Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company, Indianapolis (Stany Zjednoczone Ameryki) Sposób wytwarzania nowego antybiotyku oraz jego soli Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego antybiotyku A 16884 oraz jego soli.Nowy antybiotyk A 16884 wytwarza sie droga fermentacji nieznanego dotychczas szczepu Streptomyces lipmanii, a sole tego antybiotyku wytwarza sie poddajac go reakcji z odpowiednim kwasem lub zasada.Antybiotyk 16884 i jego sole wykazuja dzialanie przeciwbakteryjne i przeciwrobaczycowe, przy czym dzialanie przeciwbakteryjne zachodzi zarówno wobec ustrojów Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, jak i wobec ustrojów wywolujacych choroby roslin.Amonowa sól antybiotyku A 16884 jest biala amorficzna substancja ulegajaca rozkladowi w temperaturze okolo 180oC, dobrze rozpuszczalna w wodzie, rozpuszczalna w dwumetylosulfotlenku, slabo rozpuszczalna w nizszych alkanolach i nierozpuszczalna w acetonitrylu. Sól ta jest zwiazkiem amfoterycznym o 4 dajacych sie zmiareczkowac grupach opK'ai = 3,9, pK'a2 - 5,3, pK'a3 = 9,2 ipK'a4 ,= 10,5 przy miareczkowaniu w 66% roztworze dwumetyloformamidu przy wyjsciowej wartosci pH = 5,8. Pozorny ciezar czasteczkowy zwiazku wynosi okolo 435 wedlug danych z miareczkowania, w sklad jego wchodzi 44,01% wegla, 5,73% wodoru, 10,65% azotu, 31,27% tlenu i 6,86% siarki, a jego optyczna skrecalnosc wlasciwa [ct]f5 wynosi +140,9° (c = 1% ciezar/objetosc, w wodzie). Analiza widma absorpcyjnego w podczerwieni próbki zawiesiny zwiazku woleju mineralnym wykazuje nastepujace pasma: 3,18 (szerokie pasmo), 5,66; 6,26; 6,57; 6,89; 7,15; 7,28; 7,40; 7,73; 8,00; 8,14; 8,79; 9,24; 9,65; 9,79 i 10,40 mikronów. Badania soli na takie reagenty jak ninhydryna, Pan Dutscher, Benedict, Molisch, jod i chlorek dansylu daja wyniki dodatnie, podczas gdy badania na roztwór Fehlinga, chlorek zelazowy, biuret i Sakaguchi daja wyniki ujemne.Sposób wedlug wynalazku wytwarzania antybiotyku A 16884 i jego soli polega na tym, ze hoduje sie szczep Streptomyces lipmanii NRRL 3584 w pozywce zawierajacej przyswajalne zródla wegla, azotu i soli nieorganicznych w warunkach aerobowych w zanurzeniu, do momentu wytworzenia odpowiedniej ilosci zadanego antybiotyku. Antybiotyk A 16884 jest peptydem zawierajacym siarke, o czasteczce amfoterycznej.Podobnie do innych hodowli, fermentacja szczepu Streptomyces lipmanii powoduje wytworzenie sie szeregu substancji antybiotykowych, z których jedna stanowi antybiotyk A 16884. Inne substancje sa albo stosunkowo nietrwale albo wystepuja w bardzo malych ilosciach.2 71107 Antybiotyk A 16884 stosuje sie w postaci czystej lub w postaci soli, na przyklad soli addycyjnej z kwasem albo soli z kationem. W przypadku soli z kationem moze to byc sól z jednym lub dwoma kationami. Czesto korzystnie jest wytwarzac sole bezposrednio podczas etapu oczyszczania. Antybiotyk A16884 zostal wyosobniony w postaci soli jednoamonowej i jako taki jest opisany ponizej.Jednoamonowa sól antybiotyku A 16884 jest biala amorficzna stala substancja, ulegajaca rozkladowi w temperaturze okolo 180°C, dobrze rozpuszczalna w wodzie, rozpuszczalna w dwumetylosulfotlenku, slabo rozpuszczalna w nizszych alkanolach i zasadniczo nierozpuszczalnych w acetonitrylu i innych rozpuszczalnikach organicznych. Podana wyzej wartosc optycznej skrecalnosci wlasciwej jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 odnosi sie do soli suszonej w ciagu okolo 15 godzin nad bezwodnym chlorkiem wapniowym w temperaturze pokojowej pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego.Elektrometryczne miareczkowanie jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 w 66% wodnym roztworze dwumetyloformamidu przy wyjsciowej wartosci pH = 6,6 wykazuje obecnosc 4 grup: pK^ = 3,5, pK'a2 = 5,2; pK'a3 = 9,2 ipK'a4 = 10,3. Podobne miareczkowanie lecz przy wartosci pH 5,8 wykazuje grupy: pK'ai = 3,9; pK'a2 = 5,3; pK'a3 = 9,2 i pK'a4 = 10,5. Po przeksztalceniu jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 w kwas, grupa pK'a 9,2 znika. Ciezar czasteczkowy soli jednoamonowej wynosi okolo 435.Analiza pierwiastkowa jednoamonowej soli antybiotyku A 16884, wysuszonej nad pieciotlenkiem fosforu w temperaturze okolo 80°C pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, wykazuje obecnosc 44,01% wegla, 5,73% wodoru, 10,65% azotu, 31,27% tlenu i 6,86% siarki. Zawartosc grupy metoksylowej wynosi 6,64%, a acetylowej -9,23%.Próba Van Slyke'a na zawartosc aminowego azotu wykazuje 5,09%.Absorpcyjne widmo w podczerwieni próbki zawiesiny jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 w oleju mineralnym przedstawiono na fig.l. Dostrzegalne pasma w zakresie 2,0-15,0 mikronów podano wyzej.Absorpcyjne widmo w nadfiolecie wodnego roztworu jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 wykazuje szczyty absorpcyjne przy dlugosci fali 242 milimikronów (E}fm = 126) i przy 625 milimikronów (E}§Ji= 158).Pomiary zjawiska Cottona w roztworze wodnym