PL65075B1 - - Google Patents

Description

Spo¬ soby, wedlug których cefalosporyne C adlsorbuje sie na wymiennikach jonowych wykazuja jednak te niedogodnosc, ze duza czesc cefalosporyny C ulega przy tym rozkladowi.Stwierdzono, ze cefalosporyne C mozna wyodreb¬ nic z roztworu wodnego, zwlaszcza z rozcienczonego roztworu wodnego zawierajacego cefalosporyne C w mieszaninie z innymi rozpuszczonymi substancja¬ mi a przede wszystkim z cieczy kulturowej, jesli cefalosporyne wyodrebnia sie w postaci pochodnej takiej jak N-trójnitrofenylocefaloisporyna C, która jest szczególnie odpowiednia do przetworzenia w zwiazki o wysokiej aktywnosci antybakteryjnej, stanowiace pochodne kwasu 7-aminocefalosporano- wego, np. 7-fenyloacetyIoaminocefalosporanowego lub 7-tienyloacetyloaminocefalosporanowego.W sposobie wedlug wynalazku wyodrebnienie po¬ chodnej cefalosporyny C z roztworów zawieraja¬ cych cefalosporyne C polega na tym, ze cefalospo¬ ryne C zawarta w wodnym roztworze poddaje sie reakcji z kwasem trójnitrobenzenosulfonowym i wytworzona N-trójinitrofenylcicefalosporyne C wy¬ odrebnia sie z roztworu.Sposób ten jest dogodny do oczyszczania surowej cefalosporyny C lub jej pochodnych, zwlaszcza za¬ wierajacych wolna grupe aminowa w lancuchu bocznym, np. estrów cefalosporyny C. Zwiazki te rozpuszcza sie wówczas w wodzie lub innym roz¬ puszczalniku, a nastepnie traktuje kwasem trój- nitrobenzenosulfonowym jak wyzej podano.Jezeli sposób wedlug wynalazku stosuje sie do wyodrebniania cefalosporyny C z plynów fermenta¬ cyjnych, wówczas reakcje mozna prowadzic bezpo¬ srednio w cieczy kulturowej albo w przesaczu tej cieczy.W sposobie wedlug wynalazku reakcje z kwasem trójnitrobenizenosulfonowym prowadzi sie zwlaszcza w temperaturze pokojowej korzystnie w roztworze o wartosci pH 7—10, zwlaszcza 8,5—9,0. Kwas trój- nitrobenzenosiulfonowy wprowadza sie do roztworu w postaci stalej lub w postaci roztworu, przy czym mieszajac utrzymuje sie odczyn roztworu w wyzej okreslonej wartosci pH w ciagu calego okresu pro¬ wadzenia reakcji, tj. okolo 1—2 godzin.Roztwór kwasu trójnitrobenzenosulfenowego ko¬ rzystnie ^otrzymuje sie, jesli chlorek pikrylu poddaje sie reakcji z siarczynem, np. z siarczynem sodu, po¬ tasu lub amonu. Roztwór ten mozna stosowac bez¬ posrednio bez dalszej obróbki. Kwas trójnitrobenT zencsulfcncwy mozna równiez wytworzyc bezpo¬ srednio w roztworze zawierajacym cefalosporyne C, np. przez wprowadzenie do tego roztworu chlorku pikrylu i siarczynu sodu.Po zakonczeniu reakcji doprowadza sie roztwór do odczynu o wartosci pH 1—3, korzystnie 1,8—2,0 i wyodrebnia trójnitrofenylocefalosporyne C ko¬ rzystnie za pomoca ekstrakcji rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda lub mieszanina rozpuszczal¬ ników np. alkoholem nie mieszajacym sie z woda, zwlaszcza nizszym alkoholem, o 4—6 atomach wegla jak n-butanoi, alkohol amylowy, np. n-amylowy, n-heksylowy, 2-etylo-n-butanol lub: