Sposób wytwarzania nowych cyklopeptydów Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych cyklopeptydów o wzorze ogólnym R' — cyklopeptyd A w postaci zasady, sold addy¬ cyjnych z kwasami lub czwartorzedowych soli amoniowych.W podanym wzorze cyklopeptyd A oznacza reszte nonapeptydowa, którego najbardziej praw¬ dopodobna strukture okresla wzór 1. We wzorze tym Me Pro oznacza: L 4-transmetyloproline, Me Thr oznacza: L N-metylotreonine, Me Val oznacza: L N-mietylowaline, Me Leu oznacza: D N-metylo- leucyne, Pro oznacza: L proline, Gly oznacza: gli- fcokol, Deu oznacza: L leucyne, Thr oznacza: L treonine, R' oznacza rodnik acylowy; alkanoilo- wy, alkenoalowy, alkadienoilowy, alkoksykarbony- lowy, aryloaillkanoilowy, arylokasrbonylowy, arylo- sulfemylowy, *arylosuLfinylowy, arylosuifonylowy, cykloalkilokarbanylowy, heterocyklokanbonylowy, heterioeykloaliirancdiowy albo reszte rodnika pepty- dowego o budowie liniowej lub piescieniowej, któ¬ ry zwiazany jesit grupa karbonylowa z atomem azotu L 4-trainsmetyicproliny, w lancuchu bocz¬ nym cyklopeptydu A.Rteszty alkilowe, alkenylowe lub alkadienylowe rodroików alkainoilowych, alkenoilowych, alkadie- nodlowych, aryloalkanoilowych lub heterocykloal- kanoilowych maja lancuchy proste lub rozgalezio¬ ne, zawierajace 1—50 atomów wegla, ewentualnie podstawione jednym lub kilkoma atomami chlo¬ rowca albo grupami aminowymi lub alkilotiolowy- 2 mi zawierajacymi 1—5 atomów wegla. Reszty al¬ kilowe rodników alkoksykarbonylowych zawieraja 1—15 atomów wegla; moga byc one podstawione grupa dwuaiMloaminowa, w której rodniki aflkilo- 5 we zawieraja 1—5 atomów wegla.Reszty aromatyczne rodników aryloalkanoilo¬ wych, aryiokarbonylowych, arylosulfenylowych, arylosulfiinylowych lub arylosuMionylowych stano¬ wia pierscien benzenowy lub nafitadenowy, ewen- io tualnie podstawiony ijedlna liulb kilkoma grupami alkilowymi, wodorotlenowymi, benzylowymi, ami¬ nowymi, dwualkiloaiminowymi, alkanoiloaminowy- mi lub "nitrowymi, przy czym rodniki alkilowe i reszty alkilowe innych rodników zawieraja 1—12 15 atomów wegla.Reszty heterocykliczne rodników heterocykilokar- bonylowych lub heterocyklloalkanoilowych stano¬ wia uklady zlozone z jednego lub dwu pierscieni zawierajacych jeden lub kalka atomów heteroge- 20 nicznych, na przyklad azotu, tlenu lub siarki, pod¬ stawionych ewentualnie jedna albo kilkoma gru¬ pami alkilowymi lub nitrowymi.Reszty cykloalkilowe rodników cyfclloalMlokarfoo- nylowych zawieraja 5—6 atomów wegla w pier- 25 scieniu, ewentualnie podstawionym jedna lub kil¬ koma grupami aminowymi. Reszty rodników pep- tydowych, o budowie liniowej lub pierscieniowej, zawieraja 2—15 aminokwasów.Grupy aminowe stanowiace podstawniki reszt 30 alkilowych, alkenylowych i cykloalkilowych rod- 7940379403 3 4 ników wyzej scharakteryzowanych i gcrupy ami¬ nowe rodników peptydowych o budowie liniowej, albo cyklicznej moga byc ewentualnie podstawione jedna lub kilkoma grupami alkilowymi, alkanoilo- wymi, aryloalkilowymi, alkoksykarbonylowymi, aryloalkoklsyfcarbonylowynii albo alkoksyaryloalko- ksyfcarbonylowymi, przy czym rodniki alkilowe i reszty alkilowe innych rodników zawieraja 1— —30 atomów wegla.Wedlug wynalazku zwiazki o wzorze ogólnym R' — cyklopeptyd A otrzymuje sie z cyfclopeptydu A przez kondensacje z kwasem o wzorze R'—OH, w którym R' ma wyzej podane znaczenie lub po¬ chodna takiego kwasu, prowadzona metodami zna¬ nymi i stosowanymi w chemii peptydów.Sam cyklopeptyd A mozna otrzymac przez la¬ godna hydrolize antybiotyku 11072 RP, wytwarza¬ nie którego opisano w opisie patentowym fran¬ cuskim 1393206. Prawdopodobna budowe tego an¬ tybiotyku okresla wzór 2. Cyklopeptyd A mozna otrzymac z tego antybiotyku, przez jego hydrolize kwasem mineralnym lub organicznym w roztwo¬ rze organicznym rozpuszczalnika. Najkorzystniej jest stosowac w tym celu bezwodny metanolowy roztwór HC1. Reakcje prowadzi sie w temperatu¬ rze okolo 20°C; przebiega ona praktycznie do kon¬ ca w czasie okolo 2 godzin.Proces kondensacji prowadzic mozna metoda polegajaca na uzyciu karbodwuiimidu, metoda azydkowa, metoda aktywnych estrów, metoHa mieszanych bezwodników i metoda chlorków kwa¬ sowych.W tych metodach wolne grupy funkcyjne, nie biorace udzialu w reakcji, nalezy ochronic inny¬ mi grupami, które mozna nastepnie latwo wyeli¬ minowac w taki sposób, ze reszta czasteczki nie ulega przemianie. Zazwyczaj stasuje sie w tym celu grupy, które mozna eliminowac przez hydro¬ lize lub redukcje. Grupe aminowa najlepiej jest ochraniac grupami alkilofcsykarbonylowymi, na przyklad IH^rzed. butyloksykarbonylowa, grupami aryloalkotasykarbonylowytmii, na przyklad behzylo- ksykarbonylowa, albo aryloalkilowymi, na przy¬ klad benzylowa.W szczególnosci jezeli stosuje sie kwas o wzorze R"—OH, w którym R" ma znaczenie takie jak R', z tym, ze nie moze on oznaczac rodnika alkoksy- karlbonylowego, arylosultfenylowego, arylosulfiny- lowego lub arylosulflonylowego, to proces prowadzi sie w srodowisku rozpuszczalnika organicznego, ta¬ kiego jak octan etylu, dwumetylaformamiid, aceto- nitryl lub chlorek metylenu, w temperaturze 0— —30°C, w obecnosci karbodwuiimidu, na przyklad dwucykloheksylokaaibodwuimidu.Jezeli stosuje sie azydek o wzorze R"—N3, w którym R" ma wyzej podane znaczenie, to re¬ akcje prowadzi sie w srodowisku rozpuszczalnika onganicznego, na przyklad octanu etylu, ewentual¬ nie w obecnosci