wykazuja wartosc dodatnia w pasmie 263 milimikronów, a ujemna - w pasmie 236 milimikronów.Chromatografia bibulowa jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 z zastosowaniem papierka Whatmana nr 1 daje wartosc Rf - 0,79, przy czym jako rozpuszczalnik stosuje sie mieszanine propanolu, acetonitrylu i wody w stosunku objetosciowym 1:1:1. Próbki bioautograficzne otrzymuje sie przez umieszczenie papierka chromatograficznego na plytkach agarowych usianych wrazliwymi ustrojami testowymi, takimi jak Salmonella gallinarum.Widmo magnetycznego rezonansu jadrowego antybiotyku A 16884 wD20 wykazuje nastepujace cechy: 5,15 czesci/milion (1H, singlet), 4,86, 4,68 czesci/milion (2H, AB kwartet, J - 12,5 c/s); 3,9-3,7 czesci/milion (1H, multiplet); 3,67, 3,29 czesci/milion (2H, AB kwartet, J = 18 c/s); 3:,53 czesci/milion (3H, singlet); 2,6-2,3 (2H multiplet); 2,10 czesci/milion (3H, singlet); 2,1-1,6 czesci/milion (4H, multiplet).Chromatografia bibulowa jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 winnych rozpuszczalnikach daje nastepujace wyniki: Rozpuszczalnik WartoscRf Mieszanina etanolu z woda w stosunku 80 : 20 z 1,5% chlorku sodowego; papierek nasycony 1 n siarczanem sodowym 0,58 Mieszanina metanolu, propanolu i wody w stosunku 6:2:1; papierek buforowany 0,75 m fosforanu potasowego; pH =4,0 0,21 Mieszanina propanolu, pirydyny, kwasu octowego, acetonitrylu i wody w stosunku 45 : 30 : 9 :40 :36 0,40 Mieszanina III-rzed. alkoholu amylowego, acetonu i wody w stosunku2:1:2 0,40 Mieszanina octanu etylu, kwasu octowego i wody w stosunku 3:1:1 0,36 Mieszanina ketonu metylowo-etylowego i wody w stosunku 92 : 8; papierek buforowany 0,1 n octanem sodowym, pH4,6 nieruchomy Mieszanina propanolu z woda w stosunku 70 :30 0,30 Butanol nasyconywoda nieruchomy Butanol nasycony woda z 2% kwasu p-tolueno-sulfonowego 0,60 Cienkowarstwowa chromatografia jednoamonowej soli A 16884 na plytkach zelu krzemionkowego w 70% wodnym roztworze acetonitrylu, z zastosowaniem ninhydryny jako detektora, wykazuje wartosc Rf okolo 0,47, a na plytkach celulozowych w 70% wodnym roztworze acetonitrylu z tym samym detektorem wartosc ta wynosi3 71107 0,45. Aminokwasowa analiza kwasowego hydrolizatu antybiotyku A 16884, prowadzona metoda Spackma- na-Moore'a-Steina, wykazuje dwa szczyty reagujace z ninhydryna, z których jeden eluuje sie identycznie z glicyna ' (0,758 mikromoli/mg, a drugi eluuje sie tuz przed glicyna i identyfikuje jako kwas a-aminoadypinowy 2,39 mikromoli/mg. Podobna analiza pózniejszej próbki daje odpowiednio 0,49 mikromoli/mg i 1,2 mikromoli/mg.Przeprowadzono równiez szereg jakosciowych badan chemicznych antybiotyku A 16884. Wartosci dodatnie uzyskuje sie podczas badan na takie reagenty jak ninhydryna, Pan Dutscher, Benedict, Molisch, jod i chlorek dansylu, a ujemne — wobec roztworu Fehlinga, chlorku zelazowego, biuretu i Skaguchi. Jednoamonowa sól antybiotyku A 16884 okazuje sie trwala przy wartosci pH = 3-9 w temperaturze 5°C wciagu 8 dni, stosunkowo trwala przy wartosci pH = 3—9 w temperaturze 25°C w ciagu 4 dni i nietrwala przy róznych wartosciach pH w temperaturze 100°C wciagu 5 minut. Aktywnosc biologiczna zwiazku zanika powoli przy wartosci pH = 3-9 w temperaturze 37°C, przy czym polowa tej aktywnosci zanika w ciagu 4 dni.Antybiotyk A 16884 powstrzymuje rozwój bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Ilosci czesciowo oczyszczonej jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 potrzebne do zahamowania wzrostu podanych przykladowo drobnoustrojów podano w tablicy 1. Ilosci te okreslono metoda rozcienczenia agarowego lub rozcienczenia roztworem fermentacyjnym (oznaczonymi w tablicy 1 odpowiednio „r.a."i „r.f.").Podczas próby „r.a." badany drobnoustrój rozprowadza sie na plytkach agarowych zawierajacych rózne ilosci jednoamonowej soli antybiotyku A16884, celem wyznaczenia minimalnej ilosci antybiotyku wmcg/ml, potrzebnej do zahamowania wzrostu drobnoustroju w ciagu 48 godzin, a w przypadku drobnoustrojów wywolujacych choroby roslin — w ciagu 72 godzin.Podczas próby „r.f." szereg probówek zawierajacych pozywke z róznymi ilosciami amonowej soli antybiotyku A 16884 zaszczepia sie badanym drobnoustrojem, celem wyznaczenia minimalnej ilosci antybiotyku w mcg/ml, potrzebnej do zahamowania wzrostu drobnoustroju w ciagu okolo 20 godzin.Tablica 1 Nazwadrobnoustroju Potrzebnailosc antybiotyku w mcg/ml Escherichia coli EC 0127 ProteusPR6 SalmoneHa typhimurium 54 Salmonella typhosa T63 Staphylococcus aureus 3055 Staphylococcus aureus 3150 Pseudomonas aeruginosa X239 Salmonella flexneri SH3 Klebsiella aerobacter KI Klebsiella aerobacter KAI4 Mycobacterium avium X85 Streptococcus pyogenes 203 BacillussubtilisX12,l Neurospora sp. M 45-846 Sarcinalutea Xl 86 Escherichia coli ECO 127 Klebsiella aerobacter KA 14 Salmonella typhosa 6,25 r.a. 1,56 r.a. 3,12 r.a. 1,56 r.a. 50,00 r.a. 50,00 r.a. 50,00 r.a. 6,25 r.a. 6,25 r.a. 1,56 r.a. 50,00 r.a. 3,12 r.a. 3,12 r.a. 