alkohol benzy¬ lowy, ester, zwlaszcza nizszy ester alkilowy nizszego 5 kwasu alkanowego jak kwas octowy, propionowy, maslowy np. octan etylu, butylu lub ketonami nie mieszajacymi sie z woda, zwlaszcza nizszym dwu- alkilaketonem np. ketonem dwuetylowym, metylo- izobutylowym lub weglowodo/rami podstawionymi 10 lub nieipodstawionymi, zwlaszcza weglowodorami chlorowanymi, np. chlorowanym alkanem jak chlo¬ rek metylu, chloroform, chlorek etylenu, lub mie¬ szanine tych rozpuszczalników. Ekstrakcje mozna równiez prowadzic za pomoca cieklego zasadowego 15 wymieniacza jonowego np. jak Amjberlit La-2 w octanie n-:butylu lub 2-etylo-n-butanoilu.Zamiast wyodrebniania droga ekstrakcji trój¬ initrofenylocefalosporyne, mozna wytracic z roz¬ tworu przez doprowadzenie odczynu do wartosci 20 pH 1—3 korzystnie 1,8—2,0. W celu przeprowadzenia trój nitrofenylocefalosporyny C w kwas 7-amino- cefalosporynowy, mozna trójinitrofenyloicefalospory- ne poddac estryfikacji i np. przeprowadzic w po¬ chodna 7 — ACA wedlug angielskiego opisu paten- 25 towego nr 1 041 985.Wynalazek wyjasniaja nizej podane przyklady, w których temperatury podane sa w stopniach Celsjusza.Przyklad I. 370 litrów cieczy kulturowej za- 30 wierajacej cefalosporyne C zadaje sie roztworem 2,72 kg kwasu szczawiowego w 10 1 wody i 0,9 li¬ trami mieszaniny zlozonej z równych* objetosci wo¬ dy i stezonego kwasu siarkowego, uzyskujac roztwór o wartosci pH = 3. Nastepnie dodaje sie 8 kg „Cela- 35 tom" (ziemi okrzemkowej) jako pomocniczego srod¬ ka filtrujacego i saczy na prasie filtracyjnej. Uzy¬ skuje sie 320 litrów klarownego przesaczu zawiera¬ jacego 1,57 g cefalosporyny w 1 litrze roztworu.Wilgotna pozostalosc pofiltracyjna (62 kg) jako 40 bezuzyteczna usuwa sie a nastepnie dodaje sie prze¬ sacz do roztworu o wartosci pH = 7,5 zawierajacego 920 g 2,4,6-trójnitrobenzeno-sulfonianu sodowego, otrzymanego przez rozpuszczenie 796 g bezwodnego siarczynu sodowego w 3,35 litra dejonizowanej wo- 45 dy, dodanie 1 kg lodu i nastepne wprowadzenie roz¬ tworu 1,425 kg chlorku pikrylu w 435 1 acetonu prowadzone w ciagu 15 minut przy stalym miesza¬ niu. Nastepnie mieszanine roztworów doprowadza sie do wartosci pH = 9 za pomoca stezonego wodoro- 50 tlenku sodowego i przez 4 godziny utrzymuje w tem¬ peraturze 26° przy wartosci pH 8,5—5,7.Klarowny czerwony roztwór poreakcyjny, zawie- ' rajacy 2,4,6-trójnitirófenylocefalosporyne C zakwa¬ sza sie do uzyskania wartosci pH = 1,5—2,0, za po- 55 moca 5 N roztworu kwasu siarkowego, po czym poddaje ekstrakcji pirzeciwpradowej za pomoca me¬ tyloizobutyloketonu. Otrzymuje sie 190 litrów eks¬ traktu metyloizobutyloketonowego. Ekstrakt ten poddaje sie ekstrakcji przeciwpradowej w apa- 60 racie ekstrakcyjnym za pomoca 0,2 M buforu fosforanowego o wartosci pH = 8. Otrzymuje sie 95 litrów uwodnionego ekstraktu o wartosci pH =' 6, z którego ponownie ekstrahuje sie 2,4,6-trójnitro¬ fenylocefalosporyne C