PL67161B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 5.YII.1973 67161 KI. 30h,6 MKP C12d 9/14 Wspóltwórcy wynalazku: Marian Tyc, Teodora Kadzikiewicz, Kazimierz Wozniak, Andrzej Korona, Anna Sokól, Slawo¬ mir Ulikowski, Barbara Borowska Wlasciciel patentu: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa (Polska) Sposób wytwarzania wiomycyny 2 W opisie patentowym nr 66255 opisany jest srJo- sób otrzymywania mutantów o zwiekszonej zdol¬ nosci wytwarzania antybiotyków z grupy polipe- ptydów polegajacy na poddawaniu komórek dro¬ bnoustroju dzialaniu czynników mutagennych, wy¬ siewaniu na agarowe podloze hodowlane, inkubo- waniu w termostacie, przesiewaniu metoda replik wyrosnietych kolonii na podloze syntetyczne za¬ wierajace jako jedyne zródlo azotu aminokwasy, ponownej inkubacji w termostacie, izolacji z ply¬ tek matrycowych tych kolonii, które nie wyrasta¬ ja lub maja ograniczony wzrost na podlozu syn¬ tetycznym i porównaniu metoda fermentacji ak¬ tywnosci antybiotycznej wyizolowanych populacji z aktywnoscia szczepu wyjsciowego, przy czym podloze syntetyczne zawiera jako jedyne zródlo azotu aminokwasy lub ich analogi tworzace lan¬ cuch polipeptydowy w czasteczce wytwarzanego przez drobnoustrój antybiotyku.Szczepy wytwarzajace wiomycyne opisano po raz pierwszy w 1951 r. niezaleznie od siebie, prawie równoczesnie w trzech laboratoriach i nazwano je Streptomyces floridae (Am. Rev. Tuberc, 1951, 63, 4), Streptomyces vinaceus (U.S. Patent nr 2.633 445) i Streptomyces puniceus (Am. Rev. Tu¬ berc, 1951, 63, 1). Burkholder i wspólpracownicy (Buli. Torrey Batan. Club., 1955, 82, 108) na pod¬ stawie porównawczych badan taksonomicznych stwierdzili, ze szczepy wytwarzajace wiomycyne opisane pod róznymi nazwami, nie wykazuja istot- 10 15 20 25 to nych róznic taksonomicznych i sklasyfikowali je jako Streptomyces griseus var. purpureus. Zda^ niem Waksmana (The Actimomyces, T. II, str. 186) nazwy Streptomyces floridae, Streptomyces vina- ceus, Streptomyces puniceus, Streptomyces griseus var. purpureus i Streptomyces californicus sa synonimami i wszystkie wyzej wymienione szcze¬ py naleza do jednego gatunku, dla którego Waks- man proponuje nazwe Streptomyces californicus.W 1957 r. Arai i wspólpracownicy otrzymali wio¬ mycyne z przesaczu hodowli Streptoverticillus oli- voreticuli, który rózni sie od innych promieniow¬ ców wytwarzajacych wiomycyne wygladem strze¬ pek sporonosnych.Obecnie stwierdzono, ze otrzymany sposobem opisanym w opisie patentowym nr 66255 mutant szczepu Streptomyces griseus var. purpureus wy¬ twarza w hodowli glebinowej zwiekszone ilosci wiomycyny okolo 6000 j/ml, wykazuje wlasciwosci szczepu produkcyjnego oraz rózni sie od opisa¬ nych szczepów wytwarzajacych wiomycyne wlas¬ ciwosciami taksonomicznymi. Poziom wydajnosci antybiotyku, jaki otrzymuje sie. przy uzyciu otrzy¬ manego mutanta, nazwanego Streptomyces I25/WC9 jest znacznie wyzszy w porównaniu z wydajnoscia- mi notowanymi w pismiennictwie patentowym i naukowym. Dodatkowa zaleta szczepu Strepto¬ myces 125/16/6 Jes* *°» Z€ wysokie wydajnosci anty¬ biotyku uzyskuje sie przy bardzo niskich kosztach pozywek hodowlanych i produkcyjnych. 