17.1.1967 Szwajcaria Opublikowano: 20.VUI.1971 63111 KI. 12 q, 6/01 MKP C 07 c, 103/52 ukiL CZYTELNIA U- edu Patentowana Wlasciciel patentu: CIBA Societe Anonyme, Bazylea (Szwajcaria) Sposób wytwarzania nowego peptydu o dzialaniu ACTH Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania no»- wego peptydu o sekwencji D-serylo-L-tyrozylo-L-serylo- L-norleucylo- L-glutamylo-L-histydylo- L-fenyloalanylo- L-argiinylo-L-tryptofyloglicylo- L-lizylo-L-prolilo- L-wa- lilo-glicylo-L-lizylo- L-lizykL-lizylo-L-lizylo- L-prolilo- L-walilo-L-lizylo-L^walilo- L-tyrozylo-L-proliny, jak tez peptydu, który zamiast reszty glutamyloiwej zawiera re¬ szte glutaminowa oraz ich addycyjnych soli z kwasami, pochodnych takich jak estry lub amidy i zwiazków kompleksowych.Z opisu patentowego nr 59518 znane sa peptydy wy¬ kazujace w porównaniu z ACTH zwiekszona aktywnosc, a rózniace sie od znanych peptydów o adrenokortyko- tropowej aktywnosci tym, ze zawieraja D-aminokwas, jako pierwszy a-aminokwas przy koncowym amino¬ kwasie sekwencji.Znany jest równiez z belgijskiego opisu patentowego nr 668250, peptyd H-D-ser-tyr^ser-met^glu-his-fen-arg- try-gli-liz-pro- wal-gli-liz-arg-arg-pro- wal-liz-wal-tyr-pro OH (D-ser1-31-24^kortykotropina) wykazujacy doskonale dzialanie adrenokortykotropowe.Stwierdzono, ze peptyd zawierajacy reszte norieucyny zaimiast reszty metioninowej w polozeniu 4, a zamiast reszty arginylowych w polozeniu 17,18 reszty lizyny wy¬ kazuje o wiele lepsze dzialanie adtrenokoritykotropowe.Nowy peptyd stanowiacy D-ser1, norleii4, liz17,18-?1-24 kortykotropime jest przy tym latwiejszy do otrzymania niz D--ser1-P1-24-kortykotropina, poniewaz nie zawiera grup argininowych w polozeniu. 17, 18, które w obecno- 10 sci grupy guanidynowej wystepujacej w lancuchu bocz¬ nym, utrudniaja wytwarzanie .peptydu.Otrzymany sposobem wedlug wynalazku peptyd moz¬ na przeprowadzic w sole addycyjne z kwasami, pochod¬ ne takie jak estry, amidy oraz zwiazki kompleksowe.Jako addycyjne sole z kwasami wymienic nalezy zwla¬ szcza sole kwasów nadajacych sie do stosowania tera¬ peutycznego jak kwasu solnego, kwasu octowego, a zwlaszcza sole trudno rozpuszczalne, takie jak siarcza¬ ny, fosforany albo sulfoniany.Jako pochodne sa okreslone np. nizsze estry alkilowe np. metylowy, etylowy, propylowy, ester Ill-rz.-butyru albo estry benzylowe ewentualnie podstawione, np. gru¬ pa nitrowa, atomem chlorowca, nizszymi grupami alki- 15 lowymi lub nizszymi grupami alkoksylowymi, Nnnie- podstawione amidy, zwlaszcza peptyd, w którym kon¬ cowa grupa karboksylowa wegla koncowego jest zami- dowana.Jako zwiazki kompleksowe okresla sie zwiazki typu 20 kompleksowego o niewyjasnionej jeszcze budowie, które powstaja przy 'traktowaniu peptydów zwiazkami nie¬ organicznymi lub organicznymi, powodujacymi przedlu¬ zenie ich dzialania. Takimi nieorganicznymi substan¬ cjami sa zwiazki metali takich jak wapn, magnez, glin, kobalt, korzystnie cynk, a zwlaszcza trudno rozpuszczal¬ ne sole jak fosforany, pirofosforany, jak równiez wo¬ dorotlenki tych metali. Organicznymi substancjami, po¬ wodujacymi przedluzenie dzialania sa np. nieantygenne zelatyny, np. hydroksypolizelatyna, poliwinylopirodidon, 30 karboksymetyloceluloza, sulfoniany albo fosforany 25 631113 kwasu alginowego, dekstryny, polifenoli, polialkoholi, zwlaszcza fosforan polifloretyny i kwasu fitynowego, jak równiez polimery i kopolimery aminokwasów, np. protoamimy, a zwlaszcza aminokwasów, które wykazuja, przewazajacy udzial a-aminokwasów, jak kwas glutami¬ nowy albo asparaginowy.Nowe zwiazki, jak wspomniano, wykazuja znacznie . silniejsza aktywnosc ACTH niz odpowiednie zwiazki z resztami argininowymi w polozeniu 17, 18 i dlatego moga byc odpowiednio stosowane w medycynie i wete¬ rynarii, np. zamiast naturalnych hormonów.Nowe peptydy otrzymuje sie znanymi metodami otrzymywania peptydów o wiekszej dlugosci lancucha przy zastosowaniu D-atrninokwasu jako N-koncowego aminokwasu. Aminokwasy laczy sie we wspomnianej kolejnosci pojedynczo albo po uprzednim utworzeniu mniejszych jednostek peptydowych. Po zakonczeniu syn¬ tezy, grupy ochronne odszczepia sie w jednym lub ewentualnie w kilku stopniach.