za pomoca ketonu metylo- 65 izobutylowego przy wartosci pH = 2.5 Otrzymuje sie organiczny roztwór w ilosci 50 li¬ trów, który poddaje sie trzykrotnie ekstrakcji sto¬ sujac kazdorazowo po 4 litry wody przy utrzymaniu odczynu o wartosci pH — 6. W ten sposób otrzymuje sie 12 litrów uwodnionego ekstraktu, który chlodzi sie do temperatury 0°—4°, a nastepnie doprowadza do wartosci pH = 6 za pomoca kwasu solnego, osad odsacza i przemywa lodowa woda. Po wysuszeniu otrzymuje sie 751 g surowej 2,4,6-trójnitrofenylo- cefalosporyny C, przy czym z przesaczu otrzymuje sie dalsze 269 g produktu.W chromatogramie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym w ukladzie n-butanol-lodowaty kwas octowy — woda (75 : 7,5 : 21) dla 2,4,6-trójni- tiroifenyloicefalosporyny C w odniesieniu do kwasu pikrynowego jako substancji wzorcowej uzyskuje sie wartosc Rfp = 0,51. Poza tym na chromatogra¬ mie sa jeszcze widoczne plamy zwiazków 2,4,6-trój- nitrofenylowych bardziej i mniej polarnich. Prze¬ prowadzenie pochodnej w kwas 7-amino-cefalospo- rynowy (7 — ACA) mozna wykonac nastepujaco: a) 200 g surowej 2,4,6-trójnitrofenylo-cefalospory- ny C zawiesza sie w dwóch litrach ketonu metylo- izobutylowego, po czym zadaje roztworem 200 g dwufenylodwuazometanu (otrzymanego przez utle¬ nianie hydrazonu benzofenonu dwutlenkiem man¬ ganu) w 600 ml metyloizobutyloiketonu. Po uplywie 1,5 godziny czerwonofioletowy roztwór wlewa sie do 10 litrów eteru naftowego, przy czym surowy ester dwubenzhydrolowy 2,4,6-trójnitrofenylocefa- Icspciryny C wytraca sie w postaci jasno-zóltego proszku. Wytracony osad odsacza sie, przemywa eterem naftowym i suszy pod obnizonym cisnieniem w temperaturze 40°. Otrzymany produkt w chro¬ matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym w ukladzie toluen — aceton (8 : 2) wykazuje wartosc Rf = 0,53.Wydajnosc: 280 g dwuestru o 44°/o czystosci co odpowiada wydajnosci 62% w odniesieniu do znaj¬ dujacej sie w filtracie kulturowym cefalosporyny C. b) 9,6 g estru dwubenzhydrylowego, wytworzone¬ go wedlug sposobu podanego wyzej w punkcie a), rozpuszcza sie w 260 iml bezwodnego chlorku me¬ tylu i po ochlodzeniu roztworu do temperatury —18° dodaje sie 5 ml bezwodnej pirydyny, a nastepnie mieszajac, wkrapla sie w ciagu 10 minut roztwór 7,8 g pieciochlorku fosforu w 100 ml bezwodnego chlorku metylowego i miesza w ciagu dalszych 45 minut w temperaturze —s-il2° do —10°, po czym w przeciagu 5 minut dodaje sie 64 ml metanolu ochlodzonego do temperatury —10°. Nastepnie roz¬ twór miesza sie w ciagu 40 minut w temperaturze —10°, po czym w ciagu jednej godziny w tempe¬ raturze _^_10° i ciagle mieszajac dodaje sie 110 ml 2 N roztworu kwasu solnego. Po oddzieleniu faz, faze uwodniona ekstrahuje sie 100 ml chlorku mety¬ lowego i polaczone fazy chlorku metylu odparowuje sie ostroznie pod obnizonym cisnieniem. Po wysu¬ szeniu w wysokiej prózni otrzymuje sie pozostalosc o konsystencji