PL67736B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 16.VII.1973 67736 KI. 30h,210 MKP A61k 17/04 UKD Wspóltwórcy wynalazku: Arnold Adamiec, Janina Grzegorzewska, Mieczyslaw Lukaszewski, Kazimierz Samula, Irena Zarebska Wlasciciel patentu: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa (Polska) Sposób wyodrebniania insuliny ze zwierzecych gruczolów trzustkowych Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrebniania insuliny ze zwierzecych gruczolów trzustkowych.Znany sposób wyodrebniania insuliny polega na szybkim zamrozeniu swiezo wyjetych z zabitego zwie¬ rzecia gruczolów trzustkowych w temperaturze nizszej od 0°C, np. w temperaturze — 30°C, a nastepnie na rozdrobnieniu gruczolów w odpowiednich urzadzeniach rozdrabniajacych i uzyciu rozdrobnionych gruczolów bezposrednio do ekstrakcji rozpuszczalnikami organicz¬ nymi i dalszego przerobu ekstraktu wedlug ogólnie zna¬ nych metod. Sposób ten nie prowadzi do calkowitego wyodrebnienia insuliny i w zwiazku z tym nie stwarza mozliwosci pelnego wykorzystania tak cennego i deficy¬ towego surowca, jakim sa trzustkowe gruczoly zwie¬ rzece.Stwierdzono, ze wydajnosc wyodrebniania insuliny ze zwierzecych gruczolów trzustkowych mozna znacznie zwiekszyc stosujace wedlug wynalazku przed ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi poddawanie gruczolów dzialaniu wodnego roztworu soli metali z II i III gru¬ py ukladu okresowego. Dodatkowa obróbka gruczolów trzustkowych za pomoca soli tych metali wywiera szczególny wplyw na zawarta w gruczolach insuline, powodujac prawdopodobnie laczenie sie czasteczek in¬ suliny w wieksze agregaty, co chroni insuline przed niszczacym dzialaniem enzymów, a zarazem prowadzi do latwiejszego wyekstrahowania jej za pomoca roz¬ puszczalników organicznych.Wedlug wynalazku swiezo wyjete z zabitych zwie¬ rzat gruczoly trzustkowe poddaje sie niezwlocznie dzia¬ lo 15 20 25 30 laniu wodnego roztworu soli w temperaturze —5° — +5°C w ciagu 10 minut do 5 godzin, po czym przy¬ gotowane w ten sposób gruczoly oddziela sie od roz¬ tworu soli, oziebia i konserwuje przechowujac je w temperaturze —80° h5°C. Nastepnie w dogodnym momencie gruczoly rozdrabnia sie, doprowadza do tem¬ peratury —5° — +5°C, pozostawia w tej temperaturze w ciagu 10 minut do 5 godzin, ponownie oziebia sie do temperatury —80° h5°C i w znany sposób pod¬ daje sie je ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi.Do sporzadzania wodnego roztworu soli uzywa sie soli nieorganicznych i/lub organicznych, w których ka¬ tionem jest pierwiastek nalezacy do II i/lub ni grupy ukladu okresowego, korzystnie z dodatkiem soli metalu alkalicznego lub amonowej, a w sklad anionu wchodzi pierwiastek nalezacy do V—VII grupy ukladu okreso¬ wego lub tworzy go reszta kwasu organicznego zawie¬ rajacego 1—3 grup karboksylowych w czasteczce, przy czym kwas ten moze byc jedno- lub wielofunkcyjny, taki jak aminokwas lub hydroksykwas.Do sporzadzenia roztworu wodnego moga byc uzyte róznorodne sole, takie jak np. fosforan potasowy dwu- zasadowy, fosforan jednoamonowy, chlorek potasowy,, octan sodowy, glicynian sodowy, cytrynian amonowy, chlorek wapniowy, mleczan wapniowy, chlorek glino¬ wy, siarczan bismutawy, siarczan glinowo-potasowy, chlorek zelazowy, siarczan zelazawy, cytrynian zelazo¬ wy, octan olowiawy, mleczan olowiawy, przy czym w sklad roztworu moze wchodzic zarówno pojedyncza sól metalu nalezacego do II lub HI grupy ukladu okre- 67736«773fi sowego, jak i mieszanina soli nieorganicznych i/lub or¬ ganicznych.Stezenie roztworu moze byc zawarte w szerokich granicach i wynosi