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze D-sery- lo-L-tyrozylo- L^serylo-Linorleucylo- L-glutamyloHL-hi- stydylo-L-fenyloalanyio-L-arginylo- L-tryptofylo- glicylo- L-lizylo- L-prolilo-L-walilo-glicylo-L4izylo-L-lizyloHL-li- zylo-L-lizylo-LHprolilo-L-walilo-L-lizylo- L^walilo-L-tyro- zylo-L-proliny albo odpowiedniego peptydu, który za¬ miast reszty glutamylowej zawiera reszte glutaminowa, w których to peptydach chromione sa co najmniej gru¬ pa a-aminowa i grupy aminowe bocznych lancuchów, jak równiez koncowa grupa karboksylowa i ewentualnie grupa karboksylowa w bocznych lancuchach, odszczepia sie grupy ochronne i otrzymane zwiazki ewentualnie przeprowadza sie w sole 'addycyjne z kwasami, pochod¬ ne takie jak estry lub amidy, albo w zwiazki komplek¬ sowe.Polaczenie aminokwasu i/albo jednostki peptydowej nastepuje w ten sposób, ze aminokwas albo peptyd z chroniona grupa a-aminowa i uaktywniona koncowa grupa karboksylowa, poddaje sie reakcji z aminokwa¬ sem albo peptydem z wolna grupa a-aminowa i z wolna albo chroniona, np. zestryfikowana albo zamidowana koncowa grupa karboksylowa, albo aminokwas lub pep¬ tyd z uaktywniona grupa a-aminowa i chroniona konco¬ wa grupa karboksylowa poddaje sie reakcji z amino- kwaseim albo peptydem z wolna koncowa grupa karboi- ksylowa i chroniona grupa a-aminowa.Grupe karboksylowa mozna uaktywnic np. przez prze¬ prowadzenie w halogenek kwasowy, 'azydek kwasowy, bezwodnik kwasowy, imidazolid kwasowy, izoioksazolid kwasowy, albo w aktywowany ester, jak ester eyjano- metylowy, ester karboksymetylowy, ester p-nitrofenylo- wy, albo przez reakcje za pomoca karbodwuimidu (w tym przypadku przy dodaniu N-hydraksyimidu kwasu bursztynowego), albo N,N'Hkarbonylodwuimidazolu, grupe aminowa uaktywnia sie np. przez reakcje z fos¬ foranem amidu. Najczesciej sa stosowane metody takie jak karbodwuiiriidowa, metoda azydkowa, metoda uak¬ tywnionego estru i metoda bezwodnikowa. Na uwage zasluguje takze synteza z nosnikiem stalym, w której peptyd rozbudowuje sie do konca grupy karboksylo¬ wej, zwiazanej estrowo z polimerem, przez kondensacje aminokwasów.Wolne grupy funkcyjne nie biorace udzialu w reakcji chroni sie korzystnie za pomoca reszty latwo dajacych sie odszczepic na drodze hydrolizy albo redukcji d tak grupy karboksylowe przewaznie przez zestryfikowanie 4 ~ " np. metanolem, trzeciorzedowym butanolem, alkoholem p-nitrobenzylowym albo przez utworzenie amidu, grupy aminowe np. przez wprowadzenie grupy tozylowej, trój- fenyiometylowej, formylowej, trójfluoroacetylowej, o-ni- 5 trofenylosulfeinylowej, ftalilowej lub karbobenzoksylowej, albo barwnych grup ochronnych, jak grupa p-fenyloazo- benzyloksykarboinylowa i grupa p-(p' inetoksy-fenylo- azo)-benzyloksykarbonylowa albo zwlaszcza reszty trze¬ ciurzedowego 1utyloksykarbonylu. Do ochrony grupy 10 aminowej w ugrupowaniu guanidynowym argininy sto¬ suje sie grupe nitrowa; wymieniona grupa aminowa ar- giniay nie musi byc przy reakcji koniecznie chroniona, lminowa grupe histydyny mozna oslonic reszta benzy¬ lowa albo trójfenylometylowa. 15 Przeksztalcenie chronionej grupy aminowej albo imi- nowej w .wolna grupe, jak równiez przeprowadzenie funkcjonalnie zmienionej grupy karboksylowej w wolna grupe karboksylowa prowadzi sie w trakcie procesu znanymi metodami przez dzialanie srodkami hydrolizu- 20 jacymi, wzglednie redukujacymi. Korzystny sposób po¬ lega na tym, ze trójpeptyd, np. H-D-ser-tyr-ser-OH, za¬ wierajacy 3 pierwsze aminokwasy (skrócony sposób pi¬ sania dotyczy L-aminokwasów, gdy D — nie jest wy¬ szczególnione lub tetrapeptyd zawierajacy 4 aminokwa- 25 sy, z heptapeptydem lub heksapeptydem kolejnych ami¬ nokwasów az do aminokwasu 10, korzystnie metoda azydkowa, a nastepnie kondeosuje sie dekapeptyd z te- tradekapeptydem aminokwasów 11-24. Przy tej konden¬ sacji stosuje sie przewaznie metode sprzegania, metode 30 karbodwuimidowa, albo metode uaktywnionego estru, zwlaszcza za pomoca estru p^nitrofenylowego. W ostat¬ nim przypadku ipHnitrofenylowy ester dekapeptydu nie wymaga wyodrebniania, lecz takze moze byc wytwo¬ rzony w trakcie kondensacji z dekapeptydu z wolna gru- 35 pa karboksylowa, p-nkrofenolu i dwucykloheksylokar- bodwuimidu.Dekapeptyd wystepuje wiec jako a-amino- chroniony peptyd z wolna grupa karboksylowa lub grupa p^nitro- fenyloestrowa. Tetradekapeptyd stosuje sie w formie 40 estru, zwlaszcza estru trzeciorzedowego butylu albo w-amidu. Grupy aminowe w lancuchach bocznych od¬ cinków peptydu poddawanego kondensacji chroni sie korzystnie za pomoca grupy trzeciorzedowego butylo- ksykarbonylu; grupy karboksylowe bocznych lancuchów 45 przez grupe trzeciorzedowa butyloestrowa. Grupy ochronne mozna odszczepic w ostatnim etapie kwasem trójfluorooctowym.Dalszy korzystny sposób polega na tym, ze czteropep- tyd H-D-ser-tyr-ser-norleu-OH zawierajacy 4 pierwsze 50 aminokwasy kondensuje sie z eikozapeptydem amino¬ kwasów 5-24. Przy tej kondensacji jako metode sprzega¬ nia stosuje sie glównie metode azydkowa. Grupe a-ami¬ nowa hydrazydu, wzglednie azydku tetrakozapeptydu chroni sie zwlaszcza grupa trzeciorzedowa hutylooksy- 55 karbonylu. Eikozapeptyd moze wystepowac jako wolny peptyd albo jako ester, zwlaszcza jako ester trzeciorze¬ dowego butylu, albo jako Pro24-amid. Takze w