PL66256B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 20.XI.1972 66256 KI. 30h,6 MKP C12d 9/04 CZYTELNIA Twórca wynalazku: Marian Tyc Wlasciciel patentu: Instytut Przemyslu Farmaceutycznego, Warszawa (Polska) Sposób otrzymywania nowego antybiotyku inomycyny Wynalazek dotyczy wytwarzania nowego antybio¬ tyku, nazwanego inomycyna, na drodze biologicz¬ nej.Inomycyna jest wytwarzana przez nowy szczep Streptomyces griseus var. inomycini wyosobniony z próbki gleby. Antybiotyk wykazuje silne dzia¬ lanie wobec nowotworów przeszczepialnych, hamu¬ je wzrost niektórych grzybów i pierwotniaków, nie dziala na bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne.Inomycyna w postaci krystalicznej jest bez wy¬ czuwalnego zapachu, jest dobrze rozpuszczalna w metanolu, acetonie, chloroformie, benzenie, buta¬ nolu, octanie amylu, slabiej rozpuszczalna w ete¬ rze etylowym i praktycznie nierozpuszczalna w eterze naftowym. Rozpuszczalnosc w wodzie wynosi 18 mg w 1 ml.Widmo absorpcyjne w podczerwieni zawiesiny inomycyny w nujolu wykazuje maksima przy na¬ stepujacych dlugosciach fal: 3460, 3190, 2910, 1710, 1690, 1670, 1475, 1385, 1262, 1145, 1105, 1058, 1015, 990, 945, 925 cm-1 (ryc. 1). Pasma pochlaniania w podczerwieni, jakie stwierdzono dla inomycyny, sa charakterystyczne dla antybiotyków grupy cyklo- heksimidu.Sklad pierwiastkowy inomycyny jest nastepujacy: C 63,19%, 63,17%; H 8,52%, 8,68%; N 8,93%, 9,07%.Ciezar czasteczkowy obliczony metoda Rasta wyno¬ si 340. Na podstawie danych analitycznych propo¬ nuje sie dla inomycyny nastepujacy wzór suma¬ ryczny: C17H27O4N2. Zawartosc tlenu obliczono z róznicy. Zestawienie odpowiednich wartosci dla c % 63,19 63,17 63,13 H % 8,52 8,68 8,42 N Ciezar cza- stecz- % kowy 8,93 340 9,07 8,66 323,4 proponowanego wzoru przedstawia sie nastepujaco: 5 wartosci doswiadczalne wartosci teoretyczne: Wodne roztwory antybiotyku w zakresie pH 3,0 — 10 7,0 nie traca swojej aktywnosci w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 dni. W srodowi¬ sku alkalicznym antybiotyk ulega unieczynnie- Brzeczki fermentacyjne szczepu Streptomyces griseus var. inomycini oraz wodne i metanolowe roztwory krystalicznej inomycyny, poddane chro¬ matografii bibulowej w kilku rozpuszczalnikach organicznych, wykazuja dwie strefy zahamowa¬ nia wzrostu drobnoustroju testowego Saccharo- 20 myces cerevisiae ATCC 9763. Jedna strefa wy¬ stepuje w punkcie startu, a druga wykazuje wy¬ sokie wartosci Rf (^0,9). Roztwory chloroformo¬ we, acetonowe i butanolowe inomycyny, chroma- tografowane w tych samych warunkach, wyka- 25 zuja tylko jedna strefe zahamowania (RF«0,9).Czynne substancje (wedrujaca i pozostajaca w punkcie startu) po elucji z pasków bibuly zacho¬ wuja sie identycznie i ich obrazy chromatogra¬ ficzne sa podobne do tych, jakie wytwarza sub- 30 stancja wyjsciowa. Wyniki badan chromatogra- 6625666256 ficznych wskazuja na to, ze inomycyna jest zwiaz¬ kiem chemicznie jednorodnym, który w roztwo¬ rze wodnym i metanolowym ulega pewnym zmia¬ nom (prawdopodobnie powstaja solwaty), co wy¬ raza sie przez dwie strefy zahamowania w nie¬ których ukladach rozwijajacych.Spektrum antybiotyczne inomycyny przedsta¬ wiono w tablicy 1, z której wynika, ze antybio¬ tyk nie dziala na bakterie Gram-dodatnie i Gram- -ujemne. Sposród kilku badanych szczepów z ro¬ dzaju Saccharomyces wszystkie okazaly sie wraz¬ liwe na stezenie antybiotyku od 0,2 — 