PL63111B1 - - Google Patents

Description

17.1.1967 Szwajcaria Opublikowano: 20.VUI.1971 63111 KI. 12 q, 6/01 MKP C 07 c, 103/52 ukiL CZYTELNIA U- edu Patentowana Wlasciciel patentu: CIBA Societe Anonyme, Bazylea (Szwajcaria) Sposób wytwarzania nowego peptydu o dzialaniu ACTH Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania no»- wego peptydu o sekwencji D-serylo-L-tyrozylo-L-serylo- L-norleucylo- L-glutamylo-L-histydylo- L-fenyloalanylo- L-argiinylo-L-tryptofyloglicylo- L-lizylo-L-prolilo- L-wa- lilo-glicylo-L-lizylo- L-lizykL-lizylo-L-lizylo- L-prolilo- L-walilo-L-lizylo-L^walilo- L-tyrozylo-L-proliny, jak tez peptydu, który zamiast reszty glutamyloiwej zawiera re¬ szte glutaminowa oraz ich addycyjnych soli z kwasami, pochodnych takich jak estry lub amidy i zwiazków kompleksowych.Z opisu patentowego nr 59518 znane sa peptydy wy¬ kazujace w porównaniu z ACTH zwiekszona aktywnosc, a rózniace sie od znanych peptydów o adrenokortyko- tropowej aktywnosci tym, ze zawieraja D-aminokwas, jako pierwszy a-aminokwas przy koncowym amino¬ kwasie sekwencji.Znany jest równiez z belgijskiego opisu patentowego nr 668250, peptyd H-D-ser-tyr^ser-met^glu-his-fen-arg- try-gli-liz-pro- wal-gli-liz-arg-arg-pro- wal-liz-wal-tyr-pro OH (D-ser1-31-24^kortykotropina) wykazujacy doskonale dzialanie adrenokortykotropowe.Stwierdzono, ze peptyd zawierajacy reszte norieucyny zaimiast reszty metioninowej w polozeniu 4, a zamiast reszty arginylowych w polozeniu 17,18 reszty lizyny wy¬ kazuje o wiele lepsze dzialanie adtrenokoritykotropowe.Nowy peptyd stanowiacy D-ser1, norleii4, liz17,18-?1-24 kortykotropime jest przy tym latwiejszy do otrzymania niz D--ser1-P1-24-kortykotropina, poniewaz nie zawiera grup argininowych w polozeniu. 17, 18, które w obecno- 10 sci grupy guanidynowej wystepujacej w lancuchu bocz¬ nym, utrudniaja wytwarzanie .peptydu.Otrzymany sposobem wedlug wynalazku peptyd moz¬ na przeprowadzic w sole addycyjne z kwasami, pochod¬ ne takie jak estry, amidy oraz zwiazki kompleksowe.Jako addycyjne sole z kwasami wymienic nalezy zwla¬ szcza sole kwasów nadajacych sie do stosowania tera¬ peutycznego jak kwasu solnego, kwasu octowego, a zwlaszcza sole trudno rozpuszczalne, takie jak siarcza¬ ny, fosforany albo sulfoniany.Jako pochodne sa okreslone np. nizsze estry alkilowe np. metylowy, etylowy, propylowy, ester Ill-rz.-butyru albo estry benzylowe ewentualnie podstawione, np. gru¬ pa nitrowa, atomem chlorowca, nizszymi grupami alki- 15 lowymi lub nizszymi grupami alkoksylowymi, Nnnie- podstawione amidy, zwlaszcza peptyd, w którym kon¬ cowa grupa karboksylowa wegla koncowego jest zami- dowana.Jako zwiazki kompleksowe okresla sie zwiazki typu 20 kompleksowego o niewyjasnionej jeszcze budowie, które powstaja przy 'traktowaniu peptydów zwiazkami nie¬ organicznymi lub organicznymi, powodujacymi przedlu¬ zenie ich dzialania. Takimi nieorganicznymi substan¬ cjami sa zwiazki metali takich jak wapn, magnez, glin, kobalt, korzystnie cynk, a zwlaszcza trudno rozpuszczal¬ ne sole jak fosforany, pirofosforany, jak równiez wo¬ dorotlenki tych metali. Organicznymi substancjami, po¬ wodujacymi przedluzenie dzialania sa np. nieantygenne zelatyny, np. hydroksypolizelatyna, poliwinylopirodidon, 30 karboksymetyloceluloza, sulfoniany albo fosforany 25 631113 kwasu alginowego, dekstryny, polifenoli, polialkoholi, zwlaszcza fosforan polifloretyny i kwasu fitynowego, jak równiez polimery i kopolimery aminokwasów, np. protoamimy, a zwlaszcza aminokwasów, które wykazuja, przewazajacy udzial a-aminokwasów, jak kwas glutami¬ nowy albo asparaginowy.Nowe zwiazki, jak wspomniano, wykazuja znacznie . silniejsza aktywnosc ACTH niz odpowiednie zwiazki z resztami argininowymi w polozeniu 17, 18 i dlatego moga byc odpowiednio stosowane w medycynie i wete¬ rynarii, np. zamiast naturalnych hormonów.Nowe peptydy otrzymuje sie znanymi metodami otrzymywania peptydów o wiekszej dlugosci lancucha przy zastosowaniu D-atrninokwasu jako N-koncowego aminokwasu. Aminokwasy laczy sie we wspomnianej kolejnosci pojedynczo albo po uprzednim utworzeniu mniejszych jednostek peptydowych. Po zakonczeniu syn¬ tezy, grupy ochronne odszczepia sie w jednym lub ewentualnie w kilku stopniach.