eikoza- peptydzie grupy aminowe bocznych lancuchów zabez¬ piecza sie korzystnie grupa trzeciorzedowa butyloksy- 60 karbonylu, a grupy karboksylowe- bocznego lancucha grupa trzeciorzedowa butyloestrowa.Po kondensacji odcinków peptydu z otrzymanego te- tTakozapeptydu, w którym grupa a-aminowa i girupy aminowe bocznych lancuchów sa chronione przez grupe 65 trzeciorzedowa butyloksykarbonym, a którego koncowa5 grupa karboksylowa i grupy karboksylowe w bocznym lancuchu sa chronione przez grupe trzeciorzedowa bu- tyloestrowa, wszystkie grupy ochronne mozna odszcze- pic równoczesnie na drodze hydrolizy kwasowej, na przyklad kwasem trójfluorooctowym. Jezeli koncowa grupa karboksylowa nie wystepuje jako grupa trzecio¬ rzedowa butyloestrowa lecz jako grupa amidowa, otrzy¬ muje sie amidy peptydu.W zaleznosci od sposobu prowadzenia syntezy otrzy¬ muje sie nowe zwiazki w formie zasad albo ich soli. Z soli -mozna uzyskac w znany sposób zasady, które moz¬ na nastepnie przeprowadzic w sole przez dzialanie kwa¬ sami, odpowiednimi do wytwarzania soli o dzialaniu terapeutycznym, na przyklad sole z kwasami nieorga¬ nicznymi jak kwasy chlorowcowodorowe, na przyklad kwas solny albo bromowodorowy, kwas nadchlorowy, kwas octowy albo kwas tiocyjanowy, albo z kwasami organicznymi jak kwas mrówkowy, kwas octowy, kwas propiomowy, kwas iglikolowy, kwas mlekowy, kwas pi- rogronowy, kwas szczawiowy, kwas imalonowy, kwas bursztynowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas jablkowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, kwas askor¬ binowy, kwas hydrokisymaleinowy, kwas dwuhydroksy- maleinowy, kwas benzoesowy, kwas fenylooctowy, kwas 4-hydroksybenzoesowy, kwas 4-aminobenzoesowy, kwas antranilowy, kwas cynamonowy, kwas migdalowy, kwas salicylowy, kwas 4-amiinoisalicylowy, kwas 2-fenoksy- benzoesowy, kwas 2-iacetoksybenzoesowy, kwas metano- sulfonowy, kwas etanosulfonowy, kwas hydroksyetano- sulfonowy, kwas benzenosulfonowy, kwas p-toluenosul- fonowy, kwas naftalenosulfonowy, albo kwas sulfanilo- wy.Peptydy otrzymane sposobem wedlug wynalazku mo¬ ga byc zastosowane w postaci preparatów farmaceutycz¬ nych, zawierajacych peptydy w mieszaninie z farmaceu¬ tycznym nieorganicznym albo organicznym nosnikiem odpowiednim do stosowania doustnego) lub pozajelito¬ wego. Jako nosniki stosuje sie takie substancje, które nie reaguja z polipeptydami, jak na przyklad zelatyna, cukier mleczny, glukoza, sól kuchenna, skrobia, steary¬ nian magnezu, talk, oleje roslinne, alkohole benzylowe, guma, polialkilenoglikole, wazelina, choreisterol, ewen¬ tualnie inne nosniki znane i stosowane w farmacji.Preparaty farmaceutyczne mozna na przyklad wytwa¬ rzac w postaci liofilizatów lub w postaci cieklej jako roztwory, zawiesiny albo emulsje, ewentualnie sterylizo¬ wanych i/lub zawierajacych substancje pomocnicze jak: srodki konserwujace, stabilizujace, zwlizajace lub emulgujace, jak i jeszcze inne wartosciowe substancje 01 dzialaniu leczniczym.Nowe peptydy mozna podawac tak jak naturalne ACTH w postaci preparatu o przedluzonym dzialaniu jak na przyklad z dodatkiem zelatyny, fosforanu poli- floretyny, karboksymetylocelulozy albo z wyzej wymie¬ nionymi trudno rozpuszczalnymi zwiazkami metali, zwlaszcza fosforanami, pirofosforanami albo wodoro¬ tlenkiem cynku.W celu przedluzenia dzialania nowych peptydów, mozna je przeprowadzac w kompleksy z polimerami albo kopolimerami aminokwasów, zwlaszcza takich, które zawieraja przewazajaca ilosc kwasowych grup a-aminokwasowych, jak kwas glutaminowy asparagino¬ wy o konfiguracji L-, D- lub D, L. Wymienione poli¬ mery i kopolimery zawieraja w bocznych lancuchach wolne grupy karboksylowe przy wolnej lub funkcjonal- 6 nie zmienionej koncowej grupie karboksylowej, na przyklad grupe estrowa lub amidowa, ewentualnie pod¬ stawiona reszte weglowodorowa, zwlaszcza grupe nizsze¬ go alkilu. Ciezar czasteczkowy polimeru moze wynosic 5 10 000—100 000, korzystnie 20 000—80 000. Do wytwa¬ rzania preparatów celowo stosuje sie sole rozpuszczalne w wodzie i fizjologicznie dopuszczalne, na przyklad sól sodowa lub amonowa albo sól z organiczna zasada jak trójetyloamina, .prokaina, dwubenzyloamina, albo inny- 10 mi trzeciorzedowymi zasadami zawierajacymi azot.Polimery te sa znane, lub moga byc wytwarzane zna¬ nymi sposobami, na przyklad sposobami opisanymi przez M. Idelson'a i innych, J. Am. Chem. Soc. 80, 4631 et seq. (1958). Mozna na przyklad ester Y'IDenzyl|owy 15 a-karboksybezwodnika kwasu glutaminowego lub ester trzeciorzedowy butylowy kwasu glutaminowego w diok¬ sanie poddac reakcji z 'amoniakiem w okreslonym sto¬ sunku molowym, na przyklad 100:1 (odpowiednio do zadanego stopnia polimeryzacji), a po zakonczeniu pol 20 meryzacji mozna