodowli. Indukcja trwa trzy godziny.Wedlug próby, pobranej w trzeciej godzi¬ nie, aktywnosc hodowli wynosi 420 j/ml, co odpowiada szybkosci przeksztalcania hydrokortizonu 57 ml/min.Hodowle, zawierajaca 1,2-dehydrogenaze steroidowa rozciencza sie woda w stosunku 1 :20 do 40001.Natychmiast po rozcienczeniu dodaje sie 3,2 kg, a po 2 godzinach 1,6 kg hydrokortizonu (razem 4,8 kg ¦ 1,2 g/l). Po uplywie 1 godziny chromatografia cienkowarstwowa nie wykazuje juz zawartosci hydrokor- . tizonu. Wówczas ekstrahuje sie trzykrotnie brzeczke polowa objetosci chloroformu, wyciag klaruje sie weglem 1 2 4 5 681032 6 i supercellem, a naszepnie zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 20 I. Produkt wykrystal izowuje sie w zwykly sposób, odsacza i suszy. Wydajnosc: 4,2 kg prednisolonu. Jakosc preparatu odpowiada podanej w przykladzie II.Przyklad IV. Do hodowli, zawierajacej 1,2-dehydrogenaze, zgodnie z przykladem III dodaje tle hydrokortizonu w ilosci 20 g/l w nastepujacy sposób: 4 kg rozdrobnionego hydrokortizonu zawiesza sie w 16 I wody, w której rozpuszczono 100g Tween'u 80 (emulgatora), a nastepnie dodaje sie 4 I metanolu, w obecnosci którego zawiesina bardziej sie nadaje do dawkowania. Zawiesine wprowadza sie za pomoca homogenizatora, z szybkoscia 11,4 g hydrokort izonu/minute. W drugiej i szóstej godzinie wprowadzania stosuje sie jednogodzinne przerwy, dla przeprowadzenia kontrolnych analiz. Przeksztalcanie odbywa sie w temperaturze 35°C, przy stalym mieszaniu i przewietrzaniu, zapewniajacym doplyw tlenu w ilosci 80 mM/litr/godzine. Przeksztalcanie kontroluje sie mikroskopowo, a po zniknieciu ziarenek hydrokortizonu (dominuja igly prednisolonu) przeprowadza sie kontrole za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Fermentacje przerywa sie gdy zawartosc resztkowa hydrokortizonu wynosi ponizej 2%. Czas potrzebny do przeksztalcenia wynosi 10—12 oodzin.Krysztaly prednisolonu oddziela sie od plynu fermentacyjnego za pomoca separatora. Rozpuszcza sie je nastepnie w 40 litrach mieszaniny chloroformu i metanolu (w stosunku 1:1), roztwór przesacza przez pozba¬ wiony bakterii, saczek Seitza EK, klaruje 100 g aktywnego wegla, zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem i krystalizuje. Resztkowa zawartosc hydrokortizonu w uzyskanych 3,45 kg prednisolonu wynosi 1,8%.Przyklad V. Do 6 I 24-godzinnej hodowli szczepu Curvularia prasadii, na podlozu zawiarajacym 1,6% 'glukozy i 2,5% wyciagu na mo kowego kukurydzy dodaje sie 6 g zwiazku Reichsteina-S, rozpuszczonego w 60 ml metanolu, zawierajacego 10% chlorku potasowego. Inkubacje przeprowadza sie w temperaturze 26°C, przy sta¬ lym mieszaniu i napowietrzaniu, zapewniajacym doplyw tlenu w ilosci 80 mM/litr/godzine. Co 4 godziny prze¬ prowadza sie kontrole za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Po uplywie 28 godzin, po zniknieciu zwiaz¬ ku Reichsteina-S pobiera sie próbke (I) i bada przy pomocy chromatografii bibulowej (wyniki w tabeli I). Ho¬ dowle przesacza sie, a do przesaczu, który wedlug wyników chromatografii bibulowej zawiera w przewazajacej ilosci hydrokortizon, wprowadza sie 300 ml hodowli Arthrobacter simplex (przyklad III). Inkubacje prowadzi sie w temperaturze 35°C, sposobem opisanym w przykladzie III. Na podstawie wyników badan, przeprowadzo¬ nych za pomoca chromatografii cienkowarstwowej, po 4 godzinach pobiera sie nastepna (II) próbke, do badan za pomoca chromatografii bibulowej. Wyniki analiz: badanie I badanie II zwiazek Reichsteina-S/RS/ 12 gamma/ml hydrokortizon 608 „ _ 11-o<-OH-RS 5 „ 14-o<-OH-RS 82 1,2-dehydro-RS - 10 gamma/ml prednisolon - 560 2O-0OH-prednisolon - 16 1,2-dehydro-14-o<-OH-RS - 75 gamma/ml w dalszym ciagu produkt uzyskuje sie wedlug sposobu, podanego w przykladzie III. Wydajnosc: 3,1 g predniso¬ lonu.Przyklad VI. 500 ml jalowego podloza, zawierajacego 0,3% glukozy i 0,3% peptonu zaszczepia sie hodowla Arthrobacter simplex. Hodowle przeprowadza sie nastepnie na trzesawce w temperaturze 35°C az do uzyskania fazy stacjonarnej (przez okolo 20 godzin). Wprowadza sie wówczas substancje odzywcze, a miano¬ wicie 0,25 g glukozy i 0,15 g glicyny dla zabezpieczenia wzrostu w okresie indukcji. Indukcje inicjuje sie przez dawkowanie roztworu 100 ml l7-o<-metylo4estoteronu w 10 ml metanolu. Po 5 godzinnej indukcji na trzesaw¬ ce, w temperaturze 35°C aktywnosc 1,2-dehydrogenazy steroidowej wynosi 220 jednostek na ml hodowli.Wówczas rozciencza sie 500 ml hodowli 4500 ml wody i przy stalym mieszaniu dodaje sie roztwór 4 g zwiazku Reichsteina-S w 50 ml metanolu, zawierajacego 10% CaCI2. Odwodornianie nastepuje przy stalym mieszaniu i napowietrzaniu. Przeksztalcenie substratu, które dokonuje sie wciagu 16godzin, kontroluje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. W 16 godzinie pobiera sie próbke, celem przeprowadzenia chromatografii bi¬ bulowej, której wyniki przedstawiaja sie w sposób nastepujacy: Tabela II Zwiazek Reichsteina-S(RS) 2 gamma/ml plynu fermentacyjnego 1,2-dehydroRS 710 gamma/ml u J} 20-0-oksy-RS 30 gamma/ml )t if6 81032 Brzeczke fermentacyjna ekstrahuje sie trzykrotnie 0,3 objetosciami octanu etylowego, wyodrebnia produkt znanym sposobem i uzyskuje 3,28 g zwiazku 1,2-dehydro-Reichstein-S. PL