50,00 r.a. 6,25 r.a. 7,80 r.f. 15,60 r.f. 31,20 r.f.W zadnej z powyzszych prób nie wystepuje wiazanie przez surowice konska. Jak wynika z powyzszej tablicy, jednoamonowa sól antybiotyku A 16884 wykazuje aktywnosc zarówno wobec Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych drobnoustrojów.Dokladniej oczyszczona jednoamonowa sól antybiotyku A16884 poddaje sie dalszemu badaniu 'z zastosowaniem roztworu fermentacyjnego celem okreslenia jej aktywnosci przeciwbakteryjnej. W tablicy 2 podano wyniki tych badan, wyrazone jako minimalne ilosci antybiotyku w mcg/ml, potrzebne do zahamowania wzrostu drobnoustroju.4 71107 Tablica 2 Nazwa drobnoustroju Streptococcus pyogenes C 203 Staphylococcus aureus 3055 Escherichia coli EC 14 Klebsiella aerobacter KA 14 ProteusPRó ProteusPR17 Salmonella typhosa SA 12 Salmonella typhimurium S 4 Pasteurella multocida P 3 Shigella sonnia I SH 10 • Po 12 godzinach 64 128 8 8 • 2 • • • • - nie wykonano.Po 24 godzinach 128 128 8 16 8 8 4 4 2 16 Antybiotyk A 16884 i jego sole wykazuja równiez in vivo aktywnosc wobec wielu z powyzszych drobnoustrojów, dzieki czemu maja zastosowanie do zwalczania infekcji u zwierzat. Skuteczna dawka ED50 czesciowo oczyszczonej jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 wynosi 23 mg/kg w przypadku myszy skazonych Proteus PR 6, a 33,8 mg/kg w przypadku myszy skazonych Shigella SH 3. Natomiast ED50 dokladniej oczyszczonej jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 wynosi 3,64 mg/kg u myszy skazonych Escherichia coli EC 14, 23 mg/kg u myszy skazonych Salmonella typhosa SA 12 i 93,4 mg/kg w przypadku myszy skazonych Klebsiella pneumoniae K 1. Antybiotyk wprowadza sie w kazdym przypadku droga podskórna.Jak wspomniano wyzej, antybiotyk A 16884 i jego sole wykazuja poza aktywnoscia przeciwbakteryjna aktywnosc przeciwrobaczycowa, dzieki czemu srodki te moga byc podawane zwierzetom stalocieplnym w celu zwalczania rozmaitych pasozytów, a szczególnie robaków zoladkowych i jelitowych, takich jak Ascaris lumbricoides var. suum, Nematospiroides dubius, Aspiculuris tetraptera, Syphacia obYelata i inne. Antybiotyki podaje sie korzystnie doustnie, na przyklad przez domieszanie do pokarmu zwierzecego, w postaci tabletek, plynów itp. Na ogól, skuteczna pojedyncza dawka wynosi 1-500 mg antybiotyku na 1 kg lub wiecej wagi ciala zwierzecia. W przypadku stosowania antybiotyku A 16884 lub jego soli w postaci skladnika normalnego pokarmu, dobre wyniki osiaga sie stosujac ilosc 0,0001-0,05% antybiotyku w stosunku do wagi pokarmu, przy czym korzystna iloscia jest zawartosc w granicach 0,01-0,05%.Przeciwrobaczycowa aktywnosc antybiotyku A 16884 ilustruja nastepujace doswiadczenia. W pierwszym doswiadczeniu jednoamonowa sól antybiotyku A 16884 podaje sie jednorazowo przez sonde dwóm myszom skazonym Aspiculuris tetraptera i Syphacia obvelata (owsiki), przy czym stosuje sie dawke 500 mg soli na 1 kg wagi ciala myszy, zawieszona w soli fizjologicznej zawierajacej 0,125% metylocelulózy. Dla porównania stosuje sie grupe kontrolna myszy skazonych Aspiculuris tetraptera i Syphacia obvelata. Obie grupy przechowuje sie w normalnych warunkach laboratoryjnych wciagu 48 godzin od momentu podania antybiotyku, po czym usmierca sie wszystkie myszy i bada na obecnosc owsików. Wyniki badan podano w tablicy 3.Tablica Grupa kontrolna Jednoamonowa sól antybiotyku A 16884 w dawce 500 mg/kg 3 Liczba owsików na 1 mysz Aspiculuris Syphacia tetraptera obvelata 26 52 0 2,5 W drugim doswiadczeniu jednoamonowa sól antybiotyku A 16884 miesza sie z 3 porcjami typowego pokarmu dla myszy w ilosci po 0,005, 0,01 i 0,05% antybiotyku w stosunku do wagi pokarmu i porcjami tymi karmi sie oddzielne grupy, po 5 myszy kazda. Po uplywie okolo 24 godzin po rozpoczeciu karmienia poddaje sie myszy skazeniu Ascaris lumbricoides var. suum ova. Oddzielnej, kontrolnej grupie 5 myszy podaje sie pokarm nie zawierajacy antybiotyku i zakaza sie zwierzeta w tym samym czasie tym samym drobnoustrojem. Wszystkie myszy karmi sie w warunkach laboratoryjnych w ciagu 10 dni, po czym odsuwa sie pokarm, a jedenastego dnia usmierca sie zwierzeta i poddaje ich pluca badaniu na obecnosc zmian wywolanych przez Ascaris lumbricoides var. suum.W tablicy 4 podano zawartosc jednoamonowej soli antybiotyku A 16884 w pokarmie i przecietna liczbe uszkodzen w plucachjednego zwierzecia kazdej grupy.5 71 107 Tablica 4 Przecietna liczba uszkodzen 2,2 0,5 0,4 0,4 pluc Grupa Kontrolna Zawartosc antybiotyku 0,005% Zawartosc antybiotyku 0,01% Zawartosc antybiotyku 0,05% Antybiotyk A 16884 wytwarza sie przez hodowanie nowoodkrytego, nigdzie dotychczas nie opisanego szczepu drobnoustroju, wyosobnionego z próbek gleby poludniowo-amerykanskiej.Ustrój ten wyosobniono z próbek gleby przez zawieszenie porcji tych próbek w sterylnej wodzie destylowanej, a nastepnie natryskanie otrzymana zawiesina plytek agarowych, które poddaje sie kilkudniowej inkubacji w temperaturze okolo 25-35°C. Po zakonczeniu