zywicy koloru brazowego, stanowiaca zanieczyszczony ester benzhydirylowy kwasu 7-ami¬ nocefalosporynowego. c) Rozpuszcza sie ester 7 — ACA — benzhydrylo- wy w 5 ml anizolu, dodaje 14 ml kwasu trójfluoro- octowego i pozostawia na okres 30 minut w tempe- 6 ratunze 20—30° dla przareagowania, po czym do¬ daje mieszanine 25 ml trójetyloanliny i 180 ml me¬ tanolu, ochlodzona do temperatury —10°. Otrzy¬ muje sie 10*Vo uwodniona zawiesine o wartosci 5 pH 2,3. Nastepnie dodaje sie 6 ml trójetyloaminy podwyzszajac pH zawiesiny do wartosci 3,5 po czym calosc ochladza sie do temperatury 18°C i pozo¬ stawia do krystalizacji. Wykrystalizowany oisad od¬ dziela sie na nuozy, przemywa metanolem, chlor- io kiem metylenu i eterem, etylowym, po czym suszy w wysokiej prózni. Otrzymuje sie kwas 7-amino- -icefalosporanowy o czystosci 83,3°/o.Otrzymuje sie 1,62 g produktu co odpowiada wy¬ dajnosci 63,5°/o w odniesieniu do uzytego estru 15 dwubeinzhydrylowego 2,4,6-trójnitrofenolocefalospo- ryny C.Przyklad II. Do 10 litrów przesaczu kultury o zawartosci 1340 mg cefalosporyny C w 1 litrze roztworu i 190 mg azotu w postaci I-rzed-grupy aminowej w 1 litrze roztworu, otrzymanego w Wy¬ niku filtracji roztworu fermentacyjnego prowadzo¬ nej przy dodaniu 2 srodka filtracyjnego, dodaje sie 60 g kwasu 2,4,6- - trójniitrobenzenoisulfomowego, roztwór doprowadza sie do wartosci pH = 8,7 i utrzymuje przy tej war¬ tosci pH w ciagu 2 godzin. Nastepnie do mieszaniny dodaje sie 250 g „Hyflo superoel" i mieszajac do¬ prowadza roztwór do odczynu o wartosci pH = 4,3 za pomoca stezonego kwasu solnego i wytworzony zólty osad odsacza sie na nuczy lacznie z „Hyflo supercel". Klarowny przesacz, zadaje sie 3 litrami octanu etylu i doprowadza odczyn do pH warto¬ sci 2,0 za pomoca kwasu solnego. Po rozdzieleniu faz, faze octowa adolna do latwego tworzenia emulsji poddaje sie klarowaniu za pomoca filtracji przez 50 g „Hyflo supercel", przy czym wodne fazy poddaje sie ponownej trzykrotnej ekstrakcji za pomoca i litra octanu etylu. 4o Polaczone ekstrakty octanowe zadaje «ie 1 litrem octanu etylu, doprowadza do pH wartosci 6,5 za po¬ moca wodorotlenku sodu, rozdziela fazy i polaczone fazy octanu etylowego ekstrahuje sie trzykrotnie za pomoca 0,5 litra wody, przy wartosci pH= 6,0. Po- 45 laczone' roztwory wodne zadaje sie 1 litrem estru kwasu octowego i odczyn roztworu doprowadza sie do wartosci pH = 2.0 za pomoca kwasu solnego.Fazy rozdziela sie i wodna faze ekstrahuje sie po¬ nownie trzykrotnie estrem* kwasu octowego zuzy- 50 wajac po 0,5 litra estru.Polaczone ekstrakty octanu przemywa sie dwu¬ krotnie po 0,3 litra nasyconym wodnym roztworem chlorku sodowego, suszy siarczanem sodu i zagesz¬ cza do objetosci 0,5 litra, fen zageszczony roztwór 55 2,4,6-trójnitrofenylocefalosporyny C, przy lekkim chlodzeniu zadaje sie 0,2 litrami 47,5°/o roztworu dwufenylodwuazometanu w eterze naftowym i po utrzymaniu mieszaniny w ciagu 105 