0,4 mcg/ /ml. Wysoka wrazliwosc wykazywaly równiez szczepy Candida kruzei, C. xylenoides i Rhodoto- rula rubra. Antybiotyk nie wywieral hamujacego dzialania na szczepy Candida albicans nawet w stezeniu wynoszacym 200 mcg/ml. Dla szczepów Aspergillus niger i Penicillium nigricans hamuja¬ ce stezenie antybiotyku wynosilo 50 mcg/ml. Do¬ datkowe badania wykazaly, ze inomycyna hamuje równiez wzrost niektórych grzybów fitopatogen- nych oraz pierwotniaków.Aktywnosc onkostatyczna inomycyny wykazano na trzech nowotworach przeszczepialnych: mie- saku 180, miesaku 37 i raku wysiekowym Ehrli- cha. U myszy z rakiem wysiekowym Ehrlicha antybiotyk zmniejszal, ilosc plynu wysiekowego w okresie miedzy 5 — 12 dniem doswiadczenia. Przy dawce dobowej antybiotyku 80 mg/kg rozwój mie- saka 37 byl hamowany w 84,7%, -a miesaka 180 w 56,2% w porównaniu z grupa kontrolna. Dzia¬ laniu onkostatycznemu towarzyszyl ubytek cieza¬ ru ciala myszy.Widmo absorpcyjne w podczerwieni, wlasciwosci biologiczne i niektóre wlasciwosci chemiczne wska¬ zuja na podobienstwo inomycyny do antybioty¬ ków grupy cykloheksimidu (cykloheksimid, anty¬ biotyk E-73, aktyfenol, inakton, fermicydyna, na- ramycyna B, niromycyny, protomycyna, strepto- witacyjny i streptymidon). Analiza porównawcza daje podstawe do stwierdzenia, ze inomycyna nie jest identyczna z jakimkolwiek opisanym anty¬ biotykiem grupy cykloheksimidu. Wykazano, ze w sklad czasteczki inomycyny wchodza dwa ato¬ my azotu, podczas gdy dotad opisane antybiotyki grupy cykloheksimidu zawieraja po jednym ato¬ mie azotu w czasteczce. Ponadto wystepuja in¬ dywidualne róznice miedzy inomycyna i poszcze¬ gólnymi antybiotykami grupy cykloheksimidu.Szczep Streptomyces griseus var. inomycini, wytwarzajacy inomycyne, wyizolowano z próbki gleby pobranej w okolicy miasta Lodzi. Pod wzgledem cech morfologicznych i hodowla¬ nych szczep ten wykazuje duze podobien¬ stwo do gatunku Streptomyces griseus Wak- 5 sman i Henrici, lecz istotnie sie rózni od tego ga¬ tunku wlasciwosciami fizjologicznymi i bioche¬ micznymi. W brzeczkach fermentacyjnych i ho¬ dowlach agarowych szczepu Streptomyces griseus var. inomycini nie stwierdzono obecnosci strepto- 10 mycyny. Porównawcze zestawienie wlasciwosci szczepu Streptomyces griseus var. inomycini i wzorcowego szczepu Streptomyces griseus 3463 podaja tabele 2, 3 i 4.Na podstawie wyników badan taksonomicznych szczep wytwarzajacy inomycyne oceniono jako nowa odmiane gatunku Streptomyces griseus, któ¬ rej proponuje sie nazwe Streptomyces griseus var. inomycini. 15 20 25 45 50 Tablica 1 Spektrum antybiotyczne inomycyny Drobnoustrój Bacillus subtilis Corynebacterium diphteriae Escherichia coli Micrococcus pyogenes var 209 P Mycobacterium 607 Proteus vulgaris OX 19 Pseudomonas aeruginosa Salmonella typhi Sarcina lutea Shigella sonnei Candida albicans 102 Candida albicans 1476 Candida krusei 46 Candida krusei 208 Candida pseudotropica Candida pelliculosa Candida xylenoides Saccharomyces carlsbergensis Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces formosensis Rhodotorula rubra Aspergillus niger Penicillium chrysogenum Q 176 | Penicillium nigricans Najmniej¬ sze stezenie hamujace wzrost mcg/ml <200 <200 <200 <200 <200 <200 <200 <200 <200 <200 <200 <:2oo 0,8 0,8 <200 100 1,5 0,2 0,3 0,4 0,6 50 100 50 1 Tablica 2 Cechy morfologiczne i hodowlane szczepów Streptomyces griseus var. inomycini i Streptomyces