6716167161 3 4 W tablicach 1 i 2 zestawiono wlasciwosci mor- tomyces griseus var. purpureus, które okreslono fologiczne, hodowlane i fizjologiczne szczepu za pomoca testów stosowanych do róznicowania Streptomyces I25/ie/0 i wzorcowego szczepu Strep- gatunków rodzaju Streptomyces.Tablica 1 Wlasciwosci badanych szczepów na podlozach róznicujacych Podloze Agar drozdzowD- slodowy Agar z maka owsiana Agar skrobiowy z solami nieorganicznymi Agar [ asparaginowy z glicerolem Cecha hodowli wzrost zarodn. pigm. rozp. g. podst. g. pow. wzrost zarodn. pigm. rozp. g. podst. g. pow. wzrost zarodn. pigm. rozp. g. podst. g. pow. wzrost zarodn. pigm. rozp. g. podst. g. pow.Streptomyces griseus var. purpureus + + + + + + + brak buraczkowa szarobiala z odcieniem lila- -róz, sporofory proste (R) i fa¬ liste (F), zarodniki wystepuja w lancuszkach zawierajacych wiecej niz 10 zarodników + + + + + + + + brak buraczkowa lila-róz, sporofory proste (R) i faliste (F). + + + + + + brak buraczkowa szara, sporofory proste (R) i fa¬ liste (F) + + + + + + + + brak buraczkowa bialoszara, sporofory proste (R) i faliste (F) Streptomyces I25/16/6 + + + + + + + brak zóltobrazowa szarobiala, sporofory proste (R) i faliste (F), zarodniki wyste¬ puja w lancuszkach zawiera¬ jacych wiecej niz 10 zarodni¬ ków + + + + | brak bezowa szarobiala, sporofory proste (R) i faliste (F). + + | + brak bezowa + + + + + brak bezowobrazowa szarobiala, sporofory proste (R) i faliste (F) Objasnienie: zarodn. = zarodnikowanie pigm. rozp.= pigment rozpuszczalny g. podst. = grzybnia podstawowa g. pow. = grzybnia powietrzna + + ++ = wzrost obfity + ++ = „ dobry ++ = „ sredni + = skapy67161 Tablica 2 Wlasciwosci fizjologiczne badanych szczepów i Podloze Agar peptonowo- drozdzowy z cytrynianem zelazowo-amonowym Bulion tryptonowy z wyciagiem drozdzowym Podloze syntetyczne zawierajace arginine Podloze syntetyczne zawierajace lizyne Podloze syntetyczne zawierajace (3-alanine Cecha hodowli wytwarzanie pigmentu typu melaniny wytwarzanie pigmentu typu melaniny wzrost wzrost wzrost Streptomyces griseus var. purpureus nie wytwarza nie wytwarza wzrost dobry wzrost dobry wzrost dobry Streptomyces I25/16/6 wytwarza brazowy pigment wytwarza brazowy pigment nie rosnie (lub wzrost ograniczony) nie rosnie (lub wzrost ograniczony) nie rosnie (lub wzrost ograniczony) Badane szczepy zachowywaly sie podobnie pod wzgledem wykorzystywania róznych zródel wegla z podlozy syntetycznych.Tablica 3 Wlasciwosci ciemnobrazowego pigmentu wytwarzanego przez szczep Streptomyces I25/i6/6 Lp. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.Wlasciwosc Wytracanie metoda Blaokberga-Wagineira Barwa Rozpuszczalnosc w wodzie Rozpuszczalnosc w IM NaOH Wytracanie za pomoca HC1 z roztworu IM NaOH Wytracanie za pomoca FeCl3 Rozpuszczalnosc osadu w In NaOH Redukcja dwutioninem sodu Reoksydacja zelazieJankiem potasu Spektrum w nadfiolecie Pigment ciemnobrazowy z hodowli szczepu I25/i6/6 wytraca sie brazowo-czarna nie rozpuszcza sie rozpuszcza sie wytraca sie . wytraca sie rozpuszcza sie barwa czarnobrazowa-* jasnobrazowa jasnobrazowa-* czarnobrazowa 1 W zakresie 215—450 m\i nie wykazuje cha¬ rakterystycznych maksimów. Krzywa ab¬ sorpcji jest taka sama jak opisana przez Schmidliego krzywa dla pigmentu melani- 1 nowego (Helv. Chim. Acta, 1955, 38, 107S) J jakie stwierdzono* sa tak znamienne, ze z punktu widzenia zasad obecnej taksonomii promieniowców (bez uwzglednienia kryteriów ekologicznych) szczep