okresu inkubacyjnego, za pomoca sterylnej petli platynowej przenosi sie A 16884 - twórczy drobnoustrój na skosy agarowe, które poddaje sie inkubacji, celem wytworzenia odpowiedniej ilosci szczepionki do produkcji antybiotyku A 16884.Stosowane do wyrobu antybiotyku A 16884 promieniowce zidentyfikowano metoda Waksmana i Curtisa jako szczep Streptomyces lipmanii. Nowy drobnoustrój, stosowany do wytwarzania antybiotyku A 16884, umieszczono w stalym depozycie w zbiorze Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (poprzednio Northern Regional Research Laboratories) w Peorii, Illinois 61604, gdzie jest dostepny bez ograniczen pod numerem NRRL 3584.Charakterystyke Streptomyces lipmanii NRRL3584 podano w tablicach 5 i 6. Do opracowania tej charakterystyki zastosowano metody zalecane przez International Streptomyces Project [Shirling i inni - „Methods for Characterization of Streptomyces Spccies", w Inter. Buli. Systematic Bacteriol. 16, str. 313-340 (1966)] wraz z pewnymi dodatkowymi testami. Nazwy barw okreslono metoda ISCC-NBS, opisana przez Kelly'ego i innych w The ISCC-NBS Method of Designating Colors and a Dictionary of Color Names(U.S.Department of Commerce Circ. 553, Washington, D.C. 1955). Oznaczenia w nawiasach odnosza sie do szeregu barw Tresnera i Backusa [Tresner i in. „System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy", wAppl.Microbiol. 11, str. 335-338 (1963)], a oznaczenia kolorów sa podkreslone. Bloki barw Maerza i Paula (Maerz i inni, Dictionary of Color, McGraw-Hill Book Co., Inc., New York, 1950) zamknieto w nawiasach kwadratowych. O ile nie zaznaczono inaczej, hodowle prowadzono w temperaturze 30°C w ciagu 14 dni.Tablica 5 Morfologia Charakterystyka na pozywce: ISP 2 (drozdze i agar z ekstraktu slodowego ISP 3 (agar owsiany) ISP 4 (sole nieorganiczne i rozpuszczalny agar skrobiowy) ISP 5 (gliceryna i agar asparaginowy) Pasta pomidorowa i agar owsiany Sporofory sa zwykle proste, do kretych z nielicznymi haczykami; zarodniki krótkie o ksztalcie cylindrycznym i wymiarach 0,5-1 ,5juX 1,0-2,5/z wystepuja zwykle w lan¬ cuchach po 3-10, niekiedy po 10-50. Pod mi¬ kroskopem okazuja sie miec gladka powierz¬ chnie.Wzrost umiarkowany, odwrotny ciemnoszarawy brunat [8119]; grzybnia powietrzna bladozólta (Y)2db, Wzrost umiarkowany, odwrotna ciemnoszarawa zólcien [ 13E4J; grzybnia powietrzna umiarko¬ wana, biala (W) 13ba do bladozóltej (Y) 2db.Wzrost umiarkowany, odwrotna brunatnawa szarzen [7C7]; grzybnia powietrzna umiarkowana, bladozólta (Y) 2db.Wzrost obfity, odwrotny jasnozóltawy brunat [1317]; grzybnia powietrzna obfita, szarawo- -zóltawy-róz (R) 5dc.Wzrost liczny, odwrotny szarawo-zóltawy-brunat [15E8]; grzybnia powietrzna obfita, zóltawo- -szara (GY) 2dc.6 71107 Agar Emersona Agar Bennetta Agar Czapka Glukoza — agar asparaginowy Agar tyrozynowy Agar odzywczy Agar z maleinianu wapniowego Fizjologia Dzialanie na mleko Redukcja azotanów Produkcja melaniny: agar peptonowo-zelazowy trypton-ekstrakt drozdzowy Warunki cieplne na pozywce z pasty pomidorowej i agaru owsianego Reakcja barwy na zmiane wartosci pH 0,05 n HC1 0,05 n NaOH Skraplanie zelatyny Wzrost umiarkowany, odwrotny ciemno-szarawo- -zóltawy-brunat [8E9]; grzybni powietrznej i zarodników brak.Wzrost obfity, odwrotny srednio-zóltawy-brunat [14E7J; grzybnia powietrzna obfita, szarawo- -zólta (R) 3ec.Wzrost slaby, bialy; skapa grzybnia powietrzna (W) 13ba.Wzrost obfity, odwrotna szarawa-zólcien [12D4]; grzybnia powietrzna obfita, zóltawo- -szara (GY) 2dc.Wzrost umiarkowany, odwrotny jasnozóltawy- brunat [12C5]; grzybnia powietrzna obfita, szarawo-zólta (R) 3ec.Wzrost umiarkowany, odwrotna jasna zólcien [ 1 iCl]; grzybni powietrznej brak.Wzrost umiarkowany, odwrotna czern [56C1]; bardzo skapa grzybnia powietrzna.Koagulacja, peptonizacja Dodatnia Ujemna Ujemna Obfity wzrost i zarodnikowanie w temperaturze 26°C i 30°C; slaby wzrost w temperaturze 37°C; brak wzrostu w temperaturze 43°C.Brunatnawa szarzen zmienia sie w czerwien Bez zmian 100%.W tablicy 6 podano wyniki przeprowadzonych na drobnoustroju NRRL 3584 prób na wykorzystanie wegla, przy czym + oznacza wzrost i wykorzystanie wegla — oznacza brak wzrostu i wykorzystania wegla.Tablica 6 Wykorzystanie wegla przez NRRL 3584 Zwiazek L- arabinoza sacharoza D-ksyloza D-fruktoza glukoza ramnoza rafinoza i-inozyt D-mannit kontrolny (bez wegla) Wzrost7 71107 Jak podano wyzej, antybiotyk A 16884 wytwarza sie przez hodowanie drobnoustroju NRRL 3584. Jako pozywke stosuje sie którakolwiek z kilku substancji dzieki temu, ze, jak wynika z powyzszych badan, ustrój jest zdolny do wykorzystywania róznych zródel energii. Ze wzgledu na koszt produkcji, maksymalna wydajnosc procesu oraz latwosc wyosabniania antybiotyku, stosuje sie korzystnie pewne stosunkowo proste pozywki, a wiec przyswajalne zródla wegla, takie jak glukoza, skrobia, gliceryna, melasa, dekstryna i inne, sposród których najkorzystniej stosuje sie glukoze, oraz zródla przyswajalnego