zasady organlicznej, na przyklad trójetyloaminy, w temperaturze —16 — +25°C.Azydki o wzorze R"—N3 otrzymuje sie zazwyczaj w reakcji azotynu metalu alkalicznego z odpo¬ wiednim hydrozydem, w srodowisku kwasnym.Jezeli w procesie stosuje sie ester aktywny o wzorze R"—X, w którym R" ma znaczenie po¬ dane wyzej, a X oznacza reszte fenolowa lub he¬ terocykliczna zawierajaca grupe N-^OH, aktywu¬ jaca grupe karbonylowa, na przyklad imid kwasu N-hydroksybursztynowego, p-nitrofenol, 2,4,5-trój- 5 chlcHrofenol lub 1-hydroksypliperydyne, to reakcje prowadzi sie w srodowisku rozpuszczalnika orga¬ nicznego, na przyklad octanu etylu lub dwumety- loformamidu, w obecnosci karbodwuiimidu, na przyklad dwucyMoheksylokacclbodiWuiiimidu, w tem¬ peraturze —15 — +25°C, ewentualnie w obecnosci zasady organicznej, na przyklad trójetyloaiminy.Estry aktywne wytwarza sie zazwyczaj in situ, znanymi metodamli. Jezeli w procesie stosuje sie bezwodnik kwasowy o wzorze R"-^0-^CO—O—Rb w którym R" ma znaczenie podane wyzej, a Rx oznacza rodnik alkilowy zawierajacy 1-^5 atomów wegla, to reakcje prowadzi sie w rozpuszczalniku organicznym, na przyklad w chlorku metylenu, w temperaturze ^15 — +I20°C, ewentualnie w obecnosci zasady organicznej, takiej jak trój¬ etyloamina.Mieszane bezwodniki o wzorze R"—O—CO—O— —Ri wytwarza sie zazwyczaj lin situ w reakcji cMoriomrowczanu alkilu, na przyklad chloromrów- czanu etylu lub izobutylu, z kwasem o wzorze R"—OH, w srodowisku rozpuszczalnika organicz¬ nego, na przyklad chlorku metylenu, w obecnosci zasady organicznej, takiej jak trójetyloamina, w temperaturze okolo —10°C.Jezeli w procesie stosuje sie chlorki kwasowe o wzorze R"—Cl, w którym R" ma znaczenie po¬ dane wyzej, to reakcje prowadzi sie w rozpusz¬ czalniku organicznym, takim jak chlorek metyle¬ nu, ewentualnie w obecnosci zasady organicznej, takiej jak trójetyloamina, w temperaturze —15 — +T25°C.W przypadkach kiedy R' oznacza rodnik alko- ksykarbonylowy, ewentualnie podstawiony, jak okreslono wyzej, proces prowadzi sie dzialajac na cyklopeptyd A chloromrówozanem o wzorze r'"^O^CO—Cl, w którym R'" oznacza rodnik alkilowy zawierajacy 1^5 atomów wegla, ewentu¬ alnie podstawiony rodnlikiem dwualkiloaminowym, w którym kazda grupa alkilowa zawiera 1—5 ato¬ mów wegla, w srodowisku organicznego rozpusz¬ czalnika, na przyklad chlorku metylenu, w obec¬ nosci zasady organicznej, na przyklad trójetyloa¬ miny w temperaturze —15 — +30°C.Jezeli R' oznacza rodnik arylosulfenylowy, ary- losulfinylowy lub aryiosulfonylowy, scharaktery¬ zowany wyzej, to proces prowadzi sie dzialajac na cyklopeptyd A zwiazkiem o wzorze Riv__Sl(0)n^Cl, w którym RJv oznacza pierscien benzenowy lub naftalenowy podstawiony ewentualnie jednym lub kilkoma grupami alkilowymi, aminowymi, dwual- kiloaminowymi, alkanoiloaminowymi lub nitrowy¬ mi, a n oznacza liczbe o wartosci 0, 1 lub 2, w sroidowlisku rozpuszczalnika organicznego, na przyklad octanu etylu lub chlorku metylenu, w obecnosci zasady organicznej, na przyklad trój¬ etyloaminy w temperaturze —15 — +E0°C.Odmiana tego sposobu polega na reakcji kwasu lub pochodnych kwasu o wzorach R"-^OH, R"— —N3, R"—X, R"_O^OC-O^Ri, lub R"-C1 z cyklopeptydem o wzorze 3, w których to wzo- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6079403 rach R" oznacza rodnik aikanoilowy zawierajacy grupe alkilowa o 1—6 atomach wegla albo reszte peptydowa o budowie liniowej lub pierscieniowej, w sklad której wchodzi 2-^15 aminokwasów, a R2 i R3 sa identyczne badz rozne i oznaczaja atom wodoru albo rodnik alkilowy zawierajacy 1—5 atomów wegla. Warunki, w jakich zachodzi proces sa takie same, jak podano wyzej.Jezeli rodnik R", R'" i Riv w wymienionych zwiazkach zawieraja grupy ochraniajace, to prze¬ prowadza sie nastepnie proces ich eliminacji sto¬ sujac znane metody katalitycznego uwodornienia lub kwasnej hydrolizy.Nowe zwiazki o wzorze ogólnym R' — cyklo- pepttyd A mozna ewentualnie oczyszczac meitodami fizycznymi, na przyklad chromatograficznie albo chemicznymi, na przyklad przez przeprowadzenie ich w rozpuszczalne w wodzie sole, filtracje i lio¬ filizacje otrzymanego roztworu, a nastepnie rozlo¬ zenie otrzymanego produktu. Nowe zwiazki wy¬ tworzone sposobem wedlug wynalazku mozna przeprowadzic w ich sole addycyjne z kwasami lub CTwartorzedowe sole amoniowe zgodnie z cha¬ rakterem podstawnika —IR'.Sole addycyjne mozna otrzymywac w reakcji zwiazków wytwarzanych wedlug wynalazku, z kwasami, prowadzonej w srodowisku odpowied- ndego rozpuszczalnika. Zazwyczaj rozpuszcza sie zasade w wodzie dodajac teoretycznie potrzebna ilosc kwasu i liofilizuje sie otrzymany roztwór.Czwartorzedowe sole amoniowe mozna otrzymy¬ wac w reakcji zwiazków wytwarzanych wedlug wynalazku z estrami, ewentualnie w srodowisku rozpuszczalnika organicznego, prowadzonej w tem¬ peraturze otoczenia albo — w celu jej przyspie¬ szenia — w temperaturze lekko podwyzszonej. No¬ we zwdazki wytwarzane wedlug wynalazku oraz ich sole addycyjne i czwartorzedowe sole amonio¬ we odznaczaja sie cennymi wlasciwosciami tera¬ peutycznymi, a mianowicie dzialaniem antybio- tycznym; wykazuja one duza aktywnosc jako srod¬ ka przeciwgruzlicze oraz w dzialaniu przeciw za¬ razkom gramójodatnim i gpramujemnym.Zwiazki otrzymywane wedlug wynalazku wyka¬ zaly wysoka aktywnosc w dzialaniu przeciwgruz¬ liczym, w badaniach prowadzonych in viltro i in vivo. Inhibdtuja one