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze D-sery- lo-L-tyrozylo- L^serylo-Linorleucylo- L-glutamyloHL-hi- stydylo-L-fenyloalanyio-L-arginylo- L-tryptofylo- glicylo- L-lizylo- L-prolilo-L-walilo-glicylo-L4izylo-L-lizyloHL-li- zylo-L-lizylo-LHprolilo-L-walilo-L-lizylo- L^walilo-L-tyro- zylo-L-proliny albo odpowiedniego peptydu, który za¬ miast reszty glutamylowej zawiera reszte glutaminowa, w których to peptydach chromione sa co najmniej gru¬ pa a-aminowa i grupy aminowe bocznych lancuchów, jak równiez koncowa grupa karboksylowa i ewentualnie grupa karboksylowa w bocznych lancuchach, odszczepia sie grupy ochronne i otrzymane zwiazki ewentualnie przeprowadza sie w sole 'addycyjne z kwasami, pochod¬ ne takie jak estry lub amidy, albo w zwiazki komplek¬ sowe.Polaczenie aminokwasu i/albo jednostki peptydowej nastepuje w ten sposób, ze aminokwas albo peptyd z chroniona grupa a-aminowa i uaktywniona koncowa grupa karboksylowa, poddaje sie reakcji z aminokwa¬ sem albo peptydem z wolna grupa a-aminowa i z wolna albo chroniona, np. zestryfikowana albo zamidowana koncowa grupa karboksylowa, albo aminokwas lub pep¬ tyd z uaktywniona grupa a-aminowa i chroniona konco¬ wa grupa karboksylowa poddaje sie reakcji z amino- kwaseim albo peptydem z wolna koncowa grupa karboi- ksylowa i chroniona grupa a-aminowa.Grupe karboksylowa mozna uaktywnic np. przez prze¬ prowadzenie w halogenek kwasowy, 'azydek kwasowy, bezwodnik kwasowy, imidazolid kwasowy, izoioksazolid kwasowy, albo w aktywowany ester, jak ester eyjano- metylowy, ester karboksymetylowy, ester p-nitrofenylo- wy, albo przez reakcje za pomoca karbodwuimidu (w tym przypadku przy dodaniu N-hydraksyimidu kwasu bursztynowego), albo N,N'Hkarbonylodwuimidazolu, grupe aminowa uaktywnia sie np. przez reakcje z fos¬ foranem amidu. Najczesciej sa stosowane metody takie jak karbodwuiiriidowa, metoda azydkowa, metoda uak¬ tywnionego estru i metoda bezwodnikowa. Na uwage zasluguje takze synteza z nosnikiem stalym, w której peptyd rozbudowuje sie do konca grupy karboksylo¬ wej, zwiazanej estrowo z polimerem, przez kondensacje aminokwasów.Wolne grupy funkcyjne nie biorace udzialu w reakcji chroni sie korzystnie za pomoca reszty latwo dajacych sie odszczepic na drodze hydrolizy albo redukcji d tak grupy karboksylowe przewaznie przez zestryfikowanie 4 ~ " np. metanolem, trzeciorzedowym butanolem, alkoholem p-nitrobenzylowym albo przez utworzenie amidu, grupy aminowe np. przez wprowadzenie grupy tozylowej, trój- fenyiometylowej, formylowej, trójfluoroacetylowej, o-ni- 5 trofenylosulfeinylowej, ftalilowej lub karbobenzoksylowej, albo barwnych grup ochronnych, jak grupa p-fenyloazo- benzyloksykarboinylowa i grupa p-(p' inetoksy-fenylo- azo)-benzyloksykarbonylowa albo zwlaszcza reszty trze¬ ciurzedowego 1utyloksykarbonylu. Do ochrony grupy 10 aminowej w ugrupowaniu guanidynowym argininy sto¬ suje sie grupe nitrowa; wymieniona grupa aminowa ar- giniay nie musi byc przy reakcji koniecznie chroniona, lminowa grupe histydyny mozna oslonic reszta benzy¬ lowa albo trójfenylometylowa. 15 Przeksztalcenie chronionej grupy aminowej albo imi- nowej w .wolna grupe, jak równiez przeprowadzenie funkcjonalnie zmienionej grupy karboksylowej w wolna grupe karboksylowa prowadzi sie w trakcie procesu znanymi metodami przez dzialanie srodkami hydrolizu- 20 jacymi, wzglednie redukujacymi. Korzystny sposób po¬ lega na tym, ze trójpeptyd, np. H-D-ser-tyr-ser-OH, za¬ wierajacy 3 pierwsze aminokwasy (skrócony sposób pi¬ sania dotyczy L-aminokwasów, gdy D — nie jest wy¬ szczególnione lub tetrapeptyd zawierajacy 4 aminokwa- 25 sy, z heptapeptydem lub heksapeptydem kolejnych ami¬ nokwasów az do aminokwasu 10, korzystnie metoda azydkowa, a nastepnie kondeosuje sie dekapeptyd z te- tradekapeptydem aminokwasów 11-24. Przy tej konden¬ sacji stosuje sie przewaznie metode sprzegania, metode 30 karbodwuimidowa, albo metode uaktywnionego estru, zwlaszcza za pomoca estru p^nitrofenylowego. W ostat¬ nim przypadku ipHnitrofenylowy ester dekapeptydu nie wymaga wyodrebniania, lecz takze moze byc wytwo¬ rzony w trakcie kondensacji z dekapeptydu z wolna gru- 35 pa karboksylowa, p-nkrofenolu i dwucykloheksylokar- bodwuimidu.Dekapeptyd wystepuje wiec jako a-amino- chroniony peptyd z wolna grupa karboksylowa lub grupa p^nitro- fenyloestrowa. Tetradekapeptyd stosuje sie w formie 40 estru, zwlaszcza estru trzeciorzedowego butylu albo w-amidu. Grupy aminowe w lancuchach bocznych od¬ cinków peptydu poddawanego kondensacji chroni sie korzystnie za pomoca grupy trzeciorzedowego butylo- ksykarbonylu; grupy karboksylowe bocznych lancuchów 45 przez grupe trzeciorzedowa butyloestrowa. Grupy ochronne mozna odszczepic w ostatnim etapie kwasem trójfluorooctowym.Dalszy korzystny sposób polega na tym, ze czteropep- tyd H-D-ser-tyr-ser-norleu-OH zawierajacy 4 pierwsze 50 aminokwasy kondensuje sie z eikozapeptydem amino¬ kwasów 5-24. Przy tej kondensacji jako metode sprzega¬ nia stosuje sie glównie metode azydkowa. Grupe a-ami¬ nowa hydrazydu, wzglednie azydku tetrakozapeptydu chroni sie zwlaszcza grupa trzeciorzedowa hutylooksy- 55 karbonylu. Eikozapeptyd moze wystepowac jako wolny peptyd albo jako ester, zwlaszcza jako ester trzeciorze¬ dowego butylu, albo jako Pro24-amid. Takze w eikoza- peptydzie grupy aminowe bocznych lancuchów zabez¬ piecza sie korzystnie grupa trzeciorzedowa butyloksy- 60 karbonylu, a grupy karboksylowe- bocznego lancucha grupa trzeciorzedowa butyloestrowa.Po kondensacji odcinków peptydu z otrzymanego te- tTakozapeptydu, w którym grupa a-aminowa i girupy aminowe bocznych lancuchów sa