minut w tem¬ peraturzs pokojowej, mieszanine wlewa sie do 60 3,5 litrów eteru naftowego, wytracajac dwubenzhy- drylowy ester 2,4,6-trójnitrooefalosporyny C. Wy¬ tracony osad odsacza sie na nuczy i suszy pod obni¬ zonym cisnieniem w temperaturze 40°C.Otrzymuje sie 51,2 g produktu o czystosci 40,4% 65 co odpowiada wydajnosci teoretycznej 76,2*/o w prze-65075 8 liczeniu ma cefalosporyne C zawarta w roztworze pofermentacyjnym.Przyklad III. Do 11,76 g chlorku pikrylu za¬ wieszonego w 36 ml butanolu, mieszajac dodaje sie roztwór 6,6 g bezwodnego siarczynu sodowego roz- 5 puszczonego w 72 ml wody i po 30 minutach miesza¬ nia uzyskuje sie roztwór o wartosci pH = 6,5. Czer¬ wona mieszanine zawierajaca 15 g soli sodowej kwasu 2,4,6-trójnitrobenzenosulfonowego dodaje sie do 6 li¬ trów wodnego roztworu wzbogaconego w cefalospo- io ryne C (zawartosc soli sodowej cefalosporyny C z obliczenia wynosi 12,3 g, zawartosc azotu w postaci pierwszorzedowych grup aminowych 1,9%). Nastep¬ nie mieszanine reakcyjna doprowadza sie do warto¬ sci pH = 9,0 za pomoca lugu sodowego i utrzymuje 15 w ciagu 1 godziny w granicach wartosci pH 8,5— 8,7, po czym dodaje sie roztwór kwasu solnego do uzyskania pH 2,0. Po 10 minutach fazy oddziela sie.Faze uwodniona ekstrahuje sie jeszcze dwukrotnie, kazdorazowo po 500 ml mieszaniny octanu n-butylo- 20 wego i n-butanolu. Laczy sie otrzymane organiczne ekstrakty i dodaje lugu sodowego do uzyskania odczynu kwasnego o wartosci pH 5,5, po czym ekstrahuje -sie 300 ml wody, a nastepnie 200 ml i 100 mlwody. 25 Wszystkie wodne roztwory ekstrahuje sie ponow¬ nie mieszanina octanu n-butylowego i n-butanolu raz woda przy wartosci pH = 2,0 (100 ml i dwa razy 50 ml). Nastepnie ponownie ekstrahuje sie wyciagi organiczne woda przy wartosci pH 5,5 uzyskujac 30 raz 100 ml i dwukrotnie po 50 ml wody, po czym 200 mE wodnego roztworu zadaje sie 10 g „Hyflo supercel", chlodzi do temperatury od 0° do 4° i ustala wartosc pH = 1,8—2,0 za pomoca roztworu kwasu solnego 1,8 do 2,0. Przy tym wytraca sie 35 2,4,6-trójnitrofenylocefalosporyna C.Osad odsacza sie razem z pomocniczym materia¬ lem filtracyjnym, przemywa bardzo zimna odjonizo- wana woda i suszy w ciagu 15 godzin w temperatu¬ rze 40°. Wyciag zawiera 18,07 g 2,4,6-trójnitrofeny- '-0 iocefalosporyny C na 10 g „Hyflo supercer. W chro- matogramie cienkowarstwowym na zelu krzemion¬ kowym w ukladzie jak podano w przykladzie I, otrzymany produkt wykazuje wartosc Rfp = 0,5, przy czym na chromatogramie widoczne sa jeszcze 45 plamy innych bardziej i mniej polarnych zwiazków trójnitrofenylowych.Produkt moze byc w nastepujacy sposób przepro¬ wadzony w ester dwubenzhydrylowy: wytracona mieszanine zawiesza sie w 180 ml octanu n-butylu 50 i zadaje 36 g dwufenylodwumetanu w 180 ml n-bu¬ tanolu. Zawiesine miesza sie w ciagu 3 godzin, od¬ sacza „HyfLO supercel" i do przesaczu w ciagu 20 minut dodaje sie 1800 ml eteru naftowego (frakcja o