rozmnazanie jadowitych prat¬ ków gruzliczych (szczepy ludzkie, takie jak H37Rv, szczep bydlecy i rózne Sch odporne mutanty).Aktywnosc in vilbro okreslano metoda rozcienczen, w srodowisku Dubosla. W tych warunkach mini¬ malne stezenie inhiibitujace wynosilo 0,00&—1 fjtgl /ml.Szczególnie godnymi uwagi sa te zwiazki o wzo¬ rze R' — cyfclopepfcyti A, w których R' oznacza rodnik alkanoilowy lufo aflkenoilowy, podstawiony ewentualnie grupa aminowa lub alkUotiolowa albo rodnik peptydowy o budowie liniowej, przy czym grupy aminowe moga byc podstawione w sposób omówiony wyzej.Aktywnosc in vivo okreslano u myszy zakazo¬ nych doswiadczalnie, którym podawano badane zwiazki w ciagu 3 tygodni od chwili zakazenia.Myszy kontrolne umieraly po 20—30 dniach od chwili zakazenia. W taki sposób okreslono mini¬ malne skuteczne dawki jaflpo wynoszace, przy po¬ dawaniu per os, 50—300 mg/kg.Najbardziej interesujacymi wlasciwosciami tera¬ peutycznymi odznaczaja sie te zwiazki, w których 5 R' oznacza irodnik alkanoilowy podstawiony gru¬ pa aminowa, albo rodnik peptydowy o budowie li¬ niowej, przy czym grupy aminowe moga byc pod¬ stawione w sposób omówiony wyzej.W lecznictwie, zwiazki otrzymywane wedlug wy- 10 nalazku moga byc stosowane w postaci zasad, so¬ li addycyjnych z kwasami lub czwartorzedowych soli amoniowych dopuszczalnych farmakologicznie, to jest nietoksycznych w stosowanych dawkach.Dopuszczalnymi fanmafcologiiGznie solami addy- 15 cyjnymi moga byc na przyklad sole kwasów mine¬ ralnych (solnego, siarkowego, azotowego, fosforo¬ wego) lub organicznych (octowego, propdonowego, bursztynowego, benzoesowego, fumarowego, malei¬ nowego, winowego, metanosuWonowego, benzeno- 20 sulfonowego, teofilnooctowego, salisyaowego), albo pochodne tych zwiazków.Wynalazek ilustruja podane ponizej przyklady, nie ograniczajace jednak mozliwosci jego zastoso¬ wan. Rf produktów oznaczano metoda chromato- 25 grafid cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym.Przyklad I. Wytwarzanie cyfclopepftydu A. 150 g antybiotyku — peptydu otrzymanego we¬ dlug patentu francuskiego 1393208 rozpuszcza sie 30 w 1320 ml 4,5 n metanolowego roztworu HO. Ca¬ losc miesza sie w temperaturze 20^C i poddaje od¬ parowywaniu do sucha pod obnizonym cisnieniem 25 mm Hg. Pozostalosc ekstrahuje sie dwukrotnie porcjami po 250 ml metanolu. Ekstrakty meta- 35 nolowe poddaje sie odparowywaniu otrzymujac bezpostaciowa pozostalosc, która rozpuszcza sie na¬ stepnie w mieszaninie chloroformu z metanolem (stosunek objeosclLOwy 95:5). Otrzymany roztwór przepuszcza sie przez kolumne o srednicy 11 cm, 40 wypelniona 2 kg zelu krzemionkowego. Do elu- owania stosuje sie ten sam rozpuszczalnik. Zbiera sie frakcje po 640 ml. Z frakcji 10—116 otrzymuje sie 123,3 g cyMopeptydu A chromatograficznie . czystego (wydajnosc 95,5^/t). Rf — 0,55 (zel fcrze- 45 mionkowy; 1,2-dwuchloroetan — metanol; stosu¬ nek objetosciowy 65 :35). [«] g = —6fr° (c =* 0,5; metanol).Przyklad II. Rozpuszcza sie 3,35 g cyklo- 50 peptydu A w 70 ml octanu etylu i dodaje do te¬ go 1,13 g N c^acetylo-N «Mbenzyloksykarbonyilo-L lizyny. Calosc schladza sie w laznti lodowej i wprowadza 0,& g dwucyMoheksylokao^odwuimi- du, a nastepnie miesza w ciagu dwóch godzin 55 w lazni lodowej i w ciagu nastepnych 12 godzin w temperaturze 20°C. Po uplywie tego czasu wpro¬ wadza sie 5 kropel lodowatego kwasu octowego, odfifltrawuje sie wytracony osad i przemywa go octanem etylu. Warstwy organiczne laczy sie •°. i poddaje odparowywaniu do sucha pod cisnie¬ niem 25 mm Hg. Osad rozpuszcza sie w 10 ml octanu etylu i przemywa roztwór kolejno: 2V# roztworem wodoroweglanu sodowego, 1 n kwasem solnym i wreszcie woda destylowana. Warstwe 65 organiczna suszy sie bezwodnym siarczanem sodo-7*4*3 wym i poddaje filtracja. Przesacz zatega sie do su¬ cha pod cisniemliem 25 mim Hg.Surowa (pozostalosc iw ilosci 3,14 ig zaladowuje sie do kolumny o srednicy 3 cm zawierajacej 75 g ze¬ lu krzemionkowego. Kolumne eluuje sie benzenem i miesca sunkach objetosciowych 9:1 i 5:5, octanem etylu i mieszaninami octanu etylu z metanolem o sto¬ sunkach otojetosdiowych 95 : 5, 90 :10 i 75 :25. Elu- aty z octanu etylu i mieszanin octanu etylu z me¬ tanolem (95 :5 i 90:10) laczy sie i odparowuje do sucha pod cisnieniem 25 nim Hg.W ten sposób otrzymuje sie 2,13 g (N a-acely- lo-N c-benzylokisyfearbonylo-L lizydo)-cyklopeptydu A z wydajnoscia 48,5%.N = 12,43% (teoret. 12,20%) Md = Wfi°V Rf = 0,73 (zel krzemionkowy; l,2^dwuchloroelan — metanol, stosunek objetosciowy 8 : 2).Postepujac w sposób opisany wyzej lecz stosu¬ jac inne, odpowiednie surowce mozna otrzymac (N-benzyGo, N-mettyto-L waMoJncylklopeptyd A C = 64,13% (teoret.: 64,30%) H = 8,53% (teoret. 8,67%).Rf = 0,67 (zel toemsonilaowy; 1,2-^wuohloroetan— metanol, stosunek objetosciowy 8 :2). cMoiiowodorek (N-benzylo-, N-metyHo-P walilo)- -cyklopeptyidu A N = 11,50% (teoret. 11,09%); a =* 2,95% (teoret. 2,96%) Rf = 0,87 (zel krzemionkowy; l^^dwucWioroetan— metanol, stosunek objetosciowy 65:35). met^nosuilloniUni (N^beozylo-, N-metyJo-m^ walilo)- -cyiWIioipeptyciU A N = 10,59% (teoret. 11,13%); S = 2,65% (teoret. 2,55%) Rf = 0,74 (zel lerzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan — metanol, stosunek objetosciowy 80:20).(N-benzylokarbonylo-L-waliao)-cyMopeptyd A N = 11,98% I«lj? = —1W° «c = 0,5, metanol) Rf =^ 0,85 (zel taraemionkowy l,^dwuchloroetan — metanol, stosunek objetosciowy 65 :35).