odszczepic grupy ochronne, na przy¬ klad grupe benzyloofcsylowa za pomoca bromowodoru w kwasie octowym lodowatym, a grupe trzeoiorzedowa butylooksylowa kwasem trójfluorooctowym. W celu otrzymania polimeru o jednolitym, lokreslonej dlugosci 25 lancuchu, mozna rozbudowac polimer takze przez syn¬ teze sposobami znanymi w chemii peptydów (metoda) karbOidwuimidowa, metoda azydkowa i tym podobne.Stezenie polimeru w preparatach farmaceutycznych zalezy od rozpuszczalnosoi danej soli i od lepkosci. Po- 30 Umer powinien wystepowac w preparatach w formie rozpuszczonej i odpowiedniej do stosowania w zastrzy¬ kach. Stezenie peptydu o dzialaniu ladrenokortykotro¬ powym wynosi na przyklad 0,1—5 mg/ml.Sposób wedlug wynalazku objasniaja przyklady, w 35 których temperatury podano w stopniach Celsjusza.Uklady chromatogramów cienkowarstwowych ozna¬ czono nastepujaco: Uklad 40: n-butanol-etanol-woda (40 : 40 : 20), Uklad 43A: trzeciorzedowy alkohol amylowy-izopro- 40 panol-woda (67 : 26 : 7), Uklad 45: drugorzedowy butanol — 3% amoniak (70 : 30), Uklad 52: n-butanolnkwas octowy — woda (100 : 10 : : 30), 45 Uklad 52A: n-butanol-kwas octowy — woda (67 : 10 : : 23), Uklad 54: drugorzedowy butanol-izopropanol — 9% wodny roztwór kwasu monochlorooctowego (58 : 8 : 34), Uklad 100: octan etylu — pirydyna — kwas octo- 50 wy — woda (62 : 21 : 6 : 11), Uklad 101: n-butanol — pirydyna — kwas octo¬ wy — woda (38 : 24 : 8 : 30), Uklad 101E: n-butanol-pirydyna — kwas octowy — woda (44 : 24 : 2 : 30), 55 Zastosowano nastepujace skróty: Z oznacza grupe karbobenzoksylowa BOC „ grupe trzeciorzedowa-butyloksykarbony- lowa tBu „ grupe trzeoiorzedowa —- butylowa. 60 Przyklad I. 1) H — norleu — OCH3. 18,4 g L-nor- leucyny zawiesza sie w 57 ml metanolu i przy mieszaniu w temperaturze —15° w ciagu 30 minut dodaje sie 11 ml chlorku tionylu i miesza sie w ciagu nastepnych 30 mi- 65 nut utrzymujac temperature —15°, a nastepnie 90 minut7 w temperaturze 0° i w temperaturze pokojowej. Po 3 go¬ dzinnym staniu w temperaturze 40°, odparowuje sie roztwór w temperaturze 35° do suchosci, a pozostalosc krystalizuje sie z mieszaniny acetonu z heksanem (2 : 1), otrzymujac zwiazek o temperaturze topnienia 140—141°. 18,1 g otrzymanego chlorowodorku rozpuszcza sie w 20 ml wody, zadaje 200 ml eteru a nastepnie w tempe¬ raturze 0° 40 ml zimnego nasyoooego roztworu weglanu potasu. Wodna faze ekstrahuje sie wielokrotnie eterem, eterowe roztwory laczy, suszy siarczanem sodu i odpa¬ rowuje w wysokiej prózni w temperaturze 0°. Wolny ester otrzymuje sie jako klarowny olej. 2) BOC — ser — norleu — OCH3 Roztwór 22,3 g wodzianu BOC-L-seryny, 270 ml ace- tonitrylu zadaje sie roztworem 14,3 g estru metylowego Z-norleucyny i 65 ml acetonitrylu, po czym ochladza do temperatury —5°, dodaje 22,7 g dwucykloheksylo- karbodwuimidu w 35 ml acetonitrylu, miesza jeszcze jedna godzine w temperaturze —5°, nasetpnie przez noc w temperaturze 0°, uwalnia od dwucykloheksylomoczni- ka i odparowuje roztwór w temperaturze 35°. Pozosta¬ losc pochlania sie /w kwasie octowym, przemywa sie roztwór IN ikwasem solnym, IN kwasnym weglanem sodu i nasyconym roztworem chlorku sodu i odparo¬ wuje. Krystaliczny ester dwupeptydu topnieje w tempe¬ raturze 69—71°. 3) H — ser — norleu — OCH3 28,0 g BOC-ser-norleu-OGH3 rozpuszcza sie w 320 ml 90% kwasu trójfluorooctowego i pozostawia na 2 go¬ dziny w temperaturze pokojowej, nastepnie zageszcza roztwór ido polowy objetosci, zadaje 500 ml eteru, a wykrystalizowany trójfluorooctan wyodrebnia i wyod¬ rebniony produkt w ilosci 24,2 \g rozpuszcza w 35 ml wody, do roztworu dodaje 700 ml chloroformu, po czym przy mieszaniu w temperaturze 0° zadaje 210 ml nasy¬ conego roztworu weglanu potasu. Z fazy chloroformo¬ wej otrzymuje sie 16,1 g krystalicznego estru dwu¬ peptydu. 4) BOC — tyr — ser — norleu — OCH3 19,6 g BOC-tyr-OH i 16,1 g H-ser-norleu-OCH3 roz¬ puszcza sie w mieszaninie 350 ml acetonitrylu i 17,5 ml dwumetyloformamidu i w temperaturze —5° zadaje roztworem 15,9 g dwucykloheiksylokairbodwuimidu w 175 ml acetonitrylu, po czym miesza 1 goidzine w tem¬ peraturze —-5° a nastepnie przez noc w temperaturze 0°.Roztwór uwalnia sie od dwucykloheksyloimocznika, przemywa jak podano wyzej i odparowuje. Chroniony ester trójpeptydu topnieje po przekrystalizowaniu w temperaturze 143—145°. 5) H — tyr — ser — norleu — OCH3 27,3 g chronionego estru trójpeptydu rozpuszcza sie w 82,5 ml IN kwasu solnego, pozostawia do odstania na 2 godziny w temperaturze pokojowej i nastepnie za¬ daje 1500 ml eteru. Otrzymuje sie chlorowodorek wol¬ nego estru trójpeptydu, który po przekrystalizowaniu topnieje w temperaturze 218—220° (rozklad). 