PL73223B2 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Zgloszenie ogloszono: 30.05.1973 Opis patentowy opublikowano: 31.01.1975 73223 KI. 30h, 2/04 MKP A61k 23/02 Twórcy wynalazku: Eugenia Nowicka, Robert Krauze, Jerzy Mikoszewski Uprawniony z patentu tymczasowego: Wytwórnia Surowic i Szczepio¬ nek, Warszawa (Polska) Sposób rozdzielania surowiczych immunoglobulin klasy A od immunoglobulin klasy M Przedmiotem wynalazku jest sposób rozdziela¬ nia immunoglobulin surowiczych klasy A od im¬ munoglobulin klasy M.Immunoglobuliny klasy A i M stanowia czesc grupy bialek surowic ludzkich i zwierzecych zwa¬ nych gamma-globulinami. Gamma-globuliny spel¬ niaja funkcje przeciwcial i odgrywaja wazna role w mechanizmie odpornosciowym organizmu. Od¬ dzielone od pozostalych bialek surowicy ludzkiej lub zwierzecej stanowia cenny lek stosowany w terapii i profilaktyce.Wobec czestego wystepowania patologicznych niedoborów odpornosciowych, polegajacych na bra¬ ku w surowicach immunoglobulin A lub M i powo¬ dujacych objawy chorobowe, stosuje sie terapie przy pomocy podawania oczyszczonej immunoglo¬ buliny brakujacej klasy. Oczyszczone immunoglo¬ buliny klasy A i M znajduja równiez zastosowanie jako wazne odczynniki do badan biochemicznych oraz jako material wyjsciowy do otrzymywania immunosurowic przeciw IgA i przeciw IgM, uzy¬ wanych w diagnostyce klinicznej do wykrywania stanów patologicznych.Izolowanie z surowicy czystych immunoglobulin A lub czystych immunoglobulin M, zwlaszcza na wieksza skale, stanowi ciagle trudny problem techniczny ze wzgledu na wieloetapowosc proce¬ sów i ich mala koncowa wydajnosc. Jedna z trud¬ nosci, napotykanych przy oczyszczaniu immunoglo¬ bulin A i M, jest oddzielanie ich od siebie w taki 10 15 20 25 30 sposób, aby kazdy z rozdzielanych skladników mógl byc uzyty do dalszego procesu w niezmienio¬ nym stanie fizykochemicznym. Rozdzialu obu tych bialek dokonywano chromatograficznie, adsorbu- jac je na DEAE-celulozie i eluujac nastepnie bu¬ forem fosforanowym o pH = 8 w gradiencie ste¬ zen od 0,02 do 0,3 M (Fahey, 1962).Otrzymywane wyniki byly jednak niezadawala- jace ,poniewaz znaczna czesc materialu pozostawa¬ la nierozdzielona. Inne metody rozdzialu, pp^rte na róznicy w ciezarze czasteczkowym obu immu¬ noglobulin, polegaly na saczeniu bialek przez sito molekularne Sephadex G-200 (Flodin, Killander, 1962) lub ultrawirowaniu (Reisner, Franklin, 1961).Obie te metody nadaja sie raczej do stosowania na mala skale laboratoryjna.Celem wynalazku jest zastosowanie takich wa¬ runków rozdzialu chromatograficznego bialek, za¬ wierajacych gamma-globuliny surowicze, aby im¬ munoglobuliny A i M znajdowaly sie w stanie nie- zdenaturowanym w dwóch dobrze oddzielonych od siebie frakcjach i aby stanowily dogodny pólpro¬ dukt do ich dalszego otrzymywania w stanie czy¬ stym.Sposobem wedlug wynalazku, wykorzystuje sie wystepujaca przy pH powyzej 6,0 róznice w po¬ winowactwach pomiedzy immunoglobulina A, jo¬ nami wersenianowymi i immunoglobulina M wzgle¬ dem kationowych wymienników jonowych, zawie¬ rajacych jako grupy czynne aminy