(N-benayOotarbooy!]^ A N s»( 11,87% «teoret. 12,18%) Rf = 0,40 (zel krzemionkowy; l^^WAicMoroetan- - metanosulfonian (N^benzyIosarikozyQo)-cyMopeptydu A N - 10,81% (teoret. 11,53%) S m 2,89% (teoret. 3,64%) Rf = 0,77 <£el krzemionkowy; l^ndrwuchloroeten^ ¦*m*&nol, stosunek objetosciowy 05:35).(N-diodekanoilo-L waMlo)^yfclopeptyld A N = 11,60% (teoret. 11,53%) Rf = £,83 (zel kmrationkowy; J^^dwucWoroetan- -tnetanol, stosunek objetosciowy 8 :2). (undec-lO-enoll0)-cyklopep*yd A C = 64,33% (teoret. 64,08%) N = 10,95% (teoret. 11,31%) Bi « 0,58 (zel krzemionkowy; l^dwuchloroetan- -inetanol, stosunek objetosciowy 8 : 2) (lnme*ylo^-nitro-2-(plirol^^ A X m te#m (tamt 13,87%) Rf as OM (zal kroeniifoilkowy, l#4w¥^eroetan- Hmetanol, stosunek objetosciowy 8:2) chlorowodorek (N-lbenzylo^N^metyJo-L. metionylo)- -cykJopeptydu A 5 N = 11,60% (teoret. 11,30%); S = 3,12% (teoret. 2,61%) Rf = 0,66 (zel krzetóonilcorwy; n-foutanol-kwas octowy-woda, stosunek objetosciowy 4:1:5) (N-teenzyktaykaprtb^ 10 tyld A N = 11,11% (teoret. 11,48%) Rf =* 0,85 (zel krzemionkowy; M-dfwucMopoetan- Hmetanol, stosunek objetosciowy 65 :35). chiorowoxkxrek (N-b^jfto-W-mety!k)-L-fwalilo)-cy- i5 klopepty*i A C «tta mmist) ** 63,45% (teoret. §8,40%) H *dla fasady) « *,!*% ((teoret. 8^4Vt) N {dla za§ady) =» 12,03% «feeoret 12ylfl%) Rf = 0,53 (iej kgoenNontaowy; M-dwiKhloroetan- * -metanol, stosunek objetosciowy 8 :2) chlorowodorek (N4en«yfe-N-!metylo-L alanHo)-cy- kflopeptydu; A N =f 12,20% (teoret. 11,98%); a - 3,3% (teoret. 3,03%) » Rf » 0,85 (iel krwruonfcowy; M-crwuchloToetan- -nraeUnol, stosunek objetosciowy 05:36).(N-benzyilo-N-aiietylo-L feny]oabmito)-cyfc]cpeptyd A N *= H,50% (teoret. 11,58%) 30 Rf m 0,77 ((zel ta»»iorikawy; l^^wuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2) pakn-itoUo-cykaopeptyld A C ** 64,48% (taoret. 65^4«/»); H = 0,41% (teoret. 9^51V#) » N« ie,*0% (teoret. 10^3%) Rf = 0,77 (isel krzeroionJkowy; M-dwuchaioroetan- Hmetanol, stosunek objetosciowy 8 :2) un C = 64,78% (teoret. 64,0^t), H = 9J&I* (teoret. * 93%) N ~ 16,8»/# Jteoret. U4«%) Rf = 0,52 (i»l kraemiowkowy; l^ndwuclilioroetan- -metanol, atosunek objetosciowy 8:2) deto©OiLlo-cykkp^tyd A « N * 11,1% (teowt U/)5%) Rf = 0,76 Hel krzerotoakowy; l^Hdwuchlaroetan- -metetanoi, stosunek objetosciowy 8 :2) /L (4-) frittrtj&ooJe^ A C m ikG&k fteoret. 63,4Wf); H - 8,5i0*/t (teoret. w 9,^/t) N = U,M% (ttorelt Hl^/t) Rf =^ 0,T7 (ML knrejnionflDowy; l^Hlwuchtoroetan- -metanol, stosunek dbjejtoscdowy 8 :2) bejazollo-^yUopepltyd A k N ~ UMP/0 (teoret. »,«!•/•) Rf » 0,85 (zel kraeipriiojtfcowy; 1,2-dwuchloroetan- Hin^tanol, stetewtók dWe^sciowy 95 :35) izo»ilkotynoilo-cyklcp«ptyd A N ¦» 13,14% fteocet. ISA?1/!) •o Rf = 0,83 (zel krzemionkowy; l,2^olwuchloroetan- ^mete^ol, stosupek objetosciowy 65:35) salkjylDilo^j*lop0pty^ A N * MJW% (teoret. 11.68%) Rf ** MO (*el krzamianfeowy; 1,2-dwuchloroetan- 15 -metaaol, ftasunefe objetosciowy 65:35)^ 9 defcaiK*vlo-c*flaft*ptyd A C «* »96Vt (teoret. 6§,«^; H =* 9,41*/* (teoret 9,15V*) Rf ¦— 0,70 (zel krzenlionkowy; 1,2-dwuchlOfoetan- -metanol, Stosunek objetosciowy 95 :35) cMororwodorek (N~hefcsyto-L-walilo)-cykiopeptydu A N (dla zasady) = 12,25*/i (teoret. 12,27V») Hf = 0,37 (zel krzemionkowy; 1,2-dwucnlaroetaai- nmetanol; stosunek objetosciowy 8 : 2) (N^benzylo-NHmetylo-L leucyflo)-cyKtopeptyd A N — ltt,9*/i tfearet. 1!1,«V#) Rf = 0,72 (zel krzemionkowy; l,2^dwucMoroetan- -metanol, stosunek objetosctiowy 8 :2) (p*me£ok*ybenzyloksy-4~ka!^ sylotoarbonyia)-cykliopeiytyd A N = 10,8Vt (tatoret. 11,22V») Rf = 0,76 (zel fcrzcsrnionkowy; 1,2-dwuohloroetaii- -metanoi, stosunek objetosciowy 8 :2) /(10-imetylofenotiazM-3-yilo)-al^ A N =* UJM* 2,64f/o) Rf = 0,56 (zel krzemionkowy; 1,2-dwucMoroetan- -nietanol, stosunek objetosciowy 8 2) /0H(3^ben!ZodOKtfenyW A N =* 10,4^/t (teoret. 10^6Vt Rf = 0,57 nmetamol, stosunek objetosciowy 8 : 2) (N^-dwuhecrtylo®Ucylo)^y1dopeptyd A N = ll,43*/t Rf = 0,74 (zel krzeanionftBOwy; 1,2-tfwuchloroetan- -metanol; stsunek objetosciowy 8 :2).Przyklad ni. Rozpuszcza sle 0,21 g N-III- -rzed. butyloksykarbonylo-L-waliny w 25 ml cMorku metylenu zawierajacego dodatek 0,14 ml teójetyloamony. Calosc schladza sde do tempera¬ tury —7°C i dodaje 0,1 ml chloromrówiczanu ety¬ lu, po czym miesza sie w ciagu $5 mlinut w tem¬ peraturze —5°C i wprowadza roztwór P, 96 gcy- ktapeptydu A w 10 ml chlorku metylenu, zawie¬ rajacego dodatek 0,14 ml trójetyloamdny. Miesza¬ nine umieszcza sie w lazni lodowatej, miesza w ciagu 10 gadzim i wreszcie zateia przez odpa¬ rowanie pod cisntiertiem 25 mm Hg. Otrzymuje sie 0,97 g surowego (N-JH-ized. butyloksykairbonylo- -L-waik^)-cyfclopeptydu A (wydajnosc 84§/#). Pro¬ dukt rozpuszcza sie w octanie etylu. Otrzymany roztwór poddaje sie filtracji i przemywa woda, po czym tóJteza sie go, odparowujac do sucha pod cisnieniem 25 mm Hg. Otrzymuje sie 0,73 g czy¬ stego (N-III-rzed. butylokiylsartKmylo-L^walilo)- -cykiopeptydu A (wydajnosc 63f/#) N ±a Il,7*/« (teoret. 