I25/I6/6 nalezaloby uznac za nowy gatunek.Jednym z podstawowych kryteriów przy rózni¬ cowaniu gatunków rodzaju Streptomyces jest zdol¬ nosc wytwarzania pigmentu typu melaniny, której nie wykazuja dotychczas opisane szczepy z rodza¬ ju Streptomyces wytwarzajace wiomycyne. Celem Wyniki badan przedstawione w tablicach 1 i 2 wskazuja, ze szczep I25/i6/6 rozn|i sie od szczepu Streptomyces griseus var. purpureus zabarwieniem grzybni powietrznej, zabarwieniem grzybni pod- 6fc stawowej, wytwarzaniem pigmentu typu melaniny oraz zdolnoscia asymilacji niektórych aminokwa¬ sów z podloza syntetycznego. Wiekszosc wymie¬ nionych cech stanowi podstawowe kryteria w kla¬ syfikacji gatunków rodzaju Streptomyces. Róznice, 657 67161 8 stwierdzenia, czy szczep I25/i6/6 istotnie wytwarza pigment melaninowy przeprowadzono próby izo¬ lacji pigmentu z hodowli Streptomyces I25/16/6 Po¬ wadzonej na podlozu o nastepujacym skladzie: wy¬ ciagu drozdzowego 0,1%, DL tyrozyny 0,1%, NACI 5 0,85%, wody destylowanej do 100%. Wyniki badan podane w tabeli 3 wskazuja na to, ze pigment ciemnobrazowy wytwarzany przez szczep Strepto¬ myces 125/16/6 nale^y <*o grupy melanin.Szczep Streptomyces I25/i6/6 fes* stabilny pod 10 wzgledem cechy wytwarzania wiomycyny. Kilka¬ krotne pasazowanie szczepu I25/16/6 na podlozu agarowym onaz przechowywanie hodowli agaro¬ wej w ciagu kilku tygodni w temperaturze 2—4°C, jak równiez przechowywanie szczepu w postaci 15 zliofiMzowanej, nie wplywalo na obnizenie jego aktywnosci lantybiotycznej.Szczep Streptomyces I25/i6/6 n^zna rozmnazac na podlozu agarowym naturalne zródla azotu (np. wyciag kukurydzy, 2o wyciag slodowy i inne wyciagi roslinne i zwie¬ rzece), oraz siarczan amonowy lub azotany. Zród¬ lem wegla moga byc cukry proste lub wielocukry.Ponadto agarowe podloze sporulacyjne moze za¬ wierac dodatek soli mineralnych oraz dodatek mi- 25 kroelementów.Dobrze sporulujace hodowle agarowe szczepu 125/16/6 s$ wyjsciowym materialem szczepiennym do wytwarzania wiomycyny od skali laboratoryj¬ nej do skali przemyslowej. 80 Szczep Streptomyces I25/16/6 przechowuje sie na agarowym podlozu sporulacyjnym lub w postaci zliofilizowanej. Hodowle na podlozu sporulacyjnym mozna przechowywac w temperaturze 2—4°C przez co najmniej 2 miesiace bez utraty aktywnosci. Za- 85 rodniki szczepu I25/i«/6 niozna zliofilizowac w od¬ powiednich nosnikach (np. 20% surowica konska, mleko odtluszczone, roztwór zawierajacy 10% sa¬ charozy i 1% zelatyny) dla zmniejszenia odsetka smiertelnosci przy przywracaniu zliofilizowanego 40 materialu do stanu pierwotnego. Stwierdzono,' ze dobrym nosnikiem dla zarodników szczepu ^mm jest mleko odtluszczone. Wilgotmosc koncowa zlio- filizowanego materialu powinna wynosic okolo 1%.Ampulki zawierajace liofilizat powinny byc szczel- 45 nie zatopione pod zmniejszonym cisnieniem wy¬ noszacym setne czesci mm slupa Hg. W postaci zliofilizowanej szczep I25/i6/6 zachowuje zywotnosc i aktywnosc antybiotyczna przez co najmniej 2 lata. 5f Sposób wytwarzania wiomycyny przy zastosowa¬ niu szczepów otrzymanych sposobem opisanym w opdsie patentowym nr 66255 polega na prowadze¬ niu procesu biosyntezy przy uzyciu szczepu Strep¬ tomyces I25/i6/6 luD fe£o wariantów, w tempera- 55 turze ponizej 35°C, korzystnie 27—28°, na odpo¬ wiednich pozywkach zawierajacych przyswajalne zródla