chronione przez grupe 65 trzeciorzedowa butyloksykarbonym, a którego koncowa5 grupa karboksylowa i grupy karboksylowe w bocznym lancuchu sa chronione przez grupe trzeciorzedowa bu- tyloestrowa, wszystkie grupy ochronne mozna odszcze- pic równoczesnie na drodze hydrolizy kwasowej, na przyklad kwasem trójfluorooctowym. Jezeli koncowa grupa karboksylowa nie wystepuje jako grupa trzecio¬ rzedowa butyloestrowa lecz jako grupa amidowa, otrzy¬ muje sie amidy peptydu.W zaleznosci od sposobu prowadzenia syntezy otrzy¬ muje sie nowe zwiazki w formie zasad albo ich soli. Z soli -mozna uzyskac w znany sposób zasady, które moz¬ na nastepnie przeprowadzic w sole przez dzialanie kwa¬ sami, odpowiednimi do wytwarzania soli o dzialaniu terapeutycznym, na przyklad sole z kwasami nieorga¬ nicznymi jak kwasy chlorowcowodorowe, na przyklad kwas solny albo bromowodorowy, kwas nadchlorowy, kwas octowy albo kwas tiocyjanowy, albo z kwasami organicznymi jak kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propiomowy, kwas iglikolowy, kwas mlekowy, kwas pi- rogronowy, kwas szczawiowy, kwas imalonowy, kwas bursztynowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas jablkowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas askor¬ binowy, kwas hydrokisymaleinowy, kwas dwuhydroksy- maleinowy, kwas benzoesowy, kwas fenylooctowy, kwas 4-hydroksybenzoesowy, kwas 4-aminobenzoesowy, kwas antranilowy, kwas cynamonowy, kwas migdalowy, kwas salicylowy, kwas 4-amiinoisalicylowy, kwas 2-fenoksy- benzoesowy, kwas 2-iacetoksybenzoesowy, kwas metano- sulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas hydroksyetano- sulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas p-toluenosul- fonowy, kwas naftalenosulfonowy, albo kwas sulfanilo- wy.Peptydy otrzymane sposobem wedlug wynalazku mo¬ ga byc zastosowane w postaci preparatów farmaceutycz¬ nych, zawierajacych peptydy w mieszaninie z farmaceu¬ tycznym nieorganicznym albo organicznym nosnikiem odpowiednim do stosowania doustnego) lub pozajelito¬ wego. Jako nosniki stosuje sie takie substancje, które nie reaguja z polipeptydami, jak na przyklad zelatyna, cukier mleczny, glukoza, sól kuchenna, skrobia, steary¬ nian magnezu, talk, oleje roslinne, alkohole benzylowe, guma, polialkilenoglikole, wazelina, choreisterol, ewen¬ tualnie inne nosniki znane i stosowane w farmacji.Preparaty farmaceutyczne mozna na przyklad wytwa¬ rzac w postaci liofilizatów lub w postaci cieklej jako roztwory, zawiesiny albo emulsje, ewentualnie sterylizo¬ wanych i/lub zawierajacych substancje pomocnicze jak: srodki konserwujace, stabilizujace, zwlizajace lub emulgujace, jak i jeszcze inne wartosciowe substancje 01 dzialaniu leczniczym.Nowe peptydy mozna podawac tak jak naturalne ACTH w postaci preparatu o przedluzonym dzialaniu jak na przyklad z dodatkiem zelatyny, fosforanu poli- floretyny, karboksymetylocelulozy albo z wyzej wymie¬ nionymi trudno rozpuszczalnymi zwiazkami metali, zwlaszcza fosforanami, pirofosforanami albo wodoro¬ tlenkiem cynku.W celu przedluzenia dzialania nowych peptydów, mozna je przeprowadzac w kompleksy z polimerami albo kopolimerami aminokwasów, zwlaszcza takich, które zawieraja przewazajaca ilosc kwasowych grup a-aminokwasowych, jak kwas glutaminowy asparagino¬ wy o konfiguracji L-, D- lub D, L. Wymienione poli¬ mery i kopolimery zawieraja w bocznych lancuchach wolne grupy karboksylowe przy wolnej lub funkcjonal- 6 nie zmienionej koncowej grupie karboksylowej, na przyklad grupe estrowa lub amidowa, ewentualnie pod¬ stawiona reszte weglowodorowa, zwlaszcza grupe nizsze¬ go alkilu. Ciezar czasteczkowy polimeru moze wynosic 5 10 000—100 000, korzystnie 20 000—80 000. Do wytwa¬ rzania preparatów celowo stosuje sie sole rozpuszczalne w wodzie i fizjologicznie dopuszczalne, na przyklad sól sodowa lub amonowa albo sól z organiczna zasada jak trójetyloamina, .prokaina, dwubenzyloamina, albo inny- 10 mi trzeciorzedowymi zasadami zawierajacymi azot.Polimery te sa znane, lub moga byc wytwarzane zna¬ nymi sposobami, na przyklad sposobami opisanymi przez M. Idelson'a i innych, J. Am. Chem. Soc. 80, 4631 et seq. (1958). Mozna na przyklad ester Y'IDenzyl|owy 15 a-karboksybezwodnika kwasu glutaminowego lub ester trzeciorzedowy butylowy kwasu glutaminowego w diok¬ sanie poddac reakcji z 'amoniakiem w okreslonym sto¬ sunku molowym, na przyklad 100:1 (odpowiednio do zadanego stopnia polimeryzacji), a po zakonczeniu pol 20 meryzacji mozna odszczepic grupy ochronne, na przy¬ klad grupe benzyloofcsylowa za pomoca bromowodoru w kwasie octowym lodowatym, a grupe trzeoiorzedowa butylooksylowa kwasem trójfluorooctowym. W celu otrzymania polimeru o jednolitym, lokreslonej dlugosci 25 lancuchu, mozna rozbudowac polimer takze przez syn¬ teze sposobami znanymi w chemii peptydów (metoda) karbOidwuimidowa, metoda azydkowa i tym podobne.Stezenie polimeru w preparatach farmaceutycznych zalezy od