azotu, takie jak maczka sojowa, stale substancje z wyciagu kukurydzy, drozdze, maczka z nasion bawelny, ekstrakt wolowy, peptony (miesne lub sojowe), kazeina, mieszaniny aminokwasów itp., przy czym korzystnie stosuje sie peptony, maczke sojowa, mieszaniny aminokwasów itp. Pozywka moze zawierac odzywcze sole nieorganiczne zdolne do oddawania jonów sodowych, potasowych, amonowych, wapniowych, fosforanowych, siarczanowych, chlorkowych, weglanowych itp.Pozywka moze równiez zawierac niewielkie ilosci innych pierwiastków potrzebnych do osiagniecia optymalnego wzrostu i rozwoju drobnoustroju stosowanego do produkcji antybiotyku A 16884. Pierwiastki te wystepuja zwykle jako odpowiednie domieszki winnych skladnikach pozywki. Wyjsciowa wartosc pH pozywki moze byc rózna, przy czym stwierdzono, ze korzystnie winna ona wynosic 6,5—7,2. Jak zaobserwowano, w przypadku innych promieniowców wartosc pH pozywki wzrasta stopniowo w miare wzrostu ustroju i wytwarzania antybiotyku, osiagajac poziom 6,7-7,5 lub wyzszy, przy czym koncowa wartosc pH zalezy przynajmniej czesciowo od wartosci wyjsciowej, substancji buforowych w pozywce oraz czasu wzrostu drobnoustroju. \ Antybiotyk A 16884 wytwarza sie w zanurzeniu w warunkach aerobowych. Do wytwarzania stosunkowo malych ilosci antybiotyku stosuje sie powierzchniowa hodowle wstrzasana w butelkach, natomiast do produkcji duzych ilosci tego srodka stosuje sie korzystnie aerobowa hodowle w sterylnych zbiornikach. Pozywke w sterylnym zbiorniku mozna zaszczepic zawiesina z zarodnikami; jednak ze wzgledu na opóznienie wzrostu jakie nastepuje w takim przypadku, korzystnie stosuje sie hodowle wegetatywna, która zapewnia bardziej efektywne wykorzystanie urzadzen do fermentacji. Korzystnie zatem najpierw wytwarza sie wegetatywna szczepionke ustroju przez zaszczepienie stosunkowo niewielkiej ilosci pozywki jego zarodnikami, a nastepnie przenosi sie mloda aktywna wegetatywna szczepionke do duzego zbiornika, zachowujac warunki aseptyczne.Jako pozywke, w której wytwarza sie wegetatywna szczepionke stosuje sie te sama lub rózna pozywke od tej, która stosuje sie do przemyslowej produkcji antybiotyku A 16884. Ustrój, z którego otrzymuje sie antybiotyk A 16884 wzrasta w temperaturze 25-37°C, przy czym optymalne warunki wystepuja w temperaturze 26-30°C.Maksymalna produkcje antybiotyku osiaga sie na ogól w okresie 3-6-72 godzin po zaszczepieniu pozywki.Jak zwykle w procesach, prowadzonych w warunkach aerobowych, przez pozywke przepuszcza sie sterylne powietrza, przy czym dla efektywnego wzrostu ustroju i wydajnej produkcji antybiotyku A 16884, stosuje sie 0,2—0,4, korzystnie 0,40 objetosci powietrza na minute w stosunku do objetosci pozywki. Stopien aktywnosci antybiotykowej w pozywce daje sie latwo sledzic podczas fermentacji przez poddawanie próbek pozywki badaniom na hamowanie wzrostu ustrojów, który to wzrost, jak wiadomo, jest hamowany przez obecnosc antybiotyku A 16884. Jako testowe ustroje stosuje sie korzystnie Sarcina lutea i Salmonella gallinarum, a badania próbek prowadzi sie znanymi metodami: turbidometryczna lub plytkowa. Na ogól, maksymalna produkcje antybiotyku A 16884 osiaga sie w ciagu 1-3 dni po zaszczepieniu pozywki w zanurzonej hodowli aerobowej lub w hodowli wstrzasanej.Stosowane metody wyosabniania antybiotyku z aktywnego roztworu zapewniaja maksymalne odzyskanie tego srodka. Grzybnie i nierozpuszczone substancje stale usuwa sie z roztworu fermentacyjnego np. przez odsaczenie lub odwirowanie, a nastepnie wyosabnia sie antybiotyk A 16884 przez ekstrahowanie lub adsorbowanie.W przypadku wyosabniania antybiotyku A 16884 droga adsorbowania, stosuje sie odpowiednie adsorbenty, p takie jak wegiel, zel krzemionkowy, tlenek glinowy oraz zywice jonitowe. W zaleznosci od warunków fermentacji, antybiotyk A 16884 wytwarza sie w postaci amfoterycznej lub w postaci soli. Niezaleznie od postaci, w jakiej wystepuje, antybiotyk ten adsorbuje sie na jednym ze wspomnianych wyzej lub podobnych adsorbentów z roztworu w odpowiednim rozpuszczalniku. Adsorbowany antybiotyk A 16884 lub jego sól eluuje sie z adsorbentu, na przyklad przez splukanie adsorbentu rozpuszczalnikiem. Stosujac do takiego plukania roztwór mrówczanu amonowego lub octanu sodowego, otrzymuje sie odpowiednio amonowa lub sodowa sól antybiotyku A16884. Sole te daja sie latwo przeksztalcac z powrotem w antybiotyk A16884 przez zastosowanie znanych metod. W procesie wyosabniania antybiotyku jako adsorbent mozna równiez stosowac mikrokrystaliczna celuloze.Sole antybiotyku A 16884, poza sola amonowa i sola z metalem alkalicznym, wytwarza sie korzystnie przez poddanie reakcji antybiotyku A 16884 w postaci amfoterycznej z odpowiednim kwasem lub zasada. W celu wytworzenia soli addycyjnej poddaje sie antybiotyk A 16884 reakcji z kwasem nieorganicznym lub organicznym, takim jak kwas solny, bromowodorowy, jodowodorowy, siarkowy, fosforowy, octowy, benzoesowy, amidosulfonowy, winowy, cytrynowy, maleinowy, bursztynowy, askorbinowy