12,I*/fl Rf = 0,70 (tel krzettfldtókowy; i,2-dwudh!kroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2).Przyklad IV. Rozpuszcza sie 2,5 g U+6- *.metylooktanolUo N y-benzyloltoykarbonyik)-L a,, y- -dw\iafn4nobutyrylo-L-itreonylo-N y-foenzyloksy- karfoonylo-L a, y-dwuammobutyrylohydrazydu, /otrajraanego wedlug metody opisanej przez K.VcgiLeira i kinyclh w Helv. 46, 1061, (1966)/ w mie- szaninne 73 ml lodowatego kwasu octowego i 7,08 ml nonrnaflnego kwasu solnego. Calosc schla¬ dza sie do temperatury +fi°C i dodaje zamrozo¬ nego roztworu 0,232 g azotynu sodowego w 2,5mi 10 wody, po czym miesza sie w ciagu 15 minut uttfzymwjac temperature 0°C umieszcza w rozdzie¬ laczu oziejbdonym uprzednio do temperatury 0*C i dodaje 200 ml lodowatego 5#/« roztworu wodo- 5 roweglanu sodowego. Warstwe organiczna dekan- tuje sie i przemywa piecdiofcrotnie porcjami po 60 ml Dodbwaitego *)•/• roztworu wodoroweglanu sodowego. Wody przemywane ekstrahuje sie 100 ml lodowatego octanu etylu. 10 Ekstrakty organiczne przemywa sie lodowatym 5f/§ roztworem wodoroweglanu sodowego, laczy sfie je i suszy bezwodnym siarczanem sodowym wtem* peraturze 0—2°C, po czym poddaje sie je szybkiej filtracji i przesacz, stanowiacy roztwór azydku 15 kwasu L (+) O^etyloofctanoflo-N y-toenzyloksy- fcarfionytto-L a-y-lo^wuBimifeiobutytr treonyio-N- ^be^zyiloksyikiaalbKmyflió-L a, y-Krwusfrjlmomaslowego wprowadza sie do lodowatego roztworu 3,23 gcy- Mopeptydu A w 100 ml octanu etylu, zawderaja- 20 cego dodatek 0,47 ml trójetyloaminy. Calosc mie¬ sza sie w ciagu 16 godzin w temperaturze 0—2°C; -a nastepnie 48 godzin w temperaturze 20aC.Otrzymany roztwór poddaje sie zatezeniu do su¬ cha pod cisnieniem 25 mm Hg. Pozostalosc zadaje * sie 100 ml wody i fozciera dó jej rozproszkowa- nia, po czym Calosc poddaje sie filtracji i suszy osad pod cisnieniem obnizonym do 0,3 mm Hg w obecnosci pieciotlenku fosforu. Produkt zadaje sie 20 ml acetonu, odfiWrowuje osad, a przesacz 80 poddaje sie odparowywaniu do sucha pod cisnie¬ niem 20 mm Hjg. Otrzymuje sie 4,44 g L (+) 6- nmetjflooktainoillo-N-y-lben^ a, y- -dwuaminobutyrytto-L treottylo-N-y-ibenzyltofcsykar- bonyao-L a, y-dwuaflnJmobutyry(k*c^^ A 35 (wydajnosc 79V»).N = ll,54Vt (teoret. ll,fe*/t) Rf =* 0,92 (zel krzemionkowy; ly2Hdwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 1:1).Postepujac w sposób opisany wyzej, lecz stosu- <° jac inne, odpowiednie surowce, mozna otrzymac^ nastepujace zwiazM: -cyklopeptyd A.N =« 10,Mf/# (teoret. 10^6*/#); C = 64,tóf/# (teoret. « 66,03«/f) Rf = 0,76 {*efl. knrzemionfcawy; 1^2-io)wai»cffilk)axeitan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2).(N a^pelartgonylo-N e^Derizylok^oarbonylo-L Idzy- lo)M!ylk!lopeptyd A. w N = l/li8»/t (teonet. il|l^/t); C = «3;10«/f (teoret. 63,55§/«) H = 8,41«/i Rf = 0,59 (zel krzemionkowy; l^-dwuchtoroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2) K (N anpalimiftOilo-LN y4DeffiEyioks5^cai1bonyilJo-L a, y- -dwuaTTiinobutyrylo)Hcyto]opeptyd A N »± 10,59*/i (teoret. 10,76*/t); C - 65,02V# Cteordt.H^^/o) H ±s 8^/t (teoret. 8,95f/t) 60 Rf — 0,68 (lei krzemdonkowy; 1,2-dwuchloroetafli- -metanol, stosunek objetosciowy 6 :2) (IN a-M+)6-m£rtylx^o(ktemoilo-N y-lbetizyaoksykairbo* inylo-L y, y-dwtuamd!no(bultyrylo)^yMope|3ity4i A N ^ ll,13«/t ** 63,08*/©)11 79403 12 H « 8,51*/t (teoret. 8,55Vt) Rf = 0,55 (zel krzemionkowy; Ij2-idwuichil0roetan- -metianol, stosunek objetosciowy 8 : 2).Przyklad V. Postepujac w sposób opisany w przykladzie IV, lecz stosujac nastepujace su¬ rowce: iU+)6-mefcylDokt»n©iILo-N y-lbenzyliolksykarlbonylo- -L a, y-iolwiuaimlindbuityryllo^L treonyfljo-N y-lbemizylo- ksyfcarfoonyflOHL a, y^wuamiiKJibutyryOjo^yKlrazyd- -2,5 g.Hodowaty kwas octowy — 75 ml normalny kwas solny — 7,08 ml azotyn sodowy — roztwór 032 mg w 2,5 ml wody (N-metyfto-L waliloj-cyktapeptyd A; roztwór 3,6 g w 100 ml octanu etylu zawierajacego dodatek 0,94 ml tffójetyfloamimy, ataytmufe sie 5,23/ g /L(+) Oniietyilookitaaiodflo-fN y-lbenzy(kksyikBiribcny^ a, y- -dwuaminobutyrylo-L treonylo-N y4enzyloksykar- bonylo-L a, y-dwuaaiiMobu,tyTylo^^metyflK-L wali- lo)-cyklopeptyd A (wydajnosc 87;5*/«). Produkt ten oczyszcza sie metoda chromatograficzna na zelu krzemilonhorwytti. Stosuje sie 50 g zelu krzemion¬ kowego na 5 g produktu, który eluuje sie octa¬ nem etylu i mieszanina octanu etylu z metanolem o stosunku objejtoscfiowytm 9:1. Po oczyszczeniu otrzymuje sie 2,81 g D(+) 6-metylooktainoilo-N y-ibenzyflwiksyikarlbonylo-L a, y-idwuaminobutyrylo- -N-metylo-L walflo-cyklopeptydii A o czystosci chromatograficznej (wydajnosc 47*/*).N = H,79Vo (teoret. 11,79V*) Rf = 0,31 (zel krzemionkowy; l,2- -meatanol, stosunek objetosciowy 8 :2).W sposób wyzej opdsany otrzymac mozna takze nastepujace zwiazki: (Nnatearodio-L walito)^yOdopeptyd A N = 10,46Vt (teoret. lO^/t) Rf = 0,45 (zel krzemionkowy; l,2ndwuchloroetan- ^metanol, stosunek objetosciowy 8:2) (N-stearoilo-N-metylo-Li waHfiloJ^cyMopeptyd A N = 1O,O2V0 (teoret. 