rozpuszczalnosoi danej soli i od lepkosci. Po- 30 Umer powinien wystepowac w preparatach w formie rozpuszczonej i odpowiedniej do stosowania w zastrzy¬ kach. Stezenie peptydu o dzialaniu ladrenokortykotro¬ powym wynosi na przyklad 0,1—5 mg/ml.Sposób wedlug wynalazku objasniaja przyklady, w 35 których temperatury podano w stopniach Celsjusza.Uklady chromatogramów cienkowarstwowych ozna¬ czono nastepujaco: Uklad 40: n-butanol-etanol-woda (40 : 40 : 20), Uklad 43A: trzeciorzedowy alkohol amylowy-izopro- 40 panol-woda (67 : 26 : 7), Uklad 45: drugorzedowy butanol — 3% amoniak (70 : 30), Uklad 52: n-butanolnkwas octowy — woda (100 : 10 : : 30), 45 Uklad 52A: n-butanol-kwas octowy — woda (67 : 10 : : 23), Uklad 54: drugorzedowy butanol-izopropanol — 9% wodny roztwór kwasu monochlorooctowego (58 : 8 : 34), Uklad 100: octan etylu — pirydyna — kwas octo- 50 wy — woda (62 : 21 : 6 : 11), Uklad 101: n-butanol — pirydyna — kwas octo¬ wy — woda (38 : 24 : 8 : 30), Uklad 101E: n-butanol-pirydyna — kwas octowy — woda (44 : 24 : 2 : 30), 55 Zastosowano nastepujace skróty: Z oznacza grupe karbobenzoksylowa BOC „ grupe trzeciorzedowa-butyloksykarbony- lowa tBu „ grupe trzeoiorzedowa —- butylowa. 60 Przyklad I. 1) H — norleu — OCH3. 18,4 g L-nor- leucyny zawiesza sie w 57 ml metanolu i przy mieszaniu w temperaturze —15° w ciagu 30 minut dodaje sie 11 ml chlorku tionylu i miesza sie w ciagu nastepnych 30 mi- 65 nut utrzymujac temperature —15°, a nastepnie 90 minut7 w temperaturze 0° i w temperaturze pokojowej. Po 3 go¬ dzinnym staniu w temperaturze 40°, odparowuje sie roztwór w temperaturze 35° do suchosci, a pozostalosc krystalizuje sie z mieszaniny acetonu z heksanem (2 : 1), otrzymujac zwiazek o temperaturze topnienia 140—141°. 18,1 g otrzymanego chlorowodorku rozpuszcza sie w 20 ml wody, zadaje 200 ml eteru a nastepnie w tempe¬ raturze 0° 40 ml zimnego nasyoooego roztworu weglanu potasu. Wodna faze ekstrahuje sie wielokrotnie eterem, eterowe roztwory laczy, suszy siarczanem sodu i odpa¬ rowuje w wysokiej prózni w temperaturze 0°. Wolny ester otrzymuje sie jako klarowny olej. 2) BOC — ser — norleu — OCH3 Roztwór 22,3 g wodzianu BOC-L-seryny, 270 ml ace- tonitrylu zadaje sie roztworem 14,3 g estru metylowego Z-norleucyny i 65 ml acetonitrylu, po czym ochladza do temperatury —5°, dodaje 22,7 g dwucykloheksylo- karbodwuimidu w 35 ml acetonitrylu, miesza jeszcze jedna godzine w temperaturze —5°, nasetpnie przez noc w temperaturze 0°, uwalnia od dwucykloheksylomoczni- ka i odparowuje roztwór w temperaturze 35°. Pozosta¬ losc pochlania sie /w kwasie octowym, przemywa sie roztwór IN ikwasem solnym, IN kwasnym weglanem sodu i nasyconym roztworem chlorku sodu i odparo¬ wuje. Krystaliczny ester dwupeptydu topnieje w tempe¬ raturze 69—71°. 3) H — ser — norleu — OCH3 28,0 g BOC-ser-norleu-OGH3 rozpuszcza sie w 320 ml 90% kwasu trójfluorooctowego i pozostawia na 2 go¬ dziny w temperaturze pokojowej, nastepnie zageszcza roztwór ido polowy objetosci, zadaje 500 ml eteru, a wykrystalizowany trójfluorooctan wyodrebnia i wyod¬ rebniony produkt w ilosci 24,2 \g rozpuszcza w 35 ml wody, do roztworu dodaje 700 ml chloroformu, po czym przy mieszaniu w temperaturze 0° zadaje 210 ml nasy¬ conego roztworu weglanu potasu. Z fazy chloroformo¬ wej otrzymuje sie 16,1 g krystalicznego estru dwu¬ peptydu. 4) BOC — tyr — ser — norleu — OCH3 19,6 g BOC-tyr-OH i 16,1 g H-ser-norleu-OCH3 roz¬ puszcza sie w mieszaninie 350 ml acetonitrylu i 17,5 ml dwumetyloformamidu i w temperaturze —5° zadaje roztworem 15,9 g dwucykloheiksylokairbodwuimidu w 175 ml acetonitrylu, po czym miesza 1 goidzine w tem¬ peraturze —-5° a nastepnie przez noc w temperaturze 0°.Roztwór uwalnia sie od dwucykloheksyloimocznika, przemywa jak podano wyzej i odparowuje. Chroniony ester trójpeptydu topnieje po przekrystalizowaniu w temperaturze 143—145°. 5) H — tyr — ser — norleu — OCH3 27,3 g chronionego estru trójpeptydu rozpuszcza sie w 82,5 ml IN kwasu solnego, pozostawia do odstania na 2 godziny w temperaturze pokojowej i nastepnie za¬ daje 1500 ml eteru. Otrzymuje sie chlorowodorek wol¬ nego estru trójpeptydu, który po przekrystalizowaniu topnieje w temperaturze 218—220° (rozklad). 14,2 chlorowodorku rozpuszcza isie w 20 ml wody, do¬ daje sie 400 ml tworzacego warstwe dolna chloroformu 8 i w temperaturze 0° zadaje 100 ml nasyconego roztwo¬ ru weglanu potasu. Wolna zasada po przekrystalizowa¬ niu topnieje w temperaturze 84—86°. 5 6) BOC — D — ser — tyr — ser — norleu — OCH3 13,4 H-tyr^ser-nodeu-OCH3 rozpuszcza sie w 250 ml acetonitrylu i po dodaniu 15 ml dwumetyloformamidu zadaje 7,35 g BOCnDnseryny, po czym w temperaturze 10 —5° laczy sie z roztworem 7,15 g dwucykloheksylokar- bodwuimidu w 30 ml acetonitrylu i miesza 1 godzine w temperaturze —5° a nastapnie przez noc w temperaturze 0°. Roztwór uwalnia sie od dwucykloheksylomocznika i odparowuje. Chroniony ©ster tetrapeptydu po przekry- 15 stalizowaniu topnieje w temperaturze 149—151° (roz¬ klad). 