i glikolowy.8 71107 Antybiotyk A 16884 tworzy równiez sole z kationami w wyniku reakcji amfoterycznej postaci tego antybiotyku z nieorganicznymi i organicznymi zasadami i solami. Przykladami takich soli sa sole amonowe, podstawione sole amonowe, sole z metalami alkalicznymi, takimi jak sód, potas, lit, cez i rubid, sole z metalami ziem alkalicznych, takimi jak wapn, stront i bar oraz sole z innymi metalami, takimi jak glin, miedz, cynk, magnez i srebro. W przypadku zasad organicznych, na ogól korzystnie stosuje sie wodne roztwory zasad o wartosci pH = 3,0 lub wyzszej. Odpowiednimi zasadami organicznymi sa benzyloamina, metyloamina, dwumetyloamina, trójetyloamina, prokaina, dwuizopropyloamina, etanoloamina, cykloheksyloamina, dwucykloheksyloamina, dwufenyloamina, dwu-n-butyloamina, chinolina i pirydyloamina.W zasadzie korzystnie stosuje sie farmaceutycznie dopuszczalne sole antybiotyku A 16884; wszystkie jednak sole nadaja sie do stosowania jako zwiazki posrednie do wytwarzania, wyosabniania i oczyszczania antybiotyku A 16884. Do celów terapeutycznych, kationowe lub anionowe farmaceutycznie dopuszczalne sole sa zasadniczo równowazne antybiotykowi A 16884; ze wzgledu jednak na szczególne wlasciwosci, takie jak rozpuszczalnosc, determinowane przez reszte solotwórcza, pewne sole sa niekiedy korzystniejsze od innych.Ponizsze przyklady objasniaja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Wytwarzanie antybiotyku A 16884 metoda hodowli wstrzasanej.Zarodnikowa kulture Streptomyces lipmanii NRRL 3584 wytwarza sie hodujac ustrój na skosach agaru odzywczego o nastepujacym skladzie: dekstryna ekstrakt drozdzowy hydrolizowana kazeina („N-Z amina typ A", Sheffield Chemical Company) ekstrakt wolowy agar morski zdejonizowana woda 10,00 g 1,00 g 2,00 g 1,00 g 20,00 g 1 litr Przez jodanie wodorotlenku sodowego doprowadza sie wartosc pH pozywki do 7,0. Po zaszczepieniu skosów agarowych zarodnikami Streptomyces lipmanii NRRL 3584, inkubuje sie je w ciagu 6 dni w temperaturze 30°C, a nastepnie pokrywa sterylna woda destylowana i lagodnie zdejmuje powstala wodna zawiesine zarodników i komórek. 1 ml otrzymanej zawiesiny zaszczepia sie kazda ze 100 ml porcja pozywki wegetatywnej zawierajacej: glukozy 15,00g maczkisojowej 15,00 g stalych substancji z wyciagu kukurydzy 5,00 g weglanuwapniowego 2,00 g chlorkusodowego 5,00 g zdejonizowanejwody 1 litr Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 6,7 przez dodanie wodorotlenku sodowego.Szczepionke wegetatywna wstrzasa sie w ciagu 36 godzin w temperaturze 30°C na wstrzasarce zwrotnej o skoku 5 cm i predkosci 108 skoków/minute. Wytworzona szczepionke wykorzystuje sie nastepnie do produkcji antybiotyku A 16884 jak nastepuje. Wytwarza sie pozywke o nastepujacym skladzie: maczka sojowa 15,00g kazeina 1,00 g azotansodowy 3,00 g syrop glukozowy (50% glukozy) 20,00 g wodawodociagowa 1 litr Porcje po 100ml tej pozywki umieszcza sie w 500ml kolbach Erlenmeyera, które sterylizuje sie wciagu 30 minut w temperaturze 120°C. Po ochlodzeaiu zaszczepia sie kazda kolbe 5% szczepionki wegetatywnej i wstrzasa wciagu 72 godzin w temperaturze 30°C na wstrzasarce obrotowej o predkosci 250 obrotów/minute.Podczas fermentacji przez pozywke przepuszcza sie sterylne powietrze z predkoscia 0,4 obj./min. Wyosobnienie antybiotyku przeprowadza sie jak opisano w przykladzie VIII.Przyklad II. Antybiotyk A 16884 wytwarza sie postepujac, jak w przykladzie I, lecz z zastosowaniem pozywki o nastepujacym sKtaozie:9 71 107 rozpuszczalne substancje gorzelnicze (Nadrisol) . 5,00 g maczka sojowa (Nutriscy 200D) 5,00 g maczka arachidowa " ' 5,00 g koncowy melas z trzcinycukrowej 5,00 g owsianka 5,00 g gliceryna 10,00 g wodawodociagowa 1 litr oraz z zastosowaniem wstrzasarki zwrotnej o predkosci 108 skoków na minute zamiast wstrzasarki obrotowej.Przyklad III. Antybiotyk A 16884 wytwarza sie postepujac jak w przykladzie I, lecz z zastosowaniem pozywki o nastepujacym skladzie: .owsianka 20,00 g gliceryna 10,00 g woda wodociagowa 1 litr Przyklad IV. Antybiotyk A 16884^ wytwarza sie postepujac jak w przykladzie 1, lecz z zastosowaniem pozywki o nastepujacym skladzie: maczka z nasion bawelny 20,00g ' - gliceryna 10,00 g glukoza 5,00 g woda wodociagowa 1 litr Przyklad V. Antybiotyk A 16884 wytwarza sie postepujac jak w przykladzie I, lecz z zastosowaniem pozywki o nastepujacym skladzie: glukoza 20,00 g rozpuszczalnaskrobia 10,00 g pepton (Wilson159) 30,00 g hydrolizowana kazeina („N-Z amina- -typ A", Sheffield Chemical Co.) 4,00 g siedmiowodzian siarczanu magnezowego 5,00 g weglansodowy 2,00 g woda wodociagowa 1100 ml Przyklad VI. Inna zarodnikowana kulture Streptomyces lipmanii NRRL 3584 wytwarza sie hodujac ustrój na skosach odzywczego agaru o nastepujacym skladzie: dekstryna 10,00 g maczka z nasion bawelny 10,00 g ekstrakt drozdzowy 1,00 g agarmorski 25,00 g zdejonizowana woda 1000 ml Wartosc pH pozywki doprowadza sie do 7,0 przez dodanie wodorotlenku sodowego. Po zaszczepieniu skosów agarowych zarodnikami Streptomyces lipmanii NRRL 3584, inkubuje sie je w ciagu 7 dni w temperaturze 30°C, a nastepnie zeskrobuje z nich zarodniki, które laczy sie z 2,0 ml sterylnej surowicy wolowej. 