griseus 3463 Podloze 1 Agar drozdzowo^ -sodowy Cecha hodowli 4 2 wzrost grzybnia podstawowa Streptomyces griseus var. inomycini 3 + + + zólto-brazowa Streptomyces griseus 3463 4 + + + zólto-brazowa66256 c.d. tablicy 2 1 1 Agar owsiany Agar skrobiowy z solami nieorga¬ nicznymi Agar asparaginowy z glicerolem Agar peptonowy (wg Kustera) Agar z burszty- nianem wapnia 2 ' pigment rozpuszczalny grzybnia powietrzna wzrost grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny grzybnia powietrzna wzrost grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny grzybnia powietrzna wzrost grzybnia podstawowa pigment rozpuszczalny grzybnia powietrzna wytwarzanie pigmentu typu melaniny pigment 3 brak Barwa: zólto-szara lub bla- do-zólta Sporofory: proste (R) i fa¬ liste (F) Zarodniki wystepuja w lan¬ cuszkach zawierajacych wie¬ cej niz 10 zarodników.Zarodniki maja ksztalt cy¬ lindryczny + + + zólto-brazowa brak Barwa: szaro-biala + + + zólto-brazowa + zielona brak Barwa: zóltawo-szara Sporofory: proste (R) i fa¬ liste (F) + + + zólto-brazowa brak Barwa: blado-zólta Sporofory: proste (R) i fa¬ liste (F) nie wytwarza zólty pigment rozpuszczalny 1 4 ± blado-zólta proste (R) i faliste (F) Zarodniki wystepuja w lan¬ cuszkach zawierajacych wie¬ cej niz 10 zarodników. + + + | zólto-brazowa brak szaro-biala + + + zólto-brazowa i brak blado-zólta proste (R) i faliste (F) + + + | zólto-brazowa brak blado-zólta proste (R) i faliste (F) nie wytwarza zólty pigment rozpuszczalny Tablica 3 Zdolnosc przyswajania róznych zródel wegla przez szczepy Streptomyces griseus var. inomycini i Streptomyces griseus 3463 cd. tablicy 3 Zródlo wegla Agar bez dodatku zródla wegla (kontrola) Strepto¬ myces griseus var. inomycini — Strepto¬ myces griseus 3463 — 55 65 Glukoza DL-arabinoza Fruktoza Inozytol Ksyloza Mannitol Rafinoza Ramnoza + + + + + + — + + + + ± 1 ++ + + — | + + | — | + + 1 .++ | — | - 166256 8 Objasnienie: znak .4- oznacza intensywnosc wzrostu znak — oznacza brak wzrostu Tabela 4 Wzajemny antagonizm szczepów oznaczony metoda „slupków agarowych".I Hodowla agarowa szczepów Streptomyces griseus 3463 Streptomyces griseus var. inomycini , Slupki agarowe szczepów^ Strepto¬ myces griseus var. inomycini 16—22 0 Strepto¬ myces griseus 3463 o 1 13—16 Objasnienie: liczby oznaczaja srednice stref za¬ hamowania wzrostu w mm. i Sposób wedlug wynalazku polega na prowa¬ dzeniu procesu biosyntezy metoda fermentacji gle¬ binowej- przy uzyciu szczepu Streptomyces gri¬ seus varietas inomycini na pozywkach zawieraja¬ cych przyswajalne zródla wegla i zródla azotu po¬ chodzenia roslinnego i zwierzecego oraz sole mine¬ ralne w ciagu 60 — 90 godz., a otrzymany anty¬ biotyk izoluje z plynu fermentacyjnego.Z plynów pofermentacyjnych antybiotyk izoluje sie przez adsorbcje na weglu aktywowanym, elucje acetonem, ekstrakcje chloroformem z zageszczo¬ nych roztworów wodnych i krystalizacje z ropusz- czalników organicznych nie mieszajacych sie z woda.Pozywki plynne sluzace do produkcji antybio¬ tyku zawieraja przyswajalne zródla azotu i zródla wegla pochodzenia roslinnego lub zwierzecego oraz sole mineralne. Pozywki szczepi sie inoculum ko- nidialnym lub wegetatywnym. Inoculum konidial- ne stanowia zarodniki 5 — 10 dniowej hodowli agarowej. Jako inoculum wegetatywne uzywa sie 40 — 45 godz. hodowli glebinowej. Fermentacje przeprowadza sie metoda glebinowa w temperatu¬ rze ponizej 