zwykle 1—500 g/l, korzystnie 50—200 g/l. Stosuje sie przy tym 0,5—10 objetosci roz¬ tworu soli, korzystnie 1—3 objetosci roztworu soli na 1 objetosc gruczolu trzustkowego.Bezposrednie traktowanie swiezo wyjetych gruczolów trzustkowych wodnym roztworem soli w praktycznej realizacji moze napotykac trudnosci. W zwiazku z tym moze sie okazac korzystne zastosowanie odmiany spo- soku wedlug wynalazku, polegajacej na tym, ze swiezo wyjete z zabitych zwierzat gruczoly trzustkowe naj¬ pierw konserwuje sie przez oziebienie i przechowuje w temperaturze —80° h5°C, a nastepnie w dogodnym momencie gruczoly rozdrabnia sie i poddaje dzialaniu wodnego roztworu soli w temperaturze — 5° -—h5°C w ciagu 10 minut do 5 godzin, po czym gruczoly od¬ dziela sie od roztworu, oziebia ponownie do tempera¬ tury —80° h5°C i wreszcie w znany sposób podda¬ je sie ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi.Wstepna obróbka gruczolu trzustkowego za pomoca wodnego roztworu soli prowadzi do znacznego zwiek¬ szenia wydajnosci wyodrebnienia insuliny przy równo¬ czesnym znacznym zmniejszeniu wahan wydajnosci w porównaniu ze sposobami znanymi. Tak wiec w przy¬ padku zastosowania tego sposobu do wyodrebniania insuliny z wieprzowego gruczolu trzustkowego wydaj¬ nosci sposobu wedlug wynalazku sa prawie dwukrotnie wyzsze. Przedstawia to ponizsza tablica, w której ze¬ stawiono wyniki kilku prób wyodrebniania tego hor¬ monu przy zastosowaniu sposobu znanego tj. bez uzy¬ cia wstepnej obróbki za pomoca wodnego roztworu soli oraz wedlug wynalazku, przy uzyciu identycznego surowca i przy niezmienionych pozostalych operacjach wyodrebnienia. Srednia aktywnosc biologiczna prepa¬ ratów uzyskanych wedlug obu sposobów byla jednako¬ wa i wynosila 24 jedn.m./mg.Lp próby 1 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.Wydajnosc insuliny przy zastosowaniu sposobu znanego mg/kg swiezej trzustki 66,8 50.0 112,5 79,0 54,2 100,0 75,0 71,0 jedn. m./kg 1600 1200 2700 1900 1300 1400 1800 1700 Wydajnosc insuliny przy zastosowaniu sposobu wg wynalazku mg/kg swiezej trzustki 132 125 158 134 128 146 137 131 jedn. m./kg 3200 3000 3800 3200 3050 3500 3300 3150 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ku molowym 0,1 :2:2 w ilosci 150 g na 1 1 wody i utrzymywano w tym roztworze w ciagu 2 godzin w temperaturze okolo 0°C. Nastepnie gruczoly wyjeto z roztworu i szybko zamrozono w temperaturze okolo —30°C. Zamrozone gruczoly trzustkowe poddano z ko¬ lei rozdrobnieniu, doprowadzono temperature gruczo¬ lów do okolo 0°C i utrzymywano w tej temperaturze w ciagu 2 godzin. Nastepnie rozdrobnione gruczoly po¬ nownie szybko zamrozono w temperaturze — 30°C.Dobrze zamrozone gruczoly zaladowano do ekstrak- tora i poddano ekstrakcji przy pomocy 5 1 alkoholu etylowego zakwaszonego 120 ml 85% kwasu fosforo¬ wego. Ekstrakcje prowadzono 3 godziny. Ekstrakt alko¬ holowy oddzielono przez wirowanie. Pozostalosc po¬ nownie ekstrahowano 70% alkoholem etylowym w ilo¬ sci 3,5 1 i odwirowano. Polaczone ekstrakty alkalizo- wano 15% amoniakiem do wartosci pH = 7,8 — 8,2.Wydzielony osad natychmiast odsaczono, a ekstrakt zakwaszono 10% kwasem solnym do pH 3,5. Alkohol odparowano na wyparkach w temperaturze nieprzekra- czajacej 35°C. Wydzielony tluszcz usunieto przez od¬ saczenie za pomoca celitu. Surowa insuline wysolono z ekstraktu wodnego stosujac 20% nasycenia chlorkiem sodowym. Surowa insuline poddawano oczyszczaniu i krystalizacji za pomoca buforu cytrynianowego. Uzy¬ skano 250 mg insuliny o mocy 24 j.m./mg.Przyklad II. 2 kg swiezo wyjetych z zabitych zwierzat gruczolów trzustkowych