10,4§/t) Rf = 0,78 (zel krzemionkowy; l,2^dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2).Przyklad VI. Rozpuszcza sie 1,43 g kwasu heksanokarboksylowego w 5 ml dwuimetylofrma- midu i dodaje nastepnie 0,173 g N-nydroksyimidu kwasu bursztynowego. Calosc schladza sie do tem¬ peratury -^10QC i dodaje 0,31 g dwucyklohetosylo- kartoodwuLmidu. Calosc miesza sie w ciagu godzi¬ ny w temperaturze ^10°C, a nastepnie w ciagu 2 godzin w temperaturze 0°C i w ciagu 18 godzin w temperaturze 20%!.Wytworzony dwucyMoheksylomocznik odfiltro- wuje sie, a do przesaczu dodaje roztworu 1,44 g cyklopeptydu A w 75 ml dwumetyloforimamidu zawierajacego dodatek 0,21 ml trójetyloaminy i miesza w ciagu 18 goctein w temperaturze 20°O Mieszanine zateza sie nastepnie przez odparowy¬ wanie do sucha pod cisnieniem 25 mm Hg. Po¬ zostalosc rozpuszcza sie w 50 ml octanu etylu i przemywa kolejno 5$/« roztworem wodorowegla¬ nu sodowego, normalnym roztworem kwasu solne¬ go i woda. Warstwe organiczna suszy sie bezwod¬ nym siarczanem sodowym, saczy i filtrat poddaje Xo)pajowywaniu do sucha pod cisnieniem 25 mm Hfe.Pozostalosc poddaje sie rozdzielaniu chromato¬ graficznemu na dwudziestokrotnej ilosci zelukrze- mionfcowego, eluujac mieszandnami chloroformu z metanolem o progresywnie zwiekszajacej sieza- 5 wartosci metanolu. HeptanoJlo-cykllopeptyd A jest eluowany mieszanina o stosunku chloroformu do metanolu wynoszacym 98 :2 {objetosciowo). Odpo¬ wiednie frakcje eluatu zateza sie do sucha pod oióndeniem 25 mm Hg. 10 Otrzymuje sie 0,92 g heptanoiflOHcyklopeptydu A (wydajnosc 37§/«) N = ll,2Vo (teoret. ll,77«/t); C = 62,6Vt (teoret. 62,83°/o) H = 8,9Vt (teoret. 8,94Vt) 15 Rf = 0,82 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 66 :35) Postepujac w sposób opisany wyzej, lecz stosu¬ jac inne, odpowiednie surowce mozna otrzymac nastepujace zwiazki: 20 stearodlo-cyfclopeptyd A C = 66,80Vo (itieonet. 65,70Vo); H = 9,60*/t (feoret. 9,62°/o) Rf = 0,82 (zel krzemionkowy; l^-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 65 :35) 25 n-butyrylo-cyklopeptyd A C = 0O,O9W (teoret. 61^/t); H = 8,7^/t (teoret. 8,72«/o) Rf = 0,55 (zel krzemionkowy; l,2Hdwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 65:35) 30 sorlboilb-cyikiLopeipJtyd A N = ll,99°/o (teoret. lil,97f/o) Rf = 0,75 Hmetanol, stosunek objetosciowy 65 :35). chlorowodorek i(ll-pirollidynohetesanoi!lo)^yklopep- 35 tydu A N = 10,9V# (teoret. 11,35); Cl = 2,65*/t (teoret. 2,87%) Rf = 0,60 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek obfietosciowy 65:36) 40 chlorowodorek (2-pkoBdynoheksanoilo)-cyklopep- tyldu A N = lil,81°/« (teoret. 12,06Vo) Rf = 0,70 (zel krzemionkowy; l,'2Hdwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 65 : 36). 45 Przyklad VII. Rozpuszcza sfie 28,75 g cyklo¬ peptydu A w 10,5 ml dwumetyfloformamidu, a na¬ stepnie wprowadza sie 1,28 g N-111-rz.-ibutyloksy- karfbonylo-L metionianu 2,4,5-trójchlorofenylu.Roztwór schladza sie do temperatury 0% i dodaje 50 sie powoli 0,42 ml trójetyloaminy, po czym miesza sie w temperaturze 0°C w diagu 18 godzin. Roz¬ twór ten wprowadza sie do mieszaniny 45 g lodu, 15 ml cykloheksanu i 0,02 ml kwasu octowego.Otrzymuje sie bialy olej, który dekantuje sie i roz- 55 puszcza w 6 ml octanu etylu. Po dodaniu 100 ml eteru naftowego wytraca sie bialy osad, który od- fjOtrowuje sie i suszy. Otrzymuje sie 2,85 g (N- -in-rz.-^butyloksy1gar^onylo-Xj nietiLonyi](0)-cyklo- peptydu A. «o 1,2 g otrzymanego produktu rozpuszcza sie w 2,73 ml 1,8 n roztworu HC1 w dioksanie i po¬ zostawia na okres 5 godzin w temperaturze 20°C.Calosc poddaje sie zatezendu do sucha pod cisnie¬ niem 25 mm Hg. Produkt rozpuszcza sie w octa- 85 nie etylu i poddaje chromajtograifowaniu na 15 g13 79403 14 zelu (krzemionkowego, w kolumnie o srednicy 1,2 cm. Frakcje eluowane mieszanina octanu ety¬ lu z metanolem (stosunek objetosciowy 90:10) la¬ czy sie i odparowuje z ntich rozpuszczalnik pod cisnieniem 25 mm Hg. Pozostalosc zadaje sie 50 ml wody i liofilizuje otrzymany roztwór.Otrzymuje sie 0,52 g chlorowodorku (L metio- nyik)-cy(kiopeptydu A.S = 2,92V« (teoret. 2,849/t) Rf = 0,47 (zel krzemionkowy; 1,2-tiwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2).Postepujac w sposób opisany wyzej, lecz stosu¬ jac inne, odpowiednie surowce, otrzymuje sie na¬ stepujace zwiazki: Chlorowodorek (6^roMynohetoanoilo)-cyfeloipep- tydu A N = 12,05^/t (teoret. 12fi5%h) Rf = 0,52 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 05 :95).Przyklad VIII. Rozpuszcza sie 2 g cyklo- pepfydu A w 40 ml chlorku metylenu i dodaje nastepnie 0,28 ml trójetyloaminy. Calosc schladza sie do temperatury —5 H0°C i wprowadza, w ciagu 10 minut, jednoczesnie, dwa nastepujace roztwory: a) 0,56 ml trójetyloaminy rozpuszczonej w 15 ml chlorku metylenu b) 0,684 g cMorowodorku chloromrówczanu 11- ^dwiietyfloamdTKui^decyM w 15 ml chlorku metylenu.Calosc miesza sie w temperaturze 0°C w ciagu 2 godzin, a nastepnie w temperaturze 20°C w cia¬ gu 18 godzin. Mieszanine reakcyjna przemywa sie 5Vt roztworem wodoroweglanu sodowego i suszy siarczanem sodowym, po czyim poddaje sie ja od¬ parowywaniu na 25 g zelu krzemionkowego, wko¬ lumience do srednicy 1,2 cm. Frakcje eluowane mieszaninami octanu etylu z metanolem o stosun¬ ku objetosciowym wynoszacym 98 : 2 i 95 :5 laczy sie i poddaje zatezandu do sucha pod cisnieniem 25 mm Hg. Pozostalosc zadaje sie 40 ml wody i dodaje, po kropOi, normalnego kwasu solnego, az do uzyskania pH srodowiska wynoszacego 3. Nie¬ wielka Mosc osadu odsacza sie, a przesacz liofili¬ zuje. Otrzymuje sie 1,24 g (borowodorku (11-dwu- etyioamiiniONinriecyl^ A (wydajnosc 50^/t).N - 10,87Vi (teoret. ll,07«/i) Rf = o,64 {zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 65 :35).W sposób opisany wyzej otrzymuje sie takze nastepujace zwiazki: doó^ylokarbonylo-cyklopeptyd A C = 63,50»/t (teoret. 63,08Vt); H = 9,10f/i (teoret. 