0,1 pil otrzymanej zawiesiny umieszcza sie w sterylnej liofilnej probówce i liofilizuje w postaci pastylek. Wytworzonymi liofilizowanymi pastylkami zaszczepia sie wegetatywna pozywke o nastepujacym skladzie: glukoza 5,00 g dekstryna 10,00 g bakto-trypton 5,00 g ekstraktdrozdzowy 5,00 g siedmiowodzian siarczanu-magnezowego 2,00g • zdejonizowanawoda 1 litr Wartosc pH pozywki pozostawia sie na poziomie 6,7.^Przyklad VII. Wytwarzanie antybiotyku A 16884 w zakladzie doswiadczalnym.Do 40-litrowej kadzi fermentacyjnej ze stali nierdzewnej wprowadza sie 24 litry pozywki o nastepujacym skladzie:10 71107 Antifoam A (srodek przeciw- pieniacy, DowCorning) 0,20 g glukoza 5,00 g dekstryna700 50,00 g kaszkasojowa 25,00 g koncowy melas z trzciny cukrowej 3,00 g wodorofosforanpotasowy 0,25 g weglanwapniowy 2,50 g zimna woda wodociagowa . do 25 litrów Wartosc pH utrzymuje sie na poziomie 6,5. Pozywke te sterylizuje sie w ciagu 30 minut w temperaturze 120°C, po czym ochladza sie ja i zaszczepia 5% wegetatywnej pozywki wytworzonej jak podano w przykladzie VI. Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 30°C wciagu 66 godzin, wprowadzajac sterylne powietrze z predkoscia 0,35 obj./min. i mieszajac pozywke mieszadlem mechanicznym z predkoscia 420 obr./rain.Koncowa wartosc pH wynosi 7,5. Antybiotyk A 16884 wyosabnia sie jak opisano w przykladzie VIII, Przyklad VIII. Wyosabnianie surowego antybiotyku A 16884 w postaci soli jednoamonowej.Okolo 60 litrów roztworu fermentacyjnego wytworzonego w przykladzie VII filtruje sie przez Hyflo Super-cel (diatomit sprzedawany przez Johns Manville Products Corporation), po czym przepuszcza sie przesacz przez kolumne weglowa o wymiarach 9,6X150 cm (Pittsburgh Cal., 12X40, sprzedawana przez Pittsburgh Actiyated Carbon Co.). Kolumne plucze sie woda, az do uzyskania bezbarwnego odcieku, a substancje aktywna adsorbowana na weglu usuwa sie przepuszczajac przez kolumne 50% wodnego roztworu acetonu. Po polaczeniu frakcji aktywnych steza sie je pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego w celu usuniecia acetonu, wprowadza do kolumny o wymiarach 5,9X 104 cm wypelnionej zywica IRA-68 (zywica amonitowa sprzedawana przez Rohm and Haas Co.) i przemywa kwasem mrówkowym. Nastepnie przemywa sie kolumne woda do uzyskania czystego bezbarwnego odcieku i usuwa sie substancje aktywne przez przemycie 0,1 m roztworu mrówczanu amonowego.Polaczone frakcje aktywne przepuszcza sie przez kolumne weglowa (Pittsburgh 12X40) o wymiarach 4,3X72 cm, po czym plucze sie te kolumne szesciokrotnie wieksza od niej objetoscia wody, a substancje aktywne eluuje 30% wodnym roztworem acetonitrylu. Po polaczeniu frakcji aktywnych, stezeniu ich pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego w celu usuniecia acetonitrylu i liofilizowaniu, otrzymuje sie 25—30 g stalej substancji.Substancje te rozpuszcza sie w minimalnej ilosci wody i przepuszcza przez kolumne o wymiarach 7,2X60 cm, wypelniona mikrokrystaliczna celuloza (Avicel, FMC Corporation), a nastepnie zawiesza w 70% wodnym roztworze acetonitrylu i plucze acetonitrylem. Po dodaniu próbki aktywnej plucze sie kolumne równoobjetosciowa iloscia acetonitrylu i eluuje substancje aktywne metanolem, a po polaczeniu frakcji aktywnych i stezeniu ich do objetosci okolo 200 ml, wytraca sie substancje aktywna przez dodanie 10 objetosci acetonu. Po przesaczeniu osadu, wyplukaniu go acetonem i wysuszeniu pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, otrzymuje sie 9-12 g produktu. 20 g tego produktu rozpuszcza sie w minimalnej ilosci wody i przepuszcza przez kolumne zelu krzemionkowego o wymiarach 7,2X60 cm. Przed wypelnieniem kolumny, zel krzemionkowy (Grade 950, DaVison Chemical) plucze sie woda, a nastepnie metanolem i zawiesza w 70% roztworze acetonitrylu. Po wprowadzeniu próbki aktywnej plucze sie kolumne równoobjetosciowa iloscia acetonitrylu i eluuje substancje aktywna 70% roztworem acetonitrylu. Najaktywniejsze frakcje laczy sie, zateza do sucha pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego i rozpuszcza w metanolu, a substancje aktywna wytraca sie 10 objetosciami acetonu. Po odsaczeniu osadu, przemyciu go acetonem i wysuszeniu pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, otrzymuje sie 8 g produktu. Z frakcji o mniejszej aktywnosci otrzymuje sie dalsze 6 g tego produktu.Przyklad IX. Oczyszczanie jednoamonowej soli antybiotyku A 16884.W 4 ml wody rozpuszcza sie 1 g liofilizowanego produktu z przykladu VIII i przepuszcza roztwór przez kolumne o wymiarach 2X60 cm, wypelniona 175 ml zelu krzemionkowego Grade 950 w 80% wodnym roztworze acetonitrylu, po czym eluuje sie kolumne mieszanina acetonitrylu z woda w stosunku 4: 1 i przeprowadza