temperaturze wrzenia 50—70°). Odsacza, 55 sie jasnozólty osad surowego estru 2,4,6-tróanitiro- fenylocefalospoiryny C — dwubenzhydrylowego, przemywa eterem naftowym i suszy pod obnizonym cisnieniem w temperaturze 40°. Wydajnosc wynosi 24,7 g co odpowiada wydajnosci 65,3% w odniesie- 60 niu do wyjsciowego roztworu zawierajacego cefalo- sporyne C.Przyklad IV. W 25 ml octanu n-butylu roz¬ puszcza sie 17,3 g chlorku pikrylu, po czym dodaje roztwór 9,8 g bezwodnego siarczynu sodowego i mie¬ sza w ciagu 15 minut. Faza octanowa jest przy tym bezbarwna, a faza wodna, która zawiera 22 g soli sodowej kwasu 2,4,6-trójnitrobenzeinosulfonowego intensywnie czerwona. Czerwony roztwór wlewa sie do 6 litrów wodnego roztworu zawierajacego surowa cefalosporyne C w ilosci 12 g przy 1,3% wagowych pierwszorzedowych grup aminowych, po czym od¬ czyn roztworu doprowadza sie do wartosci pH = 9 dodajac lug sodowy i miesza przez 2 godziny przy wartosci pH = 8,5—8,7.Dalsza obróbke prowadzi sie wedlug sposobu opi¬ sanego w przykladzie III. Otrzymuje sie 21,8 g za¬ nieczyszczonej 2,4,6-trójnitrofenylo-cefalosporyny C na 40 g „Hyflo supercel". Przez estryfikowanie 43,6 dwufeinylodwuazometanu, analogicznie jak w przy¬ kladzie III, otrzymuje sie 28,65 g estru dwubenzhy¬ drylowego 2,4,6-trójnitrofenylo-cefalosporyny C o czystosci 55°/o, co odpowiada teoretycznej wydaj¬ nosci 64,6%. PL PL

Claims (9)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wyodrebniania pochodnej cefaLOspory- ny C z roztworów zawierajacych cefalosporyne C, znamienny tym, ze cefalosporyne C zawarta w wod¬ nym roztworze poddaje sie reakcji z kwasem trój- nitrobeinzenosulfonowym i wytworzona N-trójnitro- fenyloicefalosporyne C wyodrebnia z roztworu.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze ja¬ ko material wyjsciowy, stosuje sie ciecz kulturowa zawierajaca cefalosporyne C.

3. Sposób wedlug zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w temperaturze pokojowej.

4. Sposób wedlug zastrz. 1—3, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie przy wartosci pH = 7—10, ko¬ rzystnie 8,5—9,0.

5. Sposób wedlug zastrz. 1—4, znamienny tym, ze jako zwiazek wyjsciowy stosuje sie kwas trójnitro- benzenosulfonowy w postaci roztworu, otrzymanego w reakcji chlorku pikrylu z siarczynem.

6. Sposób wedlug zastrz. 1—5, znamienny tym, ze N-trójnitirofenylocefalosporyne C wyodrebnia sie z roztworu przez ekstrakcje.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze ekstrakcje N-trójnitrofenylocefalosporyne C prowa- dizi sie przy wartosci pH 1—3, zwlaszcza 2.

8. Sposób wedlug zastrz. 6 lub 7, znamienny tym, ze trójnitrofeinylocefalosporyne C ekstrahuje sie za pomoca nie mieszajacego sie z woda rozpuszczal¬ nika lub mieszaniny rozpuszczalników.

9. Sposób wedlug zastrz. 6 lub 7, znamienny tym, ze N-tirójnitrofenylocefalosporyne C ekstrahuje sie za pomoca plynnego jonitu. KZG 1, z. 40/72 — 200 Cena ri 10.— PL PL