Pierwszenstwo: Zgloszenie ogloszono: 10.04.1973 Opis patentowy opublikowano: 26.10.1974 71872 KI. 30h,6 MKP C12d9/22 CZYTELNIA Urzedu PalmAowego Twórcawynalazku: Kazimierz Bronikowski Uprawniony z patentu tymczasowego: Kutnowskie Zaklady Farmaceutyczne "Polfa", . Kutno (Polska) Ciagly sposób prowadzenia biosyntezy nizyny Przedmiotem wynalazku jest ciagly sposób prowadzenia biosyntezy nizyny na drodze fermentacji za pomoca mikroorganizmów ze szczepu nizynotwórczego Streptococcus lactis na podlozu z mleka lub jego wytworów, w tym równiez serwatki oraz serwatki wzbogacanej substancjami azotowymi i weglowodanami.Nizyna stanowi mieszanine róznych polipeptydów i jest inhibitorem wzrostu róznego rodzaju drobnoustro¬ jów, a dzieki temu stosowana jest w przemysle artykulów spozywczych jako srodek konserwujacy.Wedlug dotychczas znanych spsobów biosynteze nizyny przeprowadza sie na drodze fermentacji okresowej przez zaszczepienie w fermentorze uprzednio wyjalowionej pozywki trójprocentowa iloscia kultury bakteryjnej wyhodowanej w propagatorze, bedacej w stadium logarytmicznego rozwoju. Proces prowadzi sie w ciagu 15—22 godzin w temperaturze 25-30°C, utrzymujac w czasie fermentacji wartosc pH = 5,5-6,8. Powstajacy w wyniku fermentacji kwas mlekowy neutralizuje sie za pomoca wodnego roztworu wodorotlenku lub weglanu ipetalu alkalicznego, Wiadomo, ze gromadzacy sie w podlozu fermentacyjnym mleczan jest jednym z hamulców biosyntezy nizyny i jezeli w poczatkowym stadium fermentacji zawartosc soli kwasu mlekowego przekroczy jeden procent, to wtedy nastepuje szybkie wyrodzenie fermentacji przejawiajace sie utrata zdolnosci mikroorganizmów do wytwarzania nizyny. Wzrost zawartosci mleczanu w logarytmicznej fazie wzrostu bakterii jest mniej szkodliwy i w praktyce jego ujemny wplyw ujawnia sie po przekroczeniu zawartosci pieciu procent. Wada okresowej metody fermentacji jest koniecznosc dokonywania wstepnych czynnosci, poprzedzajacych wlasciwa biosynteze, jak mycie i dezynfekcja urzadzen i instalacji, napelnianie pozywka, sterylizacja, chlodzenie, rozruch biosyntezy.Po zakonczonym procesie biosyntezy konieczne jest opróznianie fermentora i napelnianie substratów do nastepnej szarzy itp. Z tym sie wiaze koniecznosc uwzgledniania dodatkowych pojemnosci fermentorów, nierytmicznosc dozowania brzeczki pofermentacyjnej do dalszej obróbki, a co za tym idzie- koszty wytwarza¬ nia produktu musza byc wysokie.Wynalazek ma na celu ograniczenie czasów nieprodukcyjnych do minimum i przeprowadzanie biosyntezy nizyny w sposób ciagly.Stwierdzono, ze cel ten mozna osiagnac na drodze zastosowania przeplywu calosci pozywki w sposób ciagly przez propagator, który stanowi wstepna faze fermentacji. W propagatorze szczep osiaga stadium2 71872 logarytmicznego rozwoju i nastepnie przeplywa do jedno— lub kilkuczlonowego fermentora, w którym nastepuje wlasciwe stadium biosyntezy nizyny, po czym brzeczke kieruje sie z ostatniego czlonu fermentora do dalszego przerobu.Wedlug wynalazku biosynteze nizyny prowadzi sie metoda ciagla w instalacji, która sklada sie z propaga¬ tora