azotu i wegla pochodzenia roslinnego i/lub zwierzecego oraz sole mineralne, przy równoczes¬ nym mieszaniu i napowietrzaniu, w czasie potrzeb- 40 nym do wytworzenia antybiotyku, który izoluje sie znanymi metodami.Jako zródlo azotu stosuje sie make rybna, droz¬ dze, wyciag drozdzowy, wyciag namokowy kuku¬ rydzy, odtluszczona make sojowa, wyciagi i hydro- 45 lizaty z maki sojowej, make z nasion sloneczniko¬ wych, make z orzeszków ziemnych, wyciagi i hy¬ drolizaty z orzeszków ziemnych i/lub siarczan amonowy albo azotany. Dodatek niektórych z wy¬ mienionych zródel azotu np. wyciagu namokowe^ go kukurydzy lub NaN03 do pozywki posiada po¬ budzajacy wplyw na wytwarzanie antybiotyku przez szczep I25/16/6 .Jako zródlo wegla stosuje sie korzystnie roz¬ puszczalne lub nierozpuszczalne weglowodany, np. glukoza techniczna, sacharoza i inne cukry proste lub ich mieszaniny, skrobie, make ziemniaczana, make kukurydziana lub ich mieszaniny z wymie¬ nionymi uprzednio cukrami prostymi. Jako zródlo wegla stosuje iie równiez oleje roslinne, np. sojo¬ wy, lub tluszcze zwierzece, np. smalec spozywczy.Pozywki plynne do produkcji wiiomycyny szcze¬ pi sie inoculum konidialnym lub wegetatywnym.Inoculum konidialne stanowia zarodniki zebrane z 5—10 dniowej hodowli na podlozu sporulacyj¬ nym. Jako inoculum wegetatywne uzywa sie 42— 48 godz. hodowli glebinowej. Fermentacje prze¬ prowadza sie w temperaturze ponizej 35°C (ko¬ rzystnie 27°—29°C) przy jednoczesnym mieszaniu i napowietrzaniu w aparaturze powszechnie sto¬ sowanej w przemysle fermentacyjnym.Zwykle po 115—139 godzinach fermentacji wy¬ dajnosc wiomycyny w kolbach na trzesawce obro¬ towej o 240 obr/min przy zastosowaniu szczepu Streptomyces I25/i6/6 wynosi okolo 6000 j/ml. Po zakonczeniu procesu fermentacji w brzeczkach fer¬ mentacyjnych szczepu 125/16/6 stwierdza sie za po¬ moca chromatografii bibulowej w ukladzie rozwi¬ jajacym: n-ptropanol: woda : 80% kwas octowy (12,5 :12,5 :1) — obecnosc tylko jednej substancji przeciwbakteryjnej, przy biologicznym wywolywa¬ niu chromatogramu za pomoca Bacillus subtilis 6633. Polozenie substancji aktywnej na pasku bi¬ buly odpowiada polozeniu strefy zahamowania, wywolanej przez wiomycyne. Z plynu pofermen¬ tacyjnego szczepu 125/16/6 wiomycyne mozna wy¬ dzielic znanymi metodami.Dalsze szczególy znajduja sie w przykladach, które sluza do objasnienia sposobu wynalazku, lecz nie stanowia jego ograniczenia. Podane w przy¬ kladach procenty oznaczaja procenty wagowe.Przyklad I Fermentacja w kolbach na trzesawce. ~" Stadium posiewowe I. Kolby Erlenmayera o poj. 500 ml zawierajace 50 ml pozywki posiewowej o skladzie nizej podanym: Sklad pozywki posiewowej nr 1 Maka sojowa odtluszczona 3,0% glukozatechniczna 2,0% wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy) 0,3% NaN03 techniczny 0,6% NH4NO3 „ 0,4% skrobia ziemniaczana 1,0% Olej sojowy surowy 0,5% Woda wodociagowa do 100% Po sterylizacji wartosc pH wynosila 6,8. Steryli¬ zowano w temperaturze 117°C w ciagu 30 min.67161 10 Sklad pozywki posiewowej nr 2 Maka sojowa odtluszczona 3,0% Glukoza techniczna 3,0% /NH4/2SO4 0,3% CaC03 0,3% KH2PO4 0,05% NaCl 0,25% Woda wodociagowa do 100% (Po sterylizacji wartosc pH wynosila 6,7. Steryli¬ zacja jak wyzej).Zaszczepiono zarodnikami zebranymi oczkiem ezy z 9 dniowej hodowla agarowej szczepu