9,08Vo) N = ll,969/t (teoret. ll/NP/t) Rf = 0,85 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuohloroetan- -onetanol, stosunek objetosciowy 8 : 2).Przyklad DC. Miesza sie w temperaturze 2°C w ciagu 18 godzin 2,96 g cyfklopeptydu A, 0,569 g chlorku o-aiiitrofenylosulfenylu i 0,42 ml tarójetyOoaminy w 40 ml octanu etylu, chlodzac ca¬ losc w lazni lodowej. Nastepnie zateza sie miesza- nline poreakcyjna do sucha, pod cisnieniem 25 mm H&. Otrzymuje sie 3,45 g surowego produktu, któ¬ ry poddaje sie chromatografowaniu na 30 g zelu krzemionkowego w kolumience o srednicy 2 cm.Frakcje eluowane octanem etylu zateza sie do su¬ cha pod cisnieniem 25 mm Hg otrzymujac 1 g 5 (o-nitrofenylosuilfenylo)Hcyklopeptydu A.N = 12,l»/t (teoret. 12,6^/t), S = 2,85V# (teoret. 2,88Vo) Rf = 0,79 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanoi, stosunek objetosciowy 8:2). io W sposób opisany wyzej, lecz stosujac inne od¬ powiednie surowce otrzymuje sie nastepujace zwiazki: (l-Kiwumetylc»manonaltaleno-5HsuMony1]o)-cyMo- peptyd A w N = il,66Vo (teoret. ll/TS^/o); S = 2,69Vt (teoret. 2,69Vi) Rf «= 0,70 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchdoroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2) p-toluenosulfonylo^cyklopeptyd A 20 N = ll,l0Vt (teoret. llj&h); S =: 2,56*/» (teoret. 2,88«/e) Rf = 0,74 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8 : 2) p^oetyloaminobenzenosuilfonylo^yMopeptyd A 25 N = ll,7lVt (teoret. IfiJSM); S = 2,90Vt (teoret. 2,77Vo) Rf — 0,82 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2).Prjzyklad X. Rozpuszcza sie 863 mg (N a-ace- 30 tylo-N e-benzyloksyfcarbonyio-L lizyloHcyklopep- tydu A w 25 ml metanolu. Dodaje sie 863 mg pal¬ ladu osadzonego na weglu (katalizator zawiera 39/t aktywnego metalu). Proces uwodornienia prowa¬ dzi sie przy energicznym mieszaniu w ciagu 2 go- 35 dzfin, w temperaturze 20°C, pod cisniendem 760 mm Hg.Otrzymany roztwór poddaje sie filtracji i prze¬ mywa osad 10 ml 0,5 n kwasu solnego. Przesacz zateza sie do sucha pod cisnieniem 25 mm Hg 40 w odparowniku obrotowym. Pozostalosc rozpusz¬ cza sie w 5 ml acetonu i wytraca produkt przez dodanie 50 ml lodowatego eteru, po czym chlodzi sie w ciagu 3 godzin do temperatury 4%, odfil- trowuje osad, przemywa go eterem i suszy w cia- 45 gu 18 godzin pod cisnieniem 0,3 mm Hg w obec¬ nosci P4O5. Otrzymuje sie 0,46 g <(N a-acetyio-L lizylo)-cyklopeptydu A (wydajnosc 57,6V§).N = 13,0*/i (teoret. 13,23»/i) [a] C= 77,2° (c = 0,5, metanol) Rf = 0,56 (zel krzemionkowy; 1,2-dwiuchloroetan- -imetanol, stosunek objetosciowy 1:1) W sposób opisany wyzej, lecz stosujac inne, od¬ powiednie surowce otrzymuje sie nastepujace zwiazki: 55 metanosulfonian L waHlo-cyMopeptydu A N = 11,83*/q (teoret. li2,14Vt) Rtf = 0,55 (zel 'krzemionkowy; l,a-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 65 : 35) 60 cMorowodorek fL(+) 6HmetyflioKManoffl)o-IL o, y-dwu- aminobutyryOo^L treony(Lo-L. a, y^dwaiaiminiobutyry- lo/-cytóLopeptytdu A Cl = 5,08«/o (teoret. 4,81V#) Rf = 0,14 (zel krzemionkowy; l,2ndwuchLoroet(an- . fi5 -metanol, stosunek objetosciowy 65 :35)79403 15 16 chlorowodorek /D(+) 6-tm«tylookltainio(ilJO-L «, y- HdwuamiiniobutyryiLo-iL tmeonylo-L a, y-dwuamlino- butyrylo)-cyMopeptydu A Cl = 5,08V« (teoret. 4,81§/t) Rf = 0,14 (zel fcrzermonlkowy; l,2Hdwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 1:1) clhlorc-L. a, y- -dwuamiinolyultyryilo-kL treonylo-L a, y-dwuamino- bultyrylo-N^metyfoo-L wafloflo/ncyMopeptydu A.N = 13,3Wt (teoret. 13,25Vo); a = 4,47°/o (teoret. 4,47Vt) Rf = 0,05 (zel tazemfionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 1:1) (N aipalimdix)ilo-L &ylo)-cy(klopie|pityd A N = I0,9*/t (teoret. ll&h) Rf = 0,14 (zel krzemionkowy; 1,2-dwudhloroetan- nmetanol, stosunek objetosciowy 8:2) chlorowodorek (N a-petorguwiyto-L liizyaó)-cyk]opep- tydu A N = 12,20Vt (teoret. 18,W/t); Cl = 2,95°/o {teoret. 2,8lV») Rf = 0,08 (zel kraemdonkowy; 1,2-dwiuchloroetan- nmetanol, stosunek objetosciowy 8:2) chlorowodorek (N «-L(+) Onmetylookltanoiilo-L, a, y- ^dwuaminobutyrylo)-cyMopeptydu A N = 12,27«/i (teoret. 12,480/») Rf = 0,40 -metanol, stosunek objetosciowy 8 :2) (N-metylo-p-dwumetyloaminofenyflo-DLi aianilo)- -cyklopeptyd A N = 13,05«/o (teoret. 13,25V«) Rf = 0,5 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8 : 2).Przyklad XI. 0,5 g 4-l(pHmetokisyibenzyloksy- karbonylo-4Hamimocylkilohekisylokarbonylo) - cyklo- peptydu A rozpuiszcza sie w 10 ml dioksanu i do¬ daje sie 0,25 ml 4 n roztworu Hd w dioksanie, po czyim miesza sie calosc w ciagu 18 godzin.Rozpuszczalnik odparowuje sie pod cisnieniem 30 mm Hg w temperaturze 35°C, a pozostalosc za¬ daje 20 ml octanu etylu. Otrzymany roztwór prze¬ mywa sie 20 ml wody i dekantuje warstwe orga¬ niczna, która nastepnie poddaje sie odparowywa¬ niu do sucha pod cisnieniem 30 mm Hg, w tem¬ peraturze 35°C.Pozostalosc rozpuszcza sie w 10 ml dioksanu, a nastepnie wprowadza sie 0,84 tmi 4 n HC1 w dioksanie. Po czterech godzinach oddestylowuje sie rozpuszczalnik pod cisnieniem 30 mm Hg i w temperaturze 35°C, a pozostalosc zadaje sie 20 ml octanu etylu. Roztwór przemywa sie 20 ml wody. Warstwe wodna dekantuje sie i laczy z fa¬ za wodna z pierwszego przemycia. Po zatezeniu pod cisnieniem 0,3 mm Hg, w temperaturze 35°C, otrzymuje sie sucha pozostalosc, która zadaje sfe 10 ml wody, odMtrowuje niewielka ilosc osadu i poddaje odparowywaniu do sucha pod cisnie¬ niem 0,3 mm Hg, w temperaturze 35°C. Pozosta¬ losc rozpuszcza sie w 10 md wody i liofilizuje.Otrzymuje sie 0,355 g (4-aminocykilohelkisylokarbo- ny!o)-cyMopeptydu A (wydajnosc l&h).N = 12,75e/o (teoret. 