analize chemiczna i chromatografie bibulowa. W wyniku eluowania kolumny otrzymuje sie wiele frakcji. Frakcje zawierajace jednoamonowa sól antybiotyku A 16884 laczy sie, zateza do sucha, rozpuszcza w niewielkiej ilosci dwumetylosulfotlenku, a nastepnie w kilku mililitrach etanolu, a substancje aktywna wytraca sie przez dodanie nadmiaru eteru. Po odwirowaniu osadu i wysuszeniu go pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, otrzymuje sie 91 mg jednoamonowej soli antybiotyku A 16884.Przyklad X. Wytwarzanie antybiotyku A 16884 w postaci kwasu.W 30 ml wody rozpuszcza sie 200 mg jednoamonowej soli antybiotyku A 16884, po czym dodaje sie do tego roztworu 6 ml zywicy Dowex 5ÓX12 H+ (Dow Chemical Co.) i miesza sie mieszanine w ciagu 30 minut. Po odsaczeniu plucze sie zywice na filtrze woda i laczy przesacze, których wartosc pH wynosi 2,7. Nastepnie11 71107 zateza sie przesacze pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego do objetosci okolo 1 ml, dodaje 4 ml metanolu i wytraca kwas przez dodanie 40 ml acetonu. Po odwirowaniu osadu i wysuszeniu go pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego, otrzymuje sie 35 mg antybiotyku A 16884 w postaci kwasu. Podczas miareczkowania w 66% roztworze dwumetyloformamidu przy wyjsciowej wartosci pH = 4,5, wartosci pK'a wynosza 3,5, 5,2 i 10,3.W okolo 2 ml wody rozpuszcza sie 180 mg jednoamonowej soli A 16884 i doprowadza wartosc pH do 10 przez dodanie 1 n roztworu wodorotlenku sodowego. Nastepnie zateza sie roztwór pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego do malej objetosci, po czym dodaje sie 4 ml metanolu, wytraca sól dwusodowa przez dodanie 40 ml acetonu, odwirowuje ja i suszy pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego. Podczas miareczkowania w 66% roztworze dwumetyloformamidu przy wyjsciowej wartosci pH = 10,4, wartosci pK'a wynosza 3,9, 5,2 i 10,5, a absorpcyjna analiza atomowa wykazuje zawartosc 6% sodu.P r z y k l a d XI. Wytwarzanie chlorowodorku antybiotyku A 16884.W 2 ml wody rozpuszcza sie 200 mg jednoamonowej soli antybiotyku A 16884, po czym doprowadza sie wartosc pH do 2,0 przez dodanie 1 n kwasu solnego. Nastepnie rozciencza sie mieszanine reakcyjna 5,0 ml metanolu i przez dodanie 50 ml acetonu wytraca sie zadany chlorowodorek antybiotyku A 16884, który odwirowuje sie, przemywa acetonem i suszy pod cisnieniem nizszym od atmosferycznega Analiza produktu wykazuje obecnosc 5,74% chloru, a elektrometryczne miareczkowanie w 66% roztworze dwumetyloformamidu przy wyjsciowej wartosci pH = 5,0 wykazuje miareczkowalne grupy 3,9, 5,2 i 10,4.Przyklad XII. Wyosabnianie surowego antybiotyku A 16884 w postaci solijednosodowej.Okolo 60 litrów roztworu fermentacyjnego z przykladu VII przesacza sie przez Hyflo-Super-cel, a przesacz przepuszcza przez 9,6X 150 cm kolumne wegla (Pittsburgh Cal. 12X40). Nastepnie przemywa sie kolumne woda do uzyskania bezbarwnego odcieku, a absorbowana substancje aktywna usuwa sie przepuszczajac przez kolumne 50% wodny roztwór acetonu. Frakcje aktywne laczy sie, zateza pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego w celu usuniecia acetonu i przepuszcza przez 5,9X 104 cm kolumne IRA-68 (cykl octanowy). Nastepnie plucze sie kolumne woda do uzyskania czystego bezbarwnego odcieku, a substancje aktywna usuwa przez wyplukanie 0,1 m roztworem octanu sodowego. Po polaczeniu frakcji aktywnych przepuszcza sie je przez 4,3X72 cm kolumne wegla (Pittsburgh Cal. 12X40), kolumne przemywa szesciokrotnie wieksza od tej kolumny objetoscia wody, a substancje aktywna eluuje 30% wodnym roztworem acetonu. Po polaczeniu frakcji aktywnych, stezeniu ich pod cisnieniem nizszym od atmosferycznego w celu unikniecia acetonu i liofilizowaniu, otrzymuje sie 20-30 g produktu, którego analiza wykazuje zawartosc 2,5% sodu.Jednoamonowa sól antybiotyku A 16884 poddano próbie na zwalczanie drobnoustrojów wywolujacych choroby roslin. W tym celu wytwarza sie wodny roztwór tej soli o stezeniu 400 czesci soli na milion czesci wagowych gotowego preparatu. Do doswiadczenia stosuje sie 30-dniowe rosliny pomidorów, po dwie na 1 naczynie. Rosliny w jednym naczyniu spryskuje sie powyzszym roztworem, suszy na powietrzu i zaszczepia pozywka podtrzymujaca aktywny wzrost Pseudomonas solanacearum. Rosliny w drugim naczyniu spryskuje sie natomiast identycznym roztworem, lecz nie zawierajacym antybiotyku, traktujac je jako grupe kontrolna, która nastepnie zaszczepia sie podobnie jak grupe badana. Wszystkie rosliny przechowuje sie wciagu 24godzin w wilgotnej komorze, a nastepnie usuwa z niej i na okres 7 dni umieszcza w dobrych warunkach uprawowych. Po uplywie tego okresu poddaje sie rosliny badaniu na obecnosc, a w przypadku obecnosci, na stopien infekcji.Stwierdzono, ze rosliny spryskane jednoamonowa sola antybiotyku A 16884 nie wykazuja zadnych objawów choroby, wywolywanej przez Pseudomonas solanacearum, podczas gdy rosliny z grupy kontrolnej wykazuja silne objawy takiej choroby. PL