Sterpto- myces I25/16/6 i wstawiono na trzesawke obrotowa o 240 obr./min. Inkubowano w temperaturze 28°C w ciagu 47 godzin. Hodowla otrzymana w ten spo¬ sób sluzyla jako inoculum dla stadium posiewo- wego II.Stadium posiewowe II. Do kolb Erlenmayera o poj. 500 ml zawierajacych po 50 ml pozywki po¬ siewowej nr 1 lub nr 2 dodano po 2 ml hodowli stadium posiewowego I. Hodowle prowadzono w temperaturze 28°C na trzesawce obrotowej o 240 obr/min w ciagu 45 godzin. Hodowla stadium II szczepiono pozywke produkcyjna nr 1 lub nir 2.Stadium produkcyjne. Do kolb Erlenmayera o poj. 500 ml zawierajacych po 40 ml pozywki pro¬ dukcyjnej nr 1 lub nr 2 o skladzie nizej podanym: Sklad pozywki produkcyjnej nr 1 Maka sojowa odtluszczona 3,0% Glukoza techniczna 3,0% Skrobia 1,0% CaCos 0,3% NaNo3 techniczny 0,6% NH4NO3 „ 0,4% KH2PO4 0,01% Wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy) 0,05% Olej sojowy surowy 1,0% Woda wodociagowa do 100% (Po sterylizacji wartosc pH wynosila 6,6. Steryli¬ zacja jak wyzej).Sklad pozywki produkcyjnej nr 2 Maka sojowa odtlusizczona 4,0% Glukoza techniczna 5,0% Wyciag namokowy kukurydzy (50% suchej masy) 0,3% 5 CaC03 /NH4/2SO4 NaNo3 Olej sojowy surowy Woda wodociagowa do 0,4% 0,4% 1,0% 0,5% 100% 15 25 (Po sterylizacji wartosc pH wynosila 6,5. Steryli¬ zacja jak wyzej).Dodano hodowle stadium II w ilosci 8% w sto¬ sunku do objetosci pozywki. Fermentacje prowa- 10 dzono w temperaturze 28°C na trzesawce obrotowej o 240 obr./min. Po zakonczeniu fermentacji (125 godz.) plyny pofermentacyjne zawieraly okolo 6000 j/ml wiomycyny.Przyklad II. Fermentacja w fermentorach.Material szczepienny przygotowywano w kolbach na trzesawce w sposób podany w przykladzie I (stadium posiewowe I i stadium posiewowe II).W fermentorze o pojemnosci 20 1 przygotowano 20 12 1 pozywki nr 1 lub nr 2 i sterylizowano ja w 120°C w ciagu 1 godziny. Po sterylizacji wartosc pH wynosila 6,7. Wyjalowiona pozywke zaszczepio¬ no inoculum (stadium posiewowe II) w ilosci 5% w stosunku do objetosci pozywki. Fermentacje pro¬ wadzono w temperaturze 28°C, przy stalym napo¬ wietrzaniu wynoszacym 1 objetosc powietrza na 1 objetosc pozywki i przy stalym mieszaniu (500 obr/ /min. W 120 godz. fermentacji przesacze brzeczek fermentacyjnych zawieraly w 1 ml okolo 6000 j 30 wiomycyny. Oznaczenie wiomycyny przeprowadza¬ no metoda biologiczna plytkowocylinderkowa uzy¬ wajac jako szczepu testowego Bacillus subtilis ATCC 6633. Z plynów pofermentacyjnych wiomy- cyne izolowano znanymi sposobami. PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania wiomycyny przy zasto- 40 sowaniu szczepów Streptomyces, znamienny tym, ze proces biosyntezy prowadzi sie przy uzyciu szczepu Streptomyces I25/16/6 w temperaturze poni¬ zej 35°, korzystnie 27 — 28°C, na odpowiednich po¬ zywkach zawierajacych przyswajalne zródla azotu 45 i wegla pochodzenia roslinnego i/lub zwierzecego oraz sole mineralne, przy równoczesnym mieszaniu i napowietrzaniu, w czasie potrzebnym do wytwa¬ rzania antybiotyku, który izoluje sie znanymi spo¬ sobami.KI. 30h,6 67161 MKP C12d 9/14 ERRATA Lam 7, wiersz 5 jest: NACI powinno byc: NaCl Lam 8, wiersz 64 jest: wartosc pH wynosila 6,8. powinno byc: wartosc pH wynosila 6,6. Lam 9, wiersz 12 jest: szczepu Sterpto- powinno byc: szczepu Strepto- W.D.Kart., C/93/73, 100+15, A4 Cena zl 10,— PL PL