7) BOC — D — ser — tyr — ser — norleu — NH — — NH2 20 11,65 g estru tetrapeptydu rozpuszcza sie w 50 ml metanolu, do roztworu dolacza 4,8 ml wodzianu hydra¬ zyny i mieszanine pozostawia sie do odstania na 24 go¬ dziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie dodaje sie 50 ml wody i miesza az. galaretowaty produkt calfcowi- 25 oie skrystalizuje. Otrzymuje sie zwiazek o temperaturze topnienia 205—207°. 8) BOC-D-ser-try-ser-norleu-glu(OtBu)-his-fen-arg- -try-gli-OH. 30 8,75 g BOC-DHser-tyr-serHnorleu-NH-NH2 rozpuszcza sie w 75 ml dwumetyloformamidu i mieszajac w tempe¬ raturze —15° zadaje 20 ml 2N roztworu chlorowodoru w lodowatym kwasie octowym i po dodaniu 1,65 g trze¬ cioirzedowego azotynu butylu miesza roztwór w ciagu 5 10 minut w temperaturze —15°, po czym do roztworu dodaje sie 5,5 ml 'trójetyloaminy. W ten sposób otrzy¬ many roztwór azydku BOC-tetrapeptydu wkrapla sie do ochlodzonego do temperatury —10° roztworu 10 g H-glu(OtBu)his-fen-arg-try1gli-OH w 225 ml dwumetylo¬ formamidu i 12 ml wody i miesza w ciagu 20 godzin w temperaturze 0°, po czym dodaje 900 ml wody. Bezpo¬ staciowy dekapeptyd odsacza sie, przemywa dwumetylo- formamiidem — woda (1 : 5) i acetonitrylem. Po powtór¬ nym wytraceniu z wodnego acetonitrylu i wyrównaniu z wilgotnoscia powietrza, otrzymuje sie 12,9 g czystego ochronionego tetrawodzianu deikapeptydu o temperatu¬ rze topnienia 215—218° (rozklad): Md = 18° - 2° (c = °5 w roztworze pirydyna-woda 50 1 : !)• Zwiazek jest jednolity na chromatogramie cien¬ kowarstwowym na silikazelu; Rf (52) = 0,3. 9) B OC-D-ser-tyr-ser-noTleu-glu-(OtBu)-his-fen-arg- -try-gli-liz-((BOC)-pro-wal-gli-liz-(BOC)-iliz- 55 -(BOC)-liz-(BOC)-liz-(BOC)Hpro^wal-tyr-pro- -OtBu. 1 g BOC-D-ser-tyrHseT-norleuiglu-(OtBu)-his-fen-arg- -try-gli-OH i 1,05 g H-liz-(BOC)Hpro-wal-gli-liz-(BOC)- ^ -liz-(BOC)-liz-(BOC)- liz-(BOC)- pro-wal-liz-(BOC)- wal- -try-pro-OtBu) otrzymuje sie przez kondensacje Z-liz- -(BOC)-OH z H4iz-(BOC)-OCH3 w obecnosci dwucyklo- heksylokarbodwuimidu, przeprowadzemie ochronionego estru dwupeptydu w hydrazyd, kondensacje z L-pinolina 65 metoda azydkowa do Z-liz-(BOC)-liz-(BOC)-pro-OH,63111 10 kondensacje tej pochodnej z H-wal-liz-(BOC)-wal-tyr- -pro-OtBu w obecnosci dwucykloheksylokarbodwuimi¬ du odszczepienie grupy karbobenzoksylowej z otrzyma¬ nej pochodnej oktapeptydu za pomoca wodoru w obec¬ nosci palladu osadzonego na weglu i kondensacje tak otrzymanego peptydu H-liz-(BOC)-liz-(BOC)ipro-wal-liz- -(BOC)-wal-tyr-pro-OtBu z peptydem, otrzymanym we¬ dlug opisu patentowego NRF nr 1 214 242, Z4iz-(BOC)- -pro-wal-gli-liz-(BOC)-liz-(BOC)-NH-NH2, metoda azyd- kowa (porównaj opis patentowy nr 59 518), kondensacje prowadzi sie w obecnosci 15 ml pirydyny, 1 ml wody i 0,47 ml 1 N roztworu kwasu solnego, dodaje sie 300 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza sie w temperaturze 50° w ciagu 3 godzin, nastepnie dodaje sie ponownie 300 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza w ciagu dalszych 6 godzin w temperaturze 50°, po czym zageszcza do objetosci okolo 5 ml i peptyd wytraca za pomoca dodania duzej ilosci eteru.Nierozpuszczalny w eterze proszek rozciera sie z wo¬ da, odsacza i suszy. Tak otrzymany surowy produkt w celu oczyszczenia zawiesza sie w 50 ml górnej i 50 ml dolnej fazie ukladu rozpuszczalników metanol-bufor- -chloroform-czterochlorek wegla (10:3:5:4) [Bufor: 28,5 ml kwasu octowego + 19,25 g octanu amonu w 960 ml wody], wytrzasa kilka godzin i uwalnia od nie¬ rozpuszczalnych skladników przez filtracje. Czesc roz¬ puszczalna poddaje sie w celu dalszego oczyszczenia roz¬ dzialowi Craig'a w podobnym ukladzie rozpuszczalni¬ ków.Stopien czystosci poszczególnych frakcji kontroluje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na plytkach silikazelowych w ukladzie 100 i chlorofor- mienmetanolu (75 :25). Chromatograficznie jednolite frakcje laczy sie i odparowuje. Octan amonu zawarty jeszcze w pozostalosci usuwa sie przez wysublimowanie w wysokiej prózni w temperaturze 40°. 10) H-D-ser-tyr-ser-norleu-glu-his-fen-arg-try^gli-liz- -pro-wal-gli-liz-liz-liz-liz-pro-wal-liz-wal-tyr- -pro-OH (sól kwasu octowego). 100 mg BOC-D-ser-tyr^ser-inorleu-glu-(OtBu)-his-fen- -arg-tyr- gli-liz-(BOC)- pro-wal-gli-liz-(BOC)- liz-(BOC)- -liz-(BOC)- liz-(BOC)-pro-wal- liz-(BOC)-wal- tyr-pro- OtBu rozpuszcza sie w 3 ml 90% kwasu trójfluoroocto- wego i pozostawia w ciagu 1,5 godziny w temperaturze 25°. Nastepnie peptyd wytraca sie duza iloscia eteru, odsacza, przemywa eterem i suszy. Tak otrzymany trój- fluorooctan tetrakozapeptydu rozpuszcza sie w 5 ml wody i w celu przemiany w octan wprowadza na ko¬ lumne (0=18 mm, 1 = 20 cm) ze slabo zasadowym wymieniaczem jonowym (Merck Nr II). W wyniku lio¬ filizacji eluatu otrzymuje sie octan wolnego tetrakoza¬ peptydu w postaci prawie bezbarwnego, lekkiego pro¬ szku.Przyklad II. 1) Z-wal-tyr-pro-NH2. 