II, III i IV rze- 73 22373 223 3 dowe (np. DEAE-, TEAE-, QAE-celuloze, DEAE- Sephadex itp.). Wieksze powinowactwo wersenia- nu do kationowych wymienników od powinowactwa immunoglobuliny A powoduje, ze w obecnosci pierwszego z wymienionych albo nie zachodzi ad¬ sorpcja immunoglobuliny A na wymienniku, albo, gdy ta adsorpcja juz nastapila uprzednio, zachodzi jej wypieranie z wymiennika. Wersenian, bedac slabiej wiazany przez wymiennik niz immunoglo- bulina M, nie ma wplywu na jej adsorpcje, o ile jego stezenie nie przekracza 0,02 M. Przy wiek¬ szych stezeniach wersenianu moze zachodzic nie¬ korzystny efekt zwiekszania sily jonowej, powo¬ dujacy równiez uwalnianie z wymiennika immu¬ noglobuliny M.Proces rozdzialu prowadzi sie w dwojaki sposób: a) mieszanine bialek, zawierajaca immunoglobu¬ liny A i M, adsorbuje sie na wymienniku katio¬ nowym, a nastepnie, zaadsorbowane immunoglo¬ buliny A eluuje sie roztworem soli wersenianowej o stezeniu od 0,005 M do 0,02 M; b) do roztworu bialek, zawierajacych immunoglobuliny A i M do¬ daje sie sole wersenianu do stezenia od 0,005 M do 0,02 M i adsorbuje sie na wymienniku kationo¬ wym immunoglobuliny M, pozostawiajac w roz¬ tworze niezaadsorbowane immunoglobuliny A. W obu przypadkach proces rozdzialu prowadzi sie w pH powyzej 6,0 oraz przy sile jonowej, nie prze¬ kraczajacej 0,17. Immunoglobuliny M, po usunie¬ ciu immunoglobulin A, moga byc eluowane z wy¬ miennika roztworami soli organicznych lub nieor¬ ganicznych o silach jonowych powyzej 0,17, np. 0,3 M roztworem chlorku sodowego.Poniewaz opisany proces jest procesem lagod¬ nym i nie zagraza denaturacja bialka, mozna go prowadzic zarówno w temperaturze niskiej, jak i pokojowej. W wyniku procesu otrzymywane sa dwie frakcje, z których pierwsza zawiera immuno¬ globuliny A wolne od zanieczyszczen immunoglo- bulinami M, a druga zawiera immunoglobuliny M wolne od immunoglobulin A. Obie frakcje posiada¬ ja, poza wymienionymi immunoglobulinami, rów¬ niez inne bialka surowicy. Oczyszczenie obu im¬ munoglobulin od tych bialek moze byc dokonane przy pomocy opisanych w literaturze metod (Vaer- man i inni, 1963, Chaplin, 1965). Immunoglobuliny A i M nie wykazuja po procesie rozdzialu róznic w ich wlasnosciach fizykochemicznych.Materialem wyjsciowym do rozdzielania immu¬ noglobulin zgodnie ze sposobem wedlug wynalaz¬ ku moze byc nie tylko surowica ludzka lub zwie¬ rzeca, ale równiez frakcje surowicze jak np. frak¬ cja globulinowa, otrzymana przez wysolenie czes¬ ci bialek surowicy przy pomocy siarczanu amonu, lub III frakcja Cohna, otrzymywana przy frakcjo¬ nowaniu surowicy metoda etanolowa (Cohn i inni, 1946.Przyklad I. Frakcje globulinowa, otrzymana z 1 000 ml surowicy ludzkiej przez wytracenie siar¬ czanem amonu przy 50% nasycenia, dializowano wobec 0,04 M buforu octanowo-amonowego, pH = ^ 8,5, do wyrównania stezen. Wydializowany roz¬ twór, zawierajacy 19 g bialka, nalozono na kolumne z ,DEAE-celuloza o wymiarach 6,0X65 cm, zrówno¬ wazona buforem uzytym do dializy. Niezaadsorbo¬ wane bialka wymyto, przeplukujac kolumne 2 li¬ trami tego samego buforu. Zaadsorbowane