PL68367B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: 27.11.1967_JJiemiecka Republika Demokratyczna Opublikowano: 10.VI. 1973 68367 KI. 421,3/54 MKP GOln 33/16 [CZYTELNIA I UKD 1 Urzeck Palentcw«wo | Pfllskilj Il**" Wspóltwórcy wynalazku: Reinhard Haschen, Wolfgang Farr, Dieter Reichelt Wlasciciel patentu: VEB Arzneimittelwerk Dresden, Radebeul (Niemiecka Republika Demokratyczna) Sposób oznaczania enzymów 1 Wynalazek dotyczy nietody oznaczania enzymów zwla¬ szcza do ilosciowego, kolorymetrycznego oznaczania leucy¬ noaminopeptydazy w plazmie i surowicy krwi.Znane sa metody ilosciowego oznaczania aktywnosci en¬ zymatycznej leucynoaminopeptydazy. W metodach tych jako reagent charakterystyczny stosowany jest amid leucyny.Wolna leucyna, wywiazujac sie z amidu leucyny pod dziala¬ niem leucynoaminopeptydazy, moze byc ilosciowo ozna¬ czona poprzez ilosciowe oznaczenie grup karboksylowych wzglednie zasadowych na drodze miareczkowania.Wywiazujaca sie pod dzialaniem enzymu wolna leucyna moze równiez zostac oddzielona od amidu leucyny za pomoca chromatografii bibulowej i oznaczona droga bezpo¬ srednia, poprzez kolorymetryczne oznaczenie barwnika, two¬ rzacego sie w czasie reakcji leucyny z ninhydryna i po usta¬ bilizowaniu go jonami Cu++. Wywiazujacy sie z leucyno- amidu, pod dzialaniem enzymu, wolny amoniak moze zostac chemicznie zwiazany z kwasem ortoborowym i oznaczony poprzez miareczkowanie kwasem. Okreslony enzymem przyrost azotu amonowego mozna mierzyc za pomoca me¬ tody ninhydrynowej.Oprócz wymienionych metod istnieje wiele metod ozna¬ czania leucynoaminopeptydazy za pomoca reagentów chro- mogenowych. Wolna p-nitroanilina, wywiazujaca sie z p-ni- troanilidu leucyny pod dzialaniem leucynoaminopeptydazy, moze byc oznaczona bezposrednio fotometrycznie dzieki zóltemu zabarwieniu. Wolna 0-naftyloamina, wywiazujaca sie z 0-naftyloamidu leucyny pod dzialaniom leucynoaminopep¬ tydazy, moze byc oznaczona poprzez kolorymetryczne ozna¬ czenie barwnika, powstajacego w czasie reakcji 0-naftylo- aminy z sola dwuazoniowa.Te znane metody wykazuja jednak wiele wad. Obok dro¬ biazgowego i pracochlonnego toku postepowania jak i nie¬ dostatecznej czulosci, przykladowo w metodzie w której sto¬ sowany jest amid leucyny, metody te sa nieprzydatne do stosowania w systemie ciaglym. Ponadto metody wykry¬ wania, poslugujace sie reagentami chromogenowymi, wyka¬ zuja niedostateczna czulosc, poniewaz p-nitroanilid i 0-nafty- loamid, przewaznie albo wylacznie, hydrolizowane sa po¬ przez aryloamidaze kwasu aminokarboksylowego.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu oznaczania leucynoaminopeptydazy, który z uwagi na czulosc wykry¬ wania jest przydatny w systemie ciaglym klinicznej diagno¬ styki marskosci watroby.Podstawowym zadaniem wynalazku jest znalezienie substratu, który bylby charakterystyczny dla leucynoaminopeptydazy i którego produkty rozkladu mozna by oznaczac w sposób latwy i szybki, przy zachowaniu duzej czulosci metody wykrywania.Stwierdzono, ze leucynoaminopeptydaza posiada zdol¬ nosc hydrolitycznego rozkladu hydrazydu L-leucyny na L-leucyne i hydrazyne równa, tak pod wzgledem sily jak i warunków, zdolnosci amidu L-leucyny bedacego znanym odczynnikiem charakterystycznym dla leucynoaminopep¬ tydazy.