18,8 g Z-wal- -tyr-pro-OtBu rozpuszcza sie w 95 ml 90% kwasu trój- fluorooctowego i pozostawia przez 1 godzine w tempera¬ turze pokojowej, po czym zageszcza do suchosci i olei¬ sta pozostalosc proszkuje przez dodanie 100 ml wody i roztarcie -w temperaturze 0°C, a nastepnie odsacza i su¬ szy do stalej wagi nad wodorotlenkiem potasu, rozpu¬ szcza w mieszaninie estru kwasu octowego i eteru nafto¬ wego i ponownie wytraca. Bezpostaciowy proszek (17,01 g) razem z 5,15 nil trójetyloaminy rozpuszcza sie w 170 ml absolutnego iczterowodorofuranu, ochladza do temperatury —15° i w ciegu 5 minut zadaje roztworeim 4,4 ml chloroweglanu izobutylu w 2,5 ml czterowodoro- furanu.Po 15 minutowym mieszaniu w temperaturze — 10° dodaje sie powoli 107 ml 0,64 N roztworu amoniaku w absolutnym octanie etylu i miesza w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°, a nastepnie w ciagu 6 godzin w tem¬ peraturze 20°. Mieszanine zageszcza sie, silnie kleista 10 pozostalosc rozpuszcza w 500 ml octanu etylu i kolejno przemywa woda, 2 N roztworem weglanu sodu ponow¬ nie woda i zageszcza do sucha. Po dwukrotnym wytra¬ ceniu pozostalosci z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego i wysuszeniu w wysokiej prózni otrzymuje 15 sie 14,4 g bezpostaciowego proszku, który wedlug chro- matogramu cienkowarstwowego stanowi jednolity zwia¬ zek. Na plytce silikiazelowej otrzymuje sie nastepujace wartosci Rf : Rf w ukladzie chloroform-metanol (9 : 1) = = 0,35, Rf (43 A) = 0,63. 20 2) H-wal-tyr-pro-NH2. 14,4 g Z-wal-tyr-pro-NH2 rozpuszcza sie w 150 ml metanolu i uwodornia za pomoca 1,5 g 10% palladu 25 osadzonego na weglu, przy normalnym cisnieniu i ab¬ sorpcji CO2 az do nasycenia (okolo 2 godzin). Po od¬ filtrowaniu katalizatora i zageszczeniu przesaczu do su¬ cha, pozostalosc rozpuszcza sie w 15 ml (metanolu i 40 ml octanu etylu, a nastepnie wytraca przez dodanie 30 120 ml eteru naftowego, odfiltrowuje i suszy w wysokiej prózni w temperaturze 40°. Otrzymuje sie 9,52 g bez¬ postaciowego proszku, który wedlug chromatogramu cienkowarstwowego na plytce celulozowej przedstawia jednolity produkt o nastepujacych wartosciach Rf: Rf 35 (40) = 0,73, Rf (45) = 0,72, Rf (54) = 0,70. 3) Z4iz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2. 9,74 g Z-liz-(BOC)- -OH i 9,52 g H-wal-tyr-pro-NH2 rozpuszcza sie w 40 ml absolutnego dwumetyloformamidu i zadaje roztworem 5,76 dwucykloheksylokarbodwuimidu w 100 ml aceto- 40 nitrylu. Miesza sie 12 goidzin w temperaturze pokojo¬ wej, odsacza wydzielony dwucykloheksylomocznik i za¬ geszcza roztwór do sucha. Stala pieniaca sie pozostalosc wytraca sie dwukrotnie z mieszaniny octanu etylu i ete¬ ru naftowego. Otrzymuje sie 16,02 g bezpostaciowego 45 proszku pochodnej tetrapeptydu, który na chromatogra- mie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym wyka¬ zuje nastepujace wartosci Rf: Rf w ukladzie chloro¬ form-metanol (9:1) = 0,29, Rf (43 A) = 0,68. 4) H-liz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2. 15,5 ig ochronione- 50 go amidu tetrapeptydu rozpuszcza sie w 100 ml metano¬ lu 1 po dodaniu 1,5% palladu osadzonego na weglu uwodornia do nasycenia, przy normalnym cisnieniu w ciagu okolo 4 godzin. Surowy produkt otrzymany po odfiltrowaniu katalizatora i zageszczeniu przesaczu do 55 sucha, rozpuszcza sie w 10 ml metanolu i 120 ml octa¬ nu etylu, a nastepnie wytraca przez dodanie 120 ml eteru naftowego i suszy w wysokiej prózni w tempera¬ turze 40°. Otrzymuje sie 11,9 g bezpostaciowego pro¬ szku, który na chromatogramie cienkowarstwowym na 60 silikazelu wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf — w ukladzie chloroform-metanol (9:1) = 0,08, Rf (43 A) = = 0,27. 5) Z-walHliz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2. 5,28 g Z^wal-OH i 3,07 ml trójetyloaminy rozpuszcza sie w 50 ml abso- 65 lutnego octanu etylu, ochladza do temperatury —10°,/ zadaje roztworem 4,57 ml chloroweglanu izobutylu w 5 ml octanu etylu i miesza jeszcze przez 15 minut w temperaturze —10°, po czym w temperaturze —5° za¬ daje roztworem 11,87 g H-liz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2 w 10 ml dwumetyloformamidu i miesza przez 30 minut w temperaturze 0° i przez 5 godzin w temperaturze poko¬ jowej a nastepnie zadaje 100 ml wody i 200 ml n-buta- nolu.Po oddzieleniu wodnej fazy, faze organiczna przemy¬ wa sie kolejno 10% roztworem kwasu winowego w tem¬ peraturze 0°, nasyconym roztworem kwasnego weglanu sodu i nasyconym roztworem siarczanu sodu, suszy siar¬ czanem sodu i zageszcza du sucha. Pienista pozostalosc w celu wstepnego oczyszczenia wytraca sie z mieszaniny metanolu z octanem etylu i eterem naftowym i raz z mieszanina metanolu z acetonitrylem. Otrzymuje sie 12,5 g bezpostaciowego proszku, który rozdziela sie wielokrotnie w ukladzie .rozpuszczalników metanol-0,1 M roztwór octanu amonu-chloroform-czterochlorek wegla (9:3:4:4) z objetosciami fazowymi po 25 ml, przez 250 stopni.Z oddzielnego elementu Nr 81 —115 (rmax = 91; K = 0,57) przy zageszczeniu do sucha i odsublimowaniu octanu amonu w wysokiej prózni w temperaturze 45°, otrzymuje sie lacznie 7,94 g chromatograficznie czyste¬ go ochronionego pentapeptydu w postaci bialego bez¬ postaciowego proszku, wykazujacego na chromatogira- mie cienkowarstwowym na silikazelu nastepujace war¬ tosci Rf: Rf — w ukladzie chloroform-metanol (9 : 1) = = 0,42, Rf (43 A) = 0,68.. 