i jedno— lub kilkuczlonowego fermentora. Propagator, jak i poszczególne czlony fermentora stanowia pojemniki fermentacyjne, zbudowane z tworzywa odpornego na kwas rtilekowy, wyposazone w mieszadlo, elementy regulacji temperatury i wartosci pH, przystosowane do prowadzenia fermentacji wzglednie beztlenowej, izolowanej od otoczenia przez utrzymywanie nadcisnienia za pomoca obojetnego i wyjalowionego gazu lub powietrza, wprowadzonego do wolnej przestrzeni zbiorników od góry. Przystosowanie pojemników do warunków ciaglej fermentacji polega na zastosowaniu doplywu w dnach pojemników i odplywu na poziomie pojemnosci roboczej. W propagatorze zamontowuje sie dodatkowo kilka krócców odplywowych umieszczonych na róznych poziomach w celu umozliwienia regulacji pojemnosci roboczej. Mozna takze w króccu, umieszczonym na górnej pokrywie propagatora, zamontowac rure zbierajaca, zamocowana szczelnie na króccu wylotowym ale w taki sposób, aby umozliwial wsuwanie lub wysuwanie rury ze zbiornika.Propagator napelnia sie wysterylizowana i ochlodzona w znany sposób pozywka o temperaturze 25—30°C i zaszczepia 1—3 procentowa kultura bakteryjna. Rozpoczyna sie biosynteza nizyny, uwidaczniajaca sie spadkiem wartosci pH srodowiska reakcji. Jezeli wykladnik jonów wodorowych osiagnie wartosc 6,2-5,0 a najlepiej 5,7, to wtedy rozpoczyna sie ciagle dozowanie sterylnej pozywki o temperaturze 25—30°C przez króciec wlewowy propagatora. Jednoczesnie otwiera sie zawór na króccu odplywowym, odbierajac brzeczke z wybranego poziomu i uruchamia mieszadlo. Wielkosc przeplywu winna byc tak dobrana, aby zostala zachowana wybrana stala wartosc pH z zakresu 6,2—5,0, korzystnie 5,6—5,8, która nie moze sie wahac w dól lub w góre wiecej, niz 0,1.Wielkosc przeplywu mozna regulowac przez zmiane wielkosci pojemnosci roboczej propagatora. Stwierdzono równiez, ze objetosciowa szybkosc* przeplywu na godzine jest zalezna od wlasciwosci szczepu uzytego do biosyntezy i ksztaltuje sie^ w granicach wartosci z zakresu 0,5—1,3 objetosci roboczej propagatora, a najczesciej wynosi 0,8 objetosci roboczej propagatora. Wyplywajaca z propagatora brzeczka przeplywa do fermentora, stanowiacego znany zbiornik lub kilka zbiorników fermentacyjnych zaopatrzonych w krócce przeplywowe.Laczna pojemnosc wszystkich zbiorników fermentora winna byc 15—23, najkorzystniej 20 razy wieksza od zalozonej objetosciowej szybkosci przeplywu na godzine.Biosynteze w fermentorze prowadzi sie w znany sposób w czasie teoretycznie nieograniczonym, odbierajac ciagle wyplywajaca na wylocie ostatniego czlonu fermentora brzeczke pofermentacyjna, z której w znany sposób wyodrebnia sie nizyne. W praktyce wydajnosc biosyntezy po pewnym czasie spada. Mozna wtedy skierowac pozywke przez ciag rezerwowy z przygotowanym uprzednio do rozpoczecia fermentacji rezerwowym propagatorem. W ciagu rezerwowym tylko propagator i pierwszy czlon fermentora winny byc zapasowe. Pozosta¬ le czlony fermentora moga byc wspólne dla obu ciagów.Zaleta sposobu wedlug wynalazku jest zwiekszenie wydajnosci biosyntezy o 10—15 procent, miniatury- 'zacja