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze badany ma¬ terial, w którym ma byc oznaczona leucynoaminopeptydaza, traktuje sie hydrazydem DL-leucyny, a odszczepiona na sku¬ tek hydrolitycznego dzialania leucynoaminopeptydazy hydrazyne kondensuje sie z aromatycznym aldehydem, 683673 68367 4 przede wszystkim p-dwumetyloaminobenzaldehydem, uzys¬ kujac zólty barwnik. Hydrolize hydrazydu DL-leucyny pod dzialaniem leucynoaminopeptydazy prowadzi sie, w zalez¬ nosci od warunków procesu inkubacji, w zakresie pH = 9,0-10,2. Równoczesnie ze sprzeganiem wolnej hydra¬ zyny, tworzacej sie z hydrazydu DL-leucyny pod dzialaniem leucynoaminopeptydazy, przykladowo z p-dwumetyloami¬ nobenzaldehydem, roztwór nastawia sie na pH ponizej 7 tak, ze z powstalego, na skutek kondensacji, zóltego barwnika tworzy sie pomaranczowozólta sól. Sól ta charakteryzuje sie wysokim molarnym wspólczynnikiem absorpcji tak, ze czu¬ losc wykrywania leucynoaminopeptydazy, w porównaniu z innymi znanymi metodami, jest znacznie wyzsza. Równo¬ czesnie z zakwaszeniem roztworu reakcja enzymatyczna zos¬ taje przerwana. Ekstynkcje leucynoaminopeptydazy, odpo¬ wiadajaca proporcjonalnym ilosciom barwnej soli, mierzy sie przy maksimum absorpcji odpowiadajacemu 455 milimi- kronom.Sposób wedlug wynalazku umozliwia szybkie ilosciowe oznaczenie zawartosci leucynoaminopeptydazy w surowicy i plazmie krwi. Ponadto sposób wedlug wynalazku ma w sto¬ sunku do innych znanych metod te zalete, ze jest bardzo charakterystyczny i wykazuje bardzo wysoka czulosc.Wynalazek wyjasniony jest blizej dwoma przykladami.Przyklad I. Metoda bez dodatkowej aktywacji. 0,5 ml buforowego roztworu substratu, skladajacego sie z 4 czesci 0,2 molarnego buforu monoetanoloaminy opH = 10,15 i 1 czesci 112 milimolarnego wodnego roz¬ tworu hydrazydu leucyny, termostatuje sie do temperatury 25°C i poddaje przez okreslony czas inkubacji za pomoca 0,2 ml surowicy lub roztworu enzymu (dla surowicy okres inkubacji wynosi 60 minut). Nastepnie dodaje sie 5 ml odczynnika wywolujacego zabarwienie, skladajacego sie z 1 czesci roztworu zawierajacego w 100 ml 96% etanolu lub metanolu 4 g p-N-N-dwumetyloaminobenzaldehydu i 17 cze¬ sci 0,1 normalnego kwasu solnego i po uplywie 30 minut, w czasie których wytwarza sie zabarwienie, oznacza sie eks¬ tynkcje osadów przy dlugosci fali wynoszacej 455 milimi- kronów w stosunku do odczynnika wywolujacego zabarwie¬ nie. Slepa próbe wykonuje sie w sposób analogiczny z ta tylko róznica, ze stosowany roztwór enzymu dodaje sie do- s piero po uprzednim dodaniu reagenta.Przyklad IL Metoda z aktywacja jonami Mg2+. 0,3 ml buforowego roztworu aktywatora, skladajacego sie z 5 czesci 0,25 molarnego buforu monoetanoloaminy opH = 9,25 ii czesci 40milimolarnego roztworu MgCla, io poddaje sie inkubacji wstepnej w temperaturze 25°C przez okres 2 godzin za pomoca 0,1 ml surowicy lub roztworu en¬ zymu. Nastepnie dodaje sie 0,1 ml 80 milimolarnego wod¬ nego roztworu hydrazydu leucyny i poddaje inkubacji przez okres 30 minut w temperaturze 25°C. Po dodaniu 4,5 ml i5 odczynnika powstaje zabarwienie. Pomiar wykonuje sie w analogiczny sposób jak to opisano w przykladzie I. Slepa próbe wykonuje sie analogicznie z ta tylko róznica, ze roz¬ twór enzymu dodaje sie po uprzednim dodaniu odczynnika wywolujacego zabarwienie. 20 PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób oznaczania enzymów, w szczególnosci iloscio¬ wego, kolorymetrycznego oznaczania leucynopminopepty- 25 dazy, znamienny tym, ze hydrazyd L-leucyny rozklada sie pod dzialaniem leucynoaminopeptydazy na L-leucyne i hyd¬ razyne i nastepnie kondensuje sie hydrazyne z aldehydem aromatycznym, a otrzymany barwnik oznacza sie kolory¬ metrycznie. 30 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, zejako alde¬ hyd aromatyczny stosuje sie p-N-N-dwumetyloaminoben- zaldehyd. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hydrolize hydrazydu leucyny przez leucynoaminopeptydaze prowadzi 35 sie scisle przy pH = 9,0-10,2. 4. Sposób wedlug zastrz. 1-3, znamienny tym, ze barw¬ nik oznacza sie kolorymetrycznie przy pH ponizej 7. Prac. Repr. UP PRL. W-wa, zam 131/73 naklad 125+18 Cena 10 zl PL PL