6) H-wal-liz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2. 5,72 g Z-wal- -liz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2 rozpuszcza sie w 75 ml me¬ tanolu i uwodornia po dodaniu 600 mg 10% palladu osadzonego na weglu w temperaturze pokojowej z ab¬ sorpcja CO2. Pobór wodoru ustaje poi okolo 5 godzi¬ nach, katalizator odsacza, a iroztwór odparowuje do su¬ cha. Otrzymuje sie 4,74 g amidu pentapeptydu jako bez¬ postaciowego chromatograficznie jednolitego proszku, który na chromaitogramie cienkowarstwowym na silika¬ zelu wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf (52) = 0,40, Rf (100) = 0,35. 7) Z-liz-(BOC)-!liz-(BOC)-pro-wal-liz-(BOC)-wal-tyr- -pro-NH2. 3,35 g Z-liz-(BOC)-liz-(BOC)-pro-OH (otrzymanej jak podano w przykladzie I) rozpuszcza sie w 20 ml abso¬ lutnego dwumetyloformamidu i po dodaniu 0,65 ml trójetyloaminy ochladza do temperatury —15° i w tej samej temperaturze do mieszaniny wkrapla sie 0,58 ml chlorku piwaloilu, ia po 6 minutach dodaje sie uprzed¬ nio ochlodzony roztwór 3,34 g Hjwal-liz-(BOC)-wal-tyr- -pro-NH2 w 10 ml absolutnego dwumetyloformamidu i miesza 20 minut w temperaturze —10°, w ciagu 5 go¬ dzin w temperaturze 0° i 2 godziny w temperaturze 20°.Nastepnie dodaje sie 70 ml estru kwasu octowego i 50 ml wody, ekstrahuje organiczna faze kolejno 0,1 M kwasem cytrynowym, 2% roztworem amoniaku i woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje rozpuszczalnik.Pozostalosc (5,74 g) w postaci bezpostaciowego proszku wykazuje na ichromatogramie cienkowarstwowym na si¬ likazelu tylko nieznaczne zanieczyszczenia i dlatego bez oczyszczania stosuje sie ja do dalszych reakcji.Rf — w ukladzie chloroform-metanol (9 : 1) = 0,23. 8) H-liz-(BOC)4iz-(BOC)-pro-wal-lizKBOC)-wal-tyr- -pro-NH2- 12 5,7 g wyzej opisanej pochodnej oktapeptydu rozpu¬ szcza sie w 100 ml metanolu i po dodaniu 550 mg 10% palladu osadzonego na weglu uwodornia przy normal¬ nym cisnieniu az do nasycenia!. Po odsaczeniu kataliza- 5 tora i po plukaniu metanolem, przesacz odparowuje sie do sucha. Biala piankowa pozostalosc rozpuszcza sie w 100 ml chloroformu, ekstrahuje 20 ml 2N roztworu kwasu octowego, faze chloroformowa zageszcza do 20 ml, wytraca peptyd przez dodanie 60 ml eteru naftowego i 10 suszy w wysokiej prózni w temperaturze 50°. Po wy¬ równaniu z wilgotnoscia powietrza otrzymuje sie 5,21 g bezpostaciowego, chromatografiozinie jednolitego prosz¬ ku, który wedlug analizy miareczkowej i elementarnej na mol amidu oktapeptydu zawiera 0,63 mola kwasu 15 octowego i 13 moli wody.Na silikazelu otrzymuje sie nastepujace wartosci Rf: Rf — w ukladzie chloroform-metanol (9:1) = 0,08, Rf (100) = 0,46. 9) Z-liz-(BOC)-pro-wal^gli-liz 20 -(BOC)-iliz-(BOC)-pro^wal-liz-(BOC)-wal-tyr- -pro-NHo. 3,91 g Z-liz-(BOC)-pro- walngli-liz-(BOC)- liz-(BOC)- -NH-NH2 (porównaj opis patentowy NRF nr 1214 241) 25 rozpuszcza sie lekko ogrzewajac w 40 ml absolutnego dwumetyloformamidu, ochladza do temperatury —20° i w tej temperaturze mieszajac zadaje kolejno powoli 6,28 ml 2,15 N kwasu solnego i 0,74 ml 5N roztworu azotynu sodu, a nastepnie miesza jeszcze w ciagu 15 30 minut w temperaturze —10° i dodaje uprzednio ochlo¬ dzony roztwór 4,07 g H-liz-(BOC)-liz-(BOC)-pro-wal-liiz- -(BOC)-iwal-tyr-pro-NH2 (zawierajacy 2,5% CH3COOH + + 15,3% H2O) w 11 ml dwumetyloformamidu jak równiez 1,98 ml trójetyloaminy i miesza w ciagu 1 go- 35 dziny w temperaturze 0°, po czym doprowadza sie pH do< wartosci 7,5 za pomoca trójetyloaminy i pozostawia na noc w temperaturze 0°, przy czym wytraca sie su¬ rowy produkt w galaretowatej postaci.Produkt odsacza sie, przemywa woda i wytraca trzy- 40 krotnie z mieszaniny metanolu z woda oraz dwukrotnie z mieszaniny metanolu z benzenem i eterem naftowym.Tak oczyszczony wstepnie material poddaje sie w ukla¬ dzie metanoil-bufoir-chloroform-czterochlorek wegla (12 : : 4 : 9 : 3) [bufor = 28,5 ml kwasu octowego + 19,25 g 45 octanu amonu w 960 ml wody] irozdzialowi Craig'a przez 160 stopni z objetosciami fazowymi po 20 ml. Z rozdzielonego elementu Nr 45 — 74 (rmax = 57; K = = 0,55) przy zageszczeniu 'do sucha i wysublimowaniu octanu amonu w temperaturze 45° w wysokiej prózni 50 uzyskuje sie lacznie 3,3 g chromatograficznie czystego ochronionego tetradekapeptydu, w postaci bialego bez¬ postaciowego proszku o temperaturze rozkladu okolo 210°, który na chromatogramie cienkowarstwowym na silikazelu wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf w ukla- 55 dzie chloroform-metanol (9:1) = 0,17, Rf (43 A) = 0,62, Rf (100) = 0,87. 