na ko- Druk. Wabrzezno 4 lumnie immunoglobuliny A wyeluowano, przemy¬ wajac kolumne 5 litrami 0,01 M roztworu werse¬ nianu sodu, doprowadzonego do pH = 8,5. Eluent z kolumny zbierano przy pomocy kolektora frak- 5 cji.Próbki, zawierajace bialko, polaczono. Otrzyma¬ no 1.200 ml plynu, zawierajacego 6,7 g bialka, z czego 1,54 g stanowily immunoglobuliny A. Roz¬ twór ten, badany metodami immunochemicznymi, 10 nie wykazywal obecnosci immunoglobuliny M. Po usunieciu frakcji, zawierajacej immunoglobuline A, kolumne przemyto 3 litrami 0,3 M roztworu chlorku sodowego. Wyplywajacy z kolumny roz¬ twór bialka zbierano przy pomocy kolektora frak- 15 cji. Laczac próbki, zawierajace bialko, otrzymano 1.600 ml roztworu, zawierajacego 4,2 g bialka, z czego 1,05 g stanowily immunoglobuliny M. Frak¬ cja ta byla wolna od immunoglobulin A.Przyklad II. 1.000 g pasty III frakcji Cohna, 20 otrzymanej przy frakcjonowaniu surowicy ludz¬ kiej metoda etanolowa, zawierajacej 240 g bialka, rozpuszczono w 10 litrach schlodzonego do tempe¬ ratury 0UC 0,04 M buforu octanowo-amonowego, pH = 9, zawierajacego 0,01 M wersenian sodu. 25 W uzyskanym roztworze zawieszono 1.000 g DEAE-celulozy, zrównowazonej uprzednio tym sa¬ mym buforem. Zawiesine mieszano wolno w tem¬ peraturze + 4UC przez 3 godziny, a nastepnie DEAE-celuloze z zaadsorbowanym na niej bial- 30 kiem odsaczono pod próznia. Otrzymano 9.200 ml przesaczu, zawierajacego 83 g bialka, z czego 14 g stanowily immunoglobuliny A. Przesacz pozbawio¬ ny byl immunoglobulin M.Odsaczona DEAE-celuloze przeplukano 2 litra- 35 mi buforu octanowo-amonowego z wersenianem so¬ du i zawieszono w 5 litrach schlodzonego do tem¬ peratury + 4°C 0,3 M roztworu chlorku sodowego.Po mieszaniu zawiesiny przez 1 godzine DEAE-ce¬ luloze odsaczono i przeznaczono do regeneracji. 40 Otrzymano 5.050 ml przesaczu drugiego, zawiera¬ jacego 96 g bialka, z których 12,5 g stanowily im¬ munoglobuliny M. Roztwór ten nie wykazywal obecnosci immunoglobulin A. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 45 1. Sposób rozdzielania immunoglobulin klasy A od immunoglobulin klasy M na drodze rozdzialu chromatograficznego na kationowych wymienni¬ kach jonowych, zawierajacych jako grupy czynne 50 aminy II, III i IV rzedowe, znamienny tym, ze mieszanine bialek, zawierajaca immunoglobuliny A i M, adsorbuje sie na wymienniku kationowym, po czym zaadsorbowane immunoglobuliny A elu¬ uje sie roztworem soli wersenianowej o stezeniu 55 od 0,005 M do 0,02 M przy sile jonowej nie prze¬ kraczajacej 0,17 i w pH powyzej 6,0, lub do roz¬ tworu bialek, zawierajacego immunoglobuliny A i M, dodaje sie sole wersenianu do stezenia od 0,005 M do 0,02 M i immunoglobuliny M adsorbu- 6t je sie na wymienniku kationowym przy sile jono¬ wej nie przekraczajacej 0,17 i w pH powyzej 6,0, pozostawiajac w roztworze niezaadsorbowane im¬ munoglobuliny A.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 65 jako roztwory rozdzielanych bialek stosuje sie su¬ rowice ludzkie i zwierzece oraz frakcje bialkowe, otrzymywane z tych surowic. 2513 15.10.74. 100 egz. ia 10 zl PL