zamrozono szybko w temperaturze —30°C i przechowywano w tej tempe¬ raturze do czasu dalszego przerobu. Nastepnie gru¬ czoly trzustkowe rozdrobniono na lamaczu szczekowym i doprowadzono temperature do okolo 0°C. Nastepnie umieszczono je na 2 godziny w dwukrotnej ilosci roz¬ tworu o temperaturze okolo 0°C zawierajacego: fos¬ foran jednoamonowy, chlorek magnezowy, chlorek po¬ tasowy i glicynian sodowy w stosunku molowym 1:1:2:2 w ilosci 200 g na 1 1 wody. Wreszcie gru¬ czoly trzustkowe wyjeto i szybko zamrozono w tem¬ peraturze —30°C.Dobrze zamrozone gruczoly trzustkowe zmielono i zaladowano do ekstraktora. Gruczoly zadano 5 1 alkoholu etylowego zakwaszonego 120 ml 85% kwasu fosforowego. Ekstrakcje prowadzono w ciagu 3 godzin.Ekstrakt alkoholowy oddzielono przez wirowanie. Po¬ zostalosc ponownie ekstrahowano okolo 70% alkoho¬ lem etylowym w ilosci 3,5 1 i odwirowano. Polaczone ekstrakty alkalizowano 15% amoniakiem do wartosci pH=7,8—8,2. Wydzielony osad natychmiast odsaczono, a ekstrakt zakwaszano 10% kwasem solnym do war¬ tosci pH=3,5. Alkohol odparowano na wyparkach w temperaturze nieprzekraczajacej 35°C. Wydzielony tluszcz usunieto przez saczenie za pomoca celitu. Su¬ rowa insuline wysolono z ekstraktu wodnego stosujac 20% nasycenia chlorkiem sodowym. Surowa insuline poddawano oczyszczeniu i krystalizacji za pomoca buforu cytrynianowego. Uzyskano 274 mg insuliny o mocy 24,2 j.m./mg. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe Przyklad I. 2 kg swiezo wyjetych z zabitych zwierzat gruczolów trzustkowych zanurzono w dwu¬ krotnej ilosci roztworu zawierajacego chlorek wapnio¬ wy, alun glinowo-potasowy i octan sodowy w stosun- 1. Sposób wyodrebniania insuliny ze zwierzecych gruczolów trzustkowych na drodze obróbki surowca w niskiej temperaturze oraz ekstrakcji rozpuszczalnika- 65 mi organicznymi, znamienny tym, ze wyjete z zabitych6TJ36 zwierzat gruczoly trzustkowe poddaje sie niezwlocznie w temperaturze —5° — +5°C w ciagu 10 minut do 5 godzin dzialaniu wodnego roztworu soli nieorganicz¬ nych i (lub organicznych, w których kationem jest pierwiastek nalezacy do II i/lub III grupy ukladu okresowego, korzystnie z dodatkiem soli metalu al¬ kalicznego lub amonowej, a w sklad anionu wchodzi pierwiastek nalezacy do V—VII grupy ukladu okre¬ sowego lub tworzy go reszta kwasu organicznego za¬ wierajacego 1—3 grup karboksylowych w czasteczce, przy czym kwas ten moze byc jedno- lub wielofunk¬ cyjny, taki jak aminokwas lub hydroksykwas, o steze¬ niu 1—500 g/l, korzystnie o stezeniu 20—200 g/l, przy czym stosuje sie 0,5—10 objetosci roztworu soli, ko¬ rzystnie 1—3 objetosci roztworu soli, na 1 objetosc gruczolu trzustkowego, po czym gruczoly oddziela sie od roztworu soli,, oziebia do temperatury —80° — +5°C i przechowuje w tej temperaturze, a nastepnie w dogodnym momencie rozdrabnia sie je, doprowadza do temperatury —5 — +5°C, pozostawia w tej tem¬ peraturze w ciagu 10 minut do 5 godzin, po czym po- 5 nownie oziebia sie je do temperatury — 80 h50C i w znany sposób poddaje ekstrakcji rozpuszczalnika¬ mi organicznymi.
2. 2. Odmiana sposobu wedlug zastrz. 1, znamienna rym, ze swiezo wyjete z zabitych zwierzat gruczoly 10 trzustkowe niezwlocznie oziebia sie i przechowuje w temperaturze —80° — +5°C, a nastepnie rozdrabnia sie je i poddaje dzialaniu wodnego roztworu soli wy¬ mienionych w zastrz. 1 w temperaturze —5° h5°C w ciagu 10 minut do 5 godzin, po czym gruczoly 15 oddziela sie od roztworu, oziebia ponownie do tem¬ peratury —80° — +5°C i w znany sposób poddaje ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi. PL