14,2 chlorowodorku rozpuszcza isie w 20 ml wody, do¬ daje sie 400 ml tworzacego warstwe dolna chloroformu 8 i w temperaturze 0° zadaje 100 ml nasyconego roztwo¬ ru weglanu potasu. Wolna zasada po przekrystalizowa¬ niu topnieje w temperaturze 84—86°. 5 6) BOC — D — ser — tyr — ser — norleu — OCH3 13,4 H-tyr^ser-nodeu-OCH3 rozpuszcza sie w 250 ml acetonitrylu i po dodaniu 15 ml dwumetyloformamidu zadaje 7,35 g BOCnDnseryny, po czym w temperaturze 10 —5° laczy sie z roztworem 7,15 g dwucykloheksylokar- bodwuimidu w 30 ml acetonitrylu i miesza 1 godzine w temperaturze —5° a nastapnie przez noc w temperaturze 0°. Roztwór uwalnia sie od dwucykloheksylomocznika i odparowuje. Chroniony ©ster tetrapeptydu po przekry- 15 stalizowaniu topnieje w temperaturze 149—151° (roz¬ klad). 7) BOC — D — ser — tyr — ser — norleu — NH — — NH2 20 11,65 g estru tetrapeptydu rozpuszcza sie w 50 ml metanolu, do roztworu dolacza 4,8 ml wodzianu hydra¬ zyny i mieszanine pozostawia sie do odstania na 24 go¬ dziny w temperaturze pokojowej. Nastepnie dodaje sie 50 ml wody i miesza az. galaretowaty produkt calfcowi- 25 oie skrystalizuje. Otrzymuje sie zwiazek o temperaturze topnienia 205—207°. 8) BOC-D-ser-try-ser-norleu-glu(OtBu)-his-fen-arg- -try-gli-OH. 30 8,75 g BOC-DHser-tyr-serHnorleu-NH-NH2 rozpuszcza sie w 75 ml dwumetyloformamidu i mieszajac w tempe¬ raturze —15° zadaje 20 ml 2N roztworu chlorowodoru w lodowatym kwasie octowym i po dodaniu 1,65 g trze¬ cioirzedowego azotynu butylu miesza roztwór w ciagu 5 10 minut w temperaturze —15°, po czym do roztworu dodaje sie 5,5 ml 'trójetyloaminy. W ten sposób otrzy¬ many roztwór azydku BOC-tetrapeptydu wkrapla sie do ochlodzonego do temperatury —10° roztworu 10 g H-glu(OtBu)his-fen-arg-try1gli-OH w 225 ml dwumetylo¬ formamidu i 12 ml wody i miesza w ciagu 20 godzin w temperaturze 0°, po czym dodaje 900 ml wody. Bezpo¬ staciowy dekapeptyd odsacza sie, przemywa dwumetylo- formamiidem — woda (1 : 5) i acetonitrylem. Po powtór¬ nym wytraceniu z wodnego acetonitrylu i wyrównaniu z wilgotnoscia powietrza, otrzymuje sie 12,9 g czystego ochronionego tetrawodzianu deikapeptydu o temperatu¬ rze topnienia 215—218° (rozklad): Md = 18° - 2° (c = °5 w roztworze pirydyna-woda 50 1 : !)• Zwiazek jest jednolity na chromatogramie cien¬ kowarstwowym na silikazelu; Rf (52) = 0,3. 9) B OC-D-ser-tyr-ser-noTleu-glu-(OtBu)-his-fen-arg- -try-gli-liz-((BOC)-pro-wal-gli-liz-(BOC)-iliz- 55 -(BOC)-liz-(BOC)-liz-(BOC)Hpro^wal-tyr-pro- -OtBu. 1 g BOC-D-ser-tyrHseT-norleuiglu-(OtBu)-his-fen-arg- -try-gli-OH i 1,05 g H-liz-(BOC)Hpro-wal-gli-liz-(BOC)- ^ -liz-(BOC)-liz-(BOC)- liz-(BOC)- pro-wal-liz-(BOC)- wal- -try-pro-OtBu) otrzymuje sie przez kondensacje Z-liz- -(BOC)-OH z H4iz-(BOC)-OCH3 w obecnosci dwucyklo- heksylokarbodwuimidu, przeprowadzemie ochronionego estru dwupeptydu w hydrazyd, kondensacje z L-pinolina 65 metoda azydkowa do Z-liz-(BOC)-liz-(BOC)-pro-OH,63111 10 kondensacje tej pochodnej z H-wal-liz-(BOC)-wal-tyr- -pro-OtBu w obecnosci dwucykloheksylokarbodwuimi¬ du odszczepienie grupy karbobenzoksylowej z otrzyma¬ nej pochodnej oktapeptydu za pomoca wodoru w obec¬ nosci palladu osadzonego na weglu i kondensacje tak otrzymanego peptydu H-liz-(BOC)-liz-(BOC)ipro-wal-liz- -(BOC)-wal-tyr-pro-OtBu z peptydem, otrzymanym we¬ dlug opisu patentowego NRF nr 1 214 242, Z4iz-(BOC)- -pro-wal-gli-liz-(BOC)-liz-(BOC)-NH-NH2, metoda azyd- kowa (porównaj opis patentowy nr 59 518), kondensacje prowadzi sie w obecnosci 15 ml pirydyny, 1 ml wody i 0,47 ml 1 N roztworu kwasu solnego, dodaje sie 300 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza sie w temperaturze 50° w ciagu 3 godzin, nastepnie dodaje sie ponownie 300 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu i miesza w ciagu dalszych 6 godzin w temperaturze 50°, po czym zageszcza do objetosci okolo 5 ml i peptyd wytraca za pomoca dodania duzej ilosci eteru.Nierozpuszczalny w eterze proszek rozciera sie z wo¬ da, odsacza i suszy. Tak otrzymany surowy produkt w celu oczyszczenia zawiesza sie w 50 ml górnej i 50 ml dolnej fazie ukladu rozpuszczalników metanol-bufor- -chloroform-czterochlorek wegla (10:3:5:4) [Bufor: 28,5 ml kwasu octowego + 19,25 g octanu amonu w 960 ml wody], wytrzasa kilka godzin i uwalnia od nie¬ rozpuszczalnych skladników przez filtracje. Czesc roz¬ puszczalna poddaje sie w celu dalszego oczyszczenia roz¬ dzialowi Craig'a w podobnym ukladzie rozpuszczalni¬ ków.Stopien czystosci poszczególnych frakcji kontroluje sie za pomoca chromatografii cienkowarstwowej na plytkach silikazelowych w ukladzie 100 i chlorofor- mienmetanolu (75 :25). Chromatograficznie jednolite frakcje laczy sie i odparowuje. Octan amonu zawarty jeszcze w pozostalosci usuwa sie przez wysublimowanie w wysokiej prózni w temperaturze 40°. 