urzadzen i instalagi, znaczne oszczednosci na robociznie bezposredniej i likwidacja szarz produkcyjnych o zerowej wydajnosci itp.Nizej podany przyklad wykonania wynalazku wyjasnia, blizej jego istote, nie ograniczajac zakresu wynalazku.Przyklad. Do wysterylizowanej probówki z zawartoscia 15 ml wyjalowionego mleka odtluszczonego wprowadza sie sterylnie 0,8 ml ozywionej w znany sposób kultury bakteryjnej nizynotwórczej o wydajnosci okreslonej w warunkach fermentacji okresowej, równej 4000 jednostek/ml, wstrzasa, zamyka korkiem z jalowej v waty i wstawia do cieplarki o temperaturze 30°C na przeciag 16 godzin, po czym zawartosc probówki wylewa sie sterylnie do propagatora, napelnionego jalowym mlekiem odtluszczonym w ilosci 300 ml, a nastepnie propaga¬ tor z zawartoscia wstawia sie do termostatu o temperaturze 30°G. Nastepuje wówczas spadek wartosci pH mleka, która po uplywie 4-5 godzin dochodzi do wartosci 5,7. Od tego czasu rozpoczyna sie dozowanie pasteryzowane¬ go lub sterylizowanego i ochlodzonego do temperatury 30°C mleka odtluszczonego z szybkoscia 200 ml/godzine przez króciec doplywowy od dolu propagatora, wlacza mieszadlo i otwiera króciec odplywowy.Jezeli zachodzi dalszy spadek wartosci pH, to wtedy zwieksza sie stopniowo szybkosc przeplywu mleka przez propagator.Natomiast w przypadku wzrostu wartosci pH koniecznym sie staje obnizenie szybkosci przeplywu do okolo 150 ml/godzine, a nastepnie w miare spadku wartosci pH stopniowo podnosi sie szybkosc przeplywu mleka w taki sposób, aby utrzymywac mozna bylo w brzeczce propagatora mozliwie stala wartosc pH, równa 5,7 z ewentualnym odchyleniem w dól lub w góre o 0,1. Po ustaleniu sie szybkosci przeplywu mleka przy wartosci pH = 5,7 oblicza sie prawidlowa objetosc propagatora przy zalozeniu wymaganego przeplywu brzeczki, która W tym przypadku wynosi 240 ml/godzine. W tym celu uzyskana w praktyce szybkosc przeplywu brzeczki, równa 260 ml/godzine dzieli sie przez objetosc robocza propagatora wynoszaca 315 ml uzyskujac wspólczynnik3 71872 równy 0,825. Nastepnie wymagana szybkosc przeplywu brzeczki 240 ml/godzine dzieli sie przez uzyskany wspólczynnik 0,825. Uzyskana liczba 291 stanowi objetosc robocza propagatora dla szybkosci równej 240 ml/godzine. W dalszym toku postepowania ustala sie pozioom odplywu pozywki z propagatora na poziomie jego objetosci roboczej, wynoszacej 291 ml i jednoczesnie reguluje przeplyw brzeczki na wyjnagana wielkosc 240 ml/godzine. Ewentualne wahania w dalszym toku fermentacji rekompensuje sie przez zwiekszenie lub zmniejszenie pojemnosci roboczej propagatora, zachowujac mozliwie stala wartosc przeplywu. Brzeczka z propagatora przelewa sie samorzutnie hermetycznym rurociagiem dó nizej ustawionego fermentora jedno- czlonowego, w którym nastepuje wlasciwe stadium biosyntezy, w temperaturze 30°C, przy czym co godzine reguluje sie wartosc pH za pomoca 10-procentowego wodnego roztworu wodorotlenku sodu. Objetosc robocza fermentora jest równa 4800 ml. Uzyskuje sie wydajnosc biosyntezy nizyny w wysokosci 4500 jednostek/ml, trwala w okresie jednego miesiaca. PL