10) H-liz-(BOC)-proHwal-gli-liz-i(BOC)-liz-(BOC)- -liz-(BOC)-li!Z-(BOC)-pro-wal-liz-wal-tyr- -pro-NH2. 60 4,97 g ochronionego amidu tetradekapeptydu rozpu¬ szcza sie przy ogrzewaniu w 100 ml metanolu i po do¬ daniu 1 g 10% palladu osadzonego na weglu uwodornia az do nasycenia w temperaturze pokojowej i normalnym 65 cisnieniu, przy absorpcji wytwarzajacego sie dwutlenku63111 13 wegla. Katalizator odsacza sie, przesacz zateza do oko¬ lo 15 ml i uwodorniony tetradeikapeptyd wytraca sie przez dodanie 50 ml benzenu i 150 ml eteru naftowego, po czym odsacza i suszy w wysokiej prózni w tempera¬ turze 45°. Otrzymuje sie 4,25 g bezpostaciowego prosz¬ ku, który wedlug chromatogramu cienkowarstwowego na silikazelu stanowi jednolity produkt o nastepujacych wartosciach Rf: Rf (43 A) = 0,18, Rf (52) = 0,41, Rf (100) = 0,33. 11) BOC-D-!ser-tyr-serHniorleu-glu-(OtBu)-his-fen- -arg-try-gli-liz-(BOC-pro-wal-gli-liz-(BOC)- -liz-(BOC)-liz-(BOC)-liz-(BOC)-pro-wal-liz- (BOC)-wal-tyrHpro-NH2. 600 mg BOC-D-ser-tyr-ser- norieu-glu-(OtBu)-his-fen- -arg-try-gli-OH i 360 mg H-liz-(BOC)-pro- wal-gli-liz- -(BOC)-liz-(BOC)-liz-(BOC)- liz-(BOQ- pro-wal-liz- -(BOC)-wal-tyr-pro-NH2 zadaje sie 12 ml pirydyny, 1 ml wody i 0,3 ml IN roztworu kwasu solnego, a nastepnie roztworem 200 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu w 1,5 ml pirydyny i miesza 5 godzin w temperaturze 45— —50° po czym dodaje sie jeszcze 150 mg dwucyklohe¬ ksylokarbodwuimidu i miesza przez noc w temperaturze 45°. Mieszanine produktu kondensacji i dwucykloheksy lomocznika wytraca sie calkowicie przez dodanie 160 ml wody, odfiltrowuje i suszy.W celu oddzielenia dwucykloheksylomocznika mie¬ szanine zawiesza sie kolejno dwa razy na goraco w eta¬ nolu, wzglednie czesciowo rozpuszcza, wytraca powtór¬ nie przez dodanie benzenu i eteru naftowego. Po 120 stopniach rozdzialu w ukladzie rozpuszczalników me- tanol-bufor-chloroform-czterochlorek wegla (10 : 3 : 5 : 4) [bufor: 28,5 ml kwasu octowego + 19,25 g octanu amo¬ nu iw 960 ml wody] otrzymuje sie czysty ochroniony amid tetrakozapeptydu z frakcji 46 — 58 (liczba po¬ dzialu K = 0,82). Przy chromatografii cienkowarstwo¬ wej na plytce silikazelowej ochroniona pochodna pep- tydu wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf (52) = 0,54, Rf (100) = 0,35.Rf w ukladzie chloroform-metanol (7 : 3) = 0,4. 12) H-D-ser-tyr-ser-orleu-glu-his-fen-arg-tyr-gli- -liz-pro-wal-gli-liz-liz-liz-liz-pro-wal-tyr-pro- -NH2 (sól kwasu octowego).Odszczepienie grup ochronnych chronionego peptydu i przeprowadzenie soli kwasu trójfluorooctowego w sól kwasu octowego przebiega iwedlug sposobu opisanego w przykladzie I. Wolny tetrakozapeptamid wykazuje przy 10 15 20 25 30 35 14 elektroforezie bibulowej (bibula Schleicher Schtill 2643/b mgl; Pirydyna-octan. Bufor pH = 6,35: czas przebiegu 1 godzina; 2000 V); odleglosc przebiegu wo¬ bec katody 8 cm. Przy chromatografii cienkowarstwo¬ wej wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf (101) na plyt¬ ce tlenku glinu = 0,58, Rf (52 A) na plytce tlenku gli¬ nu = 0,44, Rf (101 E) na plytce celulozowej = 0,46.Peptyd wytworzony sposobem wedlug wynalazku do¬ godnie przechowuje sie w postaci tzw. „suchej ampul¬ ki", zawierajacej nastepujace skladniki: kwasny octan Pro24-amidu D-seri-norleuMiz17,18-!31-2: koirtykotropiny ZnS04 + 7H20 NA3P04 + 12H20 mannit 0,5 mg 1,23 mg 1,38 mg 40,00 mg 50 Przed uzyciem, zawartosc suchej buteleczki miesza sie z 1 ml wody destylowanej zawartej w ampulce rozpu¬ szczalnika, otrzymujac zawiesine o wartosci pH 7,6. PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego peptydu o dzialaniu ACTH, znamienny tym, ze D-serylo-L-tyrozylo-L-sery- lo-L-norleucylo- L-glutamylorL-hiistydylo- L-fenyloalany- lo-L-arginylo- L-tryptofylo-glieylo- L-lizylo- L-prolilo- -L-walilo-iglieylo- L-lizylo- L-lizylo- L-lizylo- L-lizylo- -L-prolilo-I^walilo-L-lizylo- L-walilo-L-tyrozylo- L-pro- liny albo odpowiedniego peptydu, który zamiast^reszty glutamylowej zawiera reszte glutaminowa, w których to peptydach chronione sa co najmniej grupa a-aminowa i grupy aminowe bocznych lancuchów jak równiez kon¬ cowa grupa karboksylowa i ewentualnie grupy karbo¬ ksylowe obecne w bocznym lancuchu, odszczepia sie igrupy ochronne, po czym otrzymane peptydy ewentual¬ nie przeprowadza sie w ich sole addycyjne z kwasami, w pochodne takie jak estry lub amidy albo w zwiazki kompleksowe.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie z peptydu, w którym grupy aminowe chronione sa przez grupe trzeciorzedowa bu- tyloksykarboinylowa, a grupy karboksylowe przez grupe trzeciorzedowa butyioestrowa.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie na drodze hydrolizy kwasnej.

4. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie za pomoca kwasu trójfluorooc¬ towego. PL PL