10) H-D-ser-tyr-ser-norleu-glu-his-fen-arg-try^gli-liz- -pro-wal-gli-liz-liz-liz-liz-pro-wal-liz-wal-tyr- -pro-OH (sól kwasu octowego). 100 mg BOC-D-ser-tyr^ser-inorleu-glu-(OtBu)-his-fen- -arg-tyr- gli-liz-(BOC)- pro-wal-gli-liz-(BOC)- liz-(BOC)- -liz-(BOC)- liz-(BOC)-pro-wal- liz-(BOC)-wal- tyr-pro- OtBu rozpuszcza sie w 3 ml 90% kwasu trójfluoroocto- wego i pozostawia w ciagu 1,5 godziny w temperaturze 25°. Nastepnie peptyd wytraca sie duza iloscia eteru, odsacza, przemywa eterem i suszy. Tak otrzymany trój- fluorooctan tetrakozapeptydu rozpuszcza sie w 5 ml wody i w celu przemiany w octan wprowadza na ko¬ lumne (0=18 mm, 1 = 20 cm) ze slabo zasadowym wymieniaczem jonowym (Merck Nr II). W wyniku lio¬ filizacji eluatu otrzymuje sie octan wolnego tetrakoza¬ peptydu w postaci prawie bezbarwnego, lekkiego pro¬ szku.Przyklad II. 1) Z-wal-tyr-pro-NH2. 18,8 g Z-wal- -tyr-pro-OtBu rozpuszcza sie w 95 ml 90% kwasu trój- fluorooctowego i pozostawia przez 1 godzine w tempera¬ turze pokojowej, po czym zageszcza do suchosci i olei¬ sta pozostalosc proszkuje przez dodanie 100 ml wody i roztarcie -w temperaturze 0°C, a nastepnie odsacza i su¬ szy do stalej wagi nad wodorotlenkiem potasu, rozpu¬ szcza w mieszaninie estru kwasu octowego i eteru nafto¬ wego i ponownie wytraca. Bezpostaciowy proszek (17,01 g) razem z 5,15 nil trójetyloaminy rozpuszcza sie w 170 ml absolutnego iczterowodorofuranu, ochladza do temperatury —15° i w ciegu 5 minut zadaje roztworeim 4,4 ml chloroweglanu izobutylu w 2,5 ml czterowodoro- furanu.Po 15 minutowym mieszaniu w temperaturze — 10° dodaje sie powoli 107 ml 0,64 N roztworu amoniaku w absolutnym octanie etylu i miesza w ciagu 1 godziny w temperaturze 0°, a nastepnie w ciagu 6 godzin w tem¬ peraturze 20°. Mieszanine zageszcza sie, silnie kleista 10 pozostalosc rozpuszcza w 500 ml octanu etylu i kolejno przemywa woda, 2 N roztworem weglanu sodu ponow¬ nie woda i zageszcza do sucha. Po dwukrotnym wytra¬ ceniu pozostalosci z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego i wysuszeniu w wysokiej prózni otrzymuje 15 sie 14,4 g bezpostaciowego proszku, który wedlug chro- matogramu cienkowarstwowego stanowi jednolity zwia¬ zek. Na plytce silikiazelowej otrzymuje sie nastepujace wartosci Rf : Rf w ukladzie chloroform-metanol (9 : 1) = = 0,35, Rf (43 A) = 0,63. 20 2) H-wal-tyr-pro-NH2. 14,4 g Z-wal-tyr-pro-NH2 rozpuszcza sie w 150 ml metanolu i uwodornia za pomoca 1,5 g 10% palladu 25 osadzonego na weglu, przy normalnym cisnieniu i ab¬ sorpcji CO2 az do nasycenia (okolo 2 godzin). Po od¬ filtrowaniu katalizatora i zageszczeniu przesaczu do su¬ cha, pozostalosc rozpuszcza sie w 15 ml (metanolu i 40 ml octanu etylu, a nastepnie wytraca przez dodanie 30 120 ml eteru naftowego, odfiltrowuje i suszy w wysokiej prózni w temperaturze 40°. Otrzymuje sie 9,52 g bez¬ postaciowego proszku, który wedlug chromatogramu cienkowarstwowego na plytce celulozowej przedstawia jednolity produkt o nastepujacych wartosciach Rf: Rf 35 (40) = 0,73, Rf (45) = 0,72, Rf (54) = 0,70. 3) Z4iz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2. 9,74 g Z-liz-(BOC)- -OH i 9,52 g H-wal-tyr-pro-NH2 rozpuszcza sie w 40 ml absolutnego dwumetyloformamidu i zadaje roztworem 5,76 dwucykloheksylokarbodwuimidu w 100 ml aceto- 40 nitrylu. Miesza sie 12 goidzin w temperaturze pokojo¬ wej, odsacza wydzielony dwucykloheksylomocznik i za¬ geszcza roztwór do sucha. Stala pieniaca sie pozostalosc wytraca sie dwukrotnie z mieszaniny octanu etylu i ete¬ ru naftowego. Otrzymuje sie 16,02 g bezpostaciowego 45 proszku pochodnej tetrapeptydu, który na chromatogra- mie cienkowarstwowym na zelu krzemionkowym wyka¬ zuje nastepujace wartosci Rf: Rf w ukladzie chloro¬ form-metanol (9:1) = 0,29, Rf (43 A) = 0,68. 4) H-liz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2. 15,5 ig ochronione- 50 go amidu tetrapeptydu rozpuszcza sie w 100 ml metano¬ lu 1 po dodaniu 1,5% palladu osadzonego na weglu uwodornia do nasycenia, przy normalnym cisnieniu w ciagu okolo 4 godzin. Surowy produkt otrzymany po odfiltrowaniu katalizatora i zageszczeniu przesaczu do 55 sucha, rozpuszcza sie w 10 ml metanolu i 120 ml octa¬ nu etylu, a nastepnie wytraca przez dodanie 120 ml eteru naftowego i suszy w wysokiej prózni w tempera¬ turze 40°. Otrzymuje sie 11,9 g bezpostaciowego pro¬ szku, który na chromatogramie cienkowarstwowym na 60 silikazelu wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf — w ukladzie chloroform-metanol (9:1) = 0,08, Rf (43 A) = = 0,27. 5) Z-walHliz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2. 