12,5ilf/*) Rf. » 0,43 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8:2).Przyklad XII. Rozpuszcza sie 10 g cyklopep- tyidu A w 200 ml chlorku metylenu i wprowadza nastepnie 1,4 ml trojetyloaminy. Otrzymany roz¬ twór schladza sie do temperatury —5°C i wpro- 5 wadza w ciagu 10 minut lodowaty roztwór 1,-81 g chlorku trójchloroacetylu w 20 ml chlorku mety¬ lenu. Calosc miesza sie w ciagu 2 godzin w tem¬ peraturze —5°C, a nastepnie w ciagu 18 godzin w temperaturze otoczemia. Rozpuszczalnik odde¬ stylowuje sie pod cisnieniem 30 mm Hg w tem¬ peraturze 50°C, a pozostalosc zadaje 100 ml octa¬ nu etylu.Osad oddziela sie przez filtracje, a przesacz przemywa kolejno: dwukrotnie — porcjami po 75 ml — 5*/» lodowatym roztworem wodorowegla¬ nu sodowego, dwukrotnie — porcjami po 75 ml — normalnym kwasem solnym i wreszcie 30 ml na¬ syconego roztworu chlorku sodowego, filtruje iza- teza do sucha pod cisnieniem 30 mm Hg w tem¬ peraturze 50°C. Otrzymuje sie 7,23 g surowego produktu, który rozpuszcza sie w 20 ml octanu etylu i poddaje chromatogpafowaniu w kolumnie o srednicy 2 om, zawierajacej 125 g zelu krze¬ mionkowego. Eluuje sie octanem etylu. Produkt uzyskuje sie przez odparowanie do sucha pod ci¬ snieniem 30 mm Hg i w temperaturze 50°C frak¬ cji zawartej pomiedzy 150 i 450 ml eluatu.Po wysuszeniu w 30°C pod cisntieniiem 0,1 mm Hg otrzymuje sie 6 g trójchloroacetylo-cyklopep- tydu A (wydajnosc 53°/o) N = 10,9% (teoret. ll,13f/o) Rf = 0,8 (zel kirzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 65 : 35).Przyklad XIII. Rozpuszcza sie 65 g N-iau- rylo-N-metylo-D waliny w 800 ml chlorku mety¬ lenu i dodaje sie 51 ml trójetyloaminy. Calosc schladza sie w kapieli lodowej i wprowadza 182 g cykiopeptydu A, a nastepnie 42,5 g dwucyklohe- ksylokarbodwuiimidu, po czym miesza sSe w ciagu 18 godzin w temperaturze +i2^C i w ciagu na¬ stepnych 48 godzin w temperaturze 20°C. Po uplywie tego czasu wprowadza sie 5 ml lodowa¬ tego kwasu octowego i odfiltrowuje wytracony osad. Przesacz odparowuje sie do sucha pod ci¬ snieniem 25 mm Hg, a pozostalosc roztwarza w 500 ml octanu etylu. Otrzymana zawiesine schladza sie w kapieli lodowej w ciagu 30 minut, po czym odsacza czesci nierozpuszczalne. Przesacz odparowuje sie do sucha pod cisnieniem 25 mm Hg.Otrzymany surowy produkt oczyszcza sie meto¬ da chromatograficzna. W tym celu rozpuszcza sie go w-»500 ml octanu etylu i otrzymany roztwór przepuszcza sie przez kolumne o srednicy 10 cm zawierajacej 2 kg krzemionki. Kolumne eluuje sie mieszanlinami octanu etylu z metanolem przy wzrastajacej zawartosci metanolu. Zbiera sie frak¬ cje po 300 ml. Eluaty z mieszaniny octanu etylu z metanolem (stosunek objetosciowy 98:2) laczy sie i odparowuje do sucha pod cisnieniem 25 mm Hg.Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 900 ml wody, zakwasza do wartosci pH = 1 przez doda¬ nie 1 n kwasu solnego, po czym miesza sie w cia¬ gu2 godzin do calkowitego rozpuszczenia. Otrzy- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 601T many roztwór odparowuje sie do sucha pod ci¬ snieniem 0,3 mm Hig w celu odpedzenia nadmiaru chlorowodoru, po czym pozostalosc rozpuszcza sie w 500 ml wody i odparowuje do sucha podcisnie¬ niem 0,3 mm Hg. Pozostalosc zadaje sie 900 ml wody i liofilizuje otrzymany roztwór.Otrzymuje sie 74 g chlorowodorku N-laurylo-N- ^netylo-D-walHo^yM^peptykiu A.C = 62,7*/t (teoretycznie: 63,06) H = 9,25f/t (teoretycznie: 9,25) Cl = 2,6°/t (teoretycznie: 2,77) Rf = 0,51 (zel krzemionkowy; 1^-dwuchioroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8 : 2) Przyklad XIV. Postepuje sie, jak w przy¬ kladzie XIII, z tym, ze stosuje sie 1,75 g N-un- decyllio-N^metylo-DHwaliny w 110 ml chlorku me¬ tylenu, 1,52 ml trójetyloaminy, 5,4 g cykdopepty- du A i 112 g dwucykloheksyiokiarbodwuimitau. Po oczyszczeniu surowego produktu metoda chroma¬ tograficzna w kolumnie zawierajacej 120 g krze¬ mionki otrzymuje sie 1,83 g N-undecyio-N-mety- lo-D-waMocyklopeptydu A.C = 64,0°/o (teoretycznie: 64,68) H = 9,09°/q (teoretycznie: 9,54) N = il,l*/o (teoretycznie: 11,43) Rf = 0,63 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8 : 2).Przyklad XV. Postepuje sie, jak w przy¬ kladzie XII, z tym, ze stosuje sie 4,8 g N-myri- stylo-N-metylo-D-waMny w 27 ml chlorku mety¬ lenu, 2,4 ml taójetyloaminy, 10,3 g cyklopeptydu A i 2,09 g dwucyMoheksylokarfooóVuJmidu. Po oczyszczeniiu surowego produktu metoda chroma- togiratfiiczna w kolumnie zaiwtlenaijafceij 100 g krze- mionlkli i nastepnym przeprowadzeniu zwiazku w chlorowodorek otrzymuje sie 2 g chlorowodorku N-myristylo-N-metyllo-D-walilo-cyklopeptydu A.N = 10,5«7o (teoretycznie: 10,73) C51 = 2,56°/o .(teoretycznie: 2,71) Rf = 0,68 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -meitanol, stosunek objetosciowy 8 : 2) Przyklad XVI. Postepuje sie jak w przykla¬ dzie XII, z tym, ze stosuje sie 1,4 g N-trójdecylo- -N-metylo-D^waliny w 80 ml octanu etylu, 1,12 ml trójetyloamdny, 4 g cyklopeptydu A i 0,9 g dwu- cyklohefeylokarfoodwuimiidu. Po oczyszczeniu su¬ rowego produktu metoda chromatograficzna w ko¬ lumnie zawierajacej 50 g krzemionki i nastepnym przeprowadzeniu zwiazku w chlorowodorek otrzy¬ muje sie 0,48 g chlorowodcdku N-trójdecylo-N- -metylo-D-walilo-cyfclopeptydu A.N = 10,32Ve (teoretycznie: 10,85) Cl = 2,77«/o (teoretycznie: 2,82) Rf = 0,75 (zel krzemionkowy; 1,2-dwuchloroetan- -metanol, stosunek objetosciowy 8 :2). PL PL