32°C przy jednoczesnym mieszaniu i napowietrzaniu w aparaturze powszechnie stoso¬ wanej w przemysle fermentacyjnym.Szczep wytwarzajacy inomycyne rozmnaza sie na podlozach agarowych (np. agarze ziemniacza¬ nym). Zaszczepione agary skosne inkubuje sie w temperaturze 27—29°C w ciagu 5 — 10 dni i na¬ stepnie przechowuje sie w chlodni w 2—4°C. Za¬ rodniki szczepu mozna przechowywac w postaci zliofilizowanej. Hodowle na podlozu agarowym sa Wyjsciowym materialem szczepiennym do fermen¬ tacji od skali laboratoryjnej do skali przemyslo¬ wej.Schemat postepowania przy produkcji antybioty¬ ku mozna przedstawic nastepujaco: 20 25 35 40 45 Sporulacyjna hodowla szczepu na podlozu agaro¬ wym i Hodowla posiewowa na pozywce plynnej w na¬ czyniu szklanym i Hodowla posiewowa na pozywce plynnej w fer- mentorze i Hodowla produkcyjna na pozywce plynnej w fer- mentorze Czas potrzebny do otrzymania maksymalnej wy¬ dajnosci w hodowli glebinowej wynosi od 60 — 90 godzin zaleznie od warunków fermentacji. Okres najintensywniejszego wytwarzania antybiotyku wystepuje miedzy 24 — 70 godz. fermentacji.Substancje antybiotyczna wystepujaca w ho¬ dowli szczepu Streptomyces griseus var. inomycini mozna izolowac róznymi sposobami. Grzybnie od¬ dziela sie od plynu fermentacyjnego przez wiro¬ wanie lub saczenie. Z plynu fermentacyjnego an¬ tybiotyk adsorbuje sie na weglu aktywowanym w pH = 2—5. Z wegla aktywowanego antybiotyk eluuje sie acetonem lub metanolem. Otrzymane eluaty zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40—50° celem odparowania roz¬ puszczalnika organicznego. Pozostalosc wodna eks¬ trahuje sie dwukrotnie chloroformem. Polaczone wyciagi chloroformowe wprowadza sie na kolumne z tlenkiem glinowym.Z kolumny eluuje sie antybiotyk mieszanina chloroformu i acetonu. Eluat zawierajacy aktyw¬ na substancje zageszcza sie w prózni az do suchej pozostalosci, która rozpuszcza sie w malej ilosci mieszaniny zlozonej z benzenu i eteru. Krystaliza¬ cje antybiotyku przeprowadza sie w temperaturze 2—4° z mieszaniny: benzen, eter etylowy i eter naftowy. .Przyklad I. Fermentacja w kolbach na trze- sawce. Do kolb o pojemnosci 750 ml zawierajacych po 100 ml pozywki (nr 1 lub nr 2) o skladzie ni¬ zej podanym przenosi sie zarodniki szczepu Strep¬ tomyces griseus var. inomycyni zebrane oczkiem. ezy z 8-dniowej hodowli agarowej. Zaszczepione kolby umieszcza sie na trzesawce obrotowej lub wahadlowej w temperaturze 27—29°C. Maksymal¬ na wydajnosc antybiotyczna (^200 mcg/ml) osia¬ ga sie w 72—96 godz. fermentacji.Sklad pozywki nr 1 1. platków owsianych 2. Glukozy 3. CaCOs 4. NaCl 5. wody wodociagowej po pH = 6,7 — 6,9 Sklad pozywki nr 2 1. maki rybnej 2. glukozy 3. CaC03 4. NaCl wody wodociagowej = 6,7 — 6,9 po 5.PH 3% 2% 0,3% 0,3% ad 100 ml sterylizacji 2% 2% 0,2% 0,3% ad 100 ml sterylizacji 65 Obydwie pozywki sterylizuje sie w 117°C w ciagu 25 min.66256 ió Oznaczenia inomycyny przeprowadza sie metoda plytkowo-cylinderkowa, wobec wrazliwego szcze¬ pu testowego (np. Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763).Przyklad II. Fermentacja dwustadiowa w kol¬ bach na trzesawce. Stadium I. Postepuje sie jak w przykladzie I, lecz hodowle w kolbach prowa¬ dzi sie przez 42 godziny. Hodowle te uzywa sie jako inoculum do stadium II.Stadium II. Do kolb zawierajacych pozywke plynna (patrz przyklad I) dodaje sie 42 godz. ho¬ dowli wegetatywnej w ilosci 1 — 3% w stosunku do objetosci pozywki. Fermentacje glebinowa pro¬ wadzi sie na trzesawce w temperaturze 27 — 29°C w ciagu 70—90 godz.Przyklad III. Fermentacja w fermentorze.Materialem szczepiennym jest 42—45 godz. hodow¬ la glebinowa przygotowana w sposób podany w przykladzie II (stadium I).W fermentorze o pojemnosci np. 150 litrów przy¬ gotowuje sie 90 litrów pozywki (jak wyzej), za¬ wierajacej dodatkowo 0,2% oleju roslinnego lub zwierzecego. Pozywke sterylizuje sie w 118°C w ciagu 1 godziny. Wyjalowiona pozywke szczepi sie 42 godz. hodowla wegetatywna w ilosci 0,5—2% w stosunku do objetosci pozywki. Fermentacje pro¬ wadzi sie w temp. 26—28°C, az do wytworzenia maksymalnej wydajnosci (60—90 godz.), przy na¬ powietrzaniu od 0,4—0,9 objetosci powietrza na objetosc pozywki na 1 minute i stalym mieszaniu wynoszacym 220 obrotów/min. W czasie fermenta¬ cji stezenie jonów wodorowych wykazuje tylko nieznaczne wahania utrzymujac sie w granicach pH = 6,5—6,9.Po zakonczeniu fermentacji grzybnie oddziela sie od plynu przez wirowanie lub saczenie na prasie filtracyjnej. Plyn pofermentacyjny zakwasza sie 10 n HC1 do pH = 3 i dodaje sie wegla aktywo¬ wanego w ilosci 0,4% w stosunku do objetosci ply¬ nu. Plyn po adsorpcji nie wykazuje aktywnosci antybiotycznej. Wegiel aktywowany z zawartoscia antybiotyku zbiera sie na saczku Buchnera. Z we¬ gla antybiotyk eluuje sie dwukrotnie 90% aceto¬ nem (90 cz. acetonu i 10 cz. wody). Obydwa elu- aty acetonowe laczy sie i zageszcza pod zmniejszo¬ nym cisnieniem w temperaturze 40—50° az do cal¬ kowitego odparowania rozpuszczalnika.Otrzymany koncentrat wodny ekstrahuje sie dwukrotnie chloroformem (na 1 obj. koncentratu 0,5 obj. chloroformu). Polaczone wyciagi chlorofor¬ mowe wprowadza sie na kolumne z tlenkiem gli¬ nowym (Do kolumny o wymiarach 1,5 X 30 cm zawierajacej 40 g tlenku glinu wprowadza sie 150 ml wyciagu chloroformowego). Roztwór prze¬ puszcza sie z szybkoscia 2,5 ml na minute. Cala zawartosc antybiotyku adsorbuje sie na kolumnie.Z tlenku glinu antybiotyk eluuje sie chloroformem i acetonem zmieszanymi w stosunku 10 : 1, stosujac te sama szybkosc przeplywu.Eluat zawierajacy aktywna substancje zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem az do suchej po¬ zostalosci, która rozpuszcza sie w malej ilosci mie¬ szaniny zlozonej z benzenu i eteru etylowego. An¬ tybiotyk krystalizuje w temperaturze 2—4° z mie¬ szaniny: benzen, eter etylowy i eter naftowy. Re¬ krystalizacje mozna przeprowadzic z eteru etylo¬ wego w temperaturze 2°C. 25 PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku, ino¬ mycyny, znamienny tym, ze proces biosyntezy 30 prowadzi sie metoda fermentacji glebinowej przy uzyciu szczepu Streptomyces griseus var. inomy- cini na pozywkach zawierajacych przyswajalne zródla azotu i wegla pochodzenia roslinnego i zwie¬ rzecego oraz sole mineralne, w ciagu 60—90 godz., 35 a otrzymany antybiotyk izoluje sie z plynu fer¬ mentacyjnego.

2. Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny tym, ze antybiotyk izoluje sie z plynów pofermentacyj¬ nych przez adsorbcje na weglu aktywowanym, 40 elucje acetonem, ekstrakcje chloroformem z za¬ geszczonych roztworów wodnych i krystalizacje z rozpuszczalników organicznych, nie mieszajacych sie z woda. 10 15 20 25 30 35KI. 30h,6 66256 MKP C12d 9/04 o o a: 8 a. C E 3 i i 2 o I 2 £ S 2 whutajBmoma {zmoun&cusui) W.D.Kart. C/958/72, 185 + 15, A.4 Cena zl 10,— PL PL