5,28 g Z^wal-OH i 3,07 ml trójetyloaminy rozpuszcza sie w 50 ml abso- 65 lutnego octanu etylu, ochladza do temperatury —10°,/ zadaje roztworem 4,57 ml chloroweglanu izobutylu w 5 ml octanu etylu i miesza jeszcze przez 15 minut w temperaturze —10°, po czym w temperaturze —5° za¬ daje roztworem 11,87 g H-liz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2 w 10 ml dwumetyloformamidu i miesza przez 30 minut w temperaturze 0° i przez 5 godzin w temperaturze poko¬ jowej a nastepnie zadaje 100 ml wody i 200 ml n-buta- nolu.Po oddzieleniu wodnej fazy, faze organiczna przemy¬ wa sie kolejno 10% roztworem kwasu winowego w tem¬ peraturze 0°, nasyconym roztworem kwasnego weglanu sodu i nasyconym roztworem siarczanu sodu, suszy siar¬ czanem sodu i zageszcza du sucha. Pienista pozostalosc w celu wstepnego oczyszczenia wytraca sie z mieszaniny metanolu z octanem etylu i eterem naftowym i raz z mieszanina metanolu z acetonitrylem. Otrzymuje sie 12,5 g bezpostaciowego proszku, który rozdziela sie wielokrotnie w ukladzie .rozpuszczalników metanol-0,1 M roztwór octanu amonu-chloroform-czterochlorek wegla (9:3:4:4) z objetosciami fazowymi po 25 ml, przez 250 stopni.Z oddzielnego elementu Nr 81 —115 (rmax = 91; K = 0,57) przy zageszczeniu do sucha i odsublimowaniu octanu amonu w wysokiej prózni w temperaturze 45°, otrzymuje sie lacznie 7,94 g chromatograficznie czyste¬ go ochronionego pentapeptydu w postaci bialego bez¬ postaciowego proszku, wykazujacego na chromatogira- mie cienkowarstwowym na silikazelu nastepujace war¬ tosci Rf: Rf — w ukladzie chloroform-metanol (9 : 1) = = 0,42, Rf (43 A) = 0,68.. 6) H-wal-liz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2. 5,72 g Z-wal- -liz-(BOC)-wal-tyr-pro-NH2 rozpuszcza sie w 75 ml me¬ tanolu i uwodornia po dodaniu 600 mg 10% palladu osadzonego na weglu w temperaturze pokojowej z ab¬ sorpcja CO2. Pobór wodoru ustaje poi okolo 5 godzi¬ nach, katalizator odsacza, a iroztwór odparowuje do su¬ cha. Otrzymuje sie 4,74 g amidu pentapeptydu jako bez¬ postaciowego chromatograficznie jednolitego proszku, który na chromaitogramie cienkowarstwowym na silika¬ zelu wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf (52) = 0,40, Rf (100) = 0,35. 7) Z-liz-(BOC)-!liz-(BOC)-pro-wal-liz-(BOC)-wal-tyr- -pro-NH2. 3,35 g Z-liz-(BOC)-liz-(BOC)-pro-OH (otrzymanej jak podano w przykladzie I) rozpuszcza sie w 20 ml abso¬ lutnego dwumetyloformamidu i po dodaniu 0,65 ml trójetyloaminy ochladza do temperatury —15° i w tej samej temperaturze do mieszaniny wkrapla sie 0,58 ml chlorku piwaloilu, ia po 6 minutach dodaje sie uprzed¬ nio ochlodzony roztwór 3,34 g Hjwal-liz-(BOC)-wal-tyr- -pro-NH2 w 10 ml absolutnego dwumetyloformamidu i miesza 20 minut w temperaturze —10°, w ciagu 5 go¬ dzin w temperaturze 0° i 2 godziny w temperaturze 20°.Nastepnie dodaje sie 70 ml estru kwasu octowego i 50 ml wody, ekstrahuje organiczna faze kolejno 0,1 M kwasem cytrynowym, 2% roztworem amoniaku i woda, suszy siarczanem sodu i odparowuje rozpuszczalnik.Pozostalosc (5,74 g) w postaci bezpostaciowego proszku wykazuje na ichromatogramie cienkowarstwowym na si¬ likazelu tylko nieznaczne zanieczyszczenia i dlatego bez oczyszczania stosuje sie ja do dalszych reakcji.Rf — w ukladzie chloroform-metanol (9 : 1) = 0,23. 8) H-liz-(BOC)4iz-(BOC)-pro-wal-lizKBOC)-wal-tyr- -pro-NH2- 12 5,7 g wyzej opisanej pochodnej oktapeptydu rozpu¬ szcza sie w 100 ml metanolu i po dodaniu 550 mg 10% palladu osadzonego na weglu uwodornia przy normal¬ nym cisnieniu az do nasycenia!. Po odsaczeniu kataliza- 5 tora i po plukaniu metanolem, przesacz odparowuje sie do sucha. Biala piankowa pozostalosc rozpuszcza sie w 100 ml chloroformu, ekstrahuje 20 ml 2N roztworu kwasu octowego, faze chloroformowa zageszcza do 20 ml, wytraca peptyd przez dodanie 60 ml eteru naftowego i 10 suszy w wysokiej prózni w temperaturze 50°. Po wy¬ równaniu z wilgotnoscia powietrza otrzymuje sie 5,21 g bezpostaciowego, chromatografiozinie jednolitego prosz¬ ku, który wedlug analizy miareczkowej i elementarnej na mol amidu oktapeptydu zawiera 0,63 mola kwasu 15 octowego i 13 moli wody.Na silikazelu otrzymuje sie nastepujace wartosci Rf: Rf — w ukladzie chloroform-metanol (9:1) = 0,08, Rf (100) = 0,46. 9) Z-liz-(BOC)-pro-wal^gli-liz 20 -(BOC)-iliz-(BOC)-pro^wal-liz-(BOC)-wal-tyr- -pro-NHo. 3,91 g Z-liz-(BOC)-pro- walngli-liz-(BOC)- liz-(BOC)- -NH-NH2 (porównaj opis patentowy NRF nr 1214 241) 25 rozpuszcza sie lekko ogrzewajac w 40 ml absolutnego dwumetyloformamidu, ochladza do temperatury —20° i w tej temperaturze mieszajac zadaje kolejno powoli 6,28 ml 2,15 N kwasu solnego i 0,74 ml 5N roztworu azotynu sodu, a nastepnie miesza jeszcze w ciagu 15 30 minut w temperaturze —10° i dodaje uprzednio ochlo¬ dzony roztwór 4,07 g H-liz-(BOC)-liz-(BOC)-pro-wal-liiz- -(BOC)-iwal-tyr-pro-NH2 (zawierajacy 2,5% CH3COOH + + 15,3% H2O) w 11 ml dwumetyloformamidu jak równiez 1,98 ml trójetyloaminy i miesza w ciagu 1 go- 35 dziny w temperaturze 0°, po czym doprowadza sie pH do< wartosci 7,5 za pomoca trójetyloaminy i pozostawia na noc w temperaturze 0°, przy czym wytraca sie su¬ rowy produkt w galaretowatej postaci.Produkt odsacza sie, przemywa woda i wytraca trzy- 40 krotnie z mieszaniny metanolu z woda oraz dwukrotnie z mieszaniny metanolu z benzenem i eterem naftowym.Tak oczyszczony wstepnie material poddaje sie w ukla¬ dzie metanoil-bufoir-chloroform-czterochlorek wegla (12 : : 4 : 9 : 3) [bufor = 28,5 ml kwasu octowego + 19,25 g 45 octanu amonu w 960 ml wody] irozdzialowi Craig'a przez 160 stopni z objetosciami fazowymi po 20 ml. Z rozdzielonego elementu Nr 45 — 74 (rmax = 57; K = = 0,55) przy zageszczeniu 'do sucha i wysublimowaniu octanu amonu w temperaturze 45° w wysokiej prózni 50 uzyskuje sie lacznie 3,3 g chromatograficznie czystego ochronionego tetradekapeptydu, w postaci bialego bez¬ postaciowego proszku o temperaturze rozkladu okolo 210°, który na chromatogramie cienkowarstwowym na silikazelu wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf w ukla- 55 dzie chloroform-metanol (9:1) = 0,17, Rf (43 A) = 0,62, Rf (100) = 0,87. 10) H-liz-(BOC)-proHwal-gli-liz-i(BOC)-liz-(BOC)- -liz-(BOC)-li!Z-(BOC)-pro-wal-liz-wal-tyr- -pro-NH2. 60 4,97 g ochronionego amidu tetradekapeptydu rozpu¬ szcza sie przy ogrzewaniu w 100 ml metanolu i po do¬ daniu 1 g 10% palladu osadzonego na weglu uwodornia az do nasycenia w temperaturze pokojowej i normalnym 65 cisnieniu, przy absorpcji wytwarzajacego sie dwutlenku63111 13 wegla. Katalizator odsacza sie, przesacz zateza do oko¬ lo 15 ml i uwodorniony tetradeikapeptyd wytraca sie przez dodanie 50 ml benzenu i 150 ml eteru naftowego, po czym odsacza i suszy w wysokiej prózni w tempera¬ turze 45°. Otrzymuje sie 4,25 g bezpostaciowego prosz¬ ku, który wedlug chromatogramu cienkowarstwowego na silikazelu stanowi jednolity produkt o nastepujacych wartosciach Rf: Rf (43 A) = 0,18, Rf (52) = 0,41, Rf (100) = 0,33. 11) BOC-D-!ser-tyr-serHniorleu-glu-(OtBu)-his-fen- -arg-try-gli-liz-(BOC-pro-wal-gli-liz-(BOC)- -liz-(BOC)-liz-(BOC)-liz-(BOC)-pro-wal-liz- (BOC)-wal-tyrHpro-NH2. 600 mg BOC-D-ser-tyr-ser- norieu-glu-(OtBu)-his-fen- -arg-try-gli-OH i 360 mg H-liz-(BOC)-pro- wal-gli-liz- -(BOC)-liz-(BOC)-liz-(BOC)- liz-(BOQ- pro-wal-liz- -(BOC)-wal-tyr-pro-NH2 zadaje sie 12 ml pirydyny, 1 ml wody i 0,3 ml IN roztworu kwasu solnego, a nastepnie roztworem 200 mg dwucykloheksylokarbodwuimidu w 1,5 ml pirydyny i miesza 5 godzin w temperaturze 45— —50° po czym dodaje sie jeszcze 150 mg dwucyklohe¬ ksylokarbodwuimidu i miesza przez noc w temperaturze 45°. Mieszanine produktu kondensacji i dwucykloheksy lomocznika wytraca sie calkowicie przez dodanie 160 ml wody, odfiltrowuje i suszy.W celu oddzielenia dwucykloheksylomocznika mie¬ szanine zawiesza sie kolejno dwa razy na goraco w eta¬ nolu, wzglednie czesciowo rozpuszcza, wytraca powtór¬ nie przez dodanie benzenu i eteru naftowego. Po 120 stopniach rozdzialu w ukladzie rozpuszczalników me- tanol-bufor-chloroform-czterochlorek wegla (10 : 3 : 5 : 4) [bufor: 28,5 ml kwasu octowego + 19,25 g octanu amo¬ nu iw 960 ml wody] otrzymuje sie czysty ochroniony amid tetrakozapeptydu z frakcji 46 — 58 (liczba po¬ dzialu K = 0,82). Przy chromatografii cienkowarstwo¬ wej na plytce silikazelowej ochroniona pochodna pep- tydu wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf (52) = 0,54, Rf (100) = 0,35.Rf w ukladzie chloroform-metanol (7 : 3) = 0,4. 12) H-D-ser-tyr-ser-orleu-glu-his-fen-arg-tyr-gli- -liz-pro-wal-gli-liz-liz-liz-liz-pro-wal-tyr-pro- -NH2 (sól kwasu octowego).Odszczepienie grup ochronnych chronionego peptydu i przeprowadzenie soli kwasu trójfluorooctowego w sól kwasu octowego przebiega iwedlug sposobu opisanego w przykladzie I. Wolny tetrakozapeptamid wykazuje przy 10 15 20 25 30 35 14 elektroforezie bibulowej (bibula Schleicher Schtill 2643/b mgl; Pirydyna-octan. Bufor pH = 6,35: czas przebiegu 1 godzina; 2000 V); odleglosc przebiegu wo¬ bec katody 8 cm. Przy chromatografii cienkowarstwo¬ wej wykazuje nastepujace wartosci Rf: Rf (101) na plyt¬ ce tlenku glinu = 0,58, Rf (52 A) na plytce tlenku gli¬ nu = 0,44, Rf (101 E) na plytce celulozowej = 0,46.Peptyd wytworzony sposobem wedlug wynalazku do¬ godnie przechowuje sie w postaci tzw. „suchej ampul¬ ki", zawierajacej nastepujace skladniki: kwasny octan Pro24-amidu D-seri-norleuMiz17,18-!31-2: koirtykotropiny ZnS04 + 7H20 NA3P04 + 12H20 mannit 0,5 mg 1,23 mg 1,38 mg 40,00 mg 50 Przed uzyciem, zawartosc suchej buteleczki miesza sie z 1 ml wody destylowanej zawartej w